CN117062834A - Gpc3人源化抗体及其应用 - Google Patents

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CN117062834A CN202280013317.1A CN202280013317A CN117062834A CN 117062834 A CN117062834 A CN 117062834A CN 202280013317 A CN202280013317 A CN 202280013317A CN 117062834 A CN117062834 A CN 117062834A
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Abstract

提供了一种特异性结合GPC3的人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段与GPC3蛋白具有高度亲和力，能够运用于治疗肿瘤等药物的制备中。还提供了编码所述人源化GPC3抗体或抗原结合片段的核酸分子、表达载体、宿主细胞和制备所述抗体或抗原结合片段的方法。还提供了包含其的免疫缀合物、嵌合抗原受体、免疫活性细胞、多特异性分子和药物组合物。还提供了检测GPC3的方法，以及治疗包括肝细胞癌在内的各种GPC3相关病症的方法。

Description

GPC3人源化抗体及其应用
本申请要求于2021年02月10日提交中国专利局、申请号为202110182284.0、发明名称为“GPC3人源化抗体及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体而言，涉及GPC3人源化抗体及其应用。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)是一种硫酸乙酰肝素(HS)糖蛋白，属于硫酸类肝素蛋白聚糖家族成员，它通过磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜表面。GPC3核心蛋白包括580个氨基酸，大小约70KD，它被弗林蛋白酶(Furin)剪切后，产生一个40kD的氨基(N)末端亚基和一个30kD的羧基(C)末端亚基，二者通过二硫键连接。GPC3的两条HS侧链结合在靠近C端的位置(Takahiro Nishida,Hiroaki Kataoka.Glypican3-TargetedTherapy in Hepatocellular Carcinoma，Cancers 2019；11(9):1339)。
GPC3在胚胎中胚层组织的细胞增殖中发挥重要的调节作用，缺失GPC3基因会导致过度生长综合症，即Simpson-Golabi-Behmel综合症(SGBS)。GPC3在整个胎儿期均有明显表达，而出生后到成人阶段，除在胎盘、乳腺、间皮、卵巢、肺及肾组织有弱表达外，其他正常组织无明显表达。GPC3在成人多种肿瘤组织中异常表达，如肝细胞癌(HCC)、肺鳞癌、胃癌、卵巢癌等。尤其在HCC细胞中呈现高表达，它通过提高自分泌/旁分泌经典Wnt信号传递，促进HCC细胞的生长和侵袭(Capurro MI,Xiang Y-Y,Lobe C,Filmus J.Glypican-3promotes the growth of hepatocellular carcinoma by stimulating canonical Wnt signaling.Cancer Res2005；65:6245–54.)。免疫组织化学染色检测发现大约70％的HCC病人肿瘤组织中呈现GPC3蛋白高表达(Capurro M,Wanless IR,Sherman M,et al.Glypican-3:a novel serum and histochemical marker for hepatocellular carcinoma.Gastroenterology2003；125:89–97)，因此GPC3被认为是肿瘤治 疗的一个候选靶标。
克锥特珠单抗(Codrituzumab，又称为GC33抗体)是日本中外制药研发的一种重组的人源化单克隆抗体，它结合于GPC3蛋白近膜端的区域。GC33抗体靶向GPC3阳性的HCC细胞，可以产生抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)。在临床I期试验中，Codrituzumab显示出良好的免疫耐受，对HCC病人能产生抗肿瘤效果(Ikeda M,Ohkawa S,Okusaka T,et al.Japanese phase I study of GC33,a humanized antibody against glypican-3for advanced hepatocellular carcinoma.Cancer Sci.2014,105,455–462)。但是在一项募集了185例晚期肝癌患者的Ⅱ期临床试验中，与对照组相比，Codrituzumab疗效不佳，研究人员认为，病人的结果可以通过以下两种途径得到改善：使用高剂量Codrituzumab或选择表达更高水平GPC3或CD16的患者(Abou-Alfa G.K,Puig O,Daniele B,et al.Randomizedphase II placebo controlled study of codrituzumab in previously treated patients with advanced hepatocellular carcinoma.J.Hepatol.2016,65,289–295)。总之，该抗体的临床应用情况仍有待商榷。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种特异性结合GPC3的人源化抗体或抗原结合片段。本发明还提供了包含所述抗体或抗原结合片段的免疫缀合物、嵌合抗原受体、免疫活性细胞、多特异性分子、核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物、制备方法和用途。
在本发明的第一方面，提供一种特异性结合GPC3的抗体或抗原结合片段，其包含人源化的重链可变区和/或人源化的轻链可变区，所述重链可变区包含人类来源的重链框架区、包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的互补决定区(CDR)1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR2、和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR3；所述轻链可变区包含人类来源的轻链框架区、包含SEQ ID NO：18、21的氨基酸序列的互补决定区(CDR)1、包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR2、和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述重链框架区包含SEQ ID NO：11所示IGHV1-3*01的框架区HFR1、HFR2和HFR3，以及SEQ ID NO：12所示IGHJ1*01的框架区HFR4；所述轻链框架区包含SEQ ID NO：9所示IGKV2-40*01的框架区LFR1、LFR2和LFR3，以及SEQ ID NO：10所示IGKJ2*01的框架区LFR4，其中，所述框架区根据Kabat编号系统确定。
在一些实施方式中，根据Kabat编号系统编号，所述重链框架区包含选自第1、44、69、71、73、93位上的氨基酸残基突变，优选地，所述突变包含：Q1E、R71A和A93T；Q1E、I69L、R71A和A93T；或Q1E、R44G、I69L、R71A、T73K和A93T。
在一些实施方式中，根据Kabat编号系统编号，所述轻链框架区包含至多一个氨基酸残基突变；优选地，所述突变为选自第2位上的氨基酸残基突变；优选地，所述突变为I2V。
在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含：(1)SEQ ID NO：4-6任一项所示的重链可变区，或，具有与SEQ ID NO：4-6任一项所示序列相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或，具有与SEQ ID NO：4-6任一项所示序列相比发生至多20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换；
和/或，(2)SEQ ID NO：7-8、13-14任一项所示的轻链可变区，或，具有与SEQ ID NO：7-8、13-14任一项所示序列相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或，具有与SEQ ID NO：7-8、13-14任一项所示序列相比发生至多20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
优选地，所述抗体或抗原结合片段包含：(1)具有SEQ ID NO：4、5、6所示序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：14所示序列的轻链可变区；或，
(2)具有SEQ ID NO：5所示序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：7所示序列的轻链可变区；或，
(3)分别具有与上述(1)至(2)所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高一致性的序列的重链可变区和轻链可变区。
在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包括与所述CDR1、CDR2和/或CDR3相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或与所述CDR1、CDR2和/或CDR3相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人和/或猴GPC3蛋白；优选地，与人和/或猴GPC3的解离常数(KD)不大于1.00E-7M、1.00E-8M、2.00E-8M、3.00E-8M、4.00E-8M、5.00E-8M、6.00E-8M、7.00E-8M、8.00E-8M、9.00E-8M、1.00E-9M、2.00E-9M、3.00E-9M、4.00E-9M、5.00E-9M、6.00E-9M、7.00E-9M、8.00E-9M、9.00E-9M或6.00E-10M。
在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段选自全长抗体、VH单域结构抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、Fd片段、Fv片段、互补决定区(CDR)片段、单链可变片段(scFv)、scFV2、二硫键稳定的可变片段(dsFv)、结构域抗体、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体或抗体最小识别单位。
在另一方面，本发明提供了一种免疫缀合物，其包括上述任一种抗体或抗原结合片段和效应分子；优选地，所述效应分子与所述抗体或抗原结合片段连接。
在一些实施方式中，所述效应分子包括治疗剂或标记物；优选地，所述治疗剂选自药物、毒素、放射性同位素、化疗药或免疫调节剂。
在一些实施方式中，所述免疫缀合物还包括用于将所述效应分子与所述抗体或抗原结合片段缀合的接头，所述接头包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。
在另一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含上述任一项所述抗体或抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供了一种免疫活性细胞，其表达上述任一种嵌合抗原受体或包含编码上述任一种嵌合抗原受体的核酸分子；优选地，所述免疫活性细胞选自：T细胞，NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killerT cell)、DNT细胞(double negative T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞，所述T细胞优选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞。
在另一方面，本发明提供了一种多特异性分子，其包含上述任一种抗体或抗原结合片段；优选地，所述多特异性分子进一步包含特异性结合GPC3以外的抗原或结合与上述任一种抗体或抗原结合片段不同的GPC3表位的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方式中，所述GPC3以外的抗原为T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞或嗜中性细胞表面上的抗原；优选地，所述GPC3以外的抗原选自：CD3、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD16、CD16A、CD32B、PD-1、PD-2、PD-L1、VEGF、NKG2D、CD19、CD20、CD40、CD47、4-1BB、CD137、EGFR、EGFRvIII、TNF-alpha、CD33、HER2、HER3、HAS、CD5、CD27、EphA2、EpCAM、MUC1、MUC16、CEA、Claudin18.2、叶酸受体、Claudin6、WT1、NY-ESO-1、MAGE3、ASGPR1或CDH16。
在一些实施方式中，所述多特异性分子为串联scFv、双功能抗体(Db)、单链双功能抗体(scDb)、双重亲和力再靶向(DART)抗体、F(ab')2、双重可变域(DVD)抗体、臼包杵(KiH)抗体、对接及锁定(DNL)抗体、化学交联抗体、杂多聚抗体或异结合物抗体。
在另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码上述任一种 抗体或抗原结合片段、上述任一种嵌合抗原受体、上述任一种多特异性分子。
在另一方面，本发明提供了一种载体，其包含上述核酸分子。
在另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含上述核酸分子或上述表达载体，优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，包括细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293细胞系)。
在另一方面，本发明提供了制备上述任一种抗体或抗原结合片段或多特异性分子的方法，所述方法包括：培养上述宿主细胞，以及分离所述细胞表达的抗体或抗原结合片段，或分离所述细胞表达的多特异性分子。
在另一方面，本发明提供了制备所述免疫活性细胞的方法，其包括：将包含编码上述任一种嵌合抗原受体的核酸片段导入所述免疫活性细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫活性细胞表达上述任一种嵌合抗原受体。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包括治疗有效量的一种或组合的：上述任一种的抗体或抗原结合片段；或上述任一种的免疫缀合物；或上述任一种的免疫活性细胞；或上述任一种的多特异性分子；或上述任一种的核酸分子、表达载体或宿主细胞，或上述任一项所述方法制备获得的产品，以及药学上可接受的载体。
在另一方面，还提供了本发明公开的上述任一种抗体或抗原结合片段、免疫缀合物、免疫活性细胞、多特异性分子、核酸分子、表达载体、所述方法制备获得的产品或药物组合物在制备治疗GPC3介导的肿瘤的药物中的用途；优选地，所述肿瘤选自肝细胞癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、肝胚细胞瘤、成神经细胞瘤、肾母细胞瘤、小细胞肺癌、肺腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌，皮肤癌、淋巴癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、食道癌、甲状腺癌、睾丸癌、膀胱癌、支气管癌、鼻咽癌、头颈癌、子宫内膜癌、脑癌、骨癌、白血病、恶性间皮瘤、脂肪肉瘤等疾病；优选为肝细胞癌。
在另一方面，本发明还提供了一种治疗患有GPC3介导的肿瘤的受试 者的方法，其包括选择患有表达GPC3的癌症的受试者，给予所述受试者治疗有效量的上述任一种抗体或抗原结合片段、免疫缀合物、免疫活性细胞、多特异性分子、核酸分子、表达载体、所述方法制备获得的产品或药物组合物；优选地，所述肿瘤选自肝细胞癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、肝胚细胞瘤、成神经细胞瘤、肾母细胞瘤、小细胞肺癌、肺腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌，皮肤癌、淋巴癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、食道癌、甲状腺癌、睾丸癌、膀胱癌、支气管癌、鼻咽癌、头颈癌、子宫内膜癌、脑癌、骨癌、白血病、恶性间皮瘤、脂肪肉瘤等疾病；优选为肝细胞癌。
在另一方面，本发明还提供了上述任一种抗体或抗原结合片段、免疫缀合物、免疫活性细胞、多特异性分子、核酸分子、表达载体、所述方法制备获得的产品或药物组合物，用于治疗GPC3阳性肿瘤或癌症；优选地，所述肿瘤选自肝细胞癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、肝胚细胞瘤、成神经细胞瘤、肾母细胞瘤、小细胞肺癌、肺腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌，皮肤癌、淋巴癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、食道癌、甲状腺癌、睾丸癌、膀胱癌、支气管癌、鼻咽癌、头颈癌、子宫内膜癌、脑癌、骨癌、白血病、恶性间皮瘤、脂肪肉瘤等疾病；优选为肝细胞癌。
在另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包含上述任一种抗体或抗原结合片段、上述任一种免疫缀合物、上述免疫活性细胞、上述任一种多特异性分子，上述核酸分子、上述表达载体、根据上述任一种方法制备获得的产品或上述药物组合物。
在另一方面，本发明还提供了上述任一种抗体或抗原结合片段在制备检测或诊断GPC3高表达肿瘤的试剂中的用途。
在另一方面，本发明还提供了一种检测生物学样品中GPC3表达的方法，其特征在于，使来自受试者的样品与上述任一种抗体或抗原结合片段接触，并检测所述抗体或抗原结合片段与所述样品的结合。
术语定义和说明
除非另外说明，本文所用术语具有所属技术领域普通技术人员通常理 解的含义。对于本文中明确定义的术语，则该术语的含义以所述定义为准。
此外，除非本文另有说明，本文单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非另外明确指出，否则单数形式“一种”和“这种”包括复数指示物。
如本文所用，术语“包括”、“包含”和“具有”之间可互换使用，旨在表示方案的包含性，意味着所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同时应当理解，在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述，也提供“由……组成”方案。
术语“和/或”在本文使用时，包括“和”、“或”和“由所属术语链接的要素的全部或任何其他组合”的含义。
本文术语“GPC3”、“Glypican-3”、“磷脂酰肌醇蛋白聚糖3”是硫酸乙酰肝素(HS)蛋白聚糖的磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成员，其通过糖基磷脂酰肌醇锚连接到细胞表面。人GPC3具有四种已知的亚型(亚型1-4)，该四种亚型的核酸和氨基酸序列是已知的，包括GenBank登录号：NM_001164617和NP_001158089(亚型1)；NM_004484和NP_004475(亚型2)；NM_001164618和NP_001158090(亚型3)；以及NM_001164619和NP_001158091(亚型4)。在本文公开的一些实施例中，本文公开的抗体可结合所述四种GPC3亚型的一种或多种，或其保守变体。
本文术语“特异性结合”是指抗原结合分子(例如抗体)通常以高亲和力特异性结合抗原和实质上相同的抗原，但不以高亲和力结合不相关抗原。亲和力通常以平衡解离常数(equilibrium dissociation constant，KD)来反映，其中较低KD表示较高亲和力。以抗体为例，高亲和力通常指具有约1.00E-7M或更低、约1.00E-8M或更低、约1.00E-9M或更低、或约1.00E-10M或更低KD。KD计算方式如下：KD＝Kd/Ka，其中Kd表示解离速率，Ka表示结合速率。可采用本领域周知的方法测量平衡解离常数KD，如表面等离子共振(例如Biacore)或平衡透析法测定。
本文术语“抗原结合分子”按最广义使用，是指特异性结合抗原的分子。示例性地，抗原结合分子包括但不限于抗体或抗体模拟物。“抗体模 拟物”是指能够与抗原特异性结合，但与抗体结构无关的有机化合物或结合域，示例性地，抗体模拟物包括但不限于affibody、affitin、affilin、经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、核酸适体或Kunitz型结构域肽。
本文术语“抗体”按最广义使用，是指包含来自免疫球蛋白重链可变区的足够序列和/或来自免疫球蛋白轻链可变区的足够序列，从而能够特异性结合至抗原的多肽或多肽组合。本文“抗体”涵盖各种形式和各种结构，只要它们展现出期望的抗原结合活性。本文“抗体”包括具有移植的互补决定区(CDR)或CDR衍生物的替代蛋白质支架或人工支架。此类支架包括抗体衍生的支架(其包含引入以例如稳定化抗体三维结构的突变)以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。参见，例如Korndorfer et al.,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,53(1):121-129(2003)；Roque et al.,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。此类支架还可以包括非抗体衍生的支架，例如本领域已知可用于移植CDR的支架蛋白，包括但不限于肌腱蛋白、纤连蛋白、肽适体等。
本文术语“抗体”包括一种典型的“四链抗体”，其属于由两条重链(HC)和两条轻链(LC)组成的免疫球蛋白；重链是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域；轻链是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链；重链与重链之间、重链与轻链之间通过二硫键连接，形成“Y”字型结构。由于免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将本文“免疫球蛋白”分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
本文术语“抗体”可以来源于任何动物，包括但不限于人和非人动物，所述非人动物可选自灵长类动物、哺乳动物、啮齿动物和脊椎动物，例如骆驼科动物、大羊驼、原鸵、羊驼、羊、兔、小鼠、大鼠或软骨鱼纲(例如鲨)。
本文术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、完整抗体、抗原结合片段、裸抗体、缀合抗体、人源化抗体或全人抗体。
本文术语“抗原结合片段”是指保留特异性结合靶抗原的能力的一个或更多个抗体片段。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、scFv、SMIP、双抗体、三抗体、亲和体(affibody)、纳米抗体、适体或结构域抗体。涵盖术语抗体的“抗原结合片段”的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab)2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(V)包含VH和VL结构域的dAb；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341:544-546,1989)或VHH；(vii)由VH或VL结构域组成的dAb；(viii)分离的互补决定区(CDR)；(ix)由VHH和CH2、CH3组成的重链抗体片段；以及(x)两个或更多个分离的CDR的组合，所述CDR可以任选地由合成接头连接。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是通过独立的基因编码的，但是这两个结构域可以使用重组方法通过接头接合，该接头能够使其制成其中VL和VH区配对以形成单价分子的单蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人，Science 242:423-426,1988以及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且这些片段被筛选用于与完整抗体相同的方式使用。可以通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解、或在一些实施方式中通过本领域已知的化学肽合成程序来产生抗原结合片段。
本文术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆(包括任何真核、原核、 或噬菌体克隆)的抗体，而不限于该抗体的产生方法。
本文术语“多特异性”是指具有至少两个抗原结合位点，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。因此，诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等术语是指抗体/抗原结合分子可以结合的不同表位的数目。
本文术语“价”表示抗体/抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。因此,术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗体/抗原结合分子中一个结合位点、两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点的存在。
本文术语“scFv”(single-chain variable fragment)是指包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键，形成二硫键连接的Fv(dsFv)。
本文术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留或部分保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于， 抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。
本文术语“可变区”是指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的区域，“重链可变区”与“VH”、“HCVR”可互换使用，“轻链可变区”与“VL”、“LCVR”可互换使用。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。本文术语“互补决定区”与“CDR”可互换使用，通常指重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的高变区(HVR)，该部位因在空间结构上可与抗原表位形成精密的互补，故又称为互补决定区，其中，重链可变区CDR可缩写为HCDR，轻链可变区CDR可缩写为LCDR。本术语“框架区”或“FR区”可互换，是指抗体重链可变区或轻链可变区中除CDR以外的那些氨基酸残基，HFR可指代重链可变区的框架区，LFR可指代轻链可变区的框架区。通常典型的抗体可变区由4个FR区和3个CDR区按以下顺序组成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
对于CDR的进一步描述，参考Kabat等人,J.Biol.Chem.,252:6609-6616(1977)；Kabat等人,美国卫生与公共服务部，“Sequences of proteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)。本文“CDR”可由本领域公知的方式加以标注和定义，包括但不限于Kabat编号系统、Chothia编号系统或IMGT编号系统，使用的工具网站包括但不限于AbRSA网站(http://cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php)、abYsis网站(www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)和IMGT网站 (http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results)。本文CDR包括不同定义方式的氨基酸残基的重叠(overlap)和子集。
如无其他说明，本文所述“抗体”或“抗原结合片段”氨基酸残基编号由Kabat编号系统确定，详见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991，关于抗体可变区氨基酸残基的编号可参考以下网址：http://www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi。
根据Kabat编号系统
SEQ ID NO：9所示IGKV2-40*01和SEQ ID NO：10所示IGKJ2*01的框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4
LFR1为DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISC(SEQ ID NO：22)
LFR2为WYLQKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO：23)
LFR3为GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO：24)
LFR4为FGQGTKLEIK(SEQ ID NO：10)
SEQ ID NO：11所示IGHV1-3*01和SEQ ID NO：12所示IGHJ1*01的框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4：
HFR1为QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(SEQ ID NO：25)
HFR2为WVRQAPGQRLEWMG(SEQ ID NO：26)
HFR3为RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：27)
HFR4为WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：12)
本文术语“保守氨基酸”通常是指属于同一类或具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性、亲水性、主链构象和刚性)的氨基酸。示例性地，下述每组内的氨基酸属于彼此的保守氨基酸残基，组内氨基酸残基的替换属于保守氨基酸的替换：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
本文术语“同一性”和“序列……一致性”可以互换，通过以下方式计算获得：为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的“同一性”百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。
本文术语“免疫缀合物”指包含至少一个效应分子和至少一个抗体或其功能片段的多肽分子。
本文术语“效应分子”是免疫缀合物的一部分，其意欲对所述免疫缀合物靶向的细胞具有需要的作用。效应分子还被称为效应部分(effector moiety，EM)、治疗剂或诊断剂或示踪剂或类似的术语。
本文术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指经改造以在免疫活性细胞上表达并且特异性结合抗原的人工细胞表面受体，其包含至少(1)细胞外抗原结合结构域，例如抗体的可变重链或轻链，(2)锚定CAR进入免疫活性细胞的跨膜结构域，和(3)胞内信号传导结构域。CAR能够利用细胞外抗原结合结构域以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫活性细胞重定向至所选择的靶标，例如癌细胞。
本文术语“多特异性分子”是指具有至少两个抗原结合位点，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。因此，诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等是指抗体/抗原结合分子可以结合的不同表位的数目。
本文术语“免疫活性细胞”是指在生物体内担负免疫功能的细胞。作为 免疫活性细胞，可列举例如：T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞等淋巴细胞类细胞；单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等抗原呈递细胞；嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞等粒细胞。具体而言，优选列举来自人、狗、猫、猪、小鼠等哺乳动物的T细胞或NK细胞，优选为来自人的T细胞或NK细胞。另外，T细胞可以由血液、骨髓液等体液以及脾脏、胸腺、淋巴结等组织、或者浸润到原发肿瘤、转移肿瘤、癌性腹水等癌组织的免疫活性细胞中分离、纯化而得到，还可以利用由ES细胞、iPS细胞制作的T细胞。作为所述T细胞，可列举α-βT细胞、γ-δT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、肿瘤浸润T细胞、记忆T细胞、初始T细胞、NKT细胞。需要说明的是，免疫活性细胞的来源和给药对象可以相同也可以不同。进而，当给药对象为人时，作为免疫活性细胞，可以使用采自作为给药对象的患者本人的自体细胞，也可以使用采自他人的异体细胞。即，供体与受体可以一致也可以不一致，优选一致。
本文术语“载体(Vector)”是指被导入宿主细胞从而产生转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含本领域已知的一个或多个选择标记基因以及其他遗传元件。
本文术语“宿主细胞”是指在其中载体可以增殖并且其DNA可以表达的细胞，所述细胞可以是原核细胞或者真核细胞。该术语还包括受试宿主细胞的任何后代。应理解，并不是所有的后代都与亲本细胞相同，因为在复制过程中可能会发生突变，这类后代被包括在内。
本文术语“药学上可接受的载体”包括生理相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂以及类似物。通常，载体的性质取决于采用的具体给药方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体作为运载体(vehicle)，所述可注射流体包含可药用和生理上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可以包括，例如药品级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性载体之外，待给予的药物组合物还可以包含少量的无毒辅助物质，例 如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
本文术语“治疗有效量”是指如本文所公开的抗GPC3抗体或组合物的有效“治疗”个体的疾病或病症的量。在癌症的情况下，如本文所公开的抗GPC3抗体或组合物的治疗有效量可以减少癌细胞数目；减小肿瘤尺寸或重量；抑制(即在一定程度上减缓且优选为阻止)癌细胞浸润到周边器官；抑制(即在一定程度上缓慢且优选为阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与癌症有关的一或多种症状。就如本文所公开的抗GPC3抗体或组合物可阻止生长及/或杀死现有癌细胞而言，其可以具有细胞抑制性及/或细胞毒性。在一些实施例中，治疗有效量为生长抑制量。在一些实施例中，治疗有效量为延长患者存活期的量。在一些实施例中，治疗有效量为改善患者的无进展存活期的量。
本文术语“治疗”是指为用于获得有益或所需结果(包含临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益或所需临床结果包含(但不限于)以下中的一或多者：减轻疾病所引起的一或多种症状、减弱疾病程度、稳定疾病(例如预防或延迟疾病恶化)、预防或延迟疾病扩散(例如转移)、预防或延迟疾病复发、延迟或减缓疾病进展、改善疾病状态、使得疾病缓解(部分或完全)、减少治疗疾病所需的一或多种其它药物的剂量、延迟疾病进展、提高或改进生活质量、增大体重增加及/或延长存活期。“治疗”还涵盖癌症的病理性结果(例如肿瘤体积)减小。本发明的方法涵盖这些治疗方面中的任一者或多者。
本文术语“受试者”是指接受对如本发明所述的特定疾病或病症的治疗的生物体。对象和患者的实例包括接受疾病或病症治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物(例如，猴)或非灵长类哺乳动物。
本文术语“诊断”是指鉴定病理病症例如但不限于肝癌、卵巢癌、黑色素瘤或肺癌的存在或性质。诊断方法的灵敏度和特异性有所不同。诊断测定的“灵敏度”是被测试为阳性的患病个体的百分数(真阳性的百分数)。诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率，其中假阳性率定义为被测试为阳性的没有患所述疾病的那些个体的比例。虽然某一具体的诊断方法可能不能 提供对病症的明确诊断，但是只要所述方法可提供帮助诊断的阳性指示就足够了。
本文术语“肝细胞癌(HCC)”是指一种原发性的肝恶性肿瘤，一般发生在具有由病毒性肝炎、肝毒素或肝硬化(经常由酒精中毒引起)引起的炎症性肝的患者中。HCC也被称为恶性肝细胞瘤。
附图说明
图1A为ELISA检测对照抗体与人GPC3-His蛋白的结合反应；
图1B为ELISA检测对照抗体与猴GPC3-His蛋白的结合反应；
图1C为ELISA检测对照抗体与鼠GPC3-His蛋白的结合反应；
图2为ELISA检测对照抗体与多肽GC3pep蛋白的结合反应；
图3为Y035抗体和T2-23抗体检测HepG2细胞GPC3表达量的FACS结果；
图4为Y035抗体检测CHO-K1-人GPC3细胞GPC3表达量的FACS结果；
图5为Y035抗体检测HEK293T-猴GPC3细胞GPC3表达量的FACS结果；
图6为ELISA检测抗GPC3人源化抗体与人GPC3-his蛋白的结合反应；
图7A为FACS检测抗GPC3人源化抗体与CHO-K1-人GPC3细胞的结合反应；
图7B为FACS检测抗GPC3人源化抗体与CHO-K1细胞的结合反应；
图8A为FACS检测抗GPC3人源化抗体与HepG2肿瘤细胞的结合反应；
图8B为FACS检测抗GPC3人源化抗体与A431肿瘤细胞的结合反应；
图9为ELISA检测抗GPC3人源化抗体与鼠GPC3-his蛋白的结合反应；
图10为ELISA检测抗GPC3人源化抗体与猴GPC3-His蛋白的结合 反应；
图11A为FACS检测抗GPC3人源化抗体与HEK293T-猴GPC3细胞的结合反应；
图11B为FACS检测抗GPC3人源化抗体与HEK293T细胞的结合反应；
图12为ELISA检测抗GPC3人源化抗体与GC3pep多肽蛋白的结合反应。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1对照抗体制备、人源多肽制备、内源细胞鉴定和过表达细胞株的制备
(A)对照抗体的制备
Y035和T2-23克隆是识别人GPC3蛋白的抗体，二者与人GPC3蛋白有很强的结合亲和力，同时也能结合GPC3高表达细胞系，如HepG2等。Y035和T2-23克隆的重链可变区和轻链可变区序列均根据专利US2019/0046659A1获得。分别将识别人GPC3的克隆Y035和T2-23的VL和VH以及人IgG1 Fc按照从N端到C端的顺序连接，其中VH和VL之间通过3个GGGGS连接子连接，形成scFv-人IgG1 Fc(scFv-hFc)的形式，将其对应的核苷酸序列分别克隆到pTT5载体(购自优宝生物)中，并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见 Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。将表达载体按照PEI(购自Polysciences)说明书瞬时转染HEK293E细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)并使用FreeStyle TM293(Invitrogen)在37℃下连续培养5天，离心去除细胞成分，获得含ScFv-人IgG1 Fc(hFc)形式的抗体的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A层析柱(蛋白A填料AT Protein A Diamond和层析柱BXK16/26均购自博格隆)，使用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗后再用20mM PB，1MNaCl，pH 7.2进行清洗，最后使用pH3.4的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集从蛋白A层析柱上洗脱下来的带Fc标签的抗体，用1/10体积的pH8.0的1M Tris中和，用PBS在4℃条件透析过夜，透析后的抗体使用Nanodrop测定浓度，使用HPLC-SEC测定抗体纯度，使用内毒素检测试剂盒(购自安度斯)检测抗体内毒素含量，最后将抗体经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存。表1是对照抗体的序列信息，其中Y035 scFv-hFc第1-113位是VL序列，第129-243位是VH序列，T2-23 scFv-hFc第1-111位是VL序列，第127-247位是VH序列，如下划线所示。
表1对照抗体的氨基酸序列
对照抗体与人GPC3-His蛋白(购自Acro，货号：GP3-H52H4)、猴GPC3-His蛋白(购自Acro，货号：GP3-C5225)以及鼠GPC3-His蛋白(购自Sino Biological，货号：50989-M08B)的结合活性用ELISA进行检测。具体方法为：将抗原蛋白用PBS稀释到终浓度1μg/mL，然后以50μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用PBS洗板2次，加入封闭液[PBS+2％(w/w)BSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液，加入100nM梯度稀释的对照抗体或阴性对照抗体50μl每孔。37℃孵育2小时后，用PBS洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗(购自Merck，货号：AP113P)，37℃孵育1小时后，用PBS洗板5次。加入TMB底物50μl每孔，室温孵育10分钟后，加入终止液(1.0M HCl)50μl每孔。用ELISA读板机(Multimode Plate Reader，EnSight，购自Perkin Elmer)读取OD450nm数值。结果如表2，3，4和图1A、1B和1C所示， Y035、T2-23抗体与人GPC3蛋白以及猴GPC3蛋白有很好 的结合活性，Y035不与鼠GPC3蛋白结合，T2-23与鼠GPC3蛋白结合 良好。IgG亚型对照为人IgG1。
表2 ELISA检测对照抗体与人GPC3-his蛋白的结合反应
表3 ELISA检测对照抗体与猴GPC3-his蛋白的结合反应
表4 ELISA检测对照抗体与鼠GPC3-his蛋白的结合反应
(B)人源多肽GC3pep的制备
生产人源GPC3(NCBI:NM_004484.3，Ala524-Lys563)的多肽GC3pep(AELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHSPLK，SEQ ID NO：3)。对制备的上述多肽分别用识别不同表位的阳性对照抗体按照实施例1(A)的ELISA方法进行检测，结果如表5和图2所示， T2-23 不能结合多肽GC3pep，Y035能结合多肽GC3pep，说明已经制备获得能 与抗体具有结合活性的抗原多肽。
表5 ELISA检测对照抗体与多肽GC3pep蛋白的结合反应
(C)内源性表达GPC3蛋白的细胞株鉴定
将HepG2细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，离心弃去培养基上清，细胞沉淀用PBS洗涤2次。用Y035和T2-23抗体作为一抗，FITC标记的二抗(购自Invitrogen，货号：A11013)经FACS(FACS CantoTM，购自BD公司)检测和分析。结果如表6以及图3所示，说明 HepG2细胞与Y035和T2-23均可结合。
表6内源细胞系HepG2细胞的FACS检测结果
(D)表达人GPC3蛋白的CHO-K1重组细胞株的制备
编码人GPC3全长氨基酸序列(NCBI:NM_004484.3)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体(购自Clontech)并制备质粒。对CHO-K1细胞系(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)进行质粒转染( 3000 Transfection Kit，购自Invitrogen，货号：L3000-015)后，在含10μg/mL puromycin的含10％(w/w)胎牛血清的DMEM/F12培养基中选择性培养2周，用Y035抗体和山羊抗人IgG H+L抗体(Jackson，货号：109605088)，在流式细胞仪(FACSAriaII，自BD Biosciences)上分选阳性单克隆细胞到96孔板，并置于37℃，5％(v/v)CO 2培养，大约2周后选择部分单克隆孔进行扩增。对扩增后的克隆经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存。具体选择结果如表7和图4所示，IgG亚型对 照为人IgG1对照。表7说明，已经制得一系列人GPC3阳性表达的CHO-K1单克隆细胞系。图4中，横坐标为细胞荧光强度，纵坐标为细胞数。结果说明， 1C3、2B5、3E9为人GPC3高水平表达细胞株。本发明中所用的人GPC3高水平表达细胞株为2B5。
表7表达人GPC3蛋白的CHO-K1重组细胞系FACS检测结果
(E)表达猴GPC3蛋白的重组HEK293T细胞株制备
编码猴GPC3全长氨基酸序列(NCBI：XP_011739317.1)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体(购自Thermofisher scientific)并制备质粒。对HEK293T细胞系用 (Promega，货号：#E2311)进行质粒转染后，在含10μg/mL puromycin的含10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周，用Y035抗体和和山羊抗人IgG H+L抗体(Jackson，货号：109605088)在流式细胞仪(FACSAriaII，购自BD Biosciences)上分选富集阳性单克隆细胞到96孔板，并置于37℃，5％(v/v)CO 2培养，大约1周后进行扩增。对扩增后的细胞经流式细胞分析法进行检测，选择长势较好、荧光强度较高的细胞株继续扩大培养并液氮冻存。表达量的结果如图5，显示经过puromycin加压筛选后的HEK293T-猴-GPC3具有单一的阳性峰，可用于检测抗体的交叉活性。
实施例2鼠源GPC3抗体的人源化
通过比对IMGT(http://imgt.cines.fr)人类抗体重轻链可变区种系基因数据库，分别挑选与鼠源抗体同源性高的重链和轻链可变区种系基因作为模板，将鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。根据需要，将骨架序列中关键氨基酸回复突变为鼠源抗体对应的氨基酸，以保证原有的亲和力，即得到人源化抗GPC3单克隆抗体。其中抗体的CDR氨基酸残基通 常由Kabat编号系统确定并注释。
人源化轻链模板为IGKV2-40*01和IGKJ2*01，人源化重链模板为IGHV1-3*01和IGHJ1*01，将鼠源GPC3抗体的CDRs分别移植到人源模板中，即获得对应的人源化版本。根据需要，将抗GPC3的人源化抗体的FR区序列中关键氨基酸进行回复突变为鼠源抗体对应的氨基酸，以保证原有的亲和力，具体回复突变设计见表8。
表8 GPC3的人源化抗体回复突变设计
注：Grafted代表将鼠源抗体CDR植入人种系FR区序列；I2V表示将Grafted第2位I突变回V，其它依此类推。回复突变氨基酸的编号由Kabat编号系统确定。
抗GPC3的人源化抗体可变区具体序列如下：
GPC3.VH1氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示：
GPC3.VH2氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示：
GPC3.VH5氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示：
GPC3.VL1氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示：
GPC3.VL2氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示：
人源化轻链模板IGKV2-40*01氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示：
人源化轻链模板IGKJ2*01氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示：
人源化重链模板IGHV1-3*01氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示：
人源化重链模板IGHJ1*01氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示：
抗GPC3抗体存在易发生化学修饰的位点NG，我们对NG进行点突变以消除修饰风险。在其中两个实施例中，我们分别对GPC3.VL1和GPC3.VL2的NG进行突变，突变后的序列分别命名为GPC3.VL1a和GPC3.VL2a。
GPC3.VL1a氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示：
GPC3.VL2a氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示：
本发明分别从上述抗GPC3的人源化抗体轻链和重链可变区的回复突变设计中，选择不同的轻链和重链序列进行交叉组合，最终获得4个抗GPC3人源化抗体，具体组合见表9。参照实施例1方法构建形成抗GPC3人源化抗体scFv-人IgG1 Fc(scFv-hFc)的形式，Fc区序列如SEQ ID NO：1第244-475位序列所示。
表9抗GPC3人源化抗体组合
抗体名称 VL VH
S001-SIM2 GPC3.VL1 GPC3.VH2
S001-SIM3 GPC3.VL2a GPC3.VH1
S001-SIM4 GPC3.VL2a GPC3.VH2
S001-SIM5 GPC3.VL2a GPC3.VH5
上述4个人源化抗体的VH和VL序列根据Kabat编号系统的分析结果如表10所示。
表10抗GPC3人源化抗体VH和VL序列的Kabat分析结果
实施例3抗GPC3人源化抗体的鉴定
(A)酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗GPC3人源化抗体与人GPC3蛋白的结合
按照实施例1(A)的方法进行ELISA检测与数据分析。用ELISA 读板机(Multimode Plate Reader，EnSight，购自Perkin Elmer)读取OD450nm数值，抗GPC3人源化抗体与人GPC3蛋白的结合活性结果如图6和表11所示， 4个抗体均与人GPC3蛋白结合良好，其中IgG对照为hIgG1，表中的数据为OD 450nm值。
表11 ELISA检测抗GPC3人源化抗体与人GPC3蛋白的结合反应
(B)流式细胞实验(FACS)检测抗GPC3人源化抗体与表达GPC3蛋白的细胞和不表达GPC3蛋白的细胞(阴性细胞)的结合
将所需细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，吸除培养基，用PBS缓冲液洗涤2次，用胰酶消化细胞，然后用完全培养基终止消化，并吹打细胞至单细胞悬液。细胞计数后，离心，将细胞沉淀用FACS缓冲液(PBS+2％胎牛血清)重悬至2x10 6细胞每毫升，按每孔50μl加入到96孔FACS反应板中，加入抗GPC3人源化抗体待测样品每孔50μl，4度孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，加入每孔50μl山羊抗人IgG H+L抗体(Jackson，货号：109605088)，冰上孵育1小时。PBS缓冲液离心洗涤3次，100μl PBS重悬细胞后，用FACS(FACS CantoTM，购自BD公司)检测和分析结果。通过软件(FlowJo)进行数据分析，得到细胞的平均荧光强度(MFI)。再通过软件(GraphPad Prism8)分析，进行数据拟合，计算EC50。表12和图7A、7B表明 4个抗GPC3人源化 抗体均可结合CHO-K1-人GPC3细胞，不结合CHOK1细胞；表13和图8A、8B表明 4个抗GPC3人源化抗体均可结合HepG2细胞，均不结合 A431细胞。
表12 FACS检测抗GPC3人源化抗体与CHO-K1-人GPC3细胞和CHOK1细胞结合反应
表13 FACS检测抗GPC3人源化抗体与HepG2细胞和A431细胞结合反应
实施例4抗GPC3人源化抗体的交叉结合活性检测
(A)ELISA检测抗GPC3人源化抗体与猴GPC3蛋白和鼠GPC3蛋白的结合
将猴GPC3-His蛋白(购自Acro，货号：GP3-C5225)和鼠GPC3-his蛋白(购自Sino Biological，货号：50989-M08B)分别按照实施例1(A)的方法进行ELISA检测与数据分析。抗GPC3人源化抗体与鼠GPC3蛋白的ELISA结果如图9和表14所示，结果表明， 4个抗GPC3人源化抗 体与鼠GPC3蛋白均不结合。其中IgG对照为hIgG1，表中的数据为OD 450nm值。
表14 ELISA检测抗GPC3人源化抗体与鼠GPC3蛋白的结合反应
抗GPC3人源化抗体与猴GPC3蛋白的ELISA结果如图10和表15所示，结果表明， 4个抗GPC3人源化抗体与猴GPC3蛋白均结合良好。
表15 ELISA检测抗GPC3人源化抗体与猴GPC3蛋白的结合反应
(B)ELISA检测抗GPC3人源化抗体与表达猴GPC3蛋白的细胞结合
将HEK293T-猴GPC3细胞按照实施例3(B)的方法进行FACS检测与数据分析。分析结果如表16以及图11A、11B所示， 4个抗GPC3人 源化抗体均与HEK293T-猴-GPC3细胞结合，与HEK293T细胞不结合。
表16 FACS检测抗GPC3人源化抗体与HEK293T-猴GPC3细胞和HEK293T细胞结合反应
实施例5抗GPC3人源化抗体的亲和力检测
(A)抗GPC3人源化抗体与人GPC3蛋白亲和力检测
使用Protein A芯片(GE Helthcare；29-127-558)捕获抗GPC3人源化抗体。样品和运行缓冲液是HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％surfactant P20)(GE Healthcare；BR-1006-69)。流经池设置为25℃。样品块设置为16℃。两者都用运行缓冲液预处理。在每一个循环中，首先用Protein A芯片捕获待测抗体，然后注入单一浓度的GPC3抗原蛋白，记录抗体和抗原蛋白的结合和解离过程，最后用Glycine pH1.5(GE Helthcare；BR-1003-54)完成芯片再生。通过注射溶液中不同浓度的人GPC3-His持续240秒来测量结合，其中流速为30μL/分钟，从200nM起始(测试的实际浓度见详细结果)，以1：1稀释，总共5个浓度。监测解离相长达600秒，并通过从样品溶液切 换到运行缓冲液触发。通过用10mM甘氨酸溶液(pH 1.5)以30μL/分钟的流速洗涤30秒，再生表面。通过减去从山羊抗人Fc表面获得的响应来校正本体折射率(Bulk refractive index)差异。也减去空白注射(＝双重参照)。为了计算表观KD和其他动力学参数，使用Langmuir 1：1模型。抗GPC3人源化抗体与人GPC3蛋白的结合速率(K a)、解离速率(K d)及结合亲和力(KD)如表所示，其中抗体Y035作为对照。如表17所示， 4个抗GPC3人源化抗体与人GPC3蛋白的亲和力均在 1E-8M以上。
表17抗GPC3人源化抗体与人GPC3蛋白的结合亲和力
抗体名称 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
S001-SIM2 1.92E+05 3.91E-04 2.04E-09
S001-SIM3 1.94E+05 4.11E-04 2.12E-09
S001-SIM4 1.87E+05 3.67E-04 1.96E-09
S001-SIM5 2.11E+05 2.25E-04 1.07E-09
Y035 1.55E+05 2.73E-04 1.76E-09
(B)抗GPC3人源化抗体与猴GPC3-his蛋白亲和力检测
按照实施例5(A)的方法对抗GPC3人源化抗体与猴GPC3-His蛋白进行亲和力检测，其中抗体Y035作为对照。如表18所示， 4个抗GPC3 人源化抗体与猴GPC3蛋白的亲和力均在1E-8M以上，其中SIM5的亲 和力优于1E-9M，达到5.41E-10M。
表18抗GPC3人源化抗体与猴GPC3蛋白的结合亲和力
抗体名称 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
S001-SIM2 2.76E+05 4.07E-04 1.47E-09
S001-SIM3 3.38E+05 3.83E-04 1.13E-09
S001-SIM4 3.08E+05 3.66E-04 1.19E-09
S001-SIM5 3.75E+05 2.03E-04 5.41E-10
Y035 2.47E+05 3.13E-04 1.27E-09
实施例6抗体抗原结合表位(epitope)分析(抗体抗原结合区域的鉴定)
成熟的GPC3蛋白具有一个40kD左右可溶性的能够进入血液的的氨 基端(N末端)肽和一个30kD左右的膜结合的羧基端(C末端)肽。Y035抗体识别GPC3蛋白C末端靠近细胞膜的区域(近膜端)，T2-23抗体识别非近膜端区域。为了鉴定抗GPC3人源化抗体的抗原结合表位是否位于近膜端，按照实施例1(A)ELISA方法，包被人源GPC3的多肽GC3pep(近膜端)对抗GPC3人源化抗体进行近膜端结合鉴定，如图12和表19所示， 4个抗GPC3人源化抗体均能识别GC3pep，属于识别近膜端表位 的抗体。
表19 ELISA方法检测抗GPC3人源化抗体与多肽GC3pep的结合反应
以上对本发明所提供的GPC3人源化抗体及其应用进行了详细介绍。本文应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (29)

  1. 一种特异性结合GPC3的抗体或抗原结合片段，其包含人源化的重链可变区和/或人源化的轻链可变区，所述重链可变区包含人类来源的重链框架区、包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的互补决定区(CDR)1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR2、和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR3；所述轻链可变区包含人类来源的轻链框架区、包含SEQ ID NO：18、21的氨基酸序列的互补决定区(CDR)1、包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR2、和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR3。
  2. 权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述重链框架区包含SEQ ID NO：11所示IGHV1-3*01的框架区HFR1、HFR2和HFR3，以及SEQ ID NO：12所示IGHJ1*01的框架区HFR4；所述轻链框架区包含SEQ ID NO：9所示IGKV2-40*01的框架区LFR1、LFR2和LFR3，以及SEQ ID NO：10所示IGKJ2*01的框架区LFR4，其中，所述框架区根据Kabat编号系统确定。
  3. 权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，根据Kabat编号系统编号，所述重链框架区包含选自第1、44、69、71、73、93位上的氨基酸残基突变，优选地，所述突变包含：Q1E、R71A和A93T；Q1E、I69L、R71A和A93T；或Q1E、R44G、I69L、R71A、T73K和A93T。
  4. 权利要求2或3所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，根据Kabat编号系统编号，所述轻链框架区包含至多一个氨基酸残基突变；优选地，所述突变为选自第2位上的氨基酸残基突变；优选地，所述突变为I2V。
  5. 权利要求1-4任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含：(1)SEQ ID NO：4-6任一项所示的重链可变区，或，具有与SEQ ID NO：4-6任一项所示序列相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或，具有与SEQ ID NO：4-6任一项所示序列相比发生至多20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12 个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换；
    和/或，(2)SEQ ID NO：7-8、13-14任一项所示的轻链可变区，或，具有与SEQ ID NO：7-8、13-14任一项所示序列相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或，具有与SEQ ID NO：7-8、13-14任一项所示序列相比发生至多20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
  6. 权利要求5所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含：
    (1)具有SEQ ID NO：4、5、6所示序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：14所示序列的轻链可变区；或，
    (2)具有SEQ ID NO：5所示序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：7所示序列的轻链可变区；或，
    (3)分别具有与上述(1)至(2)所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高一致性的序列的重链可变区和轻链可变区。
  7. 权利要求1-6任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括与所述CDR1、CDR2和/或CDR3相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或与所述CDR1、CDR2和/或CDR3相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
  8. 权利要求1-7任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人和/或猴GPC3蛋白；优选地，与人和/或猴GPC3的解离常数(KD)不大于1.00E-7 M、1.00E-8 M、2.00E-8 M、3.00E-8 M、4.00E-8 M、5.00E-8 M、6.00E-8 M、7.00E-8 M、8.00E-8 M、9.00E-8 M、1.00E-9 M、2.00E-9 M、3.00E-9 M、4.00E-9 M、5.00E-9 M、6.00E-9 M、7.00E-9 M、8.00E-9 M、9.00E-9 M或6.00E-10 M。
  9. 根据权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段选自全长抗体、VH单域结构抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、Fd片段、Fv片段、互补决定区(CDR)片段、单链可变片段(scFv)、scFV2、二硫键稳定的可变片段(dsFv)、结构域抗体、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体或抗体最小识别单位。
  10. 一种免疫缀合物，其特征在于，所述免疫缀合物包含权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合片段和效应分子；优选地，所述效应分子与所述抗体或抗原结合片段连接。
  11. 根据权利要求10所述的免疫缀合物，其特征在于，所述效应分子包括治疗剂或标记物；优选地，所述治疗剂选自药物、毒素、放射性同位素、化疗药或免疫调节剂。
  12. 根据权利要求10或11所述的免疫缀合物，其特征在于，所述免疫缀合物还包括用于将所述效应分子与所述抗体缀合的接头，所述接头包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。
  13. 一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含权利要求1-9任一项所述抗体或抗原结合片段。
  14. 一种免疫活性细胞，其特征在于，所述免疫活性细胞表达权利要求13所述的嵌合抗原受体或包含编码权利要求13所述嵌合抗原受体的核酸分子；优选地，所述免疫活性细胞选自：T细胞，NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、DNT细胞(double negative T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞，所述T细胞优选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞。
  15. 一种多特异性分子，其特征在于，所述多特异性分子包含权利要求1-9中任一项所述的抗体或抗原结合片段；优选地，所述多特异性分子 进一步包含特异性结合GPC3以外的抗原或结合与权利要求1-9任一项所述抗体或抗原结合片段不同的GPC3表位的抗体或抗原结合片段。
  16. 根据权利要求15所述的多特异性分子，其特征在于，所述GPC3以外的抗原为T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞或嗜中性细胞表面上的抗原；优选地，所述GPC3以外的抗原选自：CD3、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD16、CD16A、CD32B、PD-1、PD-2、PD-L1、VEGF、NKG2D、CD19、CD20、CD40、CD47、4-1BB、CD137、EGFR、EGFRvIII、TNF-alpha、CD33、HER2、HER3、HAS、CD5、CD27、EphA2、EpCAM、MUC1、MUC16、CEA、Claudin18.2、叶酸受体、Claudin6、WT1、NY-ESO-1、MAGE3、ASGPR1或CDH16。
  17. 根据权利要求15或16所述的多特异性分子，其特征在于，所述多特异性分子为串联scFv、双功能抗体(Db)、单链双功能抗体(scDb)、双重亲和力再靶向(DART)抗体、F(ab')2、双重可变域(DVD)抗体、臼包杵(KiH)抗体、对接及锁定(DNL)抗体、化学交联抗体、杂多聚抗体或异结合物抗体。
  18. 一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求13所述的嵌合抗原受体、或权利要求15-17任一项所述的多特异性分子。
  19. 一种载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求18所述的核酸分子。
  20. 一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求18所述的核酸分子或权利要求19所述的表达载体，优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，包括细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293细胞系)。
  21. 一种制备权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合片段、或权利要求15-17任一项所述的多特异性分子的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求20所述的细胞，以及分离所述细胞表达的抗体或抗原结合片段，或分离所述细胞表达的多特异性分子。
  22. 一种制备权利要求14所述的免疫活性细胞的方法，其特征在于， 所述方法包括：将包含编码权利要求13所述嵌合抗原受体的核酸片段导入所述免疫活性细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫活性细胞表达权利要求13所述嵌合抗原受体。
  23. 一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括治疗有效量的一种或组合的：权利要求1-9所述的抗体或抗原结合片段；或权利要求10-12所述的免疫缀合物；或权利要求14所述的免疫活性细胞；或权利要求15-17所述的多特异性分子；或权利要求18所述的核酸分子；或权利要求19所述的表达载体；或根据权利要求21-22任一项所述方法制备获得的产品，以及药学上可接受的载体。
  24. 权利要求1-9所述的抗体或抗原结合片段；或权利要求10-12所述的免疫缀合物；或权利要求14所述的免疫活性细胞；或权利要求15-17所述的多特异性分子；或权利要求18所述的核酸分子；或权利要求19所述的表达载体；或根据权利要求21-22任一项所述方法制备获得的产品或权利要求23所述的药物组合物在制备治疗GPC3介导的肿瘤的药物中的用途；优选地，所述肿瘤选自肝细胞癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、肝胚细胞瘤、成神经细胞瘤、肾母细胞瘤、小细胞肺癌、肺腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌，皮肤癌、淋巴癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、食道癌、甲状腺癌、睾丸癌、膀胱癌、支气管癌、鼻咽癌、头颈癌、子宫内膜癌、脑癌、骨癌、白血病、恶性间皮瘤、脂肪肉瘤等疾病；优选为肝细胞癌。
  25. 一种治疗患有GPC3介导的肿瘤的受试者的方法，其特征在于，给予所述受试者治疗有效量的权利要求1-9所述的抗体或抗原结合片段；或权利要求10-12所述的免疫缀合物；或权利要求14所述的免疫活性细胞；或权利要求15-17所述的多特异性分子；或权利要求18所述的核酸分子；或权利要求19所述的表达载体；或根据权利要求21-22任一项所述方法制备获得的产品或权利要求23所述的药物组合物；优选地，所述肿瘤选自肝细胞癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、肝胚细胞瘤、成神经细胞瘤、肾母细胞瘤、小细胞肺癌、肺腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌，皮肤癌、淋巴癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、食 道癌、甲状腺癌、睾丸癌、膀胱癌、支气管癌、鼻咽癌、头颈癌、子宫内膜癌、脑癌、骨癌、白血病、恶性间皮瘤、脂肪肉瘤等疾病；优选为肝细胞癌。
  26. 权利要求1-9所述的抗体或抗原结合片段；或权利要求10-12所述的免疫缀合物；或权利要求14所述的免疫活性细胞；或权利要求15-17所述的多特异性分子；或权利要求18所述的核酸分子；或权利要求19所述的表达载体；或根据权利要求21-22任一项所述方法制备获得的产品或权利要求23所述的药物组合物，其特征在于，用于治疗GPC3阳性肿瘤或癌症；优选地，所述肿瘤选自肝细胞癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、肝胚细胞瘤、成神经细胞瘤、肾母细胞瘤、小细胞肺癌、肺腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌，皮肤癌、淋巴癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、食道癌、甲状腺癌、睾丸癌、膀胱癌、支气管癌、鼻咽癌、头颈癌、子宫内膜癌、脑癌、骨癌、白血病、恶性间皮瘤、脂肪肉瘤等疾病；优选为肝细胞癌。
  27. 一种试剂盒，其包含权利要求1-9所述的抗体或抗原结合片段；或权利要求10-12所述的免疫缀合物；或权利要求14所述的免疫活性细胞；或权利要求15-17所述的多特异性分子；或权利要求18所述的核酸分子；或权利要求19所述的表达载体；或根据权利要求21-22任一项所述方法制备获得的产品或权利要求23所述的药物组合物。
  28. 权利要求1-9所述的抗体或抗原结合片段在制备检测或诊断GPC3高表达肿瘤的试剂中的用途。
  29. 一种检测生物学样品中GPC3表达的方法，其特征在于，使来自受试者的样品与权利要求1-9所述的抗体或抗原结合片段接触，并检测所述抗体或抗原结合片段与所述样品的结合。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2024114404A1 (zh) * 2022-11-28 2024-06-06 成都科伦精准生物科技有限公司 特异性结合gpc3的嵌合抗原受体及其应用
WO2024114410A1 (zh) * 2022-11-28 2024-06-06 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 靶向gpc3的抗体及其用途

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006046751A1 (ja) * 2004-10-26 2006-05-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 糖鎖改変抗グリピカン３抗体
CL2009000647A1 (es) * 2008-04-04 2010-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para tratar o prevenir cancer hepatico que comprende una combinacion de un agente quimioterapeutico y un anticuerpo anti-glipicano 3; agente para atenuar un efecto secundario que comprende dicho anticuerpo; metodo para tratar o prevenir un cancer hepatico de un sujeto.
TWI693073B (zh) * 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
US11760807B2 (en) * 2014-05-08 2023-09-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha GPC3-targeting drug which is administered to patient responsive to GPC3-targeting drug therapy
SG11201800989RA (en) * 2015-08-03 2018-03-28 Carsgen Therapeutics Ltd Antibody against glypican-3 and application thereof
CN108164600B (zh) * 2016-12-07 2024-04-02 上海吉倍生物技术有限公司 一种抗gpc3抗体及其制备方法和用途
CN109988240B (zh) * 2017-12-29 2022-06-28 安源医药科技（上海）有限公司 抗gpc-3抗体及其用途
JPWO2020017479A1 (ja) * 2018-07-17 2021-08-02 ノイルイミューン・バイオテック株式会社 抗ｇｐｃ３一本鎖抗体を含むｃａｒ
CN116063528A (zh) * 2019-08-16 2023-05-05 原启生物科技(上海)有限责任公司 一种分离的抗原结合蛋白及其用途

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