KR20210134705A - 절단형의 변이형 Calreticulin에 결합하는 항체, 및 골수 증식성 종양의 진단, 예방 또는 치료약 - Google Patents
절단형의 변이형 Calreticulin에 결합하는 항체, 및 골수 증식성 종양의 진단, 예방 또는 치료약 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20210134705A KR20210134705A KR1020217031154A KR20217031154A KR20210134705A KR 20210134705 A KR20210134705 A KR 20210134705A KR 1020217031154 A KR1020217031154 A KR 1020217031154A KR 20217031154 A KR20217031154 A KR 20217031154A KR 20210134705 A KR20210134705 A KR 20210134705A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- amino acid
- acid sequence
- seq
- antibody
- asp
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57426—Specifically defined cancers leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4727—Calcium binding proteins, e.g. calmodulin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
골수 증식성 종양의 진단, 예방 및 치료약의 제공.
(a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드쇄, 또는 (b) 서열 번호 1에서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드쇄 중에 항원 인식 부위를 갖는 절단 후의 변이형 CALR 단백질에 결합하는 항체 또는 그 기능적 단편 및 그 항체를 함유하는 골수 증식성 종양의 진단, 예방 및 치료약.
(a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드쇄, 또는 (b) 서열 번호 1에서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드쇄 중에 항원 인식 부위를 갖는 절단 후의 변이형 CALR 단백질에 결합하는 항체 또는 그 기능적 단편 및 그 항체를 함유하는 골수 증식성 종양의 진단, 예방 및 치료약.
Description
본 발명은, 골수 증식성 종양의 진단, 예방 및 치료약에 관한 것이다.
필라델피아 염색체 음성 골수 증식성 종양(Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasms;MPNs) 환자의 일부에서는, Calreticulin(CALR) 유전자의 제9 엑손에, 염기 결실이나 삽입이 발견된다(비특허문헌 1, 2). CALR 변이 유전자로부터 산생되는 변이형 CALR 단백질은, 트롬보포이에틴 수용체를 항상적으로 활성화함으로써, 단독으로 골수 증식성 종양(MPN)을 야기하는 종양 원성을 가지고 있다는 것이 이미 밝혀져 있다 (비특허문헌 3 내지 6).
MPN 환자에서 발견되는 CALR 유전자 변이는, 반드시 최종 엑손의 국한된 장소에서의 프레임 시프트 변이이며, 프레임 시프트 변이에 의한 아미노산의 해독틀 어긋남은, 반드시 +1이다. 이러한 점에서, 변이형 CALR 단백질의 카르복실 말단에는, 야생형에 존재하지 않는 배열이 존재하고, 특히 그카르복실 말단의 44 아미노산은, 거의 모든 변이형 CALR 단백질에 공통되고 있다. 그 예로서, MPN 환자에서 발견되는 CALR 유전자 변이 중에서 가장 빈도가 높은, 52 염기 결실형(Del 52), 그 다음에 빈도가 높은, 5 염기 삽입형(Ins 5)의 카르복실 말단의 배열을, 야생형 CALR 단백질의 당해 영역과 비교한 것을 도 1에 나타냈다.
MPN을 일으키는 원인인 변이형 CALR 단백질은, 종양 세포에 발현하고 있으므로, 프레임 시프트 변이에 의해 발생한 변이형 CALR 단백질에 특이적인 배열은, 네오 항원으로서, 진단 시의 마커나, 치료 표적이 될 가능성이 시사되고 있었다 (특허문헌 1 내지 2).
Klampfl T, Gisslinger H, Harutyunyan AS, et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. The New England journal of medicine. 2013; 369: 2379-90.
Nangalia J, Massie CE, Baxter EJ, et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. The New England journal of medicine. 2013; 369: 2391-405.
Araki M, Yang Y, Masubuchi N, et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. 2016; 127: 1307-16.
Elf S, Abdelfattah NS, Chen E, et al. Mutant Calreticulin Requires Both Its Mutant C-terminus and the Thrombopoietin Receptor for Oncogenic Transformation. Cancer Discov. 2016; 6: 368-81.
Marty C, Pecquet C, Nivarthi H, et al. Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. Blood. 2016; 127: 1317-24.
Vainchenker W, Kralovics R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 2017; 129: 667-79.
그러나, 상기의 프레임 시프트 변이에 의해 출현하는 변이형 CALR 단백질에 특이적인 배열(네오 항원)을 인식하는 항체에서는, 세포 추출액이나 세포 표면에 있어서의 변이형 CALR 단백질을 정확하게 검출할 수 없다는 것이 판명되었다.
따라서, 본 발명의 과제는, MPN의 변이형 CALR 유전자 및 단백질을 정확하게 검출할 수 있는 검출 수단, MPN의 진단, 예방 또는 치료약 및 MPN 치료약의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자는, 변이형 CALR 단백질의 기능 해석을 더욱 거듭한 결과, 발현시킨 변이형 CALR 단백질의 대부분이, 변이형 단백질에 특이적인 배열(도 1) 중에서 절단되고, 네오 항원이라고 생각되고 있던 배열의 대부분이 상실된 변이형 CALR 단백질이 많이 발현하고 있다는 것을 발견하였다. 그래서, 네오 항원 중의, 절단 부위에서 아미노 말단측에 위치하는 매우 짧은 아미노산 서열을 특이적으로 인식하는 항체를 제작했더니, 배양 세포뿐만 아니라, 환자 말초혈 세포, 환자 혈소판에서도, 절단된 변이형 CALR 단백질의 발현이 확인되었다. 또한, 이 항체를 사용하면, 세포 표면에서의 변이형 CALR 단백질의 검출 감도가 비약적으로 향상되는 것, 나아가 우수한 MPN 치료 효과가 얻어진다는 것이 밝혀졌다. 이러한 점에서, CALR 유전자 변이를 갖는 MPN 환자의 진단이나 치료에 있어서는, 전장형(미 절단형)뿐만 아니라, 절단형을 포함하는 변이형 CALR 단백질까지도 검출 혹은 표적으로 함으로써, 보다 고성능인 의약품을 개발할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 변이형 CALR 단백질의 절단을 저해함으로써, 절단으로 상실되는 배열을 표적으로 하는 의약품의 효과를 증강시키는 것이 가능하다는 것이 강하게 시사되어, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은, 다음 [1] 내지 [14]를 제공하는 것이다.
[1] (a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드쇄, 또는 (b) 서열 번호 1에서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드쇄 중에 항원 인식 부위를 갖는, 절단 후의 변이형 CALR 단백질에 결합하는 항체 또는 그 기능적 단편.
[2] 다음 (c), (d) 및 (e)로부터 선택되는, [1]에 기재한 절단 후의 변이형 CALR 단백질에 결합하는 항체 또는 그 기능적 단편:
(c) 면역 글로불린 VH쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 17, 18 및 19로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 17, 18 및 19로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또한, 면역 글로불린 VL쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 26, 27 및 28로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 26, 27 및 28로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 서열로 이루어지는 폴리펩티드인 항체,
(d) 면역 글로불린 VH쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 20, 21 및 22로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 20, 21 및 22로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또한, 면역 글로불린 VL쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 29, 30 및 31로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 29, 30 및 31로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인 항체,
(e) 면역 글로불린 VH쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 23, 24 및 25로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 23, 24 및 25로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또한, 면역 글로불린 VL쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 32, 33 및 34로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 32, 33 및 34로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인 항체.
[3] 다음 (C), (D) 및 (E)로부터 선택되는, [1] 또는 [2]에 기재된 절단 후의 변이형 CALR 단백질에 결합하는 항체 또는 그 기능적 단편:
(C) 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VH쇄, 및 서열 번호 8로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 8로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VL쇄를 갖는 항체,
(D) 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VH쇄, 및 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열에서1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VL쇄를 갖는 항체,
(E) 서열 번호 7로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 7로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VH쇄, 및 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열에서 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VL쇄를 갖는 항체.
[4] 절단형의 변이형 CALR 단백질 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열 부분에의 결합에서, [2] 또는 [3]의 항체와 경합하는 항체 또는 그 기능적 단편.
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 항에 기재된 항체 또는 그 기능적 단편을 함유하는 의약 조성물.
[6] 골수 증식성 종양의 진단, 예방 또는 치료약인 [5]에 기재된 의약 조성물.
[7] 생체 시료 중의 다음의 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 검출하는 것을 특징으로 하는 골수 증식성 종양에 관련하는 변이형 CALR 단백질의 검출 방법:
(a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,
(b) 서열 번호 1에서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
[8] (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 검출이, [1] 내지 [4] 중 어느 항에 기재된 항체 또는 그 기능적 단편을 사용하는 면역학적 검출인 [7]에 기재된 변이형 CALR 단백질의 검출 방법.
[9] 다음 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드에 결합하는 약물을 스크리닝하는 것을 특징으로 하는 골수 증식성 종양 치료약의 스크리닝 방법:
(a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,
(b) 서열 번호 1에서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
[10] 생체 시료 중의 다음 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 검출하는 것을 특징으로 하는 골수 증식성 종양의 진단 방법:
(a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,
(b) 서열 번호 1에서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
[11] (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 검출이, [1] 내지 [4] 중 어느 항에 기재된 항체 또는 그 기능적 단편을 사용하는 면역학적 검출인 [10]에 기재된 진단 방법.
[12] [1] 내지 [4] 중 어느 항에 기재된 항체 또는 그 기능적 단편을 투여하는 것을 특징으로 하는 골수 증식성 종양의 예방 또는 치료 방법.
[13] 골수 증식성 종양의 진단에 사용하기 위한, [1] 내지 [4] 중 어느 항에 기재된 항체 또는 그기능적 단편.
[14] [1] 내지 [4] 중 어느 항에 기재된 항체 또는 그 기능적 단편의, 골수 증식성 종양 진단약 제조를 위한 사용.
상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드쇄 중에 항원 인식 부위(에피토프)를 갖는 항체를 사용하면, 변이형 CALR 단백질의 절단에 의해 발생한 변이형 CALR 단백질을 검출할 수 있어, 세포 표면에서의 변이형 CALR 단백질의 검출 감도가 비약적으로 향상한다. 따라서, 본 발명의 MPN 진단약을 사용하면, MPN의 검출 감도가 비약적으로 향상한다. 또한, 이 항체를 사용하면, MPN을 특이적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, (a) 및 (b)의 폴리펩티드에 결합하는 약물을 스크리닝하면, MPN치료약을 스크리닝할 수 있다.
도 1은 변이형 CALR 단백질의 특징을 도시하는 도면이다. 골수 증식성 종양 환자의 발증 원인인 CALR 유전자 변이는, +1 프레임 시프트 변이이며, 그 결과인 변이형 CALR 단백질의 카르복실 말단에는, 변이형 단백질에 공통된 아미노산 서열이 발견된다. SP:시그널 서열, N:N 도메인, P:P 도메인. 화살표는, 야생형(WT)과 다른 아미노산 서열이 시작되는 부분을 나타내고 있다.
도 2는 CALR 단백질의 아미노 말단측과 변이형 CALR 단백질의 카르복실 말단측의 배열을 인식하는 항체를 도시하는 도면이다. CALR 단백질의 아미노 말단측의 배열을 인식하는 항체는, 변이형 CALR 단백질의 변이 개소로부터 아미노 말단측의 아미노산 서열을 인식하는 시판하고 있는 항체(항CALR 항체)이다. 또한, 변이형 CALR 단백질의 카르복실 말단의 배열을 인식하는 항체는, CALR 단백질의 카르복실 말단측에 염기 서열의 변이에 의해 새롭게 형성된 아미노산 서열을 인식하는 시판하고 있는 항체(항변이형 CALR 항체)이다.
도 3은 UT-7/TPO 세포(Komatsu N.et al., Blood, 1996, 87, 4552-4556)로부터 분비된 단백질을, 도 2의 항체를 사용하여 면역블로트 해석한 결과를 도시하는 도면이다. vec는, 발현 벡터만을 도입한 세포이므로, UT-7/TPO 세포/CALR(WT)과 동일한 내재성의 CALR 단백질이 검출된다. Del 52형과 Ins 5형에서는, 항변이형 CALR 항체에 의해 검출되는 전장형의 변이형 CALR 단백질보다도 분자량이 작은 변이형 CALR 단백질이 항CALR 항체에서만 검출된다(도면 중의 애스테리스크). 또한, Ins 5형에서는, 전장형의 변이형 CALR 단백질은, 내재성의 야생형 CALR 단백질과 거의 동일한 위치에 영동되기 때문에, 항CALR 항체에서, 특이적으로 검출할 수 없다.
도 4는 변이형 CALR 단백질의 대표적인 Del 52형과 Ins 5형의 아미노(N) 말단과 카르복실(C) 말단에 FLAG 태그(FLAG-tag)를 융합한 단백질의 모식도를 나타낸다. 변이형 특이적 배열을 흑색으로, FLAG 태그를 사선으로 도시하였다.
도 5는 항 FLAG 항체를 사용한 플로 사이토메트리 해석에 의해, 세포 표면 상에 있어서의 변이형 CALR 단백질의 양을 측정한 결과를 도시하는 도면이다. 절단의 유무에 상관없이 태그가 잔존하는 N 말단에 FLAG 태그를 배치한 변이형 CALR 단백질을 발현하는 세포에서는, 변이형 CALR 단백질 특이적 배열 내에서 발생하는 절단에 의해 C 말단 FLAG가 제거된 세포에 비하여, 강한 시그널이 검출되었다. 또한, Del 52형의 발현량이 Ins 5형보다도 낮은 것에 의한 차이가 보인다.
도 6은 변이형 CALR 단백질 특이적 배열(흑색) 내에서 발생하는 단백질의 절단 부위보다도 아미노 말단측에 있는, 변이형 특이적 배열을 인식하는 항체를 나타낸다.
도 7은 도 6의 항체를 사용하여, 도 3에서 사용한 세포를 플로 사이토메트리 해석한 결과를 나타낸다. FLAG 태그가 부가한 위치에 의한, 인식력의 차이가 소실하였다. 또한, Del 52형의 발현량이 Ins 5형보다도 낮은 것에 의한 차이가 보인다.
도 8은 골수 증식성 종양 환자 세포에 있어서의 절단형 CALR 단백질의 검출을 도시하는 도면이다. 변이형 CALR 단백질 특이적 배열 내에서 발생하는 단백질의 절단 부위보다도 아미노 말단측에 있는 아미노산 서열을 인식하는 항체를 사용하여, 환자 세포로부터 조제한 세포 추출액을 면역블로트법으로 해석하였다. CALR 유전자 변이를 갖는 골수 증식성 종양 환자의 말초혈 단핵구 세포나 혈소판에 있어서, 당해 항체에서 인식할 수 있는 절단형의 변이형 CALR 단백질의 발현이 검출되었다.
도 9는 클론 B3, C6, G1 항체 모두 전장형과 절단형의 변이형 CALR 단백질을 인식하는 것을 도시하는 도면이다. UT-7/TPO 세포로부터 분비된 단백질을, 클론 B3 항체와, 클론 C6, G1 항체를 사용하여 면역블로트 해석한 결과를 도시하는 도면이다. 아미노 말단의 시그널 서열 하류에 FLAG 태그를 부가한 Del 52형과 Ins 5형의 전장형과, 보다 저분자량의 절단형의 양쪽이, 항 FLAG 항체와 마찬가지로, B3, C6, G1 어느 항체를 사용해도 검출된다.
도 10은 클론 B3, C6, G1 항체 모두 세포 표면의 변이형 CALR 단백질을 인식하는 것을 도시하는 도면이다. FLAG 태그를 부가한 Del 52형 혹은 Ins 5형의 변이형 CALR 단백질을 발현하는 UT-7/TPO 세포, 발현 벡터만을 도입한 UT-7/TPO/vec 세포에 대하여, 클론 B3 항체와, 클론 C6, G1 항체를 사용한 플로 사이토메트리 해석을 행하고, 세포 표면 상에 있어서의 변이형 CALR 단백질의 양을 측정한 결과를 도시하는 도면이다. 또한, Del 52형은, Ins 5형보다도, 발현량이 낮기 때문에, 변이의 형에 의한 시그널 강도의 차이가 보인다.
도 11은 클론 B3, C6, G1 항체의 변이형 CALR 단백질에 대한 결합능의 평가 결과를 도시하는 도면이다. 클론 B3 항체와, 클론 C6, G1 항체, 컨트롤의 래트 IgG를 사용하여, Del 52형의 변이형 CALR 단백질에 대한 결합 특이성을 ELISA법에 의해 평가하였다. 클론 B3, C6, G1 항체, 모두 농도 의존적인 변이형 CALR 단백질과의 특이적인 결합이 검출되었다.
도 12는 클론 B3 항체와 항체의 제작에 사용한 항원에 대한 결합 강도를, 표면 플라스몬 공명 해석법에 의해 평가한 결과를 도시하는 도면이다. 클론 B3 항체와 항체의 제작에 사용한 항원에 대한 결합 강도를, 표면 플라스몬 공명 해석법에 의해 평가하였다.
도 13A는 면역블로트법에 의한, 클론 B3, C6, G1 항체의 항원 인식 배열의 동정 결과를 도시하는 도면이다. Del 52형의 변이형 CALR 단백질에 있어서, 도면 중에 기재한 아미노산을 알라닌(A)으로 치환한 단백질을 발현하고, 각각의 항체의 반응성을 면역블로트법을 사용하여 평가하였다. Intact는, 아미노산 치환을 하고 있지 않은 Del 52형의 변이형 CALR 단백질을 나타내고 있다. 흑색 굵은 선으로 둘러싸인 아미노산은, 항체의 제작에 사용한 항원 배열을 나타내고 있다.
도 13B는 ELISA법에 의한, 클론 B3, C6, G1 항체의 항원 인식 배열의 동정 결과를 도시하는 도면이다. 도 13A와 같은 단백질에 대한 각각의 항체의 반응성을, ELISA법을 사용하여 평가하였다. Intact는, 아미노산 치환을 하고 있지 않은 Del 52형의 변이형 CALR 단백질을 나타내고 있다. 흑색 굵은 선으로 둘러싸인 아미노산은, 항체의 제작에 사용한 항원 배열을 나타내고 있다.
도 14는 본 발명 항체(B3, C6, G1)의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 도시하는 도면이다.
도 15는 본 발명 항체(B3, C6, G1)의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 도시하는 도면이다.
도 16은 본 발명 항체(B3, C6, G1)의 중쇄 가변 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 17은 본 발명 항체(B3, C6, G1)의 경쇄 가변 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 18은 B3 마우스 키메라 항체에 의한 MPN 모델 마우스에 대한 치료 효과를 도시하는 도면이다. Del 52형의 변이형 CALR 단백질을 발현시킨 조혈 줄기 세포를 이식하여 만들어낸 골수 증식성 종양모델 마우스(CALR Del 52 마우스), 혹은 컨트롤 벡터를 도입한 조혈 줄기 세포를 이식하여 제작한 컨트롤 마우스에, 이식 후 9주째로부터, 매주, B3 키메라 항체 혹은, 용매(PBS)를 투여하고, 골수 증식성 종양 모델 마우스에 특징적인 혈소판증다의 억제 효과를 평가하였다.
도 2는 CALR 단백질의 아미노 말단측과 변이형 CALR 단백질의 카르복실 말단측의 배열을 인식하는 항체를 도시하는 도면이다. CALR 단백질의 아미노 말단측의 배열을 인식하는 항체는, 변이형 CALR 단백질의 변이 개소로부터 아미노 말단측의 아미노산 서열을 인식하는 시판하고 있는 항체(항CALR 항체)이다. 또한, 변이형 CALR 단백질의 카르복실 말단의 배열을 인식하는 항체는, CALR 단백질의 카르복실 말단측에 염기 서열의 변이에 의해 새롭게 형성된 아미노산 서열을 인식하는 시판하고 있는 항체(항변이형 CALR 항체)이다.
도 3은 UT-7/TPO 세포(Komatsu N.et al., Blood, 1996, 87, 4552-4556)로부터 분비된 단백질을, 도 2의 항체를 사용하여 면역블로트 해석한 결과를 도시하는 도면이다. vec는, 발현 벡터만을 도입한 세포이므로, UT-7/TPO 세포/CALR(WT)과 동일한 내재성의 CALR 단백질이 검출된다. Del 52형과 Ins 5형에서는, 항변이형 CALR 항체에 의해 검출되는 전장형의 변이형 CALR 단백질보다도 분자량이 작은 변이형 CALR 단백질이 항CALR 항체에서만 검출된다(도면 중의 애스테리스크). 또한, Ins 5형에서는, 전장형의 변이형 CALR 단백질은, 내재성의 야생형 CALR 단백질과 거의 동일한 위치에 영동되기 때문에, 항CALR 항체에서, 특이적으로 검출할 수 없다.
도 4는 변이형 CALR 단백질의 대표적인 Del 52형과 Ins 5형의 아미노(N) 말단과 카르복실(C) 말단에 FLAG 태그(FLAG-tag)를 융합한 단백질의 모식도를 나타낸다. 변이형 특이적 배열을 흑색으로, FLAG 태그를 사선으로 도시하였다.
도 5는 항 FLAG 항체를 사용한 플로 사이토메트리 해석에 의해, 세포 표면 상에 있어서의 변이형 CALR 단백질의 양을 측정한 결과를 도시하는 도면이다. 절단의 유무에 상관없이 태그가 잔존하는 N 말단에 FLAG 태그를 배치한 변이형 CALR 단백질을 발현하는 세포에서는, 변이형 CALR 단백질 특이적 배열 내에서 발생하는 절단에 의해 C 말단 FLAG가 제거된 세포에 비하여, 강한 시그널이 검출되었다. 또한, Del 52형의 발현량이 Ins 5형보다도 낮은 것에 의한 차이가 보인다.
도 6은 변이형 CALR 단백질 특이적 배열(흑색) 내에서 발생하는 단백질의 절단 부위보다도 아미노 말단측에 있는, 변이형 특이적 배열을 인식하는 항체를 나타낸다.
도 7은 도 6의 항체를 사용하여, 도 3에서 사용한 세포를 플로 사이토메트리 해석한 결과를 나타낸다. FLAG 태그가 부가한 위치에 의한, 인식력의 차이가 소실하였다. 또한, Del 52형의 발현량이 Ins 5형보다도 낮은 것에 의한 차이가 보인다.
도 8은 골수 증식성 종양 환자 세포에 있어서의 절단형 CALR 단백질의 검출을 도시하는 도면이다. 변이형 CALR 단백질 특이적 배열 내에서 발생하는 단백질의 절단 부위보다도 아미노 말단측에 있는 아미노산 서열을 인식하는 항체를 사용하여, 환자 세포로부터 조제한 세포 추출액을 면역블로트법으로 해석하였다. CALR 유전자 변이를 갖는 골수 증식성 종양 환자의 말초혈 단핵구 세포나 혈소판에 있어서, 당해 항체에서 인식할 수 있는 절단형의 변이형 CALR 단백질의 발현이 검출되었다.
도 9는 클론 B3, C6, G1 항체 모두 전장형과 절단형의 변이형 CALR 단백질을 인식하는 것을 도시하는 도면이다. UT-7/TPO 세포로부터 분비된 단백질을, 클론 B3 항체와, 클론 C6, G1 항체를 사용하여 면역블로트 해석한 결과를 도시하는 도면이다. 아미노 말단의 시그널 서열 하류에 FLAG 태그를 부가한 Del 52형과 Ins 5형의 전장형과, 보다 저분자량의 절단형의 양쪽이, 항 FLAG 항체와 마찬가지로, B3, C6, G1 어느 항체를 사용해도 검출된다.
도 10은 클론 B3, C6, G1 항체 모두 세포 표면의 변이형 CALR 단백질을 인식하는 것을 도시하는 도면이다. FLAG 태그를 부가한 Del 52형 혹은 Ins 5형의 변이형 CALR 단백질을 발현하는 UT-7/TPO 세포, 발현 벡터만을 도입한 UT-7/TPO/vec 세포에 대하여, 클론 B3 항체와, 클론 C6, G1 항체를 사용한 플로 사이토메트리 해석을 행하고, 세포 표면 상에 있어서의 변이형 CALR 단백질의 양을 측정한 결과를 도시하는 도면이다. 또한, Del 52형은, Ins 5형보다도, 발현량이 낮기 때문에, 변이의 형에 의한 시그널 강도의 차이가 보인다.
도 11은 클론 B3, C6, G1 항체의 변이형 CALR 단백질에 대한 결합능의 평가 결과를 도시하는 도면이다. 클론 B3 항체와, 클론 C6, G1 항체, 컨트롤의 래트 IgG를 사용하여, Del 52형의 변이형 CALR 단백질에 대한 결합 특이성을 ELISA법에 의해 평가하였다. 클론 B3, C6, G1 항체, 모두 농도 의존적인 변이형 CALR 단백질과의 특이적인 결합이 검출되었다.
도 12는 클론 B3 항체와 항체의 제작에 사용한 항원에 대한 결합 강도를, 표면 플라스몬 공명 해석법에 의해 평가한 결과를 도시하는 도면이다. 클론 B3 항체와 항체의 제작에 사용한 항원에 대한 결합 강도를, 표면 플라스몬 공명 해석법에 의해 평가하였다.
도 13A는 면역블로트법에 의한, 클론 B3, C6, G1 항체의 항원 인식 배열의 동정 결과를 도시하는 도면이다. Del 52형의 변이형 CALR 단백질에 있어서, 도면 중에 기재한 아미노산을 알라닌(A)으로 치환한 단백질을 발현하고, 각각의 항체의 반응성을 면역블로트법을 사용하여 평가하였다. Intact는, 아미노산 치환을 하고 있지 않은 Del 52형의 변이형 CALR 단백질을 나타내고 있다. 흑색 굵은 선으로 둘러싸인 아미노산은, 항체의 제작에 사용한 항원 배열을 나타내고 있다.
도 13B는 ELISA법에 의한, 클론 B3, C6, G1 항체의 항원 인식 배열의 동정 결과를 도시하는 도면이다. 도 13A와 같은 단백질에 대한 각각의 항체의 반응성을, ELISA법을 사용하여 평가하였다. Intact는, 아미노산 치환을 하고 있지 않은 Del 52형의 변이형 CALR 단백질을 나타내고 있다. 흑색 굵은 선으로 둘러싸인 아미노산은, 항체의 제작에 사용한 항원 배열을 나타내고 있다.
도 14는 본 발명 항체(B3, C6, G1)의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 도시하는 도면이다.
도 15는 본 발명 항체(B3, C6, G1)의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 도시하는 도면이다.
도 16은 본 발명 항체(B3, C6, G1)의 중쇄 가변 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 17은 본 발명 항체(B3, C6, G1)의 경쇄 가변 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 18은 B3 마우스 키메라 항체에 의한 MPN 모델 마우스에 대한 치료 효과를 도시하는 도면이다. Del 52형의 변이형 CALR 단백질을 발현시킨 조혈 줄기 세포를 이식하여 만들어낸 골수 증식성 종양모델 마우스(CALR Del 52 마우스), 혹은 컨트롤 벡터를 도입한 조혈 줄기 세포를 이식하여 제작한 컨트롤 마우스에, 이식 후 9주째로부터, 매주, B3 키메라 항체 혹은, 용매(PBS)를 투여하고, 골수 증식성 종양 모델 마우스에 특징적인 혈소판증다의 억제 효과를 평가하였다.
본 발명의 MPN에 관련하는 변이형 CALR 단백질의 검출 및 진단 방법 그리고 MPN의 예방 또는 치료의 표적으로서 사용되는 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드는, 변이형 CALR 단백질에 특이적인 배열(도 1 중의 변이형 CALR 단백질에 공통되는 44 아미노산) 중에서 절단되어 잔존하는 카르복실 말단측의 폴리펩티드이다.
야생형 CALR 단백질은, 도 1에 도시하는 아미노산 서열(서열 번호 2)을 갖는다. 또한, CALR 유전자 변이 중에서 가장 빈도가 높은 52 염기 결실형(Del 52)은, 도 1에 도시하는 아미노산 서열(서열 번호 3)을 갖는다. 또한, CALR 유전자 변이 중에서, 다음으로 빈도가 높은 5 염기 삽입형(Ins 5)은, 도 1에 도시하는 아미노산 서열(서열 번호 4)을 갖는다. 또한, 도 1 중의 프레임으로 둘러싼 영역은, 변이형 CALR 단백질에 공통되는 아미노산 서열이다. 절단형의 변이형 CALR 단백질은, 이 공통 영역의 아미노 말단측의 불과 13 아미노산만을 포함한다. 이 공통 영역이 절단되어 절단형의 변이형 CALR 단백질이 발생하는 것, 공통 영역의 대부분이 변이형 CALR 단백질로부터 상실되는 것은, 본 발명자가 처음으로 발견한 것이다.
폴리펩티드 (a)는, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진다. 폴리펩티드 (b)에서의, 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로서는, 서열 번호 1에서 1 내지 4개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열이 바람직하고, 1 내지 3개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열이 보다 바람직하다. 보다 구체적으로는, 서열 번호 1의 카르복시 말단측에서 3 아미노산이 결실한 아미노산 서열이 보다 바람직하다. 또한, 폴리펩티드 (b)의 아미노산 서열과 서열 번호 1의 아미노산 서열의 동일성은, 80% 이상이 바람직하고, 85% 이상이 보다 바람직하고, 90% 이상이 더욱 바람직하다.
본 발명의 MPN에 관련하는 변이형 CALR 단백질의 검출 방법 및 MPN 진단, 예방, 치료 방법에서는, 생체 시료 중의 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 그 기능적 단편이 사용된다.
상기 항체로서는, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드쇄 중에 항원 인식 부위(에피토프)를 갖는 항체라면 좋지만, 절단형의 변이형 CALR 단백질에만 결합하는 것이어도, 절단형의 변이형 CALR 단백질과 전장형의 변이형 CALR 단백질의 양쪽에 결합하는 것이어도 좋으며, 절단형의 변이형 CALR 단백질과 전장형의 변이형 CALR 단백질의 양쪽에 결합하는 「변이형 CALR 단백질」에 특이적인 항체인 것이 바람직하다. 구체예로서는, 다음 (c), (d) 및 (e)로부터 선택되는 항체를 들 수 있다.
(c) 면역 글로불린 VH쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 17, 18 및 19로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 17, 18 및 19로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또한, 면역 글로불린 VL쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 26, 27 및 28로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 26, 27 및 28로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인 항체.
(d) 면역 글로불린 VH쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 20, 21 및 22로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 20, 21 및 22로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또한, 면역 글로불린 VL쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 29, 30 및 31로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 29, 30 및 31로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인 항체.
(e) 면역 글로불린 VH쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 23, 24 및 25로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 23, 24 및 25로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또한, 면역 글로불린 VL쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 32, 33 및 34로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 32, 33 및 34로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인 항체.
상기 서열 번호 17 내지 34로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의, 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로서는, 서열 번호 17 내지 34에 있어서 내지 4개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열이 바람직하고, 1 내지 3개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열이 보다 바람직하고, 1 내지 2개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열이 더욱 바람직하다. 또한, 서열 번호 17 내지 34로 표시되는 아미노산 서열과, 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열의 동일성은, 80% 이상이 바람직하고, 85% 이상이 보다 바람직하고, 90% 이상이 더욱 바람직하다.
상기한 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드쇄 중에 항원 인식 부위(에피토프)를 갖는 항체로서는, 또한 다음(C), (D) 및 (E)로부터 선택되는 항체인 것이 바람직하다.
(C) 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VH쇄 및 서열 번호 8로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 8로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VL쇄를 갖는 항체.
(D) 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VH쇄 및 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VL쇄를 갖는 항체.
(E) 서열 번호 7로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 7로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VH쇄 및 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VL쇄를 갖는 항체.
상기 서열 번호 5 내지 10으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의, 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로서는, 서열 번호 5 내지 10에 있어서 1 내지 10개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열이 바람직하고, 1 내지 8개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열이 보다 바람직하고, 1 내지 5개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열이 더욱 바람직하다. 또한, 서열 번호 5 내지 10으로 표시되는 아미노산 서열과, 서열 번호 5 내지 10으로 표시되는 아미노산 서열의 1 내지 수개가 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열의 동일성은, 80% 이상이 바람직하고, 85% 이상이 보다 바람직하고, 90% 이상이 더욱 바람직하다.
본 발명의 항체는, 상기 (c) 내지 (e)의 각 CDR의 배열, 또는 (C) 내지 (E)의 면역 글로불린 VH 영역 및 VL 영역의 배열을 갖는 것으로서, 이들의 영역 이외의 영역의 아미노산 서열은 특별히 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명의 항체는, 인간 항체와 같은 래트 이외의 포유 동물 항체이어도 좋고, 인간화 항체이어도 좋다. 보다 구체적으로는, 인간 이외의 포유 동물, 예를 들어 래트 항체의 중쇄, 경쇄의 가변 영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상 영역으로 이루어지는 키메라 항체이어도 좋고, 이와 같은 항체는 래트 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA를 인간 항체의 정상 영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 내장하고 숙주에 도입하여 산생시킴으로써 얻을 수 있다. 인간화 항체는, 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해지고, 인간 이외의 포유 동물, 예를 들어 래트 항체의 CDR을 인간 항체의 CDR에 이식한 것이며, 그 일반적인 재조합 방법도 알려져 있다. 구체예로서, 래트 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계한 DNA 배열을, 말단부에 오버랩하는 부분을 갖도록 제작한 수개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 정상 영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 내장하고, 이것을 숙주에 도입하여 산생시킴으로써 얻어진다(유럽 특허 출원 공개번호 EP239400, 국제 특허 출원 공개 번호 W096/02576 참조). CDR을 개재하여 연결되는 인간 항체의 FR은, CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변 영역의 FR의 아미노산을 치환해도 된다 (Sato, K.et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856.).
또한, 인간 항체의 취득 방법도 알려져 있다. 예를 들어 인간 림프구를 in vitro에서 원하는 항원 또는 원하는 항원을 발현하는 세포에서 감작하고, 감작 림프구를 인간 미엘로마 세포, 예를 들어 U266과 융합시켜, 항원으로의 결합 활성을 갖는 원하는 인간 항체를 얻을 수도 있다(일본 특허 공고 평1-59878 참조). 또한, 인간 항체 유전자의 모든 레파토리를 갖는 트랜스제닉 동물을 원하는 항원으로 면역함으로써 원하는 인간 항체를 취득할 수 있다(WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO94/25585, WO96/34096, WO96/33735 참조). 또한, 인간 항체 라이브러리를 사용하여, 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들어 인간 항체의 가변 영역을 단일쇄 항체(scFv)로 하여 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현시켜 항원에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 배열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 배열이 밝혀지면, 당해 배열을 적당한 발현 벡터를 제작하여 인간 항체를 취득할 수 있다. 이들 방법은 이미 주지이며, WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388을 참고로 할 수 있다.
항체의 클래스는 특별히 한정되지 않고 IgG, IgM, IgA, IgD 혹은 IgE 등의 어느 아이소 타입을 갖는 항체까지도 포함한다. 정제의 용이성 등을 고려하면 바람직하게는 IgG이다.
기능적 단편으로서는, 항체 단편(프래그먼트) 등의 저분자화 항체나 항체의 수식물을 들 수 있다. 항체 단편의 구체예로서는, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Diabody 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 중, 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 검출에 사용하는 항체는 이들의 폴리펩티드에 결합하면 좋다. 한편, MPN의 예방 또는 치료에 사용하는 항체는, 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드에 결합하고, 세포 상해 활성을 갖는 항체가 바람직하다.
절단형의 변이형 CALR 단백질에 결합하는 항체로서는, 서열 번호 1로 표시되는 배열을 갖는 폴리펩티드쇄에 결합하는 항체라면 좋지만, 절단형의 변이형 CALR 단백질 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열 부분으로의 결합에 있어서, 적어도 상기 항체 또는 그 기능적 단편 중 어느 하나와 경합하는 항체인 것이 바람직하다.
여기에서, 상기 검출에 사용되는 생체 시료로서는, 예를 들어 피험자로부터 채취된 생체 시료이며, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드가 포함되는 시료를 들 수 있다. 구체적으로는, 전혈, 혈장, 혈청, 림프구, 림프액, 혈소판, 단핵구, 과립구, 타액이나 오줌 등의 체액, 골수 생검에 의해 얻어지는 조직 표본(골수액, 골수 조직)등을 들 수 있다.
(a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 검출 수단으로서는, 액체 크로마토그래피 질량 분석법, 면역학적법, 특이적 결합능을 갖는 저/중분자나 핵산 혹은 핵산 유도체를 사용한 방법 등을 들 수 있지만, 간편하며 측정 감도가 높은 면역학적 방법이 바람직하다.
면역학적 방법으로서는, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드쇄 중에 항원 인식 부위(에피토프)를 갖는 항체 또는 그 기능적 단편을 사용하는 면역학적 방법이 바람직하다. (a) 또는 (b)의 폴리펩티드쇄 중의 에피토프로서는, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드쇄 중에 존재하는 배열이면 좋고, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드쇄 중의 연속하는 3 아미노산 이상의 아미노산을 갖는 펩티드가 바람직하고, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드쇄 중의 연속하는 5 아미노산 이상의 아미노산을 갖는 펩티드가 보다 바람직하다.
면역학적 방법에 사용하는 항체는, 예를 들어 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드쇄 중의 연속하는 3 아미노산 이상의 아미노산을 갖는 펩티드를 항원으로서 사용하여 얻어지는 항체이면 되고, 폴리클로날 항체이어도, 모노클로날 항체이어도 좋지만, 모노클로날 항체가 바람직하다. 여기에서 모노클로날 항체는, 예를 들어 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드쇄 중의 연속하는 3 아미노산 이상의 아미노산을 갖는 펩티드를 감작함으로써 얻어진 항체 산생 세포와 골수종 세포를 세포 융합시켜 하이브리도마를 제작하여 목적으로 하는 항체를 산생하는 클론을 선택하고, 이 세포를 증식시켜 제조할 수 있다.
면역학적 방법으로서는, 면역 크로마토그래피법, 효소 표지 면역학적 측정법(EIA), 방사선 면역검정(RIA), 응집법, 비탁법, 플로 사이토메트리법, 조직 면역 염색법, 웨스턴 블롯 등의 면역블로트법 등을 모두 사용할 수 있다. 여기서 면역블로트법은, 폴리펩티드를 멤브레인에 전사하고, 멤브레인 상의 폴리펩티드를 항체로 검출하는 방법이다. 항체의 검출에는, 효소 표지, 형광 표지 등이 사용된다.
생체 시료 중에 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드가 검출되면, 당해 생체 시료는 골수 증식성 종양 환자 유래의 생체 시료라고 판정할 수 있다.
본 발명의 MPN 진단약은, 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드쇄 중에 항원 인식부(에피토프)를 갖는 항체를 함유한다. 이 항체는, 전술한 항체인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 MPN 진단약에는, 상기 항체 외에, 완충액, 측정 실시 프로토콜 등이 포함되어 있어도 좋다.
본 발명의 MPN 예방 또는 치료약 등의 의약 조성물은, 상기한 항체를 함유하면 좋지만, 약학적으로 허용할 수 있는 담체와 함께 혼합, 용해, 유화, 캡슐 봉입, 동결 건조 등에 의해 제제화하여 제조할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 예방 또는 치료 대상이 되는 MPN은, 변이형 CALR가 검출되는 MPN인 것이 바람직하다.
경구 투여용이 적합한 제제는, 본 발명 항체를 물, 생리 식염수와 같은 희석제에 유효량 용해시킨 액제, 유효량을 고체나 과립으로서 포함하고 있는 켑슐제, 과립제, 산제 또는 정제, 적당한 분산매 중에 유효량을 현탁시킨 현탁액제, 유효량을 용해시킨 용액을 적당한 분산매 중에 분산시켜 유화시킨 유제 등이다.
비경구 투여용으로는, 본 발명 항체를 약학적으로 허용할 수 있는 용매, 부형제, 결합제, 안정화제, 분산제 등과 함께 주사용 용액, 현탁액, 유제, 크림제, 연고제, 흡입제, 좌제 등의 제형으로 제제화할 수 있다. 주사용의 처방에 있어서는, 본 발명의 항체를 수성 용액, 바람직하게는 행크스 용액, 링거 용액, 또는 생리적 식염 완충액 등의 생리학적으로 적합성의 완충액 중에 용해할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약은, 유성 또는 수성의 비히클 중에서 현탁액, 용액, 또는 유탁액 등의 형상을 취할 수 있다. 혹은, 본 발명 항체를 분체의 형태로 제조하고, 사용 전에 멸균수 등을 사용하여 수용액 또는 현탁액을 조제해도 좋다. 흡입에 의한 투여용으로는, 본 발명 항체를 분말화하여 락토오스 또는 전분 등이 적당한 기제와 함께 분말 혼합물로 만들 수 있다. 좌제 처방은, 본 발명 항체를 카카오버터 등의 관용의 좌제 기제와 혼합함으로써 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 치료제는, 폴리머 매트릭스 등에 봉입하여 지속 방출용 제제로서 처방할 수 있다.
본 발명의 MPN 치료약의 스크리닝법은, 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 인식하는 항체나 단백질, 저/중분자, 핵산 혹은 핵산 유도체를 스크리닝하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로는, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 인식하는 항체를 사용한 항체 의존성 세포 상해 활성이나 보체 의존성 세포 상해 활성을 갖는 항체 의약의 개발을 들 수 있다. 상기 본 발명의 항체가, 본 발명의 스크리닝법에 의해 얻어진 항체 의약의 예이다. 이 밖에도, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 저분자 혹은 중분자 화합물, 핵산 혹은 핵산 유도체, 단백질 등을 만들어 내, 살세포 효과를 갖는 저분자 혹은 중분자 화합물, 핵산 혹은 핵산 유도체, 단백질 등을 종양 세포 특이적으로 송달하는 항종양약 개발을 들 수 있다.
실시예
다음에 실시예를 들어서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 전혀 한정되지 않는다.
[시험예 1]
(1) 재료 및 시험 방법
[1] 항CALR 항체
Cell Signaling Technology사제 토끼 모노클로날 항체 클론 D3E6(Cat#12238)
[2] 항변이형 CALR 항체
Dianova사제 마우스 모노클로날 항체 클론 CAL2(Cat#DIA-CAL)
[3] 절단 부위보다도 아미노 말단측의 변이형 CALR 단백질을 인식하는 항체
서열 번호 1에 포함되는 아미노산 서열(RRMMRTKMR)의 카르복실 말단 혹은 아미노 말단에 시스테인을 부가한 펩티드를 합성하고, 캐리어 단백질 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin;KLH)과 결합시키고 나서, 8주령의 암컷 WKY/Izm 래트에게 면역하고, 추가 면역 후에 림프구를 회수하였다. 림프구를 마우스 미엘로마 SP2 세포와 PEG법에 의해 세포 융합시키고 나서, 선택 배지에서 배양하여 하이브리도마를 취득하였다. 배양 상청 중의 항체의 특이성을, 면역한 펩티드나 정제 단백질을 사용한 ELISA법에 의해 스크리닝함으로써, 절단형을 포함하는 변이형 CALR 단백질에 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마(클론 B3, C6 및 G1)을 취득하였다. 이러한 하이브리도마로부터 산생된 항체를 정제하여 시험에 사용하였다(B3 항체, C6 항체 및 G1 항체).
[4] 시험 방법
인간 거핵아구성 백혈병 세포주 UT-7/TPO에, Del 52 혹은 Ins 5형의 변이형 CALR 단백질을 발현시킴으로써 종양성에 증식하는 UT-7/TPO/CALR Del 52, UT-7/TPO/CALR Ins 5 세포와, 컨트롤로서 야생형 CALR를 발현시킨 UT-7/TPO/CALR(WT), 유전자 도입에 사용한 벡터만을 도입한 UT-7/TPO/vec 세포를, 6.0×105개/mL의 밀도로 OptiMEM 배지(Thermo Fisher사 Cat#31985070)에 파종하고, 5% CO2 존재 하에서 37℃에서 32시간 배양하였다. 이 때, UT-7/TPO/CALR WT와 UT-7/TPO/vec 세포는, 10ng/mL 트롬보포이에틴(Thrombopoietin; TPO)을 포함하는 배지에서 배양하였다. 배양액으로부터 세포를 원심 분리(15,000g×10분, 4℃)에 의해 제거한 배양 상청을 취득하고, 얻어진 분획을 환원제 존재 하에서 가열 처리한 후, SDS 폴리아크릴아미드 전기 영동법에 의해 겔 위로 전개한 후, 폴리비닐리덴 디플루오리드(PVDF)막에 전기적으로 전사하고, 5% 스킴 밀크를 포함하는 TBS-T 용액 (0.1% Tween-20, 150mM 염화 나트륨, 50mM Tris-HCI, pH 7.5)과 실온에서 1시간 반응시키고 나서, 야생형과 변이형의 양쪽을 인식하는 항체(토끼 모노클로날 항체 D3E6, Cell Signaling사 Cat#12238) 혹은, 변이형의 카르복실 말단 배열을 인식하는 시판하고 있는 항체(마우스 모노클로날 항체 CAL2, Dianova사 Cat# DIA-CAL-250)을 포함하는 5% BSA/TBS-T 용액과 4℃에서 밤새 반응시켰다. TBS-T 용액에 의한 세정을 행한 후, 퍼옥시다아제 표지된 항 토끼 IgG 항체(Santa Cruz사 Cat#sc-2030) 혹은 퍼옥시다아제 표지된 항마우스 IgG 항체(Santa Cruz사 Cat#sc-2005)을 포함하는 5% 스킴 밀크/TBS-T 용액 중에 있어서, 실온에서 1시간 반응을 행하였다. PVDF막을 TBS-T 용액으로 세정한 후에, 퍼옥시다아제 발광 시약(Thermo Fisher Scientific사 Cat#34094)과 반응시켜 얻어진 시그널을, FUSION 촬상 장치(Vilber-Lourmat사제)를 사용하여 검출하였다.
아미노 말단의 시그널 서열 하류에 히스티딘 태그를 삽입한 Del 52형의 변이형 CALR 단백질을, HEK293T 세포 내에서 발현시키고, 분비된 변이형 CALR 단백질을 포함하는 배양 상청을 원심 분리(15,000g×10분, 4℃)에 의해 조제하였다. 얻어진 상청을 HisTrap 칼럼(GE 헬스케어사 Cat#17531901)에 어플라이하고, 20mM 이미다졸을 함유하는 정제 버퍼(0.3M 염화 나트륨, 25mM Tris-HCI, pH 7.4)로 칼럼을 세정 후, 50mM 이미다졸을 함유하는 정제 버퍼를 사용하여 변이형 CALR 단백질을 정제하였다. 정제 단백질은, 2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid(NTCB)과 반응시킴으로써 시스테인 잔기를 시아노화한 후, 알칼리성 조건 하에서 단편화한 후, 매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화 비행 시간형 질량 분석계를 사용하여 단백질 단편의 질량을 동정하고, Del 52형의 변이형 CALR 단백질의 펩티드 서열 정보로부터 절단 부위를 결정하였다.
아미노 말단의 시그널 서열 하류에 FLAG 태그로 표지, 혹은, 카르복실 말단을 FLAG 태그로 표지한 Del 52형 혹은 Ins 5형의 변이형 CALR 단백질을, UT-7/TPO 세포에서 발현시키고, 소 태아 비동화 혈청 10%을 포함하는 Iscove's Modified Dulbecco's(IMDM) 배지를 사용하여 5%CO2 존재 하에서 37℃에서 배양하였다. 증식기의 세포 1×105개를 PBS(137mM 염화 나트륨, 27mM 염화칼륨을 포함하는 인산 완충액)으로 세정 후에 2% FBS/PBS 용액 중에서, 마우스 항DYKDDDDK tag 항체(후지 필름 와코준야쿠사 Cat#014-22383) 혹은, 절단 부위보다도 아미노 말단측을 인식하는 래트 항변이형 CALR 항체와, 빙상에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 2% FBS/PBS 용액을 사용하여 세포를 세정한 후, 2차 항체로서, 각각 항마우스 IgG-Alexa Fluor 647(Thermo Fisher Scientific사 Cat#A21235)과 항래트 IgG-Alexa Fluor 647(Thermo Fisher Scientific사 Cat#A21247)을 2% FBS/PBS 용액 중에 있어서 빙상에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료 후에 원심에 의해 회수한 세포에, 2% 파라포름알데히드를 포함하는 PBS 용액을, 빙상에서 15분 반응시켰다. 마지막으로, 2% FBS/PBS 용액을 첨가하고 나서, 원심 분리(400g×5분, 4℃)하고, 상청을 폐기함으로써 세포를 세정하고, 2% FBS/PBS 용액을 300μL 첨가하고, FACS Calibur(BD biosciences사제)를 사용하여 플로 사이토메트리 해석에 의해, 시그널을 정량하였다.
인간 말초혈 단핵구 세포는, 응고 방지제가 포함되는 스피츠관에 채혈된 말초혈을 원심 분리(500g×10분, 4℃)하여 얻어지는 세포 분획을 PBS 용액에 현탁한 후, 림프구 분리액 Lymphosep(MP biomedicals사 Cat#11444815) 위에 중층 하고, 원심 분리(1500rpm×30분, 실온)함으로써 버피코트를 취득하였다. 얻어진 버피 코트에 PBS 용액을 첨가하고, 재현탁한 후, 원심 분리(1500rpm×10분, 실온) 하고, 상청을 제거함으로써 말초혈 단핵구 세포를 취득하였다. 얻어진 세포를 RIPA 용액(150mM 염화 나트륨, 1mM EDTA, 1% NP-40, 1% 데옥시콜산 나트륨, 2mM 오르토바나딘(V)산 나트륨, 10mM β-글리세로 인산, 1μg/mL 아프로티닌, 2μg/mL E-64, 1μg/mL 루펩틴, 0.67μg/mL 베스타틴, 0.67μg/mL 펩스타틴, 43.5μg/mL PMSF, 20mM Tris-HCI, pH 7.4)에 현탁한 후, 초음파 파쇄하고 나서, 원심 분리(15,000g×15분, 4℃)하고 상청을 회수하여 세포 추출액을 조제하였다. 얻어진 세포 추출액을 환원제 존재 하에서 가열 처리한 후, SDS 폴리아크릴아미드 전기 영동법에 의해 겔 위로 전개한 후, 폴리비닐리덴 디플루오리드(PVDF)막에 전기적으로 전사하고, 5% 스킴 밀크를 포함하는 TBS-T 용액과 실온에서 1시간 반응시키고 나서, 절단 부위보다도 아미노 말단측을 인식하는 래트 항변이형 CALR 항체를 포함하는 5% BSA/TBS-T 용액과 4℃에서 밤새 반응시켰다. TBS-T 용액에 의한 세정을 행한 후, 퍼옥시다아제 표지된 항래트 IgG 항체(Santa Cruz사 Cat#sc-2006)를 포함하는 5% 스킴 밀크/TBS-T 용액과 실온에서 1시간 반응을 행하였다. PVDF막을 TBS-T 용액으로 세정한 후에, 퍼옥시다아제 발광 시약과 반응시켜 얻어진 시그널을, FUSION 촬상 장치를 사용하여 검출하였다.
혈소판은, EDTA를 포함하는 스피츠관에 채혈된 말초혈을 원심 분리(500g×10분, 4℃)하여 얻어지는 상청을, 원심 분리(2000×g, 15분, 4℃)하여 얻어진 침전물을, 혈소판 세정 용액(10mM 시트르산 나트륨, 150mM 염화 나트륨, 1mM EDTA, 1% 덱스트로오스, pH 7.4) 500μL로 2회 린스함으로써 조제하였다. 얻어진 혈소판을 RIPA 용액에 현탁한 후, 초음파 파쇄하고 나서, 원심 분리(15000g×15분, 4℃)하여 상청을 회수하여 세포 추출액을 조제하였다. 얻어진 세포 추출액을 환원제 존재 하에서 가열 처리한 후, SDS 폴리아크릴아미드 전기 영동법에 의해 겔 위로 전개한 후, 폴리비닐리덴 디플루오리드(PVDF)막에 전기적으로 전사하고, 5% 스킴 밀크를 포함하는 TBS-T 용액과 실온에서 1시간 반응시키고 나서, 절단 부위보다도 아미노 말단측을 인식하는 래트 항변이형 CALR 항체(B3 항체)를 포함하는 5% BSA/TBS-T 용액과 4℃에서 밤새 반응시켰다. TBS-T 용액에 의한 세정을 행한 후, 퍼옥시다아제 표지된 항래트 IgG 항체(Santa Cruz사 Cat#sc-2006)를 포함하는 5% 스킴 밀크/TBS-T 용액과 실온에서 1시간 반응을 행하였다. PVDF막을 TBS-T 용액으로 세정한 후에, 퍼옥시다아제 발광 시약과 반응시켜 얻어진 시그널을, FUSION 촬상 장치를 사용하여 검출하였다.
(2) 결과
인간 거핵아구성 백혈병 세포주 UT-7/TPO에, Del 52 혹은 Ins 5형의 변이형 CALR 단백질을 발현시킴으로써 종양성에 증식하는 UT-7/TPO/CALR Del 52, UT-7/TPO/CALR Ins 5 세포와, 컨트롤로서 야생형 CALR를 발현시킨 UT-7/TPO/CALR(WT), 유전자 도입에 사용한 벡터만을 도입한 UT-7/TPO/vec의 배양 상청 중에 포함되는 CALR 단백질을, 야생형과 변이형의 양쪽을 인식하는 항체(모노클로날 항체 D3E6, Cell Signaling사 Cat#12238)와, 변이형의 카르복실 말단 배열을 인식하는 시판하고 있는 항체(모노클로날 항체 CAL2, Dianova사 Cat# DIA-CAL-250)로 평가하였다(도 2). 그 결과, 도 2에 도시하는 바와 같이, 야생형과 변이형 CALR 단백질을 인식하는 항체(B3 항체)를 사용한 면역블로트에 있어서, 변이형 CALR 단백질을 발현하는 세포에서는, 내재성의 CALR 외에, 변이형 항체로 인식할 수 없는 밴드가 검출되었다(도 3).
NTCB를 사용하여 시스테인 잔기의 아미노 말단측에서 단편화한 펩티드 단편 중, 변이형 CALR 단백질(Del 52형을 사용)의 절단형에만 발견된 펩티드 단편의 분자량으로서, 25827.7과 25418.4을 얻었다. 이 수치와, 절단된 시스테인 잔기의 위치에서 구한 추정 분자량을 비교함으로써, Del 52형의 변이형 CALR 단백질의 절단 부위로서, 380번째의 메티오닌 잔기와 381번째의 아르기닌 잔기 사이와, 377번째의 메티오닌 잔기와 378번째의 아르기닌 잔기 사이를 동정하였다.
아미노 말단의 시그널 서열 하류에 FLAG 태그로 표지, 혹은, 카르복실 말단을 FLAG 태그로 표지한 Del 52형 혹은 Ins 5형의 변이형 CALR 단백질을, UT-7/TPO 세포에서 발현시키고, 세포 표면에 있어서의 변이형 CALR 단백질의 발현에 대하여 항 FLAG 항체를 사용한 플로 사이토메트리 해석을 행하면, 아미노 말단의 FLAG 태그를 갖는 변이형 CALR 단백질을 발현하는 세포에서는, 카르복실 말단을 FLAG 태그 표지한 변이형 CALR 단백질을 발현하는 세포에 비하여, 보다 강한 시그널이 얻어졌다(도 4, 5). 이어서, 절단 부위보다도 아미노 말단측에서, 또한 변이형 CALR 단백질에 특이적인 배열을 포함하는 펩티드를 면역하여 얻어진 항체를 사용하여 도 4, 5의 해석에 사용한 세포주의 플로 사이토메트리 해석을 행하면, FLAG 태그의 부가 위치에 의한 검출량의 차이가 소실하였다(도 6, 7). 이에 따라, 변이형 CALR 단백질에 특이적인 배열 중에서 절단되어 잔존하는 카르복실 말단측에 항원 인식 부위를 설정하는 것이, 보다 고감도인 검사약 혹은, 보다 강력한 치료약의 창작에 중요하다는 것이 나타났다.
실제로, 절단 부위보다도 아미노 말단측의 변이형 CALR 특이적 항체를 사용하여, CALR 유전자 변이 양성의 환자로부터 얻어진 말초혈 단핵구나 혈소판의 세포 추출액을 면역블로트법을 사용하여 해석했더니, 세포주의 경우와 마찬가지로, 절단된 변이형 CALR 단백질의 발현이 확인되었다(도 8). 이러한 점에서, 실제로, 환자 세포에서도, 동일한 절단이 발생하고 있다는 것, 절단되어 잔존하는 카르복실 말단측에 항원 인식 부위를 설정하는 것이, 보다 고감도인 검사약 혹은, 보다 강력한 치료약의 창작에 중요하다는 것이 나타났다.
[시험예 2]
(1) 3종의 항체가, 전장형과 절단형의 변이형 CALR 단백질을 인식하는 것의 확인
아미노 말단의 시그널 서열 하류에 FLAG 태그를 삽입한 Del 52형 혹은 Ins 5형의 변이형 CALR 단백질을 발현하는 UT-7/TPO 세포를 배양하고, 분비된 변이형 CALR 단백질을 포함하는 배양 상청을 원심 분리(1,600g×5분, 4℃)에 의해 조제하였다. 얻어진 배양 상청을 SDS와 환원제 존재 하에서 가열 처리한 후, SDS 폴리아크릴아미드 전기 영동법에 의해 겔 위로 전개한 후, 폴리비닐리덴 디플루오리드(PVDF)막에 전기적으로 전사하고, 5% 스킴 밀크를 포함하는 TBS-T 용액과 실온에서 1시간 반응시키고 나서, 래트 클론 B3, C6, G1 항체, 혹은 마우스 항 DYKDDDDK tag 항체(후지 필름 와코준야쿠사 Cat#014-22383)을 포함하는 5% BSA/TBS-T 용액과 4℃에서 밤새 반응시켰다. TBS-T 용액에 의한 세정을 행한 후, 각각, 퍼옥시다아제 표지된 염소 항래트 IgG 항체(Jackson Immuno Research Inc.사 Cat#112-035-003), 혹은 퍼옥시다아제 표지된 염소 항마우스 IgG 항체(Jackson Immuno Research Inc.사 Cat#115-035-003)를 포함하는 5% 스킴 밀크/TBS-T 용액과 실온에서 1시간 반응을 행하였다. PVDF막을 TBS-T 용액으로 세정한 후에, 퍼옥시다아제 발광 시약과 반응시켜 얻어진 시그널을, FUSION 촬상 장치를 사용하여 검출하였다.
그 결과, 도 9에 도시하는 바와 같이, 클론 B3, C6, G1 항체 모두 전장형과 절단형의 변이형 CALR 단백질을 인식한다는 것이 확인되었다.
(2) 3종의 항체가, 세포 표면의 변이형 CALR 단백질을 인식하는 것의 확인
아미노 말단의 시그널 서열 하류에 FLAG 태그로 표지한 Del 52형 혹은 Ins 5형의 변이형 CALR 단백질을, UT-7/TPO 세포에서 발현시키고, 소 태아 비동화 혈청 10%를 포함하는 IMDM 배지를 사용하여, 5% CO2 존재 하에서 37℃에서 배양하였다. 증식기의 세포 1×105개를 PBS로 세정 후에 2% FBS/PBS 용액 중에서, 마우스 항 DYKDDDDK tag 항체(후지 필름 와코준야쿠사 Cat#014-22383) 혹은, 래트 클론 B3, C6, G1 항체와, 빙상에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 2% FBS/PBS 용액을 사용하여 세포를 세정한 후, 2차 항체로서 각각 항마우스 IgG-Alexa Fluor647(Thermo Fisher Scientific사 Cat#A21235)과 항래트 IgG-Alexa Fluor 647(Thermo Fisher Scientific사 Cat#A21247)을 2% FBS/PBS 용액 중에 있어서 빙상에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료 후에 원심에 의해 회수한 세포에, 4% 파라포름알데히드를 포함하는 PBS 용액을, 빙상에서 15분 반응시켰다. 마지막으로, 2% FBS/PBS 용액을 첨가하고 나서, 원심 분리(400g×5분, 4℃)하고, 상청을 폐기함으로써 세포를 세정하고, 2% FBS/PBS 용액을 300μL 첨가하고, FACS Calibur(BD biosciences사제)를 사용하여 플로 사이토메트리 해석에 의해 시그널을 정량하였다.
그 결과, 도 10에 도시하는 바와 같이, 클론 B3, C6, G1 항체 모두, 세포 표면의 변이형 CALR 단백질을 인식한다는 것이 확인되었다.
[시험예 3]
(항체의 항원 결합력의 평가)
(1) ELISA에 의한 항원 결합력의 평가
1웰당 정제한 100ng의 Del 52형의 변이형 CALR 단백질, 혹은 컨트롤의 BSA를 흡착시킨 ELISA 플레이트(스미토모 베이크라이트 Cat#MS-8896F)를, 5mg/mL BSA를 포함하는 PBS로 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS로 웰을 세정한 후, 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800ng/mL의 클론 B3, C6, G1 항체, 혹은 래트 IgG(Santa Cruz 사 Cat#2026)과 5mg/mL BSA를 포함하는 PBS를, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS로 웰을 세정한 후, 16ng/mL의 퍼옥시다아제 표지된 염소 항래트 IgG 항체(Jackson Immuno Research Inc.사 Cat#112-035-003)과 5mg/mL BSA를 포함하는 PBS를, 실온에서 1시간 반응시켰다. TBS-T 용액으로 웰을 세정한 후, TMB 용액(나카라이테스크 Cat#05298-80)을 첨가하고, 실온에서 15분간 반응시키고 나서, 1M 황산 수용액을 첨가하여 450nm과 620nm의 흡광도를 측정하고, 흡광도의 차이를 구한 후, 컨트롤의 BSA에서 얻어진 값을 뺀 값을 산출하였다.
그 결과, 도 11에 도시한 바와 같이, 본 발명의 항체(B3, C6, G1)는, 모두 변이형 CALR 단백질과 저농도로부터 결합한다는 것을 알 수 있다.
(2) 표면 플라스몬 공명 해석에 의한 항원 결합력의 평가
표면 플라스몬 공명 해석 장치 Biacore T200(GE 헬스케어사)에 표면 플라스몬 공명 해석용의 센서 칩(GE 헬스케어사 Cat#BR100530)을 장전하고 나서, HBS-EP 버퍼(GE 헬스케어사 Cat#BR100669)로 평형화하였다. Acetate 5.5(GE 헬스케어사 Cat#BR100352)로 10μg/mL의 농도로 조제한 클론 B3 항체를, Amine coupling kit(GE 헬스케어사 Cat#BR100050)을 사용하여, 고정화량이 200RU가 되도록 고정화하였다. 계속해서, HBS-EP 버퍼에 의해 20, 10, 5, 2.5, 1.25nM의 농도로 조제한, 서열 번호 1에 포함되는 아미노산 서열(RRMMRTKMR)의 아미노 말단에 시스테인을 부가한 펩티드를 사용하여 표면 플라스몬 공명을 측정하고, BiacoreT200 Evaluation Software에 의해 해리 상수를 취득하였다.
그 결과, 도 12에 도시하는 바와 같이, 본 발명의 항체는, 변이형 CALR 단백질과 강력하게 결합한다는 것을 알 수 있다.
[시험예 4]
(항체의 항원 인식 부위의 동정)
클론 B3, C6, G1 항체가 CALR 변이 단백질 상에서 항원에 사용한 아미노산 서열을 인식하는 것을 확인하였다. 항원에 사용한 아미노산과 그 주변의 아미노산을 1개씩 알라닌으로 치환한 변이형 CALR 단백질에 대한 각각의 항체의 반응성을 면역블로트법(도 13A)과 ELISA법(도 13B)을 사용하여 평가하였다.
(1) 면역블로트법
Del 52형의 변이형 CALR 단백질에 367번째의 트레오닌(T)으로부터 378번째의 아르기닌(R)까지의 영역의 아미노산을, 1 아미노산씩 알라닌(A)으로 치환한 단백질, 혹은 치환을 행하지 않은 단백질을 HEK293T 세포 내에서 발현시켜, 분비된 변이형 CALR 단백질을 포함하는 배양 상청을 원심 분리(1,600g×5분, 4℃)에 의해 조제하였다. 얻어진 단백질 용액을, SDS와 환원제 존재 하에서 가열 처리한 후, SDS 폴리아크릴아미드 전기 영동법에 의해 겔 위로 전개한 후, PVDF막에 전기적으로 전사하고, 5% 스킴 밀크를 포함하는 TBS-T 용액과 실온에서 1시간 반응시키고 나서, 퍼옥시다아제 표지한 클론 B3, C6, G1 항체 혹은, 마우스 항CALR 항체(abcam 사 Cat#ab22683)을 포함하는 5% BSA/TBS-T 용액과 4℃에서 밤새 반응시켰다. 마우스 항CALR 항체와 반응시킨 PVDF막은, TBS-T 용액에 의한 세정을 행한 후, 퍼옥시다아제 표지된 항마우스 IgG 항체(Jackson Immuno Research Inc.사 Cat#115-035-003)를 포함하는 5% 스킴 밀크/TBS-T 용액 중에 있어서, 실온에서 1시간 반응을 행하였다. 계속해서, 모든 PVDF막을 TBS-T 용액으로 세정한 후에, 퍼옥시다아제 발광 시약(Thermo Fisher Scientific사 Cat#34094)과 반응시켜 얻어진 시그널을, FUSION 촬상 장치(Vilber-Lourmat 사제)를 사용하여 검출하였다.
그 결과, 도 13A에 도시하는 바와 같이, 본 발명의 항체가, 서열 번호 1에 1번째의 아르기닌에서 9번째의 아르기닌 사이를 인식하고 있다는 것을 알 수 있다.
(2) ELISA법
상기의 방법으로 조제한 변이형 CALR 단백질을 흡착시킨 ELISA 플레이트를, 5mg/mL BSA를 포함하는 PBS로 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS로 웰을 세정한 후, 200ng/mL의 클론 B3, C6, G1 항체, 혹은 마우스 항CALR 항체(Santa Cruz 사 Cat#sc-373863)과 5mg/mL BSA를 포함하는 PBS를, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS로 웰을 세정한 후, 16ng/mL의 퍼옥시다아제 표지된 염소 항래트 IgG 항체(Jackson Immuno Research Inc.사 Cat#112-035-003) 혹은 염소 항마우스 IgG 항체(Santa Cruz사 Cat#sc-2005)와 5mg/mL BSA를 포함하는 PBS를, 실온에서 1시간 반응시켰다. TBS-T 용액으로 웰을 세정한 후, TMB 용액을 첨가하여 실온에서 15 분간 반응시키고 나서, 1M 황산 수용액을 첨가하고, 450nm과 620nm의 흡광도를 측정하여 흡광도의 차이를 구하였다.
그 결과, 도 13B에 도시하는 바와 같이, 본 발명의 항체가, 서열 번호 1에 1번째의 아르기닌에서 9번째의 아르기닌 사이를 인식하고 있다는 것을 알 수 있다.
[시험예 5]
(본 발명 항체의 배열 정보의 결정)
본 발명의 항체(B3, C6, G1)의 중쇄 및 경쇄의 배열 정보를, 항체를 산생하는 세포로부터, PureLinc RNA Mini 키트(ThermoFisher사 Cat#12183025)을 사용하여 mRNA를 조제하였다. 얻어진 mRNA를 주형으로, 중쇄 혹은 경쇄 특이적인 역전사 프라이머를 사용하여 Rapid amplification of cDNA ends법에 의해 CDNA를 합성한 후, 플라스미드에 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드를 생어 시퀀스 해석함으로써, 중쇄와 경쇄의 cDNA의 전장 배열을 결정하였다.
그 결과를, 도 14 내지 도 17 및 서열 번호 5 내지 34에 나타낸다.
도 14는, 본 발명 항체(B3, C6, G1)의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 15는, 본 발명 항체(B3, C6, G1)의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 16은, 본 발명 항체(B3, C6, G1)의 중쇄 가변 영역의 염기 서열을 나타낸다. 도 17은, 본 발명 항체(B3, C6, G1)의 경쇄 가변 영역의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 5는, B3 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 6은, C6 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 7은, G1 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 8은, B3 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 9은, C6 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 10은, G1 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 11은, B3 항체의 중쇄 가변 영역의 염기 서열을 나타낸다. 서열 번호 12는, C6 항체의 중쇄 가변 영역의 염기 서열을 나타낸다. 서열 번호 13은, G1 항체의 중쇄 가변 영역의 염기 서열을 나타낸다. 서열 번호 14는, B3 항체의 경쇄 가변 영역의 염기 서열을 나타낸다. 서열 번호 15는, C6 항체의 경쇄 가변 영역의 염기 서열을 나타낸다. 서열 번호 16은, G1 항체의 경쇄 가변 영역의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 17은, B3 항체 VH의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 18은, B3 항체 VH의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 19는, B3 항체 VH의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 20은, C6 항체 VH의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 21은, C6 항체 VH의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 22는, C6 항체 VH의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 23은, G1 항체 VH의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 24는, G1 항체 VH의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 25는, G1 항체 VH의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 26은, B3 항체 VL의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 27은, B3 항체 VL의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 28은, B3 항체 VL의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 29는, C6 항체 VL의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 30은, C6 항체 VL의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 31은, C6 항체 VL의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 32는, G1항체 VL의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 33은, G1 항체 VL의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호 34는, G1 항체 VL의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
[시험예 6]
(치료 효과의 평가)
클론 B3 항체의 중쇄와 경쇄의 가변 영역과, 대응하는 마우스 IgG2a의 중쇄와 경쇄의 정상 영역을 융합한 키메라 B3 항체를 제작하고, Del 52형의 CALR 변이 유전자를 발현하는 조혈 줄기 세포를 이식하여 만들어 낸 골수 증식성 종양 모델 마우스에 투여하여 키메라 항체에 의한 치료 효과를 평가하였다.
클론 B3 항체의 중쇄 가변 영역과 마우스 IgG2a의 정상 영역을 코드하는 유전자 배열 혹은, 클론 B3 항체의 경쇄 가변 영역과 마우스 면역 글로불린κ의 정상 영역을 코드하는 유전자 배열을 연결하고, B3 마우스 키메라 중쇄와 경쇄 유전자를 조합한 발현 벡터를, ExpiCHO-S 세포(ThermoFisher사 Cat#A29127)에 도입하고, ExpiCHO Expression 배지(ThermoFisher사 Cat#A2910001)를 사용하여, 5% CO2 존재 하에서 37℃에서, 10일 배양하였다. 원심 분리 (4,000g×30분, 4℃)에 의해 배양 상청을 회수하고 나서, HiTrap ProteinG HP 칼럼(GE 헬스케어사 Cat#29048581)에 키메라 항체를 흡착시킨 후, 0.1M Glycine-HCI(pH 2.7)을 사용하여 용출하고, 1M Tris-HCI(pH 9.0)에 의해 중화한 용출 분획을, PBS에 투석하여 B3 마우스 키메라 항체를 조제하였다.
B3 마우스 키메라 항체에 의한 치료 효과의 평가에는, 골수 이식 모델 마우스를 사용하였다. 8 내지 10주령의 B6.CD45.1 유사유전자형 마우스(산쿄 연구소)의 대퇴골로부터 골수 세포를 정제하고, APC 표지 항c-kit 항체로 표지되는 c-kit 양성 세포를 분취하고 나서, Ter119, CD4, CD8, Gr-1, CD45R, CD3e, CD1lb 음성으로, CD117과 Scal 양성의 LSK 세포를 분취하고, Del 52형의 변이형 CALR 유전자를 발현하는 pMSCV-IRES-GFP 벡터, 혹은 컨트롤의 벡터를 포함하는 레트로바이러스를 감염시켰다. 감염 72시간 후에, 1마리당 4000개의 LSK 세포를, 6 글레이 x2회의 방사선을 조사한 8 내지 10주령의 C57BL/6J 마우스(오리엔탈 효모)에게 이식하고, 말초혈 중의 혈소판 수를 다항목 자동 혈구 계수 장치(시스멕스사 Cat#pocH-1001V Diff)에 의해 경시적으로 측정하고, 이식 2개월째에, 변이형 CALR 유전자의 발현에 의해 야기되는 골수 증식성 종양의 표현형인 혈소판증다를 확인하고 나서, 이식 후 9주째부터 매주, 상기의 B3 마우스 키메라 항체를 1마리당 250μg, 혹은 용매(PBS)를 투여하여 B3 마우스 키메라 항체에 특이적인 혈소판증다의 억제 효과를 평가하였다.
그 결과, 도 18에 도시하는 바와 같이, 본 발명 항체는, MPN에 대하여 우수한 치료 효과를 나타냈다.
<110> JUNTENDO EDUCATIONAL FOUNDATION
<120> Antibodies that bind to cleaved form of mutant calreticulin for
the diagnosis, prevention, and therapy against myeloproliferative
neoplasms
<130> JUSM0023
<150> JP 2019-036119
<151> 2019-02-28
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Arg Arg Met Met Arg Thr Lys Met Arg Met Arg Arg Met
1 5 10
<210> 2
<211> 417
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val
1 5 10 15
Ala Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Gly
20 25 30
Trp Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys
35 40 45
Phe Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp Lys
50 55 60
Gly Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ser
65 70 75 80
Phe Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr
85 90 95
Val Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu
100 105 110
Phe Pro Asn Ser Leu Asp Gln Thr Asp Met His Gly Asp Ser Glu Tyr
115 120 125
Asn Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val
130 135 140
His Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys Asp
145 150 155 160
Ile Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val
165 170 175
Arg Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val Glu
180 185 190
Ser Gly Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys Ile
195 200 205
Lys Asp Pro Asp Ala Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala Lys
210 215 220
Ile Asp Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro Glu
225 230 235 240
His Ile Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Glu
245 250 255
Met Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys
260 265 270
Gly Glu Trp Lys Pro Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp Tyr Lys Gly Thr
275 280 285
Trp Ile His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Ser Pro Asp Pro Ser
290 295 300
Ile Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe Gly Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp Gln
305 310 315 320
Val Lys Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Phe Leu Ile Thr Asn Asp Glu
325 330 335
Ala Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys Ala
340 345 350
Ala Glu Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Leu Lys
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Ala Glu Asp
370 375 380
Lys Glu Asp Asp Glu Asp Lys Asp Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp
385 390 395 400
Lys Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Val Pro Gly Gln Ala Lys Asp Glu
405 410 415
Leu
<210> 3
<211> 411
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val
1 5 10 15
Ala Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Gly
20 25 30
Trp Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys
35 40 45
Phe Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp Lys
50 55 60
Gly Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ser
65 70 75 80
Phe Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr
85 90 95
Val Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu
100 105 110
Phe Pro Asn Ser Leu Asp Gln Thr Asp Met His Gly Asp Ser Glu Tyr
115 120 125
Asn Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val
130 135 140
His Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys Asp
145 150 155 160
Ile Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val
165 170 175
Arg Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val Glu
180 185 190
Ser Gly Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys Ile
195 200 205
Lys Asp Pro Asp Ala Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala Lys
210 215 220
Ile Asp Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro Glu
225 230 235 240
His Ile Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Glu
245 250 255
Met Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys
260 265 270
Gly Glu Trp Lys Pro Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp Tyr Lys Gly Thr
275 280 285
Trp Ile His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Ser Pro Asp Pro Ser
290 295 300
Ile Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe Gly Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp Gln
305 310 315 320
Val Lys Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Phe Leu Ile Thr Asn Asp Glu
325 330 335
Ala Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys Ala
340 345 350
Ala Glu Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Thr Arg
355 360 365
Arg Met Met Arg Thr Lys Met Arg Met Arg Arg Met Arg Arg Thr Arg
370 375 380
Arg Lys Met Arg Arg Lys Met Ser Pro Ala Arg Pro Arg Thr Ser Cys
385 390 395 400
Arg Glu Ala Cys Leu Gln Gly Trp Thr Glu Ala
405 410
<210> 4
<211> 430
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val
1 5 10 15
Ala Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Gly
20 25 30
Trp Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys
35 40 45
Phe Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp Lys
50 55 60
Gly Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ser
65 70 75 80
Phe Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr
85 90 95
Val Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu
100 105 110
Phe Pro Asn Ser Leu Asp Gln Thr Asp Met His Gly Asp Ser Glu Tyr
115 120 125
Asn Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val
130 135 140
His Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys Asp
145 150 155 160
Ile Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val
165 170 175
Arg Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val Glu
180 185 190
Ser Gly Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys Ile
195 200 205
Lys Asp Pro Asp Ala Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala Lys
210 215 220
Ile Asp Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro Glu
225 230 235 240
His Ile Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Glu
245 250 255
Met Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys
260 265 270
Gly Glu Trp Lys Pro Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp Tyr Lys Gly Thr
275 280 285
Trp Ile His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Ser Pro Asp Pro Ser
290 295 300
Ile Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe Gly Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp Gln
305 310 315 320
Val Lys Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Phe Leu Ile Thr Asn Asp Glu
325 330 335
Ala Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys Ala
340 345 350
Ala Glu Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Leu Lys
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Ala Glu Asp
370 375 380
Asn Cys Arg Arg Met Met Arg Thr Lys Met Arg Met Arg Arg Met Arg
385 390 395 400
Arg Thr Arg Arg Lys Met Arg Arg Lys Met Ser Pro Ala Arg Pro Arg
405 410 415
Thr Ser Cys Arg Glu Ala Cys Leu Gln Gly Trp Thr Glu Ala
420 425 430
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn
20 25 30
Phe Ile His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asn Tyr Asn Tyr Glu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Val Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 121
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Phe Val His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asp Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn His Lys Phe
50 55 60
Asn Gly Lys Ser Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asn Tyr Tyr Asp Gly Arg Glu Val Met Asp Ala Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Phe Val His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asp Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asn Tyr Tyr Asp Gly Arg Glu Val Met Asp Ala Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Asn Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Gly Met Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Ser Lys Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Asn
100 105
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 9
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Thr Leu Ser Ala Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Glu Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ser Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Thr His Gly Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 10
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Thr Leu Ser Ala Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Glu Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Cys
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ser Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Gly Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 357
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 11
caggtacagc tgcagcaatc tggggctgaa ctggtgaagc ctgggtcctc agtgaaaatt 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc cgtaacttta tacactggat aaaacagcag 120
cctggaaatg gccttgagtg gattgggtgg atttttcctg gagatggtga tacagagtac 180
aatcaaaagt tcaatgggaa ggcaacactc actgcagaca aatcgtccag cacagcctat 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagaggaaat 300
tacaactacg agtactttga ttactggggc caaggagtca tggtcacagt ctcctca 357
<210> 12
<211> 363
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 12
caggtacagc tgcagcaatc tggggctgaa ctggtgaagc ctgggtcctc agtgaaaatt 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agttactttg tgcactggat aaaacagcag 120
cctggagatg gccttgagtg gattgggtgg atttatcctg gagatggtga tacagagtac 180
aatcacaagt tcaatgggaa gtcaacactc actgcagaca gatcctccag tacagcctat 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagggaat 300
tactatgatg gtcgggaagt tatggatgcc tggggtcaag gagcttcagt cactgtctcc 360
tca 363
<210> 13
<211> 363
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 13
caggtacagc tgcagcaatc tggggctgaa ctggtgaagc ctgggtcctc agtgaaaatt 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agttactttg tgcactggat aaaacagcag 120
cctggagatg gccttgagtg gattgggtgg atttatcctg gagatggtga tacagagtac 180
aatcaaaagt tcaatgggaa ggcaacactc actgcagaca gatcctccag tacagcctat 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagggaat 300
tactatgatg gtcgggaagt tatggatgcc tggggtcaag gagcttcagt cactgtctcc 360
tca 363
<210> 14
<211> 321
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 14
gacatccaga tgacacagtc tccggcttcc ctgtctgcat ctctgggaga aactgtctcc 60
atcgagtgtc tagcaagtga ggacatttac agttatttag catggtatca acagaagcca 120
gggaaatctc ctcagctcct gatctttgct gcaaataggt tgcaagatgg ggtcccatca 180
cggttcagtg gcagtggatc tggcacacag ttttctctca agatcagcgg catgcaacct 240
gaagatgaag gggattattt ctgtctacag ggttccaagt ttccgtacac ctttggacct 300
gggaccaagc tggaactgaa c 321
<210> 15
<211> 336
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 15
gatgttgtgc tgacccagac tccacccact ttatcggcta ccattggaca atcggtctcc 60
atctcttgca ggtcaagtca gagtctctta gatagtgatg gagaaaccta tttaaattgg 120
ttgctacaga ggccaggcca atctccacag cttctaattt attcggtctc caacctggaa 180
tctggggtcc ccaacaggtt cagtggcagt gggtcagaaa cagatttcac actcaaaatc 240
agtggaatgg aggctgaaga tttgggagtt tactactgca tgcaagctac ccatggtccg 300
tacacgtttg gagctgggac caagctggaa ctgaaa 336
<210> 16
<211> 336
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 16
gatgttgtgc tgacccagac tccacccact ttatcggcta ccattggaca atcggtctcc 60
atctcttgca ggtcaagtca gagtctctta gatagtgatg gagaaaccta tttaaattgg 120
ttgctacaga ggccaggcca atgtccacag cttctaattt attcggtatc caacctggaa 180
tctggggtcc ccaacaggtt cagtggcagt gggtcagaaa cagatttcac actcaaaatc 240
agtggagtgg aggctgaaga tttgggagtt tactactgca tgcaaggtac ccatggtccg 300
tacacgtttg gagctgggac caagctggaa ctgaaa 336
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 17
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn Phe Ile His
1 5 10
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 18
Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Asn
1 5 10 15
Gly
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 19
Gly Asn Tyr Asn Tyr Glu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 20
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Val His
1 5 10
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 21
Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn His Lys Phe Asn
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 22
Gly Asn Tyr Tyr Asp Gly Arg Glu Val Met Asp Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 23
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Val His
1 5 10
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 24
Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Asn
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 25
Gly Asn Tyr Tyr Asp Gly Arg Glu Val Met Asp Ala
1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 26
Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 27
Ala Ala Asn Arg Leu Gln Asp
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 28
Leu Gln Gly Ser Lys Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 29
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 30
Ser Val Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 31
Met Gln Ala Thr His Gly Pro Tyr Thr
1 5
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 32
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 33
Ser Val Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 34
Met Gln Gly Thr His Gly Pro Tyr Thr
1 5
Claims (14)
- (a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드쇄, 또는 (b) 서열 번호 1에서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드쇄 중에 항원 인식 부위를 갖는, 절단 후의 변이형 CALR 단백질에 결합하는 항체 또는 그 기능적 단편.
- 제1항에 있어서, 다음 (c), (d) 및 (e)로부터 선택되는, 절단 후의 변이형 CALR 단백질에 결합하는 항체 또는 그 기능적 단편:
(c) 면역 글로불린 VH쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 17, 18 및 19로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 17, 18 및 19로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또한, 면역 글로불린 VL쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 26, 27 및 28로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 26, 27 및 28로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인 항체,
(d) 면역 글로불린 VH쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 20, 21 및 22로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 20, 21 및 22로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또한, 면역 글로불린 VL쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 29, 30 및 31로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 29, 30 및 31로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인 항체,
(e) 면역 글로불린 VH쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 23, 24 및 25로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 23, 24 및 25로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또한, 면역 글로불린 VL쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3이, 각각 서열 번호 32, 33 및 34로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 32, 33 및 34로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인 항체. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 다음 (C), (D) 및 (E)로부터 선택되는, 절단 후의 변이형 CALR 단백질에 결합하는 항체 또는 그 기능적 단편:
(C) 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VH쇄, 및 서열 번호 8로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 8로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VL쇄를 갖는 항체,
(D) 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VH쇄, 및 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VL쇄를 갖는 항체,
(E) 서열 번호 7로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 7로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VH쇄, 및 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 면역 글로불린 VL쇄를 갖는 항체. - 절단형의 변이형 CALR 단백질 중의 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열 부분에의 결합에 있어서 제2항 또는 제3항에 기재된 항체와 경합하는 항체 또는 그 기능적 단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 기능적 단편을 함유하는 의약 조성물.
- 제5항에 있어서, 골수 증식성 종양의 진단, 예방 또는 치료약인 의약 조성물.
- 생체 시료 중의 다음 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 검출하는 것을 특징으로 하는 변이형 CALR 단백질의 검출 방법:
(a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,
(b) 서열 번호 1에서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드. - 제7항에 있어서, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 검출이, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 기능적 단편을 사용하는 면역학적 검출인 변이형 CALR 단백질의 검출 방법.
- 다음 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 인식하는 약물을 스크리닝하는 것을 특징으로 하는 골수 증식성 종양 치료약의 스크리닝 방법:
(a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,
(b) 서열 번호 1에서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드. - 생체 시료 중의 다음 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 검출하는 것을 특징으로 하는 골수 증식성 종양의 진단 방법:
(a) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,
(b) 서열 번호 1에서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드. - 제10항에 있어서, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 검출이, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항 기재된 항체 또는 그 기능적 단편을 사용하는 면역학적 검출인 진단 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항 기재된 항체 또는 그 기능적 단편을 투여하는 것을 특징으로 하는 골수 증식성 종양의 예방 또는 치료 방법.
- 골수 증식성 종양의 진단에 사용하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항 기재된 항체 또는 그 기능적 단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항 기재된 항체 또는 그 기능적 단편의, 골수 증식성 종양 진단약 제조를 위한 사용.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019036119 | 2019-02-28 | ||
| JPJP-P-2019-036119 | 2019-02-28 | ||
| PCT/JP2020/008434 WO2020175689A1 (ja) | 2019-02-28 | 2020-02-28 | 切断型の変異型Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎに結合する抗体、及び骨髄増殖性腫瘍の診断、予防又は治療薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210134705A true KR20210134705A (ko) | 2021-11-10 |
Family
ID=72239809
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020217031154A KR20210134705A (ko) | 2019-02-28 | 2020-02-28 | 절단형의 변이형 Calreticulin에 결합하는 항체, 및 골수 증식성 종양의 진단, 예방 또는 치료약 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220098290A1 (ko) |
| EP (1) | EP3932952A4 (ko) |
| JP (1) | JPWO2020175689A1 (ko) |
| KR (1) | KR20210134705A (ko) |
| CN (1) | CN113508140A (ko) |
| AU (1) | AU2020227989A1 (ko) |
| BR (1) | BR112021016619A2 (ko) |
| CA (1) | CA3130909A1 (ko) |
| IL (1) | IL285267A (ko) |
| MA (1) | MA55090A (ko) |
| MX (1) | MX2021010404A (ko) |
| SG (1) | SG11202108494YA (ko) |
| WO (1) | WO2020175689A1 (ko) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2021331170A1 (en) * | 2020-08-27 | 2023-03-23 | Juntendo Educational Foundation | Anti-cleaved mutant calr-cd3 bispecific antibody and pharmaceutical composition |
| CN114395037B (zh) * | 2021-11-03 | 2023-01-17 | 深圳市人民医院 | 靶向钙网蛋白的纳米抗体及其应用 |
| US20230272055A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-08-31 | Incyte Corporation | Anti-mutant calreticulin (calr) antibodies and uses thereof |
| WO2023108201A1 (en) * | 2021-12-13 | 2023-06-22 | Central Adelaide Local Health Network Inc | Antibodies to mutant calreticulin and uses thereof |
| TW202342097A (zh) * | 2022-02-25 | 2023-11-01 | 學校法人順天堂 | 抗突變calr抗體與其他藥劑組合而成之醫藥 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016087514A1 (en) | 2014-12-02 | 2016-06-09 | Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh | Anti-mutant calreticulin antibodies and their use in the diagnosis and therapy of myeloid malignancies |
| JP2016537012A (ja) | 2013-09-16 | 2016-12-01 | ツェーエムエム−フォルシュングスツェントルム フュア モレクラレ メディツィン ゲーエムベーハー | 骨髄性悪性腫瘍の診断のための突然変異体カルレチクリン |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58201994A (ja) | 1982-05-21 | 1983-11-25 | Hideaki Hagiwara | 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法 |
| GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
| GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
| CA2109602C (en) | 1990-07-10 | 2002-10-01 | Gregory P. Winter | Methods for producing members of specific binding pairs |
| EP0546073B1 (en) | 1990-08-29 | 1997-09-10 | GenPharm International, Inc. | production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| EP0605522B1 (en) | 1991-09-23 | 1999-06-23 | Medical Research Council | Methods for the production of humanized antibodies |
| DE69233782D1 (de) | 1991-12-02 | 2010-05-20 | Medical Res Council | Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken |
| AU3328493A (en) | 1991-12-17 | 1993-07-19 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| EP0656941B1 (en) | 1992-03-24 | 2005-06-01 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
| AU675661B2 (en) | 1992-07-24 | 1997-02-13 | Abgenix, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
| JPH08509612A (ja) | 1993-04-26 | 1996-10-15 | ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド | 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物 |
| GB9313509D0 (en) | 1993-06-30 | 1993-08-11 | Medical Res Council | Chemisynthetic libraries |
| EP0731842A1 (en) | 1993-12-03 | 1996-09-18 | Medical Research Council | Recombinant binding proteins and peptides |
| WO1996002576A1 (fr) | 1994-07-13 | 1996-02-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anticorps humain reconstitue contre l'interleukine-8 humaine |
| EP1978033A3 (en) | 1995-04-27 | 2008-12-24 | Amgen Fremont Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
| CA2219486A1 (en) | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
| EP3029060A1 (en) * | 2014-12-01 | 2016-06-08 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Genetically modified higher plants with increased photosynthesis and/or biomass production, methods and uses thereof |
| JP2017062127A (ja) * | 2015-09-24 | 2017-03-30 | 学校法人順天堂 | 骨髄増殖性腫瘍予防又は治療薬のスクリーニング方法 |
-
2020
- 2020-02-28 CN CN202080017462.8A patent/CN113508140A/zh active Pending
- 2020-02-28 CA CA3130909A patent/CA3130909A1/en active Pending
- 2020-02-28 MX MX2021010404A patent/MX2021010404A/es unknown
- 2020-02-28 JP JP2021502656A patent/JPWO2020175689A1/ja active Pending
- 2020-02-28 WO PCT/JP2020/008434 patent/WO2020175689A1/ja unknown
- 2020-02-28 AU AU2020227989A patent/AU2020227989A1/en active Pending
- 2020-02-28 SG SG11202108494YA patent/SG11202108494YA/en unknown
- 2020-02-28 US US17/434,619 patent/US20220098290A1/en active Pending
- 2020-02-28 MA MA055090A patent/MA55090A/fr unknown
- 2020-02-28 BR BR112021016619A patent/BR112021016619A2/pt unknown
- 2020-02-28 KR KR1020217031154A patent/KR20210134705A/ko unknown
- 2020-02-28 EP EP20763555.8A patent/EP3932952A4/en active Pending
-
2021
- 2021-08-01 IL IL285267A patent/IL285267A/en unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016537012A (ja) | 2013-09-16 | 2016-12-01 | ツェーエムエム−フォルシュングスツェントルム フュア モレクラレ メディツィン ゲーエムベーハー | 骨髄性悪性腫瘍の診断のための突然変異体カルレチクリン |
| WO2016087514A1 (en) | 2014-12-02 | 2016-06-09 | Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh | Anti-mutant calreticulin antibodies and their use in the diagnosis and therapy of myeloid malignancies |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Araki M, Yang Y, Masubuchi N, et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. 2016; 127: 1307-16. |
| Elf S, Abdelfattah NS, Chen E, et al. Mutant Calreticulin Requires Both Its Mutant C-terminus and the Thrombopoietin Receptor for Oncogenic Transformation. Cancer Discov. 2016; 6: 368-81. |
| Klampfl T, Gisslinger H, Harutyunyan AS, et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. The New England journal of medicine. 2013; 369: 2379-90. |
| Marty C, Pecquet C, Nivarthi H, et al. Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. Blood. 2016; 127: 1317-24. |
| Nangalia J, Massie CE, Baxter EJ, et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. The New England journal of medicine. 2013; 369: 2391-405. |
| Vainchenker W, Kralovics R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 2017; 129: 667-79. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3932952A1 (en) | 2022-01-05 |
| US20220098290A1 (en) | 2022-03-31 |
| EP3932952A4 (en) | 2022-11-30 |
| CN113508140A (zh) | 2021-10-15 |
| WO2020175689A1 (ja) | 2020-09-03 |
| IL285267A (en) | 2021-09-30 |
| MX2021010404A (es) | 2021-09-14 |
| AU2020227989A1 (en) | 2021-09-09 |
| SG11202108494YA (en) | 2021-09-29 |
| CA3130909A1 (en) | 2020-09-03 |
| BR112021016619A2 (pt) | 2021-11-03 |
| JPWO2020175689A1 (ko) | 2020-09-03 |
| MA55090A (fr) | 2022-01-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20210134705A (ko) | 절단형의 변이형 Calreticulin에 결합하는 항체, 및 골수 증식성 종양의 진단, 예방 또는 치료약 | |
| CA2367901C (en) | Monoclonal antibodies, antigens and diagnosis and therapy of malignant diseases | |
| AU2013306390B2 (en) | Antibodies and vaccines for use in treating ROR1 cancers and inhibiting metastasis | |
| AU2018274932B2 (en) | Cancer cell-specific antibody, anticancer drug and cancer testing method | |
| KR102017070B1 (ko) | 치료 펩티드 | |
| CN113166257B (zh) | Cd47抗体及其制备方法和应用 | |
| JP2022512954A (ja) | Ｎｋｇ２ａ抗体およびその製造方法と使用 | |
| US20030096285A1 (en) | Identifying anti-tumor targets or agents by lipid raft immunization and proteomics | |
| KR102197478B1 (ko) | 식도암을 검출 및 치료하기 위한 조성물 및 방법 | |
| KR20210094589A (ko) | 항-b7-h3 항체 | |
| CN109988240B (zh) | 抗gpc-3抗体及其用途 | |
| WO2012008494A1 (ja) | 子宮体がんの検査方法、子宮体がんの検査薬、並びに子宮体がん抗原に対する抗体 | |
| JP6909795B2 (ja) | 胃癌の検出および治療のための組成物および方法 | |
| CN110713537A (zh) | 一种sema4d抗体及其制备方法和应用 | |
| JP2022009080A (ja) | 卵巣癌の検出および治療のための組成物および方法 | |
| TWI790992B (zh) | 抗ｔｍｅｍ-１８０抗體、抗癌劑、及癌之檢查方法 | |
| CN115298216A (zh) | 抗体或其抗原结合片段、其制备方法及医药用途 | |
| RU2815960C2 (ru) | Антитела, которые связываются с расщепленной формой мутантного кальретикулина, и средство для диагностики, профилактики или лечения миелопролиферативного новообразования | |
| CN114641307A (zh) | 抗cd19抗体及其用途 | |
| JPWO2018181656A1 (ja) | 抗ｇｐｒ２０抗体 | |
| CN115611984A (zh) | NKp46抗体及其制备方法和应用 | |
| KR20190107967A (ko) | 한국인 위암 연관 유전자 단클론 항체 및 이의 제조방법 | |
| JPWO2018034259A1 (ja) | Ｔｍｅｍ１３２ａに結合する抗体、抗がん剤、およびがんの検査方法 | |
| WO2000052470A1 (fr) | Moyen de diagnostic et de traitement de la leucemie |