CN109988240B

CN109988240B - 抗gpc-3抗体及其用途

Info

Publication number: CN109988240B
Application number: CN201711475705.9A
Authority: CN
Inventors: 周若芸; 刘雪梅; 孙见宇; 郑云程; 高永娟; 王舒舒; 孙乃超; 李强
Original assignee: PHARMAB Inc; Anyuan Pharmaceutical Technology Shanghai Co ltd
Current assignee: Anyuan Pharmaceutical Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN109988240A

Abstract

本发明提供了以高亲和力与GPC‑3糖蛋白特异性结合的单克隆抗体，还提供了编码所述抗体的核酸分子，用于表达所述抗体的表达载体和宿主细胞，以及所述抗体的生产方法。此外，本发明还提供了包含所述抗体的免疫缀合物以及药物组合物，以及所述抗体用于制备诊断GPC‑3高表达肿瘤的试剂用途或制备用于免疫治疗的嵌合抗原受体修饰用途以及制备用于治疗多种疾病(包括癌症)的药物用途。

Description

抗GPC-3抗体及其用途

技术领域

本发明属于治疗性单克隆抗体领域，更具体地，本发明涉及一种针对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)的抗体；还涉及所述抗体在治疗多种疾病(包括但不限于肝细胞癌、黑色素瘤、结直肠癌、卵巢癌等)中的用途。

背景技术

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC-3)，又称DGSX，GTR2-2等，是硫酸乙酰肝素糖蛋白家族成员之一，在研究过度生长综合症(Simpson-Golabi-Behmel Syndrome,SGBS)时被发现(Pilia G等,Nat Genet.,12:241-247,1996)。1996年Lage等人在胃癌细胞系EPG85-257RNOV的cDNA表达文库中分离得到GPC-3基因，1997年Pilia等再次分离了该区段基因并命名为GPC-3。迄今为止，在人体组织中已经分离了6个家族成员(GPC-1,2,3,4,5,6)。

GPC-3基因位于人X染色体上，编码产生70kD的前体核心蛋白。前体核心蛋白被前蛋白转换酶(Furin)酶切后，产生40kD的分泌型氨基端亚单位和30kD具有两条硫酸乙酰肝素(Heparin/Heparan Sulfate,HS)聚糖链的羧基端亚单位。核心蛋白羧基末端(C末端)通过糖磷脂酰肌醇(Glycophosphatidylinositol,GPI)锚定于细胞膜表面，氨基末端(N末端)游离于胞外，可分泌到血液中。

GPC-3与胚胎整体发育有关，在大多数胚胎组织中高表达，是一个细胞增殖的抑制因子。GPC-3缺失可导致SGBS(过度生长综合症)，一种X-染色体连锁遗传病。GPC-3缺陷小鼠显示过度发育生长和一些SGBS的典型异常，同时还增加了发生胚胎性肿瘤(如肾母细胞瘤、神经母细胞瘤)的危险性(Cano-Gauci DF等,JCell Biol.,1146:255-264,1999)。在转基因小鼠中，GPC-3过表达可抑制肝细胞增殖和肝脏再生(Liu B等,Hepatology,52:1060-1067,2010)。

GPC-3也被报道与某些癌症关联，如肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌等，并且在恶性间皮瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢细胞癌等恶性肿瘤中表达沉默。在HCC组织中，无论是GPC-3mRNA还是蛋白均呈过表达趋势，并且在HCC早期即已发生，因此被公认为HCC早期诊断及干预治疗的一个高特异性靶点。

肝癌是世界第五大流行癌症类型，是癌症相关死亡的第三大原因(Bosch FX等,Gastroenterology,127:S5-16,2004；EI-Serag HB等,Gastroenterology,132:2557-76,2007)。HCC是肝癌的主要形式，导致90％的肝癌发生，每年造成约100万人死亡。HCC主要致病因子为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和酒精性肝炎，这三者所导致的肝癌约占人类HCC的80％(Rustgi VK,Gastroenterol Clin North Am.,16:545-551,1987)。此外，肝硬化患者5年以上发生HCC风险约为20％。其次，脂肪性肝病、脂肪性肝炎、肥胖病和糖尿病也是肝癌发生原因之一(Sanyal A等,Curr Med Res Opin.,26:2183-2191,2010；Mittal S等,J ClinGastroenterol,47:S2-6,2013)。目前手术切除是治疗HCC首选，但是临床诊断的原发性肝癌只有10％-20％可以通过手术切除。

多个研究表明，GPC-3在HCC组织中过表达，而在正常组织中不表达或低表达，可作为潜在HCC治疗靶点和早期诊断的生物标记物。GPC-3通过其C末端接近细胞膜区域的两条功能性HS聚糖链，调节多条信号通路，与多种生长因子如成纤维生长因子(FibroblastGrowth Factor,FGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor,IGF)、转化生长因子-β(Transforming Growth Factor beta,TGF-β)、骨形态生成蛋白(Bone MorphogenicProtein,BMP)、Wnts和Hedgehog等结合，介导肝癌的发生发展；通过调节基质金属蛋白酶和尿激酶型纤溶酶原激活物活性而达到水解细胞外基质，导致促进肿瘤侵袭转移。

细胞膜上的部分GPC-3分子可在体内裂解并分泌到血液中，检测游离状态的GPC-3已成为HCC早期诊断的重要手段。目前已有几个抗GPC-3的单抗被开发用于HCC的临床检测，如针对GPC-3羧基端的单抗1G12(Capurro M等,Gastroenterology,125:89-97,2003)和针对GPC-3氨基端的单抗M18D04、M19B11(Hippo Y等,Cancer Res.,64:2418-2423,2004)被用来检测HCC中的GPC-3血清表达水平；还有针对GPC-3氨基端的单抗A1836A和针对GPC-3羧基端的单抗GPC-3-C02(Yamauchi N等,Mod Pathol.,18:1591-1598,2005)已被应用于肿瘤免疫组织化学检测。

抗GPC-3抗体还可通过抑制GPC-3功能抑制肝癌细胞的增殖或转移，也可通过特异性阻断与之相关信号的通路，抑制肿瘤细胞形成。目前已有多个人源化抗GPC-3治疗性单抗正在开发中。例如科济生物和吉凯基因分别处于Ⅰ期和Ⅰ/Ⅱ期(https://www.clinicaltrials.gov/)；贝勒医学院处于临床Ⅰ期(https://www.clinicaltrials.gov/)；Roche的hGC33已完成Ⅱ期临床(https://www.clinicaltrials.gov/)；NIH的YP7抗体和HN3抗体处于临床前研究阶段(Feng M等,Proc Natl Acad Sci USA.,110:E1083-1091,2013)；Medarex的全人源抗体MDX-1414处于临床前研究阶段(Feng M等,FEBS Lett.,588:377-82,2014)。

除以上抗GPC-3抗体在肝癌诊断和治疗中的应用以及与化疗药物索拉菲尼结合使用外，抗GPC-3抗体还可用于抗体与毒素偶联、双特异性抗体、嵌合抗原受体T细胞治疗等。因此，研发人源化、高亲和力的抗GPC-3功能性抗体，为肝癌和其它多种恶性肿瘤患者提供更为精确的诊断及治疗方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对GPC-3具有高亲和力的抗GPC-3单克隆抗体。

一种分离的结合GPC-3的单克隆抗体，其特征在于，包含：

重链可变区，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；和

轻链可变区，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列，且选自下组：

(1)重链可变区包含如SEQ ID NO：1所示的CDR-H1氨基酸序列，和SEQ ID NO：3所示的CDR-H2氨基酸序列，和SEQ ID NO：5所示的CDR-H3氨基酸序列；和其轻链可变区包含如SEQ ID NO：2所示的CDR-L1氨基酸序列，和SEQ ID NO：4所示的CDR-L2氨基酸序列，和SEQID NO：6所示的CDR-L3氨基酸序列；

(2)重链可变区包含如SEQ ID NO：23所示的CDR-H1氨基酸序列，和SEQ ID NO：26所示的CDR-H2氨基酸序列，和SEQ ID NO：31所示的CDR-H3氨基酸序列；和其轻链可变区包含如SEQ ID NO：24所示的CDR-L1氨基酸序列，和SEQ ID NO：29所示的CDR-L2氨基酸序列，和SEQ ID NO：6所示的CDR-L3氨基酸序列；

(3)重链可变区包含SEQ ID NO：23所示的CDR-H1氨基酸序列，和SEQ ID NO：27所示的CDR-H2氨基酸序列，和SEQ ID NO：31所示的CDR-H3氨基酸序列；和轻链可变区包含SEQID NO：25所示的CDR-L1氨基酸序列，和SEQ ID NO：30所示的CDR-L2氨基酸序列，和SEQ IDNO：6所示的CDR-L3氨基酸序列；

(4)重链可变区包含SEQ ID NO：23所示的CDR-H1氨基酸序列，和SEQ ID NO：28所示的CDR-H2氨基酸序列，和SEQ ID NO：31所示的CDR-H3氨基酸序列；和轻链可变区包含SEQID NO：25所示的CDR-L1氨基酸序列，和SEQ ID NO：30所示的CDR-L2氨基酸序列，和SEQ IDNO：6所示的CDR-L3氨基酸序列。

进一步地，包含上述CDR序列的抗体为鼠源的或人源化的。

在一些实施例中，所述抗体为鼠源的，其重链可变区进一步包含鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或其变体的重链FR区；和其轻链可变区包含鼠κ、λ链或其变体的轻链FR区。

较优选地，上述鼠源抗体包含：

(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；和/或

(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

更优选地，本发明的优选实施例中鼠源抗体GPC3#4，其重链可变区包含SEQ IDNO：7所示的氨基酸序列；和其轻链可变区包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述抗体为人源化的。制备人源化抗体可以用CDR移植技术、表面重塑技术、计算机模拟技术或其他现有技术来完成。

本发明的一些实施例中，将上述鼠源抗体GPC3#4通过CDR移植(CDR-grafting)进行人源化改造。由此产生的所述人源化抗体，较优选地，其重链可变区包含选自SEQ IDNOs：9、11、13和17所示的氨基酸序列；和其轻链可变区包含选自SEQ ID NOs：10、12、14和18所示的氨基酸序列。更优选地，由此产生的所述人源化抗体AB13E1、AB13E2、AB13E3和AB13E5，其重链可变区分别包含如SEQ ID NO：9、11、13和17所示的氨基酸序列；和其轻链可变区分别包含如SEQ ID NO：10、12、14和18所示的氨基酸序列。

本发明的一些实施例中，将上述鼠源抗体GPC3#4通过表面重塑技术进行人源化改造。较优选的，由此产生的所述人源化抗体AB13E4，其重链可变区包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；和其轻链可变区包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。

在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明抗体的序列进行替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体的序列可以与其来源序列至少70％同源；更优地，本发明所述变体的序列可以与其来源序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。

本发明的抗体可以为全长抗体，例如，在一些优选的实施方案中，本发明的抗人GPC-3抗体还包含人IgG2或IgG1的重链恒定区和人κ轻链恒定区；或者，所述抗体可以仅包含抗原结合片段，诸如Fab或Fab’2片段，或单链抗体ScFv。

在一个实施例中，所述的抗体结合人GPC-3。具体的，所述的抗体能够阻断人GPC-3和GPC-3抗体之间的相互作用。所述抗体与GPC-3结合的K_D值为≤5×10^-11M，优选的为1×10^-11M或更小的K_D。

本发明另一方面，提供一种编码如上所述抗体的DNA分子。优选的，编码所述抗体重链可变区的DNA分子分别如SEQ ID NO：19和21所示，和编码所述抗体轻链可变区的DNA分子分别如SEQ ID NO：20和22所示。

例如，编码本发明的优选人源化抗体AB13E3重链可变区的DNA分子如SEQ ID NO：19所示，且编码其轻链可变区序列的DNA分子如SEQ ID NO：20所示。

再如，编码本发明另一优选人源化抗体AB13E4重链可变区的DNA分子如SEQ IDNO：21所示，且编码其轻链可变区的DNA分子如SEQ ID NO：22所示。

本发明另一方面，提供了一种表达载体，该载体包含上述DNA分子。

本发明另一方面，提供一种用如上所述表达载体转化的宿主细胞。宿主细胞优选为CHO细胞。

本发明另一方面，提供一种包含与治疗剂缀合的本发明所述抗体的免疫缀合物。所述治疗剂优选为毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。

本发明另一方面，还提供了一种药物组合物，其包含本发明所述抗体以及可药用赋形剂、载体或稀释剂，以及有效量的上述抗体。

本发明又一方面，还提供了制备本发明所述抗体的方法，其包括：(a)在允许产生所述抗体的条件下培养本发明的上述宿主细胞；(b)回收、分离产生的所述抗体。

本发明又一方面，还涉及根据本发明所述结合GPC-3的抗体在制备用于诊断GPC-3高表达肿瘤的试剂用途或制备用于免疫治疗的嵌合抗原受体修饰用途。

本发明再一方面，还涉及根据本发明所述结合GPC-3的抗体、或包含其的药物组合物、或包含其的免疫缀合物在制备用于治疗GPC-3介导的任何疾病的药物用途。

其中，所述的疾病优选为癌症；更优选为高表达GPC-3的癌症；所述的癌症包括但不限于肝细胞癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、肝胚细胞瘤、成神经细胞瘤、肾母细胞瘤、小细胞肺癌、肺腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌，皮肤癌、淋巴癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、食道癌、甲状腺癌、睾丸癌、白血病、恶性间皮瘤、脂肪肉瘤等疾病；最优选为肝细胞癌和黑色素瘤。

优选地，在制备治疗癌症的药物中可以使用人源化的抗GPC-3抗体。

其中，本发明提供的抗体可单独使用或与其他治疗剂或治疗方法联合使用：例如与化疗药物(索拉菲尼)联合使用，用于抗体与毒素偶联物，双特异性抗体，嵌合抗原受体T细胞等。

本发明制备的抗GPC-3人源化抗体亲和力常数K_D值接近1pM，且具有极强的特异性，预期临床给药剂量将大大降低。并且，抗体介导的ADCC实验数据显示，本发明所提供的人源化抗体可以有效杀伤高表达GPC-3的PLC/PRF/5细胞，将能够有效治疗GPC-3介导的任何疾病。此外，本发明所述抗体采用CHO细胞表达，具有产量高、活性高、纯化工艺简单以及生产成本低的优势。

发明详述

缩写和定义

CDR 互补决定区

EC₅₀ 半效应浓度

ELISA 酶联免疫吸附

HS 硫酸乙酰肝素

HRP 辣根过氧化物酶

VH 免疫球蛋白重链可变区

VL 免疫球蛋白轻链可变区

IgG 免疫球蛋白G

K_D 平衡解离常数

Ka 结合速率常数

Kd 解离速率常数

FACS 荧光激活细胞分选

mAb 单克隆抗体

HCAb 重链抗体

IgNAR Ig新抗原受体

PBS 磷酸盐缓冲盐水

IgA 免疫球蛋白A

IgM 免疫球蛋白M

RIA 放射免疫分析

PCR 聚合酶链式反应

LDH 乳酸脱氢酶

TMB 3,3',5,5'-四甲基联苯胺

PBMC 外周血单核细胞

IL-2 白细胞介素2

本发明的术语“抗体”包括完整抗体(例如，IgG1或IgG4)、各种功能性片段(例如可仅包括抗原结合部分，如Fab、F(ab’)2或ScFv或dsFv片段)及其变体(例如人源化、糖基化等)。本发明还包括具有糖基化修饰的抗GPC-3抗体。在一些应用中，进行修饰以除去不期望的糖基化位点，例如在寡糖链上去岩藻糖修饰以增强ADCC(抗体依赖细胞毒性反应)功能；在另一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变CDC(补体依赖细胞毒性反应)作用。

“单克隆抗体(mAb)”指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。mAb或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术，或其他现有技术进行重组得到。

“人源化抗体”指其中来源于另一哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已经被移植到人构架序列上的抗体，可以在人构架序列内进行其他的构架区修饰。

“抗体片段”和“抗原结合片段”是抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(Parental Antibody)的抗原结合区或可变区。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当用摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗体片段包括但不限于：Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、Fd片段、互补决定区(CDR)片段、二硫键稳定性蛋白(dsFv)等；线性抗体(Linear Antibody)、单链抗体(例如ScFv单抗体)(技术来自Genmab)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、单域抗体(Single Domain Antibody)(例如VH结构域抗体)、结构域抗体(技术来自AbIynx)；由抗体片段形成的多特异性抗体(例如三链抗体、四链抗体等)；和工程改造抗体如嵌合抗体(Chimeric Antibody)(例如人源化鼠抗体)、异缀合抗体(Heteroconjugate Antibody)等。

“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。

“Fc区”含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。

“Fab’片段”含有一条重链和一条轻链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分，由此可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。

“F(ab’)2片段”含有两条重链和两条轻链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。

“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。

“Fd片段”由一条重链的CH1及可变区组成，是Fab片段除去轻链后剩下的重链部分。

“IgG”免疫球蛋白G，是血清和胞外液中含量最高的Ig，IgG1、IgG2和IgG3的CH2能通过经典途径活化补体，并可与巨噬细胞、NK细胞表面Fc受体结合，发挥调理作用、ADCC作用等。人IgG1、IgG2和IgG4可通过其Fc段与葡萄球菌蛋白A(SPA)结合，用于免疫诊断。

“骨架区(FR)”是重链和轻链的可变区内除CDR以外的区域，氨基酸组成和排列相对不易变化。

“二硫键稳定性蛋白(dsFv)”在VH和VL区分别引入一个半胱氨酸突变点，从而在VH和VL之间形成二硫键而实现结构稳定性。

“单域抗体”用基因工程方法获得，主要有3类，第一类是从骆驼科动物HCAb获得的重链可变区，为单一的折叠单元，保留了完整的抗原结合活性，是最小的天然抗体片段。第二类是从鲨鱼等软骨鱼IgNAR获得的重链可变区，用VNAR表示。第三类是从人源或鼠源mAb获得的重链或轻链可变区，保留了抗原结合活性，但亲和性和可溶性大为下降。

“单链Fv抗体(或ScFv抗体)”是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。对于ScFv综述，可参见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利第4946,778号和第5260,203号。

“缀合”、“连接”是指使两个多肽成为一个连续的多肽分子，或者是指将放射性核素或其他分子与多肽例如ScFv共价连接。在具体上下文中，所述术语包括提及连接配体例如抗体部分与效应分子。所述连接可通过化学或重组的方式。“化学方式”是指所述抗体部分与效应分子之间的反应，使所述两个分子之间形成共价键以形成一个分子。

“分离的抗体”指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与GPC-3特异性结合的分离的抗体基本不含与除GPC-3以外的抗原特异性结合的抗体)。但是，与GPC-3分子等其他抗原可能具有交叉反应性。

本文所用术语“超变区”或“CDR区”或“互补决定区”是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。CDR区序列可以由IMGT、Kabat、Chothia和AbM方法来定义或本领域熟知的任何CDR区序列确定方法而鉴定的可变区内的氨基酸残基。抗体CDR可鉴定为最初由Kabat等人定义的高变区，例如，轻链可变结构域的24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)位残基和重链可变结构域的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)位残基，参见Kabat EA等,1991,Sequencesof Proteins of Immunological Interest(免疫目的物的蛋白质序列),第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.；CDR的位置亦可鉴定为最初由Chothia等人描述的“超变环”(HVL)结构来界定的。IMGT(ImMunoGeneTics)也提供了包括CDR的免疫球蛋白可变区的编号系统，根据IMGT编号定义CDR区，例如，轻链可变结构域的27-32(L1)、50-52(L2)和89-97(L3)位残基和重链可变结构域的26-35(H1)、51-57(H2)和93-102(H3)位残基，参见如Lefranc MP等的Dev Comp Immunol,2003,27:55-77，其通过引用并入本文。用于CDR鉴定的其它方法包括“AbM定义”，其为Kabat与Chothia之间的折衷且使用Oxford Molecular′s AbM抗体模型软件得到；或CDR的“接触定义”，其基于所观察的抗原接触且阐述于MacCallum RM等人,1996,J Mol Biol.,262:732-745中。CDR的“构型定义”方法中，CDR的位置可鉴定为对抗原结合作出贡献的残基，参见例如Makabe K等人,2008,JBiol Chem.,283:1156-1166。本发明所用的方法可利用或根据这些方法中的任一种所定义的CDR，包括但不限于Kabat定义、IMGT定义、Chothia定义、AbM定义、接触定义和/或构型定义中的任一者来定义。

“表位”抗原决定簇，这些是具有抗原性(即可诱发特异性免疫应答)的分子上的特定化学基团或肽序列。抗体特异性结合多肽(例如GPC-3)上的特定抗原表位。

“免疫结合”和“免疫结合性质”指一种非共价相互作用，其发生在免疫球蛋白分子和抗原(对于该抗原而言免疫球蛋白为特异性的)之间。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的平衡解离常数(K_D)表示，其中K_D值越小，表示亲和力越高。所选多肽的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法定量。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(Ka或Kon)和“解离速率常数”(Kd或Koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出，参见Malmqvist M,1993,,Nature,361:186-187。Kd/Ka的比率等于解离常数K_D，参见Davies DR等,1990,Annual Rev Biochem.,59:439-473。可用任何有效的方法测量K_D、ka和kd值。在优选的实施方案中，用生物发光干涉测量法(例如，实施例3.2中所述的ForteBio Octet法)来测量解离常数。在其它优选的实施方案中，可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或Kinexa来测量解离常数。当平衡结合常数(K_D)为≤5×10^-11M，优选为≤1×10^-11M，本发明的抗体被认为特异性地结合至GPC-3表位。

“宿主细胞”在其中载体可以增殖并且其DNA可以表达的细胞，所述细胞可以是原核细胞或者真核细胞。该术语还包括受试宿主细胞的任何后代。应理解，并不是所有的后代都与亲本细胞相同，因为在复制过程中可能会发生突变，这类后代被包括在内。

“载体”是被导入宿主细胞从而产生转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含本领域已知的一个或多个选择标记基因以及其他遗传原件。

“细胞毒性”分子例如免疫毒素对意欲靶向的细胞的毒性，而不是对生物其他细胞的毒性。

“化学治疗剂”在特征为异常细胞生长的疾病的治疗中有治疗用途的任何化学剂。这样的疾病包括肿瘤、新生物和癌症以及特征为增生性生长的疾病。联合化疗给予多于一种的试剂来治疗癌症。

“GPC-3”人GPC-3有四种已知的亚型(亚型1-4)。GPC-3的四种亚型的核酸和氨基酸序列是已知的，包括GenBank登录号：NM_001164617和NP_001158089(亚型1)；NM_004484和NP_004475(亚型2)；NM_001164618和NP_001158090(亚型3)；以及NM_001164619和NP_001158091(亚型4)。在本文公开的一些实施方案中，本文公开的抗体可结合所述四种GPC-3亚型的一种或多种，或其保守变体。

“硫酸乙酰肝素(HS)”碳水化合物的糖胺聚糖家族的成员，其在结构上与肝素非常密切相关，是发现于所有动物组织的线性多糖。HS为蛋白聚糖(PG)，其中两条或多条HS链接近地连接到细胞表面或细胞外基质蛋白。HS以这种形式结合多种蛋白配体并调节多种生物活性，包括发育过程、血管发生、血液凝固和肿瘤转移。

高ADCC活性

指本发明的抗体与已知的GPC-3抗体的ADCC活性接近或更高。已知的GPC-3抗体包括例如，中国专利申请CN101287492A中所述的V22和V209等。

ADCC活性可通过本领域技术人员公知的方法进行测定。例如，可通过LDH试剂盒检测被肿瘤细胞杀伤后释放的LDH。用于测定ADCC活性的具体条件没有特别限制，然而，例如可以利用下述实施例中所述的条件进行测定。

表达GPC-3的细胞的实例包括，在其中插入了GPC-3编码基因的CHO细胞系等。为测定ADCC活性，优选使用PLC/PRF/5细胞系。表达GPC-3的重组CHO细胞系可以通过任意方法制备。

在GPC-3抗体用作抗癌药物的情况下，优选其与含有具有SEQ ID：15所示氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID：16所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体具有相同水平的ADCC活性。

此外，本发明包括具有GPC-3高结合活性的抗体。

在本发明中，抗体对GPC-3的结合活性可通过利用本领域技术人员公知的方法进行测定。例如，可通过利用PBS缓冲液稀释的GPC-3抗原与人源化抗体AB13E3和AB13E4之间的反应进行测定。此外，对于评价结合活性而言，可利用酶联免疫吸附，酶免疫分析法，放射免疫测定法或荧光抗体技术。例如，当利用酶联免疫吸附时，将用PBS缓冲液稀释的GPC-3加于96孔板，过夜后弃去包被溶液，加入PBST/1％脱脂奶粉封闭，用PBST缓冲液洗板后，加入人源化单抗AB13E3和AB13E4和HRP标记的GPC-3抗体的混合液，用PBST洗去未结合的抗体和HRP标记的GPC-3抗体，用TMB显色液显色，然后用硫酸终止反应，以酶标仪在双波长450/620nm处读取吸光度值。结合活性的上限没有特别限制。然而，例如，上限可被限定在本领域技术人员能够确定的技术上合理的范围之内。可以理解该技术上合理的范围可随技术的发展而进一步扩大。

同源抗体

在又一方面，本发明抗体包含的重链和轻链可变区所包含的氨基酸序列与本文所述的优选抗体的氨基酸序列同源，且其中所述抗体保留了本发明抗GPC-3抗体的期望的功能特性。

例如，本发明提供了人源化的结合GPC-3的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：(a)所述重链可变区包含与选自SEQ ID NOs：9、11、13、15和17的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列；更优地，所述重链可变区包含与选自SEQ ID NOs：9、11、13、15和17的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的氨基酸序列；(b)所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NOs：10、12、14、16和18的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列；更优选地，所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NOs：10、12、14、16和18的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的氨基酸序列。

用于比较的序列比对方法在本领域是熟知的。多种程序和比对算法描述于：SmithTF和Waterman MS,Adv.Appl.Math.,2:482,1981；Higgins DG和Sharp PM,CABIOS5:151,1989。Altschul SF等,Nature Genet.,6:119,1994提供了序列比对方法和同源性计算的详细思路。

具有保守修饰的抗体

术语“保守修饰”意图指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸的取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代指氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域中对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有详细说明。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体CDR区中的一个或多个氨基酸残基。

在某些实施方式中，本发明的抗体包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的重链可变区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文所述优选抗体(例如AB13E3或AB13E4)的特定氨基酸序列或其保守修饰，且其中所述抗体保留了本发明抗GPC-3抗体的期望的功能特性。因此，本发明提供了分离的结合GPC-3的抗体或其抗原结合部分，其包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的重链可变区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的轻链可变区，例如，其中采用IMGT方法定义：(a)所述重链可变区CDR-H1序列包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或所述重链可变区CDR-H2序列包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或所述重链可变区CDR-H3序列包含SEQ ID NO：5所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或(b)所述轻链可变区CDR-L1序列包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或(b)所述轻链可变区CDR-L2序列包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或(b)所述轻链可变区CDR-L3序列包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。例如，采用Kabat方法定义：(a)所述重链可变区CDR-H1序列包含SEQ ID NO：23所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或所述重链可变区CDR-H2序列包含SEQ ID NO：26所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或所述重链可变区CDR-H3序列包含SEQ ID NO：31所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或(b)所述轻链可变区CDR-L1序列包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或(b)所述轻链可变区CDR-L2序列包含SEQ ID NO：29所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；和/或(b)所述轻链可变区CDR-L3序列包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。

免疫辍合物

可将本文描述的GPC-3的人抗体或抗体片段缀合到治疗剂或效应分子。免疫缀合物包括但不限于，其中治疗剂与抗体或抗体片段共价连接的分子。治疗剂是针对具体靶分子或带有靶分子的细胞具有特定生物活性的试剂。本领域的技术人员会理解，治疗剂可包括多种药物(例如长春碱、道诺霉素等)、细胞毒素(例如天然的或经修饰的假单胞菌外毒素或白喉毒素)、本身含有药物组合物的包囊剂(例如脂质体)、放射性同位素(例如¹²⁵I、³²P、¹⁴C、³H、³⁵S)和其他标记、靶部分和配体。

使用本文描述的治疗剂和抗体或抗体片段，本领域技术人员可容易地构建含有功能等价核酸(例如序列不同、但编码相同的效应部分或抗体序列的核酸)的多个克隆。因此，本发明提供了编码抗体、抗体片段和缀合物及其融合蛋白的核酸。

效应分子可使用本领域技术人员已知的任何数量的方式连接至目的抗体或抗体片段。所述抗体或抗体片段与所述功能性分子可以通过共价连接、偶联、附着、交联等方式构成辍合物。根据效应物的化学结构，连接所述效应分子和抗体或抗体片段的方法有所不同。多肽一般含有多个官能团：例如羧基(-COOH)、游离氨基(-NH₂)或巯基(-SH)，其可用于与抗体或抗体片段上合适的官能团发生反应以与所述效应分子结合。或者，可将所述抗体或抗体片段衍生化以暴露或连接另外的反应性官能团。考虑到已经报道的大量用于将多种放射性诊断化合物、放射性治疗化合物、标记(例如酶或荧光分子)药物、毒素和其他试剂连接到抗体或抗体片段的方法，本领域技术人员将能够确定用于将给定试剂连接至抗体或抗体片段的合适方法。

可以用可检测部分标记可结合(例如特异性结合)GPC-3的人抗体或抗体片段。可用的可检测试剂包括荧光化合物(包括但不限于荧光素、罗丹明等)、生物发光标记物(包括但不限于荧光素酶、绿色荧光蛋白等)。还可以用可用于检测的酶来标记抗体或抗体片段，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。此外，还可以用作标记的实例包括但不限于磁性试剂、稀土元素、锰、顺磁性颗粒、可被第二报告分子识别的预定多肽表位、放射性标记的氨基酸、化学基团等。

可将本文所述的人抗体或抗体片段与毒素一起使用以产生免疫毒素。示例性的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素和其亚基以及肉毒杆菌毒素A-F。这些毒素可以容易地从商业来源获得(例如,Sigma,MO)。

药物组合物

本发明的人源化抗体、抗体片段、包含该抗体的免疫缀合物可以应用于制备药物组合物。药物组合物可包括一种或组合的(如两种或更多不同的)本发明的抗体或抗体片段或免疫缀合物。例如，本发明的药物组合物可包含与靶抗原上的不同表位结合的具有互补活性的抗体或抗体片段(或免疫缀合物)的组合。例如，Roche公司的人源化单抗GC33与肝癌一线治疗药物索拉菲尼的联合使用(Allegretta M等,Anticancer Agents Med Chem.,11:543-548,2011)；GPC-3及其偶联物在诊断和治疗肝癌方面的研究(中国专利CN106414499A)；嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)在肝癌治疗方面的研究(www.sohu.com/a/146613575-682259,2017/06/07)。

所述的组合物还包括药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”指当分子本体、分子片段或组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其他不良反应。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体示例包括糖类(如乳糖)、淀粉、纤维素及其衍生物、植物油、明胶、多元醇(如丙二醇)、海藻酸等。

本发明的GPC-3抗体或抗体片段可与一种或更多种其他治疗剂共同使用，所述治疗剂如毒素、细胞毒剂、放射性同位素或免疫抑制剂。抗体或抗体片段可连接至所述剂(作为免疫复合体)或与所述剂分开施用。在后一种情况下，抗体或抗体片段可在所述剂之前、之后或与所述剂共同施用，或可与其他已知疗法(如抗癌疗法、如辐射)共同施用。此类治疗剂包括但不限于抗肿瘤剂，诸如多柔比星(阿霉素)、顺铂博来霉素硫酸盐、亚硝基脲氮芥、苯丁酸氮芥和环磷酰胺羟脲，这些治疗剂本身仅在对患者具有毒性或亚毒性水平时才有效。共同施用可以解决由于发展抗药性或者肿瘤细胞抗原性改变(这将使它们对抗体没有反应)所引起的问题。

靶特异性的效应细胞，如连接至本发明的GPC-3抗体或抗体片段的效应细胞，也可用作治疗剂。靶向的效应细胞可以是人白细胞，诸如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞和其他带有IgG或IgA受体的细胞。如果需要，可从要治疗的受试者获取效应细胞。靶特异性效应细胞可作为生理可接受的溶液中的细胞的悬浮液来施用。施用的细胞数可在10⁸-10⁹数量级范围内，但是可根据治疗目的而有所不同。一般而言，该量足以实现在靶细胞(如表达GPC-3的肿瘤的细胞)的定位并通过如吞噬实现细胞杀伤。施用路径也有所不同。

施用靶特异性效应细胞的疗法可与清除靶细胞的其他技术联合进行。例如，使用本发明的组合物和/或装备了这些组合物的效应细胞的抗肿瘤疗法与化学疗法联合使用。此外，组合免疫疗法可用于指导两种不同的细胞毒效应细胞群排斥肿瘤细胞。例如，连接至抗FcγRI或抗CD3的抗GPC-3抗体可与IgG受体或IgA受体特异结合剂联合使用。

存在补体的情况下，也可使用具有补体结合位点的本发明的组合物，所述补体结合位点诸如来自与补体结合的IgG1、IgG2或IgG4或IgM的部分。本发明的组合物还可与补体一起施用。

包含本发明的抗体组合物和使用说明的试剂盒同样属于本发明范畴。试剂盒还可包含一种或多种其他试剂，诸如免疫抑制剂、细胞毒剂或放射性同位素或一种或多种其他的本发明的人抗体(如具有互补活性的人抗体，该抗体与第一人抗体结合GPC-3抗原中的不同表位)。因此，使用本发明的抗体组合物治疗的患者可另外施用(在施用本发明的人抗体之前、与之同时或之后)其他治疗剂，诸如细胞毒剂或放射性同位素，其可增强或放大人抗体的治疗效果。

药物组合物可用于与细胞增殖有关的疾病诸如癌症的治疗和/预防，且对肝癌的治疗和/预防是尤其有用的。在本发明的抗体被用作药物组合物时，本领域技术人员可通过公知的方法将抗体配制成剂型。例如，药物组合物可以以无菌注射溶液或与水的悬浮液或其他药用溶液的形式注射使用。例如，抗体可通过与药用载体或溶液，诸如无菌水，生理盐水，植物-油，乳化剂，悬浮液，表面活性剂，稳定剂，香料，赋形剂，载体，防腐剂，粘合剂等适当地混合制备成药物实施细则普遍接受的所需单位剂型配制成剂型。选择这些制剂中活性成分的量来施用所示范围内的合适剂量。

癌症

本发明抗体或抗体片段可用于治疗癌症(即抑制肿瘤细胞的生长或存活)。可用本发明抗体或抗体片段抑制其生长的优选的癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性实例包括肝细胞癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、肝胚细胞瘤、成神经细胞瘤、肾母细胞瘤、小细胞肺癌、肺腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌，皮肤癌、淋巴癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、食道癌、甲状腺癌、睾丸癌、白血病、恶性间皮瘤、脂肪肉瘤等疾病。

诊断方法

本发明提供了一种通过利用本发明的抗体或抗体片段检测试验样品中的GPC-3蛋白来诊断诸如肿瘤疾病的方法。本发明的抗体、抗体片段、包含该抗体的免疫缀合物、药物组合物以及基因修饰的免疫细胞可以应用于制备诊断试剂。

这里使用的检测包括定量检测和非定量检测。定量检测包括测定GPC-3蛋白的浓度和含量。非定量检测包括，例如，仅测定是否存在GPC-3蛋白，测定是否存在定量或更多的GPC-3蛋白，测定GPC-3蛋白量与另一样品(例如对照样品)的GPC-3量的对比。

试验样品没有特别的限制，只要其是可能含有GPC-3蛋白的样品即可，然而优选的为由活生物体诸如哺乳动物收集的样品，且更优选的为由人收集的样品。试验样品的具体实例可包括，例如血液，组织液，血浆，血管外液体，脑的液体，滑液，胸膜液，血清，淋巴液，唾液，优选血液，血清和血浆。此外，由诸如活生物体收集的细胞培养液获得的试验样品也包括在本发明的试验样品中。

待诊断的癌症没有特别的限制，具体的实例可包含肝细胞癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、肝胚细胞瘤、成神经细胞瘤、肾母细胞瘤、小细胞肺癌、肺腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌，皮肤癌、淋巴癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、食道癌、甲状腺癌、睾丸癌、白血病、恶性间皮瘤、脂肪肉瘤等疾病；最优选为肝细胞癌和黑色素瘤。

待检测的GPC-3没有特别的限制，且可以是全长GPC-3或其片段。在检测GPC-3的片段时，可以是N-末端片段或C-末端片段，优选N-末端片段。此外，GPC-3蛋白也可以是添加硫酸乙酰肝素的GPC-3或GPC-3核心蛋白。

检测试验样品所含GPC-3蛋白的方法没有特别的限制，优选的通过利用抗GPC-3抗体的免疫方法进行检测。免疫方法的实例包括，例如，放射免疫测定，酶联免疫分析，荧光免疫测定，发光免疫测定，免疫沉淀，比浊免疫测定。优选为酶联免疫分析，尤其优选为ELISA(例如间接ELISA)。可通过本领域技术人员公知的方法来识别上述免疫方法。

本发明检测GPC-3蛋白的方法中，除用于GPC-3蛋白测定的试验样品之外可提供对照样品。对照样品包括阴性对照样品和阳性对照样品。可通过比较阴性对照样品获得的结果与阳性对照样品获得的结果来检测试验样品的GPC-3蛋白。也可通过获得对照样品与试验样品的检测结果数值以及比较这些数值来定量检测试验样品中所含的GPC-3蛋白。

检测GPC-3蛋白与支持体通过抗GPC-3抗体结合的一个优选实施方案是利用可检测标记标记抗GPC-3抗体的方法。例如，将含有GPC-3蛋白的缓冲液添加给支持体诸如微板以使GPC-3蛋白被固定。过夜后吸掉缓冲液并用PBST缓冲液洗板，微板用例如PBST和1％脱脂奶粉的混合液封闭以防止蛋白的非特异性结合。用PBST缓冲液冲洗微板，然后加入用PBST/1％脱脂奶粉稀释至合适浓度的待测抗体，孵育洗板后加入PBST/1％脱脂奶粉稀释的标记二抗，孵育后冲洗微板，加入TMB显色。可通过本领域技术人员公知的方法检测蛋白。例如，在抗体用放射性物质标记的情况下，蛋白通过液体闪烁法或RIA法进行检测。在其中抗体用酶标记的情况下，可通过添加底物以及用吸光度读数器检测底物的酶促变化诸如显色来检测蛋白。在抗体用荧光物质标记的情况下，可通过荧光剂检测蛋白。

抗GPC-3抗体的治疗用途

可将本发明的抗体、抗体片段、免疫缀合物和药物组合物用作治疗剂。这些药剂可通常用于在受试者中减缓或抑制肿瘤细胞生长或转移。在这些应用中，将治疗有效量的抗体或抗体片段给予受试者，其量足以抑制癌细胞生长、复制或转移或足以抑制癌症的征象或症状。本发明的抗体、抗体片段、免疫缀合物和药物组合物可引起以下体内外的生物活性：如抑制高表达GPC-3的细胞生长和/或杀死该细胞；在存在效应细胞的情况下，介导高表达GPC-3的细胞吞噬或ADCC作用；或阻止GPC-3配体与GPC-3结合等。合适的受试者可包括被诊断患有表达GPC-3的癌症(包括但不限于HCC、黑色素瘤、结直肠癌、卵巢癌、甲状腺癌等)的受试者。

本发明抗体或抗体片段的治疗有效剂量将取决于疾病严重程度以及患者健康状况。此外，给予所需量还部分取决于抗体与抗原的结合亲和力和抗体在受试者体内的药代动力学特性。本发明抗体或抗体片段的治疗有效剂量给药的常用范围(以非限制实例的方式)可为约0.1mg/kg体重-约50mg/kg体重。常用给药频率可在例如从每天两次至一周一次的范围内。施用的剂量和方法可根据患者的体重，年龄和症状进行变化，且由本领域技术人员适当地选择。

本文公开的抗体、抗体片段、免疫缀合物、药物组合物给药还可伴随其他抗癌剂给药或其它治疗(例如肿瘤的手术切除)。任何合适的抗癌剂均可以与本文公开的抗体、抗体片段、免疫缀合物和药物组合物组合给予。示例性的抗癌剂可包括化学治疗剂(例如有丝分裂抑制剂)、烷化剂(例如氮芥Nitrogen Mustard)、抗代谢物(例如叶酸类似物)、天然产物(例如长春花生物碱Vinca Alkaloid)、多种试剂(例如铂配位络合物)、激素和拮抗剂(例如肾上腺皮质类固醇)、免疫调节剂(例如溴匹立明Bropirimine,Upjohn)等。其他抗癌治疗包括特异性靶向癌细胞的其他抗体。对于某些类型的癌症的另一种常见治疗是手术治疗，例如手术切除癌症部位或其一部分。治疗的另一实例是放射治疗，例如在进行手术切除前，向肿瘤部位给予放射性物质或能量(例如外线束疗法)以帮助消灭肿瘤或使其更小。

单克隆抗体制备

本发明的mAb可以通过多种技术进行制备，包括常规mAb方法学，例如Kohler G和Milstein C,Nature,1975:256:49中所述的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交规程，但是原则上也可以使用制备mAb的其它方法，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。

用于制备杂交瘤的动物没有特别限制，但是优选地考虑其与用于细胞融合的亲本细胞的相容性进行选择。优选动物系统为鼠科动物系统。在小鼠中制备杂交瘤是非常完善的规程。分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合规程也是已知的。

由杂交瘤获得mAb的方法包括培养杂交瘤和根据标准方法由培养上清液获得mAb。另一个方法包括将杂交瘤施用于与杂交瘤相容的哺乳动物来使其增殖，以及由腹水中获得mAb。前一方法适用于获得高纯度抗体，后一方法适用于抗体的批量生产。

由此获得的抗体可从宿主细胞的内部或外部(培养基，等等)分离，然后可纯化为基本上纯的和均一的抗体。通过多肽纯化中通常使用的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，通过任意方法包括层析柱，过滤，超滤，盐析，溶剂沉淀，溶剂萃取，蒸馏，免疫沉淀，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电点聚焦，透析，重结晶，及其组合来进行多肽的分离和纯化。

为表达抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如PCR扩增或使用表达目标抗体的杂交瘤的cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将DNA插入到表达载体中，从而使得目的基因与转录和翻译调控序列可操作的连接，转染宿主细胞进行表达，表达宿主优选真核表达载体，更优选哺乳动物细胞，例如CHO及其衍生细胞系。

本发明的人源化抗体可以根据上述制备的鼠抗序列进行制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为创造人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人源框架序列，参见Winter的美国专利No.5,225,539及Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。还可以利用转基因动物，例如，HuMAb小鼠(Medarex,Inc.)含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微型基因座(miniloci)，加之使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如Lonberg N等人,Nature,368:856-859,1994)；或携带人重链转基因和人轻链转染色体的“KM小鼠TM”(参见专利WO02/43478)进行抗体人源化改造。其他抗体人源化改造的方法包括如噬菌体展示技术等。

由本发明的GPC-3抗体识别的GPC-3分子上的表位不局限于特定的表位。抗GPC-3抗体可识别任意的表位，只要该表位存在于GPC-3分子上。因此，任意的片段也可用作用于产生本发明的抗GPC-3抗体的抗原，只要其含有存在于GPC-3分子上的表位。

通过下列实施例进一步说明本发明，所述实施例不应解释为进一步限制。在此将整篇申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和已公开专利申请的内容明确收入本文作为参考。

附图说明

图1、间接ELISA测定GPC3#4与人GPC-3的结合。

图2、竞争ELISA测定GPC3#4与GPC-3对照抗体的结合抑制能力。

图3、AB13E1-AB13E5和GPC3#4重链可变区氨基酸序列的并列比较。其中，下划线为CDR区序列(根据IMGT系统定义)。

图4、AB13E1-AB13E5和GPC3#4轻链可变区氨基酸序列的并列比较。其中，下划线为CDR区序列(根据IMGT系统定义)。

图5、ELISA测定AB13E3和AB13E4的效价及特异性。

图6、竞争ELISA测定AB13E3和AB13E4与GPC-3对照抗体的相对亲和力。

图7、AB13E3和AB13E4与过表达GPC-3的PLC/PRF/5细胞的结合。

图8、AB13E3和AB13E4与过表达GPC-3的Huh7细胞的结合。

图9、AB13E3和AB13E4对表达GPC-3的PLC/PRF/5细胞的杀伤作用。

具体实施方式

实施例1：抗人GPC-3鼠源单克隆抗体的制备

将人GPC-3纯化抗原50μg(北京义翘神州生物)以完全弗氏佐剂充分乳化后，采用多点免疫方式免疫雄性Balb/C小鼠(上海斯莱克实验动物)，免疫周期为三周一次。在第3次免疫后第10天，通过眼窝取血，ELISA测试血浆抗人GPC-3抗体滴度以监测小鼠免疫应答程度。然后在融合前3天，对产生抗人GPC-3抗体滴度最高的小鼠加强免疫一次。3天后，处死小鼠并取出该小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞株融合。混合2×10⁸Sp2/0细胞与2×10⁸小鼠脾细胞在50％聚乙二醇(分子量为1450)和5％二甲基亚砜(DMSO)中融合。用Iscove培养基(含有10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，100μM次黄嘌呤，400nM氨基蝶呤和16μM胸苷)来调整脾脏细胞数至5×10⁵/ml，以0.3ml加入96孔培养板孔内，并置于37℃，5％CO₂培养箱内。培养10天后，取50μl培养上清用实施例2的方法检测抗人GPC-3的抗体滴度，选取OD值最高的100个孔挑取融合后的克隆，一共获得356个克隆。挑取的克隆转移至96孔板中继续培养3天，再次用同样方法选取OD值最高的95个克隆，各取培养上清50μl采用实施例6.3的方法，检测抗人GPC-3抗体与肝癌细胞系PLC/PRF/5的结合能力。挑选相对荧光强度最高的10个克隆继续扩大培养，使用ProteinA亲和层析的方法纯化获得高纯度的鼠抗人GPC-3抗体。经抗体浓度测定后，分别用实施例2的方法测定抗体与GPC-3蛋白的结合曲线，用实施例6.3的方法测定抗体与PLC/PRF/5细胞的结合能力。根据上述结果最终选定候选鼠单克隆抗体GPC3#4(杂交瘤细胞株DWX-1分泌)。

实施例2、ELISA法测定抗GPC-3鼠源抗体效价

采用ELISA对杂交瘤细胞株DWX-1(所分泌抗体被命名为GPC3#4)培养上清中纯化的鼠源单克隆抗体的效价进行测定。用PBS缓冲液将GPC-3抗原稀释至0.2μg/ml，以100μl/孔的体积加于96孔板中，4℃放置16-20h。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBST(pH 7.4，PBS含0.05％吐温20)缓冲液洗板1次后，加入200μl/孔PBST/1％脱脂奶粉，室温孵育1h封闭。移去封闭液，用PBST缓冲液洗板3次后，加入用PBST/1％脱脂奶粉稀释至适合浓度的待测GPC-3鼠源抗体，100μl/孔，室温孵育1.5h。移去反应体系，用PBST洗板3次后，50μl/孔加入用PBST/1％脱脂奶粉稀释(稀释比例1:5000)HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(The JacksonLaboratory)，室温孵育1h。PBST洗板3次后，加入100μl/孔TMB，室温孵育显色10-30min。加入50μl/孔0.2M硫酸终止反应。酶标仪在双波长450/620nm处检测吸光值(O.D.)，计算EC₅₀值。

从图1可知，杂交瘤克隆细胞株DWX-1表达的鼠单抗GPC3#4能与GPC-3结合。GPC3#4与抗原结合活性的EC₅₀值约为0.01μg/ml。

实施例3、抗GPC-3鼠源单克隆抗体的筛选与鉴定

3.1、抗GPC-3鼠源抗体与GPC-3对照抗体的结合抑制测定

用PBS缓冲液将GPC-3抗原稀释至0.2μg/ml，以100μl/孔的体积加于96孔酶标板中，室温过夜。弃去包被溶液，加入200μl/孔PBST/1％脱脂奶粉，室温孵育1h封闭。移去封闭液，PBST缓冲液洗板3次后，然后每孔加入50μl稀释好的鼠源单抗GPC3#4与50μl HRP标记的GPC-3抗体(Santa Cruz Biotechnology)混合液(阳性对照)，以未加入GPC3#4抗体的作为阴性对照，以HRP标记的羊抗人IgG(Jackson Laboratory)作为检测抗体，充分孵育后以PBST洗去未结合的抗体及HRP标记的GPC-3抗体，加入100μl每孔的TMB显色液，显色30min。用0.2M的硫酸终止反应，以酶标仪在双波长450/620nm处读取吸光度值。如图2中所示，鼠源抗体GPC3#4能特异地阻断HRP标记的GPC-3抗体与GPC-3的结合。

3.2、抗GPC-3鼠源抗体的亲和力测定以及动力学分析

采用生物薄膜干涉技术(BLI)对纯化的鼠单克隆抗体的结合亲和力常数进行测定。按照Octet分子相互作用仪(ForteBio Octet RED&QK系统，PALL公司)标准操作方法进行测定。多通道平行定量分析浓度梯度设定为：3.125、6.25、12.5、25、50和100nM，将人GPC-3-His(北京义翘神州生物)偶联Ni-NTA传感器。追踪抗原-抗体结合动力学及解离动力学。鼠单克隆抗体GPC3#4的结合常数ka值＝6.24×10⁵/Ms，解离常数kd值＝1.0×10^-7/s，平衡解离常数K_D值＝kd/ka＝1.07×10^-12M。鼠单克隆抗体GPC3#4的平衡解离常数K_D值<1×10^- ¹¹M，具有极高的亲和力。

实施例4、抗GPC-3鼠源单抗的亚型鉴定及可变区扩增

抗体亚型鉴定：取杂交瘤细胞培养上清液，采用IsoStrip^TM小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(Santa Cruz Biotechnology)鉴定抗体亚型。单抗GPC3#4亚型经鉴定为IgG1(Kappa)。

抗体可变区扩增：将候选杂交瘤细胞DWX-1培养至总数量10⁷个细胞，1000rpm离心10min收集细胞，并以Trizol试剂盒(Invitrogen)提取总RNA，用反转录试剂盒SMARTerRACE合成第一链cDNA，以第一链cDNA为后续模板扩增杂交瘤细胞所对应的抗体可变区DNA序列。根据亚型鉴定结果，获取该抗体亚型的重链和轻链恒定区序列，设计特异性的巢式PCR引物，该扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补。采用常规PCR方法扩增目的基因，将扩增产物测序后，得到杂交瘤克隆DWX-1分泌抗体GPC3#4的重链可变区序列SEQ ID NO：7和轻链可变区序列SEQ ID NO：8。采用IMGT方法定义，该抗体的重链CDR(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1，3和5所示，其轻链CDR(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2，4和6所示。采用Kabat方法定义，该抗体的重链CDR(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23，26和31所示，其轻链CDR(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：24，29和6所示。也可以采用任何其他的本领域公知的CDR区序列确定方法来鉴定可变区内CDR区的氨基酸残基。

实施例5、抗GPC-3鼠源抗体的人源化

根据上述获得的杂交瘤细胞分泌的抗体的可变区序列，采用CDR移植抗体人源化改造方法进行人源化改造。简言之，人源化改造过程涉及以下步骤：把各杂交瘤细胞分泌的抗体的氨基酸序列与人胚胎系抗体氨基酸序列进行比对，找出同源性高的序列；分析考察HLA-DR亲和性，选出亲和力低的人胚胎系框架序列；之后利用计算机模拟技术，应用分子对接分析可变区及其周边的框架氨基酸序列，考察其空间立体结合方式。通过计算静电力，范德华力，亲疏水性和熵值，分析各杂交瘤细胞分泌的抗体氨基酸序列中可与NGF作用以及维护空间构架的关键氨基酸，将其嫁接回已经选择的人胚胎系抗体框架。

其中，鼠源抗体GPC3#4以人IGHV1-46*01重链可变区和人IGKV2-30*02轻链可变区为模板序列，共获得4个人源化抗体，分别是AB13E1、AB13E2、AB13E3和AB13E5。上述人源化抗体的可变区氨基酸序列如表1所示。

此外，还采用表面重塑方法对上述获得的杂交瘤细胞分泌的抗体的可变区序列进行人源化改造。表面重塑方法是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造，该方法仅替换与人抗体表面氨基酸差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性的基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。具体的，表面重塑人源化改造过程涉及以下步骤：首先将各杂交瘤细胞分泌的抗体的氨基酸序列与人胚胎系抗体氨基酸序列进行比对，找出同源性高的序列；之后利用计算机模拟技术，选择solvent accessibility大于30％时，将暴露的表面氨基酸替换成人胚胎系抗体氨基酸。对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区构象的残基尽量不替换。其中，鼠源抗体GPC3#4以人IGHV1-46*01重链可变区和人IGKV2-30*02轻链可变区为模板序列，构建了人源化抗体AB13E4。上述人源化抗体的可变区氨基酸序列如表1所示。

图3显示5个抗GPC-3人源化抗体和鼠源抗体GPC3#4的重链可变区氨基酸序列的并列比较。图4显示5个人源化的抗体和鼠源抗体GPC3#4的轻链可变区氨基酸序列的并列比较。可变区中，互补决定区与构架区有如图3、4标示，重链和轻链可变区CDR采用IMGT法定义。

从表2中各人源化抗体的亲和力常数及动力学参数可知，AB13E1、AB13E2、AB13E3、AB13E4和AB13E5与鼠源抗体GPC3#4相比人源化程度超过70％，但亲和力没有明显损失，K_D值均小于1×10^-11M，保留了亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，大大降低了其免疫原性。

表1、人源化抗体可变区氨基酸序列

表2、人源化抗体亲和力比较

本发明制备的鼠源单抗GPC3#4及其衍生的5个人源化抗体AB13E1、AB13E2、AB13E3、AB13E4和AB13E5的CDR区的氨基酸序列如表3所示，其中抗体可变区所包含的CDR的氨基酸序列分别采用Kabat和IMGT方法来定义，人源化抗体中CDR区突变的氨基酸序列以下划线标出。

表3、关于示例性的抗人GPC-3抗体GPC3#4及其衍生的人源化抗体的CDR区序列

注：_表示采用Kabat定义后的CDR不同于鼠源抗体CDR的氨基酸

实施例6、抗GPC-3人源化抗体功能鉴定

6.1、间接法ELISA测定人源化抗体的效价及结合特异性

采用实施例2的方法测定人源化抗体AB13E3和AB13E4与抗原GPC-3的结合特性。以GPC-3抗体(Santa Cruz Biotechnology)作为阳性对照，以人IgG作为阴性对照。使用HRP标记的羊抗人IgG(Jackson Laboratory)作为检测抗体。

如图5所示，人源化抗体AB13E3和AB13E4都能特异性地结合人GPC-3，且它们与抗原结合活性的EC₅₀值均与阳性对照接近，约在0.001～0.01μg/ml之间。这表明本发明所构建的抗GPC-3人源化抗体AB13E3和AB13E4与GPC-3的结合能力未因人源化改造而消减，仍保留了鼠源亲本抗体的高亲和力。

6.2、GPC-3人源化抗体相对亲和力测定

用实施例3.1的方法检测GPC-3人源化抗体AB13E3和AB13E4的相对亲和力。将GPC-3抗原稀释至0.1μg/ml，以HRP标记的GPC-3抗体作为阳性对照，以人IgG作为阴性对照。

结果如图6所示，抗体AB13E3和AB13E4都能特异性阻断HRP标记的GPC-3抗体与GPC-3的结合，且它们与GPC-3抗体-HRP竞争结合GPC-3的EC₅₀值与GPC-3抗体接近，都在0.1～1μg/ml之间。因此，可以判断抗体AB13E3和AB13E4与GPC-3抗体的亲和力大小相当。

6.3、抗GPC-3人源化抗体体外细胞结合实验

正常培养的肝癌细胞系PLC/PRF/5(上海中科院细胞所)和Huh7细胞(上海中科院细胞所)分别用0.25％Trypsin和0.02％EDTA消化，离心收集后用1％PBSB重悬，调整细胞密度2×10⁶/ml，加入96孔U底板中，100μl/孔，4℃封闭0.5h。稀释抗体：将AB13E3和AB13E4分别用1％PBSB各自分别稀释成20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064μg/ml。将96孔U底板离心，甩去上清，加入稀释好的抗体，100μl/孔，4℃孵育1h。用1％PBSB洗涤细胞3次。将羊抗人IgG-FITC抗体(上海碧云天生物技术)用1％PBSB按1:250稀释后加入96孔U底板，100μl/孔，4℃孵育1h。用1％PBSB洗涤细胞3次，上流式检测。

结果显示在图7、图8中，AB13E3和AB13E4均可以与高表达GPC-3的PLC/PRF/5和Huh7细胞表面的GPC-3特异性结合。

实施例7、抗GPC-3单克隆抗体介导的ADCC作用

采用密度梯度离心法从人新鲜血液制备PBMC，用含10％热灭活胎牛血清的1640培养基重悬，加入50IU/ml IL-2维持过夜。将PBMC离心收集，用EasySep^TM Human CD56Positive Selection Kit(Stemcell Technologies Inc.)分选出NK细胞备用。将正常培养的肝癌细胞PLC/PRF/5用0.25％胰酶消化，离心收集细胞，调整细胞密度2×10⁵/ml，加入96孔v底板，100μl/孔；稀释抗体：将GPC-3抗体、AB13E3、AB13E4以及不相关同型单抗AB8分别稀释至50000，5000，500，50，5和0.5ng/ml，加入96孔v底板中，50μl/孔，37℃，5％CO₂孵育0.5h；将NK细胞调整密度2×10⁶/ml，加入96孔v底板中，50μl/孔，设置只有肿瘤细胞的对照孔；将96孔v底板置于37℃，5％CO₂培养箱中，摇床震荡120rpm。6h后，用LDH试剂盒检测每孔中肿瘤细胞被杀伤后释放的LDH；通过origin8软件进行分析，计算抗体介导的细胞杀伤毒性。其中没有杀伤和完全杀伤情况下的A490值分别接近0.25和0.55。

如图9所示，AB13E3和AB13E4均可以杀伤表达GPC-3的PLC/PRF/5细胞，且与阳性对照GPC-3抗体杀伤结果接近。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述所述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 安源医药科技（上海）有限公司

旭华（上海）生物研发中心有限公司

<120> 抗GPC-3抗体及其用途

<130> 2017

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> CDR-H1

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu

1 5

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> CDR-L1

<400> 2

Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> CDR-H2

<400> 3

Ile Asp Pro Gln Thr Gly Asn Thr

1 5

<210> 4

<211> 3

<212> PRT

<213> CDR-L2

<400> 4

Lys Val Ser

1

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> CDR-H3

<400> 5

Thr Arg Phe Tyr Ser Leu Thr Tyr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> CDR-L3

<400> 6

Phe Gln Gly Ser His Phe Pro Tyr Ala

1 5

<210> 7

<211> 115

<212> PRT

<213> 鼠源抗体GPC-3#4重链可变区氨基酸序列

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Pro Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val Asn Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Asp Pro Gln Thr Gly Asn Thr Ala Phe Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Val Arg Ser Leu Thr Ser Glu Gly Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Leu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> 鼠源抗体GPC-3#4轻链可变区氨基酸序列

<400> 8

Asp Val Leu Met Thr Gln Val Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Phe Pro Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 115

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB13E1重链可变区氨基酸序列

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asp Pro Gln Thr Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Leu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 112

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB13E1轻链可变区氨基酸序列

<400> 10

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Phe Pro Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 11

<211> 115

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB13E2重链可变区氨基酸序列

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Asp Pro Gln Thr Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Leu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB13E2轻链可变区氨基酸序列

<400> 12

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Phe Pro Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 13

<211> 115

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB13E3重链可变区氨基酸序列

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Asp Pro Gln Thr Gly Asn Thr Ala Phe Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Leu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB13E3轻链可变区氨基酸序列

<400> 14

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Phe Pro Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 115

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB13E4重链可变区氨基酸序列

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Asp Pro Gln Thr Gly Asn Thr Ala Phe Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Gly Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Leu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB13E4轻链可变区氨基酸序列

<400> 16

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Phe Pro Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 115

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB13E5重链可变区氨基酸序列

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asp Pro Gln Thr Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Gly Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Leu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213> 人源化抗体AB13E5轻链可变区氨基酸序列

<400> 18

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Phe Pro Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 345

<212> DNA

<213> 人源化抗体AB13E3重链可变区核苷酸序列

<400> 19

caggtccagc tggtccagtc tggcgccgaa gtgaagaagc caggcgcctc cgtgaaggtg 60

agctgtaagg cctctggcta caccttcaca gactatgaga tgcattgggt gaagcaggct 120

ccaggacagg gactggagtg gatcggcgct atcgatcccc agaccggcaa cacagccttc 180

aatcagaagt ttaagggcag agtgaccctg acacgcgaca agagctcttc caccgtgtac 240

atggagctga gctctctgag gtccgaggat accgccgtgt actattgcac acggttttac 300

agcctgacct actggggtca gggcaccctg gtcacagtgt ccagc 345

<210> 20

<211> 351

<212> DNA

<213> 人源化抗体AB13E3轻链可变区核苷酸序列

<400> 20

gatgtgctga tgacacagtc tccactgtcc ctgccagtga ccctgggaca gccagcttcc 60

atcagctgta gatcttccca gtccatcgtg cacagcaacg gcaataccta cctgcagtgg 120

tatctgcagc gccctggcca gagcccaaag ctgctgatct acaaggtgtc taataggttc 180

tccggcgtgc cagaccggtt ttctggctcc ggcagcggca cctatttcac actgaagatc 240

tctagagtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactattgtt ttcagggctc ccatttcccc 300

tacgcttttg gcggtggtac taaagtggag atcaagcgca ccgtggctgc c 351

<210> 21

<211> 345

<212> DNA

<213> 人源化抗体AB13E4重链可变区核苷酸序列

<400> 21

caggtccagc tggtccagtc tggcgccgaa gtggtgaagc caggcgcctc cgtgaagctg 60

agctgtaagg cctctggcta caccttcaca gactatgaga tgcattgggt gaagcagact 120

ccaggacagg gactggagtg gatcggcgct atcgatcccc agaccggcaa cacagccttc 180

aatcagaagt ttaagggcag agctaccctg acacgcgaca agagctcttc caccgcttac 240

atggaggtga gctctctgag gtccgagggc accgccgtgt actattgcac acggttttac 300

agcctgacct actggggtca gggcaccctg gtcacagtgt ccagc 345

<210> 22

<211> 336

<212> DNA

<213> 人源化抗体AB13E4轻链可变区核苷酸序列

<400> 22

gatgtgctga tgacacagtc tccactgtcc ctgccagtga ccctgggaca gccagcttcc 60

atcagctgta gatcttccca gtccatcgtg cacagcaacg gcaataccta cctgcagtgg 120

tatctgcaga agcctggcca gtctccaaag ctgctgatct acaaggtgtc taataggttc 180

tccggcgtgc cagaccggtt ttctggctcc ggcagcggca cctatttcac actgaagatc 240

tctagagtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactattgtt ttcagggctc ccatttcccc 300

tacgcttttg gcggtggtac taaactggag atcaag 336

<210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> CDR-H1

<400> 23

Asp Tyr Glu Met His

1 5

<210> 24

<211> 16

<212> PRT

<213> CDR-L1

<400> 24

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln

1 5 10 15

<210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213> CDR-L1

<400> 25

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> CDR-H2

<400> 26

Ala Ile Asp Pro Gln Thr Gly Asn Thr Ala Phe Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> CDR-H2

<400> 27

Ile Ile Asp Pro Gln Thr Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 28

<211> 17

<212> PRT

<213> CDR-H2

<400> 28

Ala Ile Asp Pro Gln Thr Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> CDR-L2

<400> 29

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213> CDR-L2

<400> 30

Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser

1 5

<210> 31

<211> 6

<212> PRT

<213> CDR-H3

<400> 31

Phe Tyr Ser Leu Thr Tyr

1 5

Claims

1.一种分离的结合GPC-3的单克隆抗体，其特征在于，包含：

重链可变区，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列；和

轻链可变区，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列，且选自下组：

(1)CDR的氨基酸序列采用IMGT方法来定义，重链可变区包含如SEQ ID NO：1所示的CDR-H1氨基酸序列，和SEQ ID NO：3所示的CDR-H2氨基酸序列，和SEQ ID NO：5所示的CDR-H3氨基酸序列；和其轻链可变区包含如SEQ ID NO：2所示的CDR-L1氨基酸序列，和SEQ IDNO：4所示的CDR-L2氨基酸序列，和SEQ ID NO：6所示的CDR-L3氨基酸序列；

(2)CDR的氨基酸序列采用Kabat方法来定义，重链可变区包含如SEQ ID NO：23所示的CDR-H1氨基酸序列，和SEQ ID NO：26所示的CDR-H2氨基酸序列，和SEQ ID NO：31所示的CDR-H3氨基酸序列；和其轻链可变区包含如SEQ ID NO：24所示的CDR-L1氨基酸序列，和SEQID NO：29所示的CDR-L2氨基酸序列，和SEQ ID NO：6所示的CDR-L3氨基酸序列；

(3)CDR的氨基酸序列采用Kabat方法来定义，重链可变区包含SEQ ID NO：23所示的CDR-H1氨基酸序列，和SEQ ID NO：27所示的CDR-H2氨基酸序列，和SEQ ID NO：31所示的CDR-H3氨基酸序列；和轻链可变区包含SEQ ID NO：25所示的CDR-L1氨基酸序列，和SEQ IDNO：30所示的CDR-L2氨基酸序列，和SEQ ID NO：6所示的CDR-L3氨基酸序列；

(4)CDR的氨基酸序列采用Kabat方法来定义，重链可变区包含SEQ ID NO：23所示的CDR-H1氨基酸序列，和SEQ ID NO：28所示的CDR-H2氨基酸序列，和SEQ ID NO：31所示的CDR-H3氨基酸序列；和轻链可变区包含SEQ ID NO：25所示的CDR-L1氨基酸序列，和SEQ IDNO：30所示的CDR-L2氨基酸序列，和SEQ ID NO：6所示的CDR-L3氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体为鼠源的或者人源化的。

3.如权利要求2所述抗体，其特征在于，所述抗体为鼠源的，其重链可变区包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3的重链FR区；和其轻链可变区包含鼠源κ、λ链的轻链FR区。

4.如权利要求3所述抗体，其特征在于，其重链可变区包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；和/或其轻链可变区包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

5.如权利要求2所述抗体，其特征在于，所述抗体为人源化的，其重链可变区包含选自SEQ ID NOs：9、11、13、15和17所示的氨基酸序列；和其轻链可变区包含选自SEQ ID NOs：10、12、14、16和18所示的氨基酸序列。

6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，包含重链可变区和轻链可变区，且选自下组：

(a)重链可变区如SEQ ID NO：9所示，和轻链可变区如SEQ ID NO：10所示；

(b)重链可变区如SEQ ID NO：11所示，和轻链可变区如SEQ ID NO：12所示；

(c)重链可变区如SEQ ID NO：13所示，和轻链可变区如SEQ ID NO：14所示；

(d)重链可变区如SEQ ID NO：15所示，和轻链可变区如SEQ ID NO：16所示；

(e)重链可变区如SEQ ID NO：17所示，和轻链可变区如SEQ ID NO：18所示。

7.如权利要求1-6任一项所述抗体，其特征在于，所述抗体包含一个或更多个氨基酸的替换、添加和/或缺失，且与其来源序列至少95％、96％、97％、98％或99％同源；其中，所述抗体与GPC-3结合的K_D值为≤5×10^-11M。

8.如权利要求1-6任一项所述抗体，其特征在于，所述抗体为包含人IgG2或IgG1的重链恒定区和人κ轻链恒定区的全长抗体；或仅包含Fab或Fab’2或ScFv的抗原结合片段。

9.如权利要求1-6任一项所述抗体，其特征在于，所述抗体含有糖基化修饰。

10.编码如权利要求1-7任一项所述抗体的DNA分子。

11.如权利要求10所述的DNA分子，其特征在于，编码所述抗体重链可变区的DNA分子选自SEQ ID NO：19和21，和编码所述抗体轻链可变区的DNA分子选自SEQ ID NO：20和22。

12.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求10或11所述DNA分子。

13.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求12所述的表达载体，所述宿主细胞为CHO细胞。

14.一种免疫缀合物，其特征在于，包含如权利要求1-7任一项所述抗体，所述免疫缀合物还包含治疗剂，其中，治疗剂为毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。

15.一种药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1-7任一项所述抗体以及可药用赋形剂、载体或稀释剂。

16.制备如权利要求1-7任一项所述抗体的方法，其包括：在允许产生所述抗体的条件下培养包含如权利要求13所述的宿主细胞，以及回收、分离产生的所述抗体。

17.如权利要求1-7任一项所述抗体或如权利要求14所述免疫缀合物或如权利要求15所述的药物组合物在制备用于治疗肝细胞癌的药物中的用途。