CN112703013B - Cd3抗原结合片段及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了人源化和多功能CD3抗体，其中包括的CD3的重链可变区包含SEQ ID NOs:1‑3中任一条的氨基酸序列或其变体序列，轻链可变区包含SEQ ID NOs:26‑28中任一条的氨基酸序列或其变体序列。本申请还提供了一种多功能抗体，该抗体包括(a)轻链‑重链对，该轻链‑重链对针对肿瘤细胞或微生物具有特异性；和(b)融合肽，该融合肽包括单链可变片段和具有CH2结构域和/或CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽针对免疫细胞具有特异性。本申请提供的抗体具有改善的生物学活性、热稳定性和/或耐酸性。

Description

CD3抗原结合片段及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及抗体工程领域。具体而言，本发明涉及抗体，例如多功能抗体，例如针对CD3的抗体，尤其是人源化的抗体，所述抗体的抗原结合片段以及相关用途。
背景技术
CD3是T细胞表面分子，其能够与T细胞表面的T细胞受体结合形成TCR-CD3复合物活化T细胞，在抗原识别和免疫信号传导中起重要作用。CD3抗体广泛应用于移植排斥反应和自身免疫病等的治疗中。已知鼠源CD3抗体如OKT3可能导致显著的人抗鼠抗体(HAMA)反应而不利于在人中使用。因此，需要对这类鼠源抗体进行人源化或其他处理，以降低不良反应。目前避免或减少HAMA反应的主要途径是使鼠源性单抗人源化或研制完全人源化抗体。例如，可以通过向鼠源抗体引入与人抗体蛋白相同的序列片段，降低HAMA反应。但是，人类中可能并不存在结构类似的蛋白，从而可能无法进行这样的处理。而且，人源化抗体往往遇到抗体亲和力下降、活力不高、稳定性差或产量低等瓶颈问题而无法获得有效的治疗蛋白。
发明内容
本发明提供了一种抗体，例如多功能抗体，例如针对CD3的抗体，尤其是人源化的抗体，所述抗体的抗原结合片段以及相关用途。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，特别是人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体特异性结合灵长类如人和/或猴CD3，所述抗体包括构架区，分别为FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4、FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，和互补性决定区(CDR)，其中重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3氨基酸序列分别为SEQ ID NOs：1、2和3所示的氨基酸序列，或其变体序列，例如CDR-H3的变体序列SEQ ID Nos：4-14和190-191所示序列中的任一种，轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3氨基酸序列分别为SEQ ID N0：26、27和28所示的氨基酸序列，或其变体序列，其中所述人源化抗体的构架区包括下述序列中的一个或多个：
a)SEQ ID No：15或16的FR-H1；
b)QEQ ID No：17的FR-H2；
c)SEQ ID Nos：18-24中任一个的FR-H3；
d)SEQ ID No：25的FR-H4；
e)SEQ ID Nos：29-31中任一个的FR-L1；
f)SEQ ID Nos：32-38中任一个的FR-L2；
g)SEQ ID Nos：39-42中任一个的FR-L3；和/或
h)SEQ ID Nos：43-44中任一个的FR-L4。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，特别是人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体特异性结合灵长类如人和/或猴CD3，其中所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括下述任一项的序列：
a)SEQ ID NOs：45-62的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NOs：45-62的至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NOs：45-62的至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
所述轻链可变区包括下述任一项的序列：
d)SEQ ID NOs：63-73的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NOs：63-73的至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NOs：63-73的至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，特别是人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体特异性结合灵长类如人和/或猴CD3，其中所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含选自下组的氨基酸序列：
a)SEQ ID Nos：46、63；SEQ ID Nos：47、63；SEQ ID Nos：49、63；SEQ ID Nos：50、63；SEQ ID Nos：51、63；SEQ ID Nos：46、71；SEQ ID Nos：47、71；SEQ ID Nos：49、71；SEQ IDNos：51、71；SEQ ID Nos：52、72；SEQ ID Nos：53、72；SEQ ID Nos：54、72；SEQ ID Nos：55、72；SEQ ID Nos：56、72；SEQ ID Nos：57、72；SEQ ID Nos：58、72；SEQ ID Nos：62、72；SEQ IDNos：52、73；SEQ ID Nos：53、73；SEQ ID Nos：54、73；SEQ ID Nos：55、73；SEQ ID Nos：56、73；SEQ ID Nos：57、73；SEQ ID Nos：58、73；SEQ ID Nos：61、73；SEQ ID Nos：62、73；SEQ IDNos：45、63；SEQ ID Nos：48、63；SEQ ID Nos：45、64；SEQ ID Nos：45、67；SEQ ID Nos：48、64；SEQ ID Nos：48、67；SEQ ID Nos：45、71；SEQ ID Nos：48、71；SEQ ID Nos：50、71；SEQ IDNos：61、72；SEQ ID Nos：60、73；SEQ ID Nos：60、72；SEQ ID Nos：59、72：
b)与a)的至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与a)的至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种多特异性抗体，优选双特异性抗体，其包含权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及针对其他抗原和/或其他抗原表位的抗体或抗原结合片段，例如相对于对应的非肿瘤细胞而言在肿瘤细胞上过表达的蛋白；肿瘤抗原，如CD38，BCMA，PD-L1，SLAMF7，Claudin18.2或CEA；病毒；细菌；和/或内毒素。
在一些实施方案中，本发明提供一种多肽，包含或选自SEQ ID NOs：45-62的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：45-62的至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或与SEQ IDNOs：45-62的至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种多肽，包含或选自SEQ ID NOs：63-73的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：63-73的至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或与SEQ IDNOs：63-73的至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述人源化抗体与对照抗体相比具有可比的亲和力和提高的生物学活性、热稳定性和/或耐酸性。
在一些实施方案中，本发明提供一种多核苷酸，编码本发明的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体，该抗体包括(a)轻链-重链对，该轻链-重链对针对肿瘤细胞或微生物具有特异性；和(b)融合肽，该融合肽包括单链可变片段和单链Fc片段，其中该融合肽针对免疫细胞具有特异性。在一些实施方案中，所述单链Fc片段包含本文描述的CH2和/或CH3序列，例如具有SEQ ID Nos：155-161或192任一项的序列的CH2和/或SEQ ID Nos：162-183任一项的序列的CH3。在一些实施方案中，所述融合肽包含本文描述的抗体相应序列或其部分序列，例如所述融合肽包含本文描述的人源化抗体的轻链和/或重链可变区和/或框架区序列。在一些实施方案中，所述融合肽的单链可变片段(scFv)包含本文描述的人源化抗体的scFV。
在一些实施方案中，本发明的抗体中的融合肽包括VHs-接头1-VLs-铰链1-CH2-CH3-b，重链包括VHm-CH1-铰链2-CH2-CH3-a，轻链包括VLm-CL。
在一些实施方案中，本发明的抗体中的所述轻链-重链对特异性结合：
a)相对于对应的非肿瘤细胞而言在肿瘤细胞上过表达的蛋白；
b)肿瘤抗原，如CD38，BCMA，PD-L1，SLAMF7，Claudin18.2或CEA；
c)病毒；
d)细菌；和/或
e)内毒素。
在一些实施方案中，本发明的抗体中的所述融合肽特异性结合免疫细胞抗原，例如所述融合肽包含特异性结合灵长类如人和/或猴CD3的抗原结合位点，例如所述融合肽包含本文描述的抗体的轻链和重链的可变区。
在一些实施方案中，本发明的抗体的融合肽的VH包括选自SEQ ID Nos：45-62、74、76、78、80、82、84、86、88任一项的序列；融合肽的VL包括选自SEQ ID Nos：63-73、75、77、79、81、83、85、87、89任一项的序列；融合肽的接头1包括选自SEQ ID Nos：120-138任一项的序列；融合肽的铰链1和重链的铰链2包括选自SEQ ID Nos：139-147任一项的序列；融合肽的CH2和重链的CH2包括选自SEQ ID Nos：155-161或192任一项的序列；融合肽的CH3-b包括选自SEQ ID Nos：163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183任一项的序列；重链的CH3-a包括选自SEQ ID Nos：162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182任一项的序列；重链的VHm包括选自SEQ ID Nos：90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、193任一项的序列；重链的CH1包括SEQ ID Nos：154的序列；轻链的VLm包括选自SEQ ID Nos：91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、194任一项的序列；和/或轻链的CL包括选自SEQ ID Nos：148-153任一项的序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体的融合肽的VH和融合肽的VL分别包含选自下组的氨基酸序列：a)SEQ ID Nos：45、63；SEQ ID Nos：48、63；SEQ ID Nos：48、71；SEQ ID Nos：49、63；SEQ ID Nos：49、71；SEQ ID Nos：51、71；SEQ ID Nos：58、72；SEQ ID Nos：60、72；SEQID Nos：60、73；SEQ ID Nos：59、72；SEQ ID Nos：61、73；SEQ ID Nos：62、73；SEQ ID Nos：58、72；SEQ ID Nos：74、75；SEQ ID Nos：76、77；SEQ ID Nos：78、79；SEQ ID Nos：80、81；SEQID Nos：82、83；SEQ ID Nos：84、85；SEQ ID Nos：86、87；SEQ ID Nos：88、89；
b)与a)的至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与a)的至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
所述重链的VHm和轻链的VLm分别包含选自下组的氨基酸序列：d)SEQ ID Nos：90、91；SEQ ID Nos：92、93；SEQ ID Nos：94、95；SEQ ID Nos：96、97；SEQ ID Nos：98、99；SEQ IDNos：100、101；SEQ ID Nos：102、103；SEQ ID Nos：104、105；SEQ ID Nos：106、107；SEQ IDNos：108、109；SEQ ID Nos：110、111；SEQ ID NoS：112、113；SEQ ID NoS：114、115；SEQ IDNos：116、117；SEQ ID Nos：118、119；SEQ ID Nos：193、194；
e)与d)的至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与d)的至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体中：
a)融合肽的CH3-b和重链的CH3-a具有形成杵-臼结构的替换对，例如一个CH3结构域上的T366被相对较大的氨基酸残基替换，如酪氨酸(Y)或色氨酸(W)替换，另一CH3结构域上的Y407被相对较小的氨基酸残基替换，如苏氨酸(T)，丙氨酸(A)或缬氨酸(V)，例如包含表15的一处或多处替换；
b)融合肽的CH3-b和重链的CH3-a具有形成离子键的替换对，例如该CH3结构域之一含有一处或多处替换，经在生理条件下有正电荷的氨基酸残基替换，而另一CH3结构域包含一处或多处替换，经一个或多个在生理条件下具有负电荷的氨基酸残基替换，例如该带正电的氨基酸残基为精氨酸(R)，组氨酸(H)或赖氨酸(K)，例如该带负电荷的氨基酸残基可为天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，例如被替换的氨基酸残基包括D356、L368、K392、D399和K409中的一个或多个，例如表16的一处或多处替换；
c)融合肽的CH3-b和重链的CH3-a具有形成二硫键的替换对，例如表17的替换；和/或
d)融合肽的CH3-b和重链的CH3-a具有导致与蛋白A的结合能力下降的替换，例如一个CH3结构域上的H435和Y436分别被替换为精氨酸和苯丙氨酸，如表18所示。
在一些实施方案中，本发明的抗体中的Fc片段包含选自SEQ ID Nos：155-161或192任一项的序列的CH2和/或SEQ ID Nos：162-183任一项的序列的CH3。
在一些实施方案中，本发明的抗体的该重链或融合肽的重链包含人或者人源化的Fc片段，例如人IgG Fc片段，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5 Fc片段。
在一些实施方案中，与野生型抗体比，本发明的抗体的该重链、融合肽的重链和/或该融合肽的Fc片段包含一处或多处替换，该替换在该重链和融合肽之间形成杵-臼结构配对。
在一些实施方案中，本发明的抗体的该重链和/或该融合肽的Fc片段包含一处或多处替换，该替换在该重链和融合肽之间形成盐桥配对。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括Y101，Y102，Y103，Y104，Y105，Y150-8-3，Y150-F8-4，Y150-F8-5，Y150-F8-6，Y150-F8-7，Y150-F8-8，Y150-F8-9，Y150-F8-10，Y150-F8-11，Y150-F8-12，Y150-F8-13、Y150-F8-14、Y150-F8-15、Y150-F9-7、Y150-F9-11、Y150-F9-12、MS-hCD3-IC15、MS-hCD3-IC16、MS-hCD3-IC17和MS-hCD3-IC18，其中按照融合肽VHs-接头1-VLs-铰链1-CH2-CH3-b，重链VHm-CH1-铰链2-CH2-CH3-a，轻链VLm-CL各组分的顺序，
Y101分别包括SEQ ID Nos：45、129、63、142、159、167、106、154、139、159、166、107、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y102分别包括SEQ ID Nos：48、129、63、142、159、167、106、154、139、159、166、107、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y103分别包括SEQ ID Nos：48、129、71、142、159、167、106、154、139、159、166、107、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y104分别包括SEQ ID Nos：49、129、63、142、139、167、106、154、139、159、166、107、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y105分别包括SEQ ID Nos：49、129、71、142、139、167、106、154、139、159、166、107、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-8-3分别包括SEQ ID Nos：45、129、63、141、157、167、90、154、139、157、166、91、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-F8-4分别包括SEQ ID Nos：48、129、63、141、157、167、90、154、139、157、166、91、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-F8-5分别包括SEQ ID Nos：49、129、71、141、139、167、90、154、139、157、166、91、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-F8-6分别包括SEQ ID Nos：51、129、71、141、139、167、90、154、139、157、166、91、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-F8-7分别包括SEQ ID Nos：49、129、71、144、158、167、90、154、139、158、166、91、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-F8-8分别包括SEQ ID Nos：49、129、71、144、161、167、90、154、139、161、166、91、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-F8-9分别包括SEQ ID Nos：49、129、71、144、161、167、96、154、139、161、166、97、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-F8-10分别包括SEQ ID Nos：58、129、72、144、161、167、96、154、139、161、166、97、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-F8-11分别包括SEQ ID Nos：60、129、72、144、161、167、96、154、139、161、166、97、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-F8-12分别包括SEQ ID Nos：60、129、73、144、161、167、96、154、139、161、166、97、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-F8-13分别包括SEQ ID Nos：59、129、72、144、161、167、96、154、139、161、166、97、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-F8-14分别包括SEQ ID Nos：61、129、73、144、161、167、96、154、139、161、166、97、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-F8-15分别包括62、129、73、144、161、167、96、154、139、161、166、97、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-F9-7分别包括49、129、71、141、139、167、92、154、139、157、166、93、150；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-F9-11分别包括49、129、71、144、161、167、92、154、139、161、166、93、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
Y150-F9-12分别包括49、129、71、144、192、167、92、154、139、192、166、93、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
MS-hCD3-IC15分别包括49、129、71、141、159、167、118、154、139、159、166、119、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
MS-hCD3-IC16分别包括49、129、71、141、157、167、118、154、139、157、166、119、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
MS-hCD3-IC17分别包括49、129、71、141、161、167、118、154、139、161、166、119、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；
MS-hCD3-IC18分别包括58、129、72、141、161、167、118、154、139、161、166、119、148；或者与上述至少一个氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；或者与上述至少一个氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段，可以以小于大约10-8M，例如小于大约10-8M，10-9M、10-10M或更小的KD结合靶标，或以小于大约100nM，例如小于大约10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM或更小的EC50结合靶标，优选地，所述抗原结合片段选自F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、Fd、scFv。
在一些实施方案中，本文提供一种多核苷酸，其编码本文描述的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本文提供一种表达载体，其包含本文描述的多核苷酸。
在一些实施方案中，本文提供一种宿主细胞，其包含本文描述的多核苷酸或表达载体。
在一些实施方案中，本文提供一种制备本发明的抗体的方法，其包括本文描述的多核苷酸或表达载体引入到宿主细胞中，以制备所述抗体。
在一些实施方案中，本文提供一种抗体偶联物，其包含本文描述的抗体或其抗原结合片段以及与其偶联的偶联部分，优选地，所述偶联部分选自纯化标签(如His标签)、细胞毒性剂，可检测的标记，放射性同位素、发光物质、有色物质、酶或聚乙二醇。
在一些实施方案中，本文提供一种抗体偶联物，其中所述抗体可以结合治疗剂、药物前体、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂或PEG。
在一些实施方案中，该抗体可以连接至或融合至治疗剂上，该治疗剂可包括可检测标记物，如放射性标记物、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活性治疗剂或诊断剂、细胞毒性剂，其可为药物或毒素，超声增强剂，非放射性标记物，它们的组合和其他这类本领域已知的成分。
在一些实施方案中，通过将其偶联化学发光化合物，该抗体被可检测地标记。然后，通过检测化学反应过程中产生的发光来确定化学发光物标记的抗原结合多肽的存在。特别有用的化学发光物标记化合物的例子有鲁米诺、异鲁米诺、热性(theromatic)吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
在一些实施方案中，该抗体也可被可检测地标记，使用荧光发光金属如152Eu，或其他的镧系标记。这些金属可使用以下金属螯合基团连接到抗体上，如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。将多种基团连接至抗体的技术是公知的，参见，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting 0f Drugs In CancerTherapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，inControlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等(编)，Marcel Dekker，Inc.，pp.623-53(1987)；Thorpe，“Antibody Carriers 0f Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：AReview”，in Monoclonal Antibodies’84：BiologicalAnd Clinical Applications，Pinchera等(编)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective OfThe Therapeutic Use 0f Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编)，Academic Presspp.303-16(1985)，以及Thorpe等，“The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates”.Immunol.Rev.(52：119-58(1982))。
在一些实施方案中，本文提供一种融合蛋白，其包含本文描述的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本文提供一种药物组合物，其包括本文描述的抗体或其抗原结合片段，抗体偶联物，或融合蛋白，任选地，还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物为适合于口服施用于胃肠道(GI)的剂型，优选地，所述剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂；或所述药物为适合于通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射，病灶内注射的剂型。
在一些实施方案中，本文提供一种试剂盒，其包括本文描述的抗体或其抗原结合片段，抗体偶联物，或融合蛋白，优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本文描述的抗体或其抗原结合片段，抗体偶联物，或融合蛋白；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、发光物质、有色物质、酶。
在一些实施方案中，本文提供所述抗体或其抗原结合片段，其用于治疗疾病，或本文描述的抗体或其抗原结合片段用于治疗疾病用途，或本文描述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗疾病的药物中用途。
在一些实施方案中，本文提供的抗体可与其它治疗剂(例如用于治疗肿瘤或癌症的治疗剂)组合使用。
在一些实施方案中，本文提供一种试剂盒，其包括本文提供的抗体或其抗原结合片段和药用载体，和使用说明书，以及任选的其它治疗剂(例如用于治疗肿瘤或癌症的治疗剂)。
在一些实施方案中，本文提供的组合物和/或试剂盒中，所述抗体或其抗原结合片段与细胞毒性部分、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分缀合。
在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段，能够用于治疗疾病如癌症或肿瘤。
在一些实施方案中，本文提供所述抗体或其抗原结合片段用于治疗疾病如癌症或肿瘤的用途。
在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗疾病如癌症或肿瘤的药物中用途。
在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段可以用于治疗疾病如癌症或肿瘤，包括但不限于多发性骨髓瘤，肺癌(如小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌，肺鳞癌)等。
在一些实施方案中，本文提供人源化CD3抗体的方法及所得的人源化序列。该人源化的抗体序列为基础所制备单克隆抗体和多功能抗体，具有合适的亲和力、高稳定性和良好的细胞杀伤能力。
在一些实施方案中，本文提供的该人源化CD3抗体与对照抗体如原始抗体SP34以及其他文献所提供的有较高同源性的CD3抗体相比，在多功能抗体的生物学活性及稳定性方面，显示比其他CD3抗体更好的生物学活性和/或稳定性。
在一些实施方案中，本文提供一种多功能抗体及制备方法，该抗体包含：(a)轻链-重链对，该轻链-重链对针对肿瘤细胞或微生物具有特异性；和(b)融合肽，该融合肽包含单链可变片段(ScFv)和具有CH2结构域和/或CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽针对免疫细胞具有特异性。
在一些实施方案中，本发明抗体的轻链-重链对或VLm-VHm配对针对肿瘤抗原具有特异性。在一些实施方案中，该肿瘤抗原选自：PD-L1，SLAMF7，CD38和BCMA等。在一些实施方案中，该轻链-重链对或VLm-VHm配对针对较对应的非肿瘤细胞而言在肿瘤细胞上过表达的蛋白具有特异性。
在一些实施方案中，该轻链-重链对或VLm-VHm配对针对病毒或细菌具有特异性。一方面，该轻链-重链对或VLm-VHm配对针对内毒素具有特异性。
在一些实施方案中，该免疫细胞选自T细胞、CIK细胞、NKT细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞和肥大细胞。
在一些实施方案中，该ScFv或VLs-VHs配对针对以下抗原具有特异性，该抗原包括例如CD3，CD4，CD8，CD40L，CD152，CD16，CD56，CD94，CD158，CD161，CD19，CD20，CD21，CD40。在一些实施方案中，该抗原为CD3。
在一些实施方案中，该轻链通过二硫键与该重链或融合重链结合。在一些实施方案中，该重链通过一个或多个二硫键与该融合肽结合。在一些实施方案中，该融合重链1通过一个或多个二硫键与该融合重链2。在一些实施方案中，该重链或融合重链包含人或者人源化的Fc片段。在一些实施方案中，该重链或融合重链的Fc片段包含人IgG Fc片段。在一些实施方案中，该融合肽的Fc片段包含人或者人源化的Fc片段。在一些实施方案中，该融合肽的Fc片段包含人IgG Fc片段。
在某些方面，与野生型抗体片段相比，该重链、融合重链和/或该融合肽的Fc片段包含一处或多处替换，该替换在该重链和融合肽之间形成杵-臼结构配对(knobs-into-holes)。该配对可显著提高重链和融合肽的异二聚体配对效率。
在某些方面，该重链和/或该融合肽的Fc片段包含一处或多处替换，该替换在该重链和融合肽之间形成盐桥配对(salt-bridge)。该配对可显著提高重链和融合肽的异二聚体配对效率。
在某些方面，该融合肽中的该CH2结构域位于该scFv片段和CH3结构域之间。一方面，该融合肽不包含CH1结构域。
在一个实施例中，本申请还提供一种包含上述任一实施例中的抗体的组合物。一方面，载体为药物载体。
另一实施例提供了一种复合体，该复合体包含与一个或多个抗原结合的上述任一实施例中的抗体。
附图说明
图1A显示抗体结构示意图。图1B显示抗体各组分的蛋白质一级结构示意图。
图2显示单克隆抗体各组分的蛋白质一级结构示意图。
图3显示人源化CD3单克隆抗体表达量。
图4显示单克隆抗体与CD3+T细胞的结合能力。
图5显示人源化CD3抗体组装的多功能抗体在CHO细胞中瞬时转染表达水平。
图6显示现有CD3抗体单抗的细胞亲和力。
图7显示不同的本发明的多功能抗体对T细胞的体外激活能力。
图8显示不同的多功能抗体对多发性骨髓瘤细胞MC/CAR的体外杀伤能力。
图9显示不同的多功能抗体对肺癌细胞H358的体外杀伤能力。
图10显示本发明的多功能抗体Y105与对比抗体Y106、CT-F4、CT-F5和CT-F6在柠檬酸缓冲液体系的40℃加速热稳定性检测。
图11显示本发明的多功能抗体Y150-F8-5、Y150-F8-6、Y150-F8-7及Y150-F8-8与对比抗体Y150-F8-1、Y150-F8-2、CT-F1、CT-F2及CT-F3在柠檬酸缓冲液体系中的40℃加速热稳定性检测。
图12显示本发明的多功能抗体Y150-F8-9、F8-10、F8-12、F9-7及F9-11与对比抗体Y150-F8-1、Y150-F9-6、CT-F1、CT-F2及CT-F3在柠檬酸缓冲液体系中的40℃加速热稳定性检测。
图13显示本发明的多功能抗体MS-hCD3-IC15、IC16、IC17及IC18与对比抗体IC-2至IC-7在柠檬酸缓冲液体系中的40℃加速热稳定性检测。
图14显示本发明的多功能抗体Y150-F8-5、Y150-F8-6、Y150-F8-7及Y150-F8-8与对比抗体Y150-F8-1、Y150-F8-2、CT-F1、CT-F2及CT-F3在组氨酸缓冲液体系中的40℃加速热稳定性检测。
图15显示本发明的多功能抗体Y150-F8-9、F8-10、F8-12、F9-7及F9-11与对比抗体Y150-F8-1、Y150-F9-6、CT-F1、CT-F2及CT-F3在组氨酸缓冲液体系中的40℃加速热稳定性检测。
图16显示本发明的多功能抗体MS-hCD3-IC15、IC16、IC17以及IC18与对比抗体IC-2至IC-7在组氨酸缓冲液体系中的40℃加速热稳定性检测。
图17显示本发明的多功能抗体Y105与对比抗体Y106、CT-F4、CT-F5和CT-F6在pH3.5的柠檬酸缓冲液体系的耐酸性稳定性检测。
图18显示本发明的多功能抗体Y150-F8-5、Y150-F8-6、Y150-F8-7及Y150-F8-8与对比抗体Y150-F8-1、Y150-F8-2、CT-F1、CT-F2及CT-F3在pH3.5柠檬酸缓冲液体系中的耐酸性稳定性检测。
图19显示本发明的多功能抗体Y150-F8-9、F8-10、F8-12、F9-7及F9-11与对比抗体Y150-F8-1、Y150-F9-6、CT-F1、CT-F2及CT-F3在pH3.5柠檬酸缓冲液体系中的耐酸性稳定性检测。
图20显示本发明的多功能抗体MS-hCD3-IC15、IC16、IC17和IC18与对比抗体IC-2至IC-7在pH3.5柠檬酸缓冲液体系中的耐酸性检测。
图21显示不同多功能抗体在小鼠肿瘤模型中的体内药效及瘤体积监测。其中，图21A为本发明的多功能抗体Y150-F8-8；图21B为本发明的多功能抗体F8-9；和图21C为本发明的多功能抗体F9-11；抗CD3抗体序列均为VH2a和VL5，抗CD38抗体序列均不相同。
具体实施方式
定义
自然产生的抗体中存在六个“互补决定区”或“CDR”，它们具有特定的定位以形成抗原结合结构域。该抗原结合结构域的其余氨基酸，称为“框架”区，具有更少的分子内可变性。该框架区主要采用β-折叠片构型，且CDR形成环，该环连接该β-折叠片结构，有时形成该β-折叠片结构的一部分。因此，框架区用于形成支架，该支架使CDR通过链内的、非共价作用在正确方向上定位。由该定位的CDR形成的抗原结合域定义了互补于免疫活性抗原表位的表面。该互补表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。本领域技术人员可对分别包括CDR和框架区的氨基酸针对任何给定的重链或轻链可变区容易地识别(参见，“Sequencesof Proteins of Immunological Interest，”Kabat，E.，等，美国卫生和公共服务部(U.S.Department of Health and Human Servicos，)，(1983)；Chothia和Lesk，J.MoI.Biol.，196：901-917(1987))。
本文中，使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链和轻链多肽的可变区中都存在的非连续的抗原结合位点。这种具体区域由Kabat等描述于美国卫生和公共服务部，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983)和由Chothia等描述与J.MoI.Biol.196：901-917(1987)中。根据Kabat和Chothia的定义，CDR包括相互比较时重叠的氨基酸残基，或氨基酸亚结构。然而，每种关于抗体或其变体的CDR的定义的应用都将在本文定义和使用的术语的范围内。如果给定该抗体的可变区氨基酸序列，则本领域技术人员通常可确定哪些残基包含特定CDR。
Kabat等也定义了用于可变结构域序列的编号系统，该系统适用于任一种抗体。本领域技术人员可毫无疑义地将该“Kabat编号”系统用于任何可变结构域序列，而不依赖于该序列自身之外的任何实验数据。本文使用的“Kabat编号”是指Kabat等描述的编号系统，其内容记载于美国卫生和公共服务部，“Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest”(1983)。
Kabat编号系统描述的CDR区如下：CDR-H1在大约31号氨基酸处开始(即，第一半胱氨酸残基后约9个残基)，包括约5-7个氨基酸，并在下一个色氨酸残基处终止。CDR-H2在CDR-H1的末端后第15个残基处开始，包括约16-19个氨基酸，并在下一个精氨酸或赖氨酸残基处终止。CDR-H3在CDR-H2的末端后约第33个氨基酸残基处开始；包括3-25个氨基酸；并在序列W-G-X-G处终止，其中X为任意氨基酸。CDR-L1在约残基24处开始(即，在半胱氨酸残基之后)；包括大约10-17个残基；并终止于下一个色氨酸残基。CDR-L2在CDR-L1的末端后约16个残基后开始，并包括约7个残基。CDR-L3在CDR-L2的末端后约第33个残基处开始(即，在半胱氨酸残基之后)；包括约7-11个残基，并在序列F或W-G-X-G处终止，其中X为任意氨基酸。
本文描述的抗体可来自任何动物源，包括鸟和哺乳动物，包括灵长类。优选地，抗体为人、狒狒、恒河猴，食蟹猴，鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、驼马、马或鸡的抗体。
本文描述的人源化抗体能够特异性结合CD3，例如灵长类CD3，包括例如人和/或猴CD3。
本文使用的术语“重链恒定区”包括来自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽至少包含以下一种：CH1结构域，铰链(例如，上部铰链区、中间铰链区，和/或下部铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。例如，本申请中使用的抗原结合多肽可包含具有CH1结构域的多肽链；具有CH1结构域、至少一部分的铰链结构域和CH2结构域的多肽；具有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；具有CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH3结构域的多肽链，或者具有CH1结构域，至少一部分铰链结构，CH2结构域，和CH3结构域的多肽链。在另一个实施例中，本申请的多肽包括具有CH3结构域的多肽链。另外，在本申请中使用的抗体可能缺少至少一部分CH2结构域(例如，所有的或一部分的CH2结构域)。本技术领域的普通技术人员应理解重链恒定区可能会被修改，使得它们在氨基酸序列上与天然存在的免疫球蛋白分子不同。
本文所公开的抗体的重链恒定区可以来自于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包含来自IgG1分子的CH1结构域和来自IgG3的分子的铰链区。在另一例子中，重链恒定区可以包含铰链区，该铰链区部分来自IgG1分子，且部分地来自IgG3分子。在另一例子中，重链部分可包含嵌合铰链，该嵌合铰链一部分来自IgG1分子，并且一部分来自IgG4分子。
本文使用的术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链恒定区包括恒定kappa结构域和恒定lambda结构域中的至少一个。
“轻链-重链对”是指轻链和重链的集合，它们可通过轻链的CL结构域和CH1结构域之间的二硫键形成二聚体。
各种免疫球蛋白类的恒定区的亚基结构和三维结构是已知的。术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(多数为氨基末端)恒定区。CH1结构域邻近VH结构域并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
本文使用的术语“CH2结构域”包括一部分的重链分子，该部分范围，例如，从抗体的约残基244到残基360，使用常规的编号方案(残基244至360，Kabat编号系统；和残基231-340，EU编号系统；见Kabat等，美国卫生和公共服务部，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”(1983)。CH2结构域是独特的，因为它与另一个结构域配对不紧密。相反，两个N-连接的支链的糖链插入至完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。有文献记载，CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C-末端，并包含约108个残基。
本文使用的术语“铰链区”包括重链分子的将CH1结构域连接至CH2结构域的那一部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，从而使两个N-末端抗原结合区独立地移动。铰链区可分为三个不同的结构域：上部、中部、和下部铰链结构域(Roux等人，J.Immunol161：4083(1998))。
本文使用的术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸含有巯基，该巯基可以与第二个巯基形成二硫键或桥连。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区由二硫键连接并且两个重链由两个二硫键连接，在对应于使用Kabat编号系统的239和242处(位置226或229，EU编号系统)连接。
本文使用的术语“嵌合的抗体”将用于指以下任何抗体：其中其免疫反应区或位点得自或来自第一物种且其恒定区(该恒定区可以是完整的，部分的或根据本申请修改过的)得自第二物种。在某些实施例中靶结合区或位点将来自非人类来源(例如小鼠或灵长类)且恒定区来自人。
本文使用的“百分比人源化”通过以下方式计算：测定人源化的结构域和种系结构域之间的框架氨基酸差值的数量(即，非CDR差)，用氨基酸总数减去该数量，然后除以氨基酸总数，再乘以100。
所谓“特异性结合”或“对…有特异性”，通常意味着抗体通过它的抗原结合结构域结合抗原表位，并且该结合使得抗原结合结构域和抗原表位之间必须有一些互补性。根据这个定义，抗体被认为是“特异性结合”至抗原表位，当它结合到该抗原表位时，经抗原结合结构域的结合比结合至随机的，不相关的抗原表位更容易。本文中使用术语“特异性”以确定某一抗体结合至特定抗原表位的亲和力。例如，抗体“A”可能被视为对于一给定的抗原表位比抗体“B”具有更高的特异性，或抗体“A”可被说成是结合至抗原表位“C”比其对于相关抗原表位“D”具有更高的特异性。在一些实施方案中，本发明的抗体以小于大约10-8M，例如小于大约10-8M，10-9M、10-10M或更小的KD结合靶标。在一些实施方案中，本发明的抗体以小于大约100nM，例如小于大约10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM或更小的EC50结合靶标。
应注意非明确数量的实体限定应指一或多个(种)该实体；例如，“多功能抗体”应理解为表示一或多个(种)多功能抗体。同样地，非明确数量限定的、术语“一个或多个”和“至少一个”本文中可互换使用。
本文使用的术语“多肽”用于包括单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且也指通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或多个氨基酸的任一条或多条链，而不是指特定长度的该产物。因此、肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白”、“氨基酸链”、或任何指两个或多个氨基酸组成的一条或多条链的其他术语都包括在“多肽”的定义中，且术语“多肽”可代替这些术语的任何一个或与它们互换使用。术语“多肽”也用于指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护基/阻断基衍生化、蛋白水解裂解或通过非自然产生的氨基酸的修饰。多肽可衍生自天然的生物源或通过重组技术生产，但不一定由指定核酸序列翻译而成。其可以任何方式产生，包括通过化学合成方式。
本文使用的关于细胞、核酸(如DNA或RNA)的术语“分离的”，是指分别从其他的以天然来源的大分子存在的DNA或RNA分离的分子。本文使用的术语“分离的”也指通过重组DNA技术生产时基本不含细胞材料，病毒材料或培养基的核酸或肽，或经化学合成制备时基本不含化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”是指包括非自然产生为片段的核酸片段，且这些片段自然状态下不存在。本文中术语“分离的”也用于指从其他细胞蛋白或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽是指包括纯化的和重组的多肽。
本文使用的术语“重组”，在涉及多肽或多核苷酸时指自然状态下不存在的多肽或多核苷酸的形式，其中一个非限制性的例子，可以通过将通常不会一起出现的多核苷酸或多肽组合在一起来实现。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽链分子之间或两个核酸分子之间的序列相似程度。同源性可通过比较每个序列中的位置来测定，可通过比对来进行比较。当在被比较的序列中的位置上有相同的碱基或氨基酸时，在该位置上的分子为同源的。多个序列之间的同源度为这些序列共有的配对或同源位点数量的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本申请的序列之一之间具有少于40％的同源性，但优选小于25％的同源性。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列具有一定的百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”是指，在比对时，在这两个序列比较时该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。此种比对和百分比同源性或序列同一性，可使用本领域中已知的软件程序测定，例如，通过Ausubel等人编的(2007)Current Protocols in Molecular Biology描述的那些软件。优选地，使用默认参数用于比对。生物学等效的多核苷酸是具有上面提到的特定百分比的同源性，并编码具有相同或相似的生物活性多肽的多核苷酸。
术语“等效核酸或多核苷酸”是指与该核酸的核苷酸序列或其互补序列具有一定程度的同源性，或序列同一性的核苷酸序列的核酸。双链核酸的同源物是指包含特定核苷酸序列的核酸，该特定核苷酸序列具有与另一核酸或其互补序列具有一定程度的同源性。一方面，某核酸的同系物能够与该核酸或其互补序列杂交。同样地，“等效的多肽”是指与参考多肽的氨基酸序列具有一定程度的同源性，或序列同一性的多肽。在一些方面，该序列同一性至少为约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些方面，该等效序列保留了参考序列的活性(例如，抗原表位结合)或结构(例如，盐桥)。
杂交反应可以在不同的“严格”条件下进行。通常，低严格杂交反应于约40℃在约10×SSC或同等离子强度/温度的溶液中进行。中等严格杂交通常在约50℃于约6×SSC中进行，高度严格杂交反应通常在约60℃于约1×SSC中进行。杂交反应也可在本技术领域的技术人员熟知的“生理条件”下进行。生理条件的一个非限制性例子是细胞中通常存在的温度，离子强度，pH值和Mg2+浓度。
多核苷酸由4个核苷酸碱基组成的特定序列组成：腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)，在该多核苷酸为RNA时尿嘧啶(U)替换胸腺嘧啶。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子按字母顺序排列的表示。该字母顺序表示可以被输入到计算机的数据库中，该计算机中有中央处理单元，并且用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源性检索。术语“多态性”是指共存有多于一种形式的基因或其一部分。基因的一部分具有至少两种不同的形式，即，两种不同的核苷酸序列时，该基因的该部分被称为“基因的多态区域”。多态区域可以是单核苷酸，其同一性在不同的等位基因中不同。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以互换使用，并涉及任何长度的核苷酸的聚合物形式，无论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以有任何三维结构，并且可以具有任何已知或未知的功能。以下为多核苷酸的非限制性实施例：基因或基因片段(例如，探针，引物，EST或SAGE标签)，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转移RNA，核糖体RNA，核酶，cDNA，dsRNA，siRNA，miRNA，重组多核苷酸，分支多核苷酸，质粒，载体，单独的任意序列的DNA，单独的任意序列的RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则在多核苷酸的装配之前或之后对碱基结构进行修饰。该核苷酸序列可以被非核苷酸成分中断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，如用标记成分结合。该术语也指双链和单链分子。除非另外指出或要求，否则本申请的多核苷酸的任一实施例既包括双链形式也包括已知的两条互补单链形式或预计成为双链形式的情况。
术语“编码”在其应用于多核苷酸时指被认为“编码”某一多肽的多核苷酸，以其天然的状态或由本领域技术人员熟知的方法操作时，它可以被转录和/或翻译以产生该多肽的mRNA和/或其片段。反义链是此种核酸的互补物，该编码序列可以由其推导出。
本文使用的术语“可检测的标签”指可直接或间接检测的化合物或组合物，该化合物或组合物直接或间接地结合至待检测的组合物(例如，多核苷酸或蛋白质，该蛋白如抗体)以获得“有标签的”组合物。该术语还包括，结合至该多核苷酸的序列，其通过插入序列的表达提供信号，如绿色荧光蛋白(GFP)等。该标签自身可被检测(例如放射性同位素标签或荧光标签)或者，在酶标签情况下，可催化底物化合物或组合物的化学改变，该改变可被检测。该标签可用于小规模检测或更适于高通量筛选。同样地，合适的标签包括但不限于放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料、和蛋白(包括酶)。该标签可仅被检测，也可被定量。仅被检测的反应通常包括仅能证实其存在的反应，其中可被定量的反应通常包括具有可定量的(例如可通过数字报告的)值例如强度、极化和/或其他性质的反应。在发光或荧光分析中，可检测的反应可直接使用与分析成分相关的实际上涉及结合的发光体或荧光基团，或间接使用与另一(例如报告分子或指示剂)成分连接的发光体或荧光基团。
本文使用的，“抗体”或者“抗原结合多肽”指特定识别并结合抗原的多肽或多肽复合体。抗体可为整个抗体也可为任何抗原结合片段或者其单链。因此术语“抗体”包括含有特定分子的任何蛋白或肽，该特定分子含有至少一部分的免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子具有结合至抗原的生物活性。此种情况的实例包括但不限于，重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，框架(FR)区或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。
本文使用的术语“抗体片段”或“抗原结合片段”为抗体的一部分，该抗体为例如F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv等。不管结构如何，与相同的抗原结合的抗体片段被认为是完整抗体。术语“抗体片段”包括适配体、适配体对映体和双体。术语“抗体片段”也包括任何合成的或基因改造的蛋白，它们与抗体一样可结合至特定的抗原以形成复合体。
“单链可变片段”或“scFv”指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区域的融合蛋白。在某些方面，这些区域用10至约25个氨基酸的短接头肽连接。该接头可富含甘氨酸以具有柔性，也含有丝氨酸或苏氨酸以具有可溶性，且能将VH的N-末端连接至VL的C末端，反过来也一样。该蛋白质保留了原始的免疫球蛋白的特性，只是去除了恒定区并引入了接头。ScFv分子为本领域已知的，例如美国专利5，892，019中描述的那些。
本领域技术人员应理解重链分为gamma、mu、alpha、delta、及epsilon(γ，μ，α，δ，ε)并具有一些亚类(例如，γl-4)。该链的性质决定了抗体的“类”，如IgG，IgM，IgA，IgG，或者IgE。免疫球蛋白亚类(同型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等被很好表征并在功能上具有特异性。本领域技术人员参考本申请可容易识别这些类和同型的每一种修饰形式，因此，这些形式在本申请范围内。所有免疫球蛋白类明确地在本申请的范围内，下列讨论通常将针对免疫球蛋白分子的IgG类。关于IgG，标准免疫球蛋白分子包含两个相同的轻链多肽(它们的分子量约为23,000道尔顿)和两个相同的重链多肽(它们的分子量为53,000-70,000)。这四条链通常经二硫键以“Y”型连接在一起，其中轻链在“Y”结构的口部开始支撑重链，并延伸穿过可变区。
本申请的抗体、抗原结合多肽、它们的变体或衍生物包括但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化的抗体、灵长类化的(primatized)抗体、或嵌合抗体、单链抗体、抗原表位结合片段，例如，Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL结构域或VH结构域的片段、由Fab表达库产生的片段、和抗独特型(idiotypic)(抗-Id)抗体(包括，例如，本文公开的抗Id抗体至LIGHT抗体)。本申请的免疫球蛋白分子或抗体分子可为任何类型的(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、免疫球蛋白分子的任何类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
轻链分为kappa或lambda(K，λ)。每类重链均可结合kappa或lambda轻链。通常，轻链和重链共价地结合在一起，且当这些免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因改造的宿主细胞产生时，两条重链的“尾部”部分通过共价二硫键或非共价连接结合在一起。在该重链中，氨基酸序列从Y型结构的叉端的N末端向每条链的底部C末端延伸。
轻链和重链两者都分成结构区和功能同源区。术语“恒定”和“可变的”为功能上的使用。在此，应认识到轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)同时决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域(CH1，CH2或CH3)提供了重要的生物学性质，例如分泌、经胎盘的流动性、Fc受体结合，补体结合等。通常恒定区结构域的数量随着远离抗体的抗原结合位点或氨基端的末端位置而增加。N末端部分为可变区，而在C末端部分为恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
如上所述，可变区域使得抗体能选择性识别并特异性结合抗原上的抗原表位。即，抗体的VL结构域和VH结构域，或互补决定区(CDR)的亚类组合形成定义三维抗原结合位点的可变区域。这种四价抗体结构形成了抗原结合位点，该抗原结合位点存在于Y构型的每个臂的末端。更具体地，该抗原结合位点被每个VH和VL链(即，CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3，CDR-L1，CDR-L2和CDR-L3)上的三个CDR定义。在一些实例中，例如，某些衍生自骆驼种或基于骆驼免疫球蛋白改造的免疫球蛋白，完整的免疫球蛋白分子可仅由重链组成，而没有轻链。参见，例如，Hamers-Casterman等，Nature 363：446-448(1993)。
本文使用的术语“治疗”是指治疗性治疗和预防或防治措施，其中对于受试者进行防止或减慢(减轻)不良的生理变化或疾病，如癌症的发展。有益的或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状，降低疾病的程度、稳定(例如使其不恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病发展，改善或缓和疾病状态，并缓解(无论是部分或全部)，无论可否被检测到。“治疗”也可指与不接受治疗时的预计生存期相比能延长生存期。那些需要治疗的状况包括那些已经具有病症或症状以及那些容易具有病症或症状或那些将对病症或症状进行预防的情况。
所谓“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指任何受试者，特别是哺乳动物受试者，它们需要进行诊断，预后或治疗。哺乳动物受试者包括人类，家养动物，农场动物，动物园，运动场，或宠物，如狗，猫，豚鼠，兔，大鼠、小鼠，老鼠，马，牛，奶牛，灵长类(例如，人、猴如食蟹猴，猕猴，狒狒，和黑猩猩等)等。
本文使用的短语，如“需要治疗的患者”或“需要治疗的受试者”包括例如哺乳动物受试者如人，这些受试者将受益于本申请使用的抗体和组合物的给药，例如进行检测，诊断程序和/或治疗。
多功能抗体
本申请的一个实施例提供了一种异二聚体抗体，该抗体包含两个不同的抗原结合多肽单元。在某些方面，该异二聚体与其对应的同二聚体大小不同，可利用大小上的区别来促进分离异二聚体和同二聚体。
在某些方面，如图1中，这两个抗原结合多肽单元之一包含类似于野生型抗体的轻链-重链对。在整个本申请中，该单元也称为“单价单元”。
在某些方面，如图1中，其他抗原结合多肽单元包含单链可变片段(scFv)。这样的scFv可融合至抗体的恒定片段(Fc)的N端，称为融合肽。在本申请全文中此融合肽也被称为“单链单元”。
本申请提供了一种多功能抗体及制备方法，该抗体包含：(a)轻链-重链对，该轻链-重链对针对肿瘤细胞具有特异性；和(b)融合肽，该融合肽包含单链可变片段(ScFv)和具有CH2结构域和/或CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽针对免疫细胞具有特异性。该抗体称为多功能抗体。
任何上述的抗体或多肽还可包括额外的多肽，例如，如本文所述的编码的多肽，抗体恒定区的信号肽，该信号肽用于指导分泌，或如本文所述的其他异源多肽。
本技术领域的普通技术人员还应当理解，本文所述的抗体可会被修改，以使得它们的氨基酸序列与天然存在的结合多肽不同，它们得自这些天然存在的结合多肽。例如，来自于指定的蛋白的多肽或氨基酸序列可与起始序列类似，例如，与起始序列具有一定百分比的同一性，例如，其可与起始序列有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
此外，也可进行核苷酸或氨基酸替换，缺失，或插入以在“非必需”氨基酸区域进行保守替换或改变。例如，来自指定的蛋白质的多肽或氨基酸序列可与启动顺序相同，除了一个或多个独立的氨基酸的替换，插入，或缺失，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多独立的氨基酸替换，插入，或缺失。在某些实施例中，来自指定的蛋白质的多肽或氨基酸序列相对于起始序列有1至5个、1至10个、1至15个或1至20个独立的氨基酸的替换，插入，或缺失。
在某些实施例中，抗原结合多肽包含通常不与抗体结合的氨基酸序列或一个或多个基团。在下面更详细地描述了示例性的修改。例如，本申请的单链Fv抗体片段可包含柔性接头序列，或可以被修改以添加的官能基团(例如，聚乙二醇(PEG)、药物、毒素或标记物)。
本申请的抗体，其变体或衍生物包括被修改的衍生物，即，将任何类型的分子共价连接至抗体且该共价连接不会阻止抗体结合至抗原表位。例如，但不限于，该抗体可以被修改，例如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生、蛋白水解裂解、连接到细胞配体或其他蛋白等。众多的化学修饰的任一种均可以通过已知的技术进行，包括，但不限于特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素代谢合成等。此外，该抗体可以包含一种或多种非经典氨基酸酸。
在其它实施例中，本申请的抗原结合多肽可包含保守的氨基酸替换。
“保守氨基酸替换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，其包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-支链的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换。在另一实施例中，一串氨基酸可被结构上类似的串替换，后者在顺序上和/或侧链家族的组成上不同。
抗体制备方法
抗体的制备方法在本技术领域是公知的，在此进行描述。在一些实施例中，本申请的抗原结合多肽的可变区和恒定区是完全人类的。完全人抗体可使用现有技术中描述的技术制备，并如本文所述。例如，抗特定抗原的完全人抗体可以通过将该抗原施用至转基因动物来制备，该转基因动物已被修改以产生此种响应抗原刺激的抗体，但其内源性基因座已被禁用。可以用来制造这种抗体的示例性的技术描述于美国专利：6,150,584、6,458,592、6,420,140，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，所制备的抗体不会对待治疗的动物(例如人)产生有害的免疫反应。在一个实施例中，本申请的抗原结合多肽，其变体或衍生物经本领域公认的技术修改以降低其免疫原性。例如，抗体可以制成人源化的、灵长类化的、去免疫的、或嵌合的抗体。这些类型的抗体来自于非人类抗体，通常为是鼠或灵长类动物的抗体，该抗体保留或基本保留了亲本抗体的抗原结合性质，但它是在人体中免疫原性较低。这可以通过多种方法实现，包括(a)将整个非人类的可变结构域接枝到人恒定区以产生嵌合抗体；(b)将至少一部分的一种或多种非人类的互补决定区(CDR)接枝到人框架区和恒定区，保留或不保留关键框架残基，或(c)移植整个非人类可变结构域，但用与人类类似的部分通过替换表面残基将它们“遮盖”。
去免疫也可用于降低抗体的免疫原性。本文使用的，术语“去免疫”包括改变抗体以修改T细胞抗原表位(见，例如，国际申请公开号WO/9852976 A1和WO/0034317 A2)。例如，本申请对来自起始抗体的可变重链和可变轻链序列进行了分析，并制作了来自每个V区域的人T细胞抗原表位“图谱”，该图谱显示了互补性决定区(CDR)和该序列中的其它关键残基有关的抗原表位的位置。可对来自该T细胞抗原表位图谱的单个T细胞表位进行分析，以识别备选的氨基酸替换，其低风险改变最终抗体活性。本申请设计了一系列可选的可变重链和轻链序列，包括氨基酸替换的组合，并且这些序列随后合并至一系列结合多肽中。通常，产生12至24种不同的抗体，并对其测试结合性和/或功能性。然后将包括修改过的可变区和人恒定区的完整的重链和轻链基因克隆至表达载体中，将得到的质粒导入细胞系中用于产生整个抗体。然后将这些抗体通过合适的生化和生物学分析进行比较，并识别最佳变量。
本申请的抗原结合多肽的结合特异性可通过体外实验测得，例如免疫沉淀，放射免疫分析法(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)。
描述的制备单链单元的技术(美国专利4,694,778号；Bird，Science 242：423-442(1988)；Huston等的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55：5879-5883(1988)；和Ward等的Nature334：544-554(1989))可用于产生本申请的单链单元。经氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段形成单链单元，获得单链融合肽。在大肠杆菌(E.coli)中合成功能性Fv片段的技术也可以使用(Skerra等的Science 242：1038-1041(1988))。
可以用于产生单链Fvs(scFvs)和抗体的技术实例包括描述在美国专利第4,946,778号和5,258,498号；Huston等的Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等的Proc.Natl.Sci.USA 90：1995-1999(1993)；和Skerra等的Science 240：1038-1040(1988)。对于某些应用，包括在人体内体内使用抗体和体外检测分析，可优选使用嵌合的、人源化的或人抗体。嵌合抗体为抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，例如含有来自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。嵌合抗体的制造方法是本领域已知的。见，例如，Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等的BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等的J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美国专利第5,807,715；4,816,567和4,816397号，其全部内容通过引用的方式并入本文。
人源化的抗体为来自于非人类物种的抗体分子，并且该抗体分子结合所需的抗原，该抗体分子具有一个或多个来自非人类物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。通常，在人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的对应残基替换所改变，优选提高抗原结合能力。这些框架替换通过本领域已知的方法识别，例如，通过建立CDR和框架残基的相互作用模型，以鉴定对于抗原结合和序列比较重要的框架残基，以找出在特定位置的异常的框架残基。(见，例如，Queen等的美国专利第5,585,089号；Riechmann等的Nature 332：323(1988)，其全部内容通过引用并入本文)。可使用多种本领域已知的技术对抗体进行人源化，这些技术包括，例如，CDR-移植(EP 239，400；PCT公开号WO 91/09967；美国专利第5,225,539；5,530,101和5,585,089号)，饰面(veneering)或表面置换(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等的，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等的Proc.Natl.Sci.USA 91：969-973(1994))，和链改组(shuffling)(美国专利第5,565,332号，其全部内容通过引用结合至本文)。
完全人抗体对于人类患者的治疗是特别理想的。人抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用来自人免疫球蛋白序列的抗体库的噬菌体展示方法。还参见，美国专利第4,444,887号和4,716,111号；和PCT公开号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，这些文件的每一个在此通过引用结合至本文。
也可以使用转基因小鼠产生人抗体，该转基因小鼠不能表达功能性内源性免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因。例如，可将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体随机地或通过同源重组导入至小鼠胚胎干细胞中。或者，除了人重链和轻链基因之外，还可将人可变区、恒定区和多变区导入至小鼠胚胎干细胞中。可通过同源重组将该小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因非功能性地分别给予或同时引入人免疫球蛋白基因座。具体地，JH区的纯合缺失防止产生内源性抗体。修改后的胚胎干细胞展开并微注射到囊胚中以产生嵌合体小鼠。然后饲养嵌合体小鼠用于产生表达人抗体的纯合子后代。对该转基因小鼠用选定的抗原以正常的方式免疫，例如，使用所需的靶多肽的全部或一部分。针对该抗原的单克隆抗体可从经免疫的转基因小鼠用常规杂交瘤技术获得。该转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重新排列，并随后进行类别转化和体细胞突变。因此，使用该技术，能够产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。生产人抗体的该技术的概述，见Lonberg和Huszar Int.Rev.Immunol.73：65-93(1995)。用于生产人抗体和人单克隆抗体的技术和用于生产此种抗体的技术方案的详细讨论，参见，如PCT公开号WO 98/24893；WO 96/34096；WO96/33735；美国专利第5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；和5,939,598号，它们通过引用以全文形式结合至本文。此外，如Abgenix公司(Freemont，Calif.)和GenPharm((San Jose，Calif.)等公司能提供针对选定的抗原的人抗体，使用与上述类似的技术获得。
识别选定的抗原表位的完全人抗体也可使用被称为“导向选择”的技术产生。在该方法中，选定的非人类单克隆抗体，例如，小鼠抗体，用于引导识别相同抗原表位的完全人抗体的选择。(Jespers等的Bio/Technology 72：899-903(1988)。还参见，美国专利第5,565,332号，其通过引用全文结合至本文)。
在一些实施方案中，编码所需的单克隆抗体的DNA很容易地使用常规方法分离和测序(例如，通过使用寡核苷酸探针，该探针能够特异性结合至鼠抗体的重链和轻链的编码基因)。单独的和亚克隆的杂交瘤细胞作为这种DNA的首选来源。分离后，该DNA可置于表达载体中，然后将该载体转到原核或真核宿主细胞中，如大肠杆菌(E.coli)细胞，猴COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾细胞293或骨髓瘤细胞，这些细胞不产生免疫球蛋白。更具体地，单独的DNA(可如本文所述进行合成)可用于克隆恒定区和可变区序列用于制备抗体，如Newman等于1995年1月25日提交的美国专利5,658,570，其在此通过引入结合至本文。本质上讲，这需要从选定的细胞中提取RNA，转化成cDNA，并通过PCR使用Ig特异性引物扩增。用于该目的的合适的引物也描述于美国专利5,658,570号中。如将在下面更详细地讨论的，表达所需的抗体的转化的细胞可相对大量地培养以提供临床上和商业应用上的免疫球蛋白。
此外，使用常规的重组DNA技术，本申请的抗原结合多肽的一个或多个CDR，可插入框架区内，例如，插入至人框架区以使非人类抗体人源化。该框架区可以是天然存在的或共有的框架区，且优选为人的框架区(见，例如，Chothia等的J.Mol.Biol.278：457-479(1998)，人的框架区的列表)。优选地，该框架区和CDR的组合所产生的多核苷酸编码多肽，该多肽特异性地结合至所需多肽的至少一个抗原表位，例如，LIGHT。优选地，可在框架区内进行一个或多个氨基酸替换，并且，优选地，该氨基酸替换提高该抗体对抗原结合能力。此外，这种方法可用于获得一个或多个可变区半胱氨酸残基(该半胱氨酸残基参与链内二硫键形成)的氨基酸替换或缺失，这样产生缺乏一个或多个链内二硫键的抗体分子。其他对于该多核苷酸进行的改变都包含在本申请的范围内，并在现有技术范围内。
此外，可使用用于通过对来自小鼠抗体分子的基因剪接生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA：851-855(1984)；Neuberger等的Nature 372：604-608(1984)；Takeda等的Nature 314：452-454(1985))，具有合适的抗原特异性，与具有合适生物活性的人抗体分子基因一起。如本文使用的，嵌合抗体为其中不同部分来自不同动物种类的分子，例如含有来自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。
然而，另一种用于产生重组抗体的高效方法公开于Newman，Biotechnology10：1455-1460(1992)。具体地，该技术导致产生含有猴可变结构域和人恒定序列的灵长类化的抗体。该文件通过引用全文结合至本文中。此外，这种技术也被描述在共同转让的美国专利号5,658,570、5,693,780和5,756,096，其中每一篇通过引用并入本文。
在一些实施方案中，产生抗体的细胞系可使用本领域技术人员熟知的技术选择和培养。这样的技术描述在多种实验室手册和主要出版物中。在这方面，本文中适合使用的技术如下所述描述于Current Protocols in Immunology，Coligan等编，Green PublishingAssociates and Wiley-Interscience，John Wiley和Sons，New York(1991)，其通过引用以全文并入本文中，包括补充参考。
在一些实施方案中，本领域技术人员公知的标准技术可用于在编码本申请抗体的核苷酸序列中引入突变，包括，但不限于，定点诱变和PCR介导的突变，这产生氨基酸替换。优选地，所述变体(包括衍生物)，相对于参考可变重链区，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、轻链可变区、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3，编码少于50个氨基酸替换、少于40个氨基酸替换、少于30个氨基酸替换、少于25个氨基酸替换、少于20个氨基酸替换、少于15个氨基酸替换、少于10个氨基酸替换、少于5个氨基酸替换、少于4个氨基酸替换、少于3个氨基酸替换、或少于2个氨基酸替换。或者，可将沿着全部或部分的编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，可对所得到的突变体针对生物活性筛选，以确定保留有活性的突变。
治疗和诊断方法
本文所述的，本申请的抗原结合多肽、变体或衍生物可用于与癌症或传染病相关的某些治疗和诊断方法中。
本申请还涉及基于抗体的治疗，此种治疗包括将本申请的双特异性抗体给予至患者，例如动物、哺乳动物和人，用于治疗本文描述的一种或多种疾病或状况。本申请的治疗化合物包括但不限于，本申请的抗体(包括如本文所述的它们的变体和衍生物)和核酸或编码本申请的抗体的多核苷酸(包括如本文所述的它们的变体和衍生物)。
本申请的抗体也可以用于治疗，抑制或预防疾病，病症或状况，包括恶性的疾病，病症，或与这样的疾病或病症相关的状况，如免疫应答相关的疾病。在一些实施方案中，本发明的抗体可以用作免疫抑制剂。在一些实施方案中，本发明的抗体可以用于治疗自体免疫疾病。本申请的抗原结合多肽，其变体或衍生物用于抑制癌症的生长，发展和/或转移，特别是上面列出的或下面段落中列出的那些。
可以用本申请的抗体或其变体或衍生物治疗，预防，诊断和/或预测的与增加细胞存活相关的其他疾病或状况，包括但不限于癌症或肿瘤，包括恶性肿瘤的发展和/或转移，以及相关疾病，如多发性骨髓瘤，肺癌(如小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌，肺鳞癌)等。
任何特定患者使用的具体的剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括使用的特定抗原结合多肽、其变体或衍生物、患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食及给药时间、排泄率、药物组合、待治疗的具体疾病的严重程度。由医疗护理者对这些因素的判断在本技术领域内的普通技术范围内。用量也将取决于待治疗的个体病人，给药途径，制剂的类型，所使用的化合物的特征，疾病的严重程度和预期的效果。所用的量可通过本领域已知的药物学和药代动力学的原理决定。
给予抗原结合多肽、其变体或衍生物的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。该抗原结合多肽或组合物可以通过任何方便的途径给药，例如通过输注或大剂量注射，通过上皮或粘膜与皮肤内层(例如，口腔粘膜，直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起给药。因此，本申请的含抗原结合多肽的药物组合物可被口服给药、直肠给药、非肠道给药、脑池内给药、阴道内给药、腹膜内给药、局部给药(如经粉剂、软膏、滴剂或透皮贴剂)、含服给药或作为口腔或鼻腔喷剂。
本文使用的术语“非肠道”是指包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的给药模式。
给药可以是全身或局部给药。此外，还可能需要的是通过任何合适的途径，包括脑室内和鞘内注射引入本申请的抗体进入中枢神经系统；脑室导管可促进脑室注射，例如，将导管连接到一个储液库。也可以肺部给药，例如，通过使用吸入器或雾化器，含雾化剂的配方进行。
还可能需要的是将本申请的抗原结合多肽或组合物局部给药至需要治疗的区域，这可通过，例如但不限于，在手术过程中局部灌注，局部应用，例如与手术后伤口敷料结合，通过注射、通过导管、通过栓剂、或通过植入物实现，所述植入物为多孔的、无孔的、或凝胶状材料、包括膜或纤维。优选地，当给予本申请的蛋白质(包括抗体)时必须小心使用不吸收蛋白质的材料。
本申请的抗体的量，在治疗、抑制、和预防可以通过标准的临床技术确定的炎症，免疫或恶性疾病、病症或症状方面是有效的。此外，在体外实验中可以任选用量以帮助确定最佳的剂量范围。配方中使用的精确剂量也将取决于给药途径，和疾病、病症或状况的严重性，并应根据医生的判断和每个病人的具体情况确定。可从来自体外或动物模型试验系统的剂量-反应曲线推算出有效剂量。
治疗感染或恶性的疾病，症状或病症的方法，该方法包括给予本申请抗体，该抗体的变体，该治疗通常在体外进行试验，然后在一个可以接受的动物模型中针对所期望的治疗或预防活性进行体内试验，然后用于人类。合适的动物模型，包括转基因动物，对于本领域的普通技术人员是公知的。例如，本文描述的用于证明抗原结合多肽的治疗效果的体外分析，包括抗原结合多肽对于细胞系或患者组织样本的作用效果。抗原结合多肽对细胞系和/或组织样本的作用效果可利用本领域技术人员已知的技术测定，这些技术例如本文其他地方所披露的分析。根据本申请，可以使用体外分析以确定是否特定的抗原结合多肽给药被指示，包括在体外细胞培养分析，其中患者组织样本在培养基中培养，并暴露于化合物或以其他方式给予化合物，观察这种化合物对于该组织样本的作用。
抗体结构信息
单克隆抗体结构为：对称单特异性抗体，包含两个相同的轻链和两个相同的重链，具有轻-重链配对和重链-重链配对；轻-重链配对靶向同一种靶点。
多功能抗体结构为：非对称双特异性抗体，包含轻链、重链和融合肽，具有轻-重链配对，和重链-融合肽配对，轻-重链配对靶向肿瘤抗原，融合肽ScFv靶向免疫细胞抗原CD3。
在某些方面，该重链通过一个或多个二硫键结合至融合肽，或者两个不同的融合重链之间形成一个或多个二硫键。一方面，该一个或多个二硫键形成于该CH1(或VLs)和CH2结构域之间的铰链区的氨基酸残基之间。
在某些方面，该融合肽的CH2结构域位于scFv片段和CH3结构域之间。换句话说，该scFv片段连接于该Fc片段的CH2末端。在某些方面，该单链单元不包含CH1结构域。
一方面，该单价单元和单链单元之一或两者都包含人抗体序列或人源化的序列。例如，在一个方面，该单价单元的重链包含人或人源化的Fc片段。在一个具体的方面，该重链的Fc片段包含人IgG Fc片段。
一方面，该融合肽的Fc片段包含人或人源化的Fc片段。在一个具体的方面，该融合肽的Fc片段包含人IgG Fc片段。
图1A为多功能抗体1结构示意图，图1B为抗体各组分的蛋白质一级结构示意图。
本发明的改造的人源化CD3抗体
(1)人源化CD3抗体可变区的CDR和FR序列
[表1]人源化CD3抗体可变区CDR和FR序列
Figure BDA0002923590610000341
Figure BDA0002923590610000351
Figure BDA0002923590610000361
Figure BDA0002923590610000371
Figure BDA0002923590610000381
Figure BDA0002923590610000391
Figure BDA0002923590610000401
其他结构域的序列
(1)接头结构域的氨基酸序列
[表10]接头的氨基酸序列
Figure BDA0002923590610000411
(2)铰链结构域的氨基酸序列
[表11]铰链的氨基酸序列
Figure BDA0002923590610000412
(3)轻链恒定区CL结构域的氨基酸序列
[表12]CL的氨基酸序列
Figure BDA0002923590610000413
Figure BDA0002923590610000421
(4)重链恒定区CH1结构域的氨基酸序列
[表13]CH1的氨基酸序列
Figure BDA0002923590610000422
Fc氨基酸编号遵从Kabat编号。“Kabat编号”是指Kabat等描述的编号系统，其内容记载于美国卫生和公共服务部，“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)。具体的编号见下表：
[表14]基于Kabat编号系统的Fc氨基酸编号
Figure BDA0002923590610000423
其中，
第221-227位氨基酸为铰链(hinge)结构域，
第228340位氨基酸为重链第二恒定区CH2结构域，
第341447位氨基酸为重链第三恒定区CH3结构域。
可对抗体进行修改以提高异二聚体配对效率。比如，在某些方面，与野生型的抗体片段比较，该单价单元重链的Fc片段和/或该融合肽的Fc片段可包含一处或多处替换，这些替换之间形成杵-臼结构对。杵臼构型在本领域中是已知的。参见，例如Ridgway等的“‘Knob-into-holes’engineering of antibody CH3 domains for heavy chainheterodimerization，”Protein Engineering 9(7)：617-21(1996)。
一方面，一个CH3结构域上的T366被相对较大的氨基酸残基替换，如酪氨酸(Y)或色氨酸(W)替换。然后，另一CH3结构域上的Y407可被相对较小的氨基酸残基替换，如苏氨酸(T)，丙氨酸(A)或缬氨酸(V)。
[表15]Fc氨基酸替换的组合在单价单元和单链单元之间形成杵臼结构对提高异二聚体配对效率
组合序号 一个CH3上的替换 另一CH3上的替换
l T366W Y407A
2 T366W Y407V
3 T366Y Y407A
4 T366Y Y407V
5 T366W T366S，L368A，Y407V
一方面，该CH3结构域之一含有一处或多处替换，经在生理条件下有正电荷的氨基酸残基替换，而另一CH3结构域包含一处或多处替换，经一个或多个在生理条件下具有负电荷的氨基酸残基替换。一方面，该带正电的氨基酸残基可为精氨酸(R)，组氨酸(H)或赖氨酸(K)。另一方面，该带负电荷的氨基酸残基可为天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。可被替换的氨基酸残基包括，但不限于，D356、L368、K392、D399和K409。
[表16]CH3氨基酸替换的组合在单价单元和单链单元之间形成离子键提高异二聚体配对效率
组合序号 一个CH3上的替换 另一CH3上的替换
1 D356K D399K K392D K409D
2 L368R D399K K392D K409D
3 L368K D399K K392D K409D
4 L368R D399K K409D
5 L368K D399K K409D
6 L368R K409D
7 L368K K409D
一方面，一个CH3结构域上的S354被替换为半胱氨酸，另一CH3结构域上的Y349也被替换为半胱氨酸，两个被替换位置的残基形成了二硫键。
[表17]CH3氨基酸替换的组合在单价单元和单链单元之间形成二硫键提高异二聚体配对效率
组合序号 一个CH3上的替换 另一CH3上的替换
1 S354C Y349C
一方面，一个CH3结构域上的H435和Y436分别被替换为精氨酸和苯丙氨酸，该替换导致Fc与蛋白A之间的结合能力显著降低，从而使异二聚体和同二聚体之间具有不同的蛋白A结合活性，在亲和层析过程中易于将两者分离。
[表18]一个CH3的氨基酸替换导致与蛋白A的结合能力下降
组合序号 CH3上的替换
1 H435R，Y436F
Figure BDA0002923590610000441
Figure BDA0002923590610000451
Figure BDA0002923590610000461
Figure BDA0002923590610000471
Figure BDA0002923590610000481
Figure BDA0002923590610000491
Figure BDA0002923590610000501
实施例二：人源化抗体制备及抗体活性检测
1.抗体表达质粒构建方法。所用的载体为pcDNA3.1。
(1)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段DNA，聚合酶为DNA聚合酶(2×PrimeSTAR Max Premix，TaKaRa，货号R405A)。DNA序列根据序列号45-73的氨基酸序列进行逆向翻译获得。所得PCR产物即为目的片段DNA。
(2)限制性内切酶酶切载体质粒。限制性内切酶(例如Notl，Nrul或BamHI-HF等)。
所得酶切产物即为酶切的载体DNA。
*载体分两种：重链表达载体和轻链表达载体。其中重链表达载体具有信号肽及人IGG1重链恒定区DNA序列，包括CH1、铰链、CH2和CH3，和重链可变区，酶切位点在信号肽的3’和CH1的5’端之间；其中轻链表达载体具有信号肽及人kappa轻链恒定区DNA序列，和轻链可变区，酶切位点在信号肽的3’和轻链恒定区的5’端之间。
(3)PCR产物或酶切产物进行纯化，使用Tiangen的DNA纯化试剂盒，具体操作步骤见Tiangen的试剂盒内附说明书。所得的纯化产物即为纯化的目的片段DNA，和纯化的酶切载体DNA。
(4)目的片段重组，重组酶(Exnase II，Vazyme，货号C112-01)
重链片段重组于酶切的重链表达载体DNA，轻链片段重组于酶切的轻链表达载体DNA。
(5)热激转化
取10μl重组产物加入到100μl Trans10感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴放置30分钟，将管置于42℃水浴60秒，不要摇动，迅速转移至冰浴2分钟，加入600μl LB液体培养基(含抗生素)，37℃摇床培养1小时，取适量菌液涂布到含对应抗生素的LB平板上，将平板倒置于37℃恒温培养箱培养过夜。挑单菌落，送样至武汉金开瑞测序，选取测序正确单菌落扩大培养，并进行质粒大提，用于哺乳动物细胞转染实验。重链片段重组于酶切的重链表达载体DNA所获得的质粒称为重链表达质粒，轻链片段重组于酶切的轻链表达载体DNA所获得的质粒称为轻链表达质粒。
1、抗体表达方法
包括CHO-S和293E两种瞬时转染表达体系，具体如下：
(1)CHO-S瞬时转染步骤(以100ml转染总体积为例)
a)细胞转染前一天传代，例如，CD-CHO可用于细胞传代，调整悬浮细胞密度至1×106cells/ml，体积90ml，保证细胞处于对数生长期，第二天转染时细胞密度能达到2×106cells/ml；
b)37℃，125rpm，5％CO2过夜摇床培养；
c)转染当天，预热FectoPRO转染试剂到室温并轻轻混匀；
d)取10ml无血清培养基，如opti PRO-SFM，稀释50μg DNA，轻柔混匀，并将其加入到100μl转染试剂中，混合均匀，室温孵育10分钟形成转染复合物；
e)将转染复合物均匀加入到准备好的90ml处于对数生长期的细胞中，加入后立即摇匀，并放置在摇床培养37℃，125rpm，5％CO2；
f)转染后2～4小时，加入75μl转染增强剂Fecto
Figure BDA0002923590610000511
Booster；
g)转染后1824小时，降温至32℃培养；
h)转染后第3，5，7天进行补料，补料体积为细胞总体积的3.5％；
i)细胞活力低于70％收获，表达时间9-13天。
(2)293E瞬时转染步骤(以20ml转染总体积为例)
a)细胞转染前一天传代，例如，FreeStyleTM 293可用于细胞传代，调整悬浮细胞密度至0.6-0.8×106cells/ml，体积20ml，保证细胞处于对数生长期，第二天转染时细胞密度能达到1.2-1.6×106cells/ml；
b)37℃，125rpm，5％CO2过夜摇床培养；
c)转染当天，使用前预热LPEI到室温并轻轻混匀；
d)用0.67ml无血清培养基，如FreeStyleTM 293，稀释20μg DNA，混匀；
e)用0.67ml无血清培养基，如FreeStyleTM 293，稀释40μg LPEI，混匀；
f)将步骤5中稀释过的LPEI加入到步骤4中稀释过的DNA中，迅速混匀，并且室温孵育15分钟以使复合物形成；
g)将步骤6中的转染复合物均匀加入到准备好的20ml处于对数生长期的细胞中，加入后立即摇匀，并放置在摇床培养37℃，125rpm，5％CO2；
h)转染后第1，3天进行补料，补料体积为细胞总体积的5％；
i)表达至第6天收获。
(3)转染为共转染，将任一种轻链表达质粒和任一种重链表达质粒等比例转染至前述的哺乳动物细胞中，表达所得的抗体为单克隆抗体，具有与天然抗体一致的二价对称的Y型结构，该结构的一级结构示意图显示于图2。
(4)表达单克隆抗体的代号及表达量(在293E细胞中)如下：
Figure BDA0002923590610000531
Figure BDA0002923590610000541
Figure BDA0002923590610000551
Figure BDA0002923590610000561
Figure BDA0002923590610000571
Figure BDA0002923590610000581
2、抗体纯化
抗体纯化主要为亲和层析，具体如下：
(1)收获：表达抗体的细胞培养液，3000×g离心10分钟后，取上清，用0.22μm的滤器过滤后4℃保存备用；
(2)亲和层析(MabSelect SuRe GE 17543801，以18ml柱体积为例)
a)平衡：结合缓冲液(25mM Tris三羟甲基氨基甲烷，pH7.07.4)平衡层析柱，直至UV检测器、电导数值至保持稳定或基线，至少平衡5个柱体积；
b)上样：将过滤的上清以流速5ml/min上样；
c)洗平衡：结合缓冲液冲洗5个柱体积；
d)洗脱：用洗脱缓冲液(50mM Citrate柠檬酸，pH 3.4±0.1)洗脱样品，流速5ml/min，洗脱5个柱体积，收集洗脱峰；
e)中和：洗脱液以1MTris三羟甲基氨基甲烷pH8.0中和，调节样品pH至6.0±0.1。纯化得到的抗体为单克隆抗体，具有与天然抗体一致的二价对称的Y型结构。
3、抗体活性检测
在本实施例中，抗体活性检测主要是抗体与CD3阳性细胞结合活性的检测。
1)细胞准备：CD3端亲和力检测用CD3阳性的诱导培养的CIK细胞/人全血分离的T细胞。取足够量细胞300g离心5min，弃上清，用1％FBS-PBS重悬细胞，调整密度为4×106/ml，每孔取50μl，按照细胞每孔为2×105铺板。离心机4度300×g，离心5min，弃上清，细胞铺板在冰上操作；
2)抗体添加：按照实验设计，梯度稀释抗体，稀释抗体在冰上操作。如抗体稀释的初始浓度为3000nM，3倍稀释，稀释11个浓度梯度。将稀释好的抗体每孔50μl加入到细胞孔中，轻柔吹打混匀，在4度1100rpm/min震荡孵育2h；
3)洗涤：用150μ1 1％FBS-PBS重悬细胞，4度300×g离心5min，弃上清。重复洗涤一次；
4)二抗孵育：加入稀释好的二抗PE anti-human IgG FC(Biolegend，409304)，二抗终浓度为8μg/ml，体积为50μl/孔，同时设置只加细胞和二抗的孔作为对照，轻柔吹打混匀，4度避光1100rpm/min震荡孵育1h；
5)洗涤：用150μl 1％FBS-PBS重悬细胞，4度300×g离心5min，弃上清。重复洗涤一次；
6)固定：每孔加入200μl的2％多聚甲醛重悬细胞在室温固定细胞20min.300×g离心5min，弃上清；
7)细胞重悬：用200μl 1％FBS-PBS重悬细胞，300g离心5min，弃上清；
8)流式上样：用150μl 1％FBS-PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测；
9)数据分析：用流式分析软件FlowJo 7.6分析数据，用Graphpad Prism 5做图计算EC50值。
抗体与人、猴T细胞结合活性检测结果显示于图4。图4显示了单克隆抗体与CD3+T细胞的结合能力。
由细胞结合活性检测结果可以看到，这些抗体余sp34单抗相比，均具有较高的亲和力(EC50＜100nM)且人猴CD3均能结合。
实施例三：本发明的多功能抗体制备
一、质粒构建方法
操作步骤同本申请实施例二中“1、抗体表达质粒构建方法”。具体涉及三种质粒的构建：轻链表达质粒(pL)、重链表达质粒(pH)和融合肽表达质粒(pF1)。
多功能抗体表达方法同本申请实施例二中“2、抗体表达方法”。转染时为三种质粒共转染：表达图1所示的多功能抗体1，需要质粒pL、pH和pF1共转染至CHO-S或293E细胞进行表达。
本发明的多功能抗体由三条多肽组成：
(1)融合肽，由重链可变区(VHs)、接头1、轻链可变区(VLs)、铰链1、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3-b)组成，接头1序列见表10，铰链1见表11中Hin2-9序列，CH2序列见表19，CH3序列见表20中CH3-b序列。VHs、VLs的序列均来自本申请中新的人源化SP34的序列，具体见表2。
(2)重链，由重链可变区(VHm)、重链恒定区1(CH1)、铰链(Hinge)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3-a)组成，CH1序列见表13，铰链序列见表11中Hin1序列，CH2序列与融合肽的CH2一致(见表19)，CH3序列见表20中CH3-a序列；CH3-a与融合肽的CH3-b按照表20中一一对应。
(3)轻链，由轻链可变区(VLm)和轻链恒定区(CL)组成，CL序列见表12；
多功能抗体的组成示意图见图1B。
二、多功能抗体的纯化方法：
抗体纯化主要为亲和层析、离子交换层析、疏水层析及分子筛，具体如下：
(1)收获：表达抗体的细胞培养液，3000×g离心10分钟后，取上清，用0.22μm的滤器过滤后4℃保存备用；
(2)亲和层析(MabSelect SuRe GE 17-543801，以18ml柱体积为例)
a)平衡：结合缓冲液(25mM三羟甲基氨基甲烷，pH7.0-7.4)平衡层析柱，直至UV检测器、电导数值至保持稳定或基线，至少平衡5个柱体积；
b)上样：将过滤的上清以流速5ml/min上样；
c)洗平衡：结合缓冲液冲洗5个柱体积；
d)洗脱：用洗脱缓冲液(50mM柠檬酸，pH 3.4±0.1)洗脱样品，流速5ml/min，洗脱5个柱体积，收集洗脱峰；
e)中和：洗脱液以1M Tris三羟甲基氨基甲烷pH8.0中和，调节样品pH至6.0±0.1。
(3)离子交换层析(以阳离子交换层析为例，HiTrap SP-HP GE 17-1151-01 5ml柱体积)
a)样品准备：亲和层析样品经过微滤后，用超纯水稀释，使得电导小于5mS/cm，然后调pH到6.0±0.1；
b)平衡及上样：先用5个柱体积的缓冲液B(25mM柠檬酸+1M氯化钠，电导应为80～90mS/cm，pH为6.0±0.1)平衡，再用至少5个柱体积的缓冲液A(25mM柠檬酸，电导应小于5mS/cm，pH为6.0±0.1)平衡层析柱，至电导、pH、紫外基线平稳后，上样，流速3ml/min；
c)洗平衡：用5个柱体积的缓冲液A进行清洗，流速5ml/min；
d)洗脱：030％缓冲液B，20个柱体积；100％缓冲液B10个柱体积，整个过程流速3ml/min，洗脱液分管收集并进行检测。
(4)疏水层析(Capto phenyl ImpRes填料GE XK16/20 11.5cm/23ml)
a)样品处理：用5M氯化钠调节样品至1M氯化钠，调节pH至6.0；
b)平衡及上样：先用缓冲液A(25mM Citrate柠檬酸盐+1M氯化钠，pH为6.0±0.1)平衡5个柱体积，流速5ml/min；流速3.3ml/min上样；
c)洗平衡：用5个柱体积的缓冲液A进行清洗，流速5ml/min；10％缓冲液B(25mMCitrate柠檬酸盐，pH为6.0±0.1)清洗5个柱体积，流速5ml/min；
d)洗脱：90％缓冲液B洗脱，流速5ml/min，分管收集洗脱峰并进行检测；
(5)分子筛(HiLoad Superdex 200pg GE 28989336 26/600)
a)平衡及上样：缓冲液(20mM组氨酸+0.15M氯化钠，PH6.0±0.1)平衡2个柱体积后上样，流速3ml/min；
洗脱：缓冲液洗脱2个柱体积，分管收集洗脱峰并进行检测。
Figure BDA0002923590610000621
Figure BDA0002923590610000631
Figure BDA0002923590610000641
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Figure BDA0002923590610000661
Figure BDA0002923590610000671
Figure BDA0002923590610000681
Figure BDA0002923590610000691
Figure BDA0002923590610000701
Figure BDA0002923590610000711
Figure BDA0002923590610000721
Figure BDA0002923590610000731
实施例四：多功能抗体的生物学活性检测
1、细胞亲和力
1)细胞准备：多功能抗体分子CD3端亲和力检测用CD3阳性的人全血分离的T细胞，肿瘤抗原的亲和力检测用对应抗原的阳性肿瘤细胞进行检测：如CD38抗原检测用CD38阳性的MM.1S细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)或RPMI8226细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)，PD-L1抗原检测用PD-L1阳性的H358细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)等。取足够量细胞300×g离心5min，弃上清，用1％FBS-PBS重悬细胞，调整密度为4×106/ml，每孔取50μl，按照细胞每孔为2×105铺板。4度300×g，离心5min，弃上清，细胞铺板在冰上操作；
2)抗体添加：按照实验设计，梯度稀释抗体，稀释抗体在冰上操作。比如抗体稀释的初始浓度为3000nM，3倍稀释，稀释11个浓度梯度。将稀释好的抗体每孔50μl加入到细胞孔中，轻柔吹打混匀，在4度1100rpm/min震荡孵育2h；
3)洗涤：用150μl 1％FBS-PBS重悬细胞，4度300×g离心5min，弃上清。重复洗涤一次；
4)二抗孵育：加入稀释好的二抗PE anti-human IgG FC(Biolegend，409304)，二抗终浓度为8ug/ml，体积为50μl/孔，同时设置只加细胞和二抗的孔作为对照，轻柔吹打混匀，4度避光1100rpm/min震荡孵育1h；
5)洗涤：用150μl 1％FBS-PBS重悬细胞，4度300g离心5min，弃上清。重复洗涤一次；
6)固定：每孔加入200μ1的2％多聚甲醛重悬细胞在室温固定细胞20min.300×g离心5min，弃上清；
7)细胞重悬：用200μl 1％FBS-PBS重悬细胞，300×g离心5min，弃上清；
8)流式上样：用150μl 1％FBS-PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测；
9)数据分析：用流式分析软件FlowJo 7.6分析数据，用Graphpad Prism 5做图计算Kd值。
2、T细胞激活
1)取培养状态良好的肿瘤细胞(非小细胞肺癌细胞H358，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；骨髓瘤细胞MC/CAR，购自ATCC)，制备单细胞悬液，按照2E4/孔细胞数铺入96孔板
2)从健康志愿者全血中密度梯度离心分离PBMC，按照实验设计的效靶比(E：T)往肿瘤细胞板中加入PBMC
3)按照实验设计对抗体进行一系列浓度梯度稀释，加入各浓度抗体
4)将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中孵育至检测时间。收集悬浮的PBMC细胞，加入相应的CD3，CD69检测抗体孵育1h后洗去多余抗体，重悬细胞，流式检测CD3和CD69双阳性细胞比例，即为抗体诱导PBMC中T细胞的活化比例，具体计算：
Figure BDA0002923590610000741
用“GraphPad Prism5”软件以双抗体浓度作为横坐标，以CD3&CD69)％值作为纵坐标进行非线性拟合(log(agonist)vs.response--Variable slope)，计算得到T细胞活化曲线及EC50值。
3、体外杀伤
1)取足够量的肿瘤细胞(如H358细胞和MC/CAR细胞)，制备单细胞悬液；
2)CFSE染色肿瘤细胞：取一定量的细胞悬液离心(300×g，5min)去上清；加入2ml用PBS配制的CFSE溶液，CFSE终浓度为5μM；将细胞置于5％CO2、37℃培养箱，孵育15min；取出细胞，PBS洗涤，离心(300×g，5min)去上清，重复洗涤三次，完全培养基重悬细胞，取悬液细胞计数；
3)肿瘤细胞铺板：用完全培养基将细胞密度重悬至2×105/ml，按照2×104个/孔，即100μl/孔加入96孔板；
4)加入效应细胞PBMC(从人全血中分离)：效应细胞用实验体系中肿瘤细胞使用的完全培养基重悬，按实验设计中效靶比换算加入相应效应细胞数，按照体积50μl/孔加入；
5)加入稀释抗体：按照实验设计，抗体最高浓度为10μg/ml，因抗体补入50μl，占总体积200μl的1/4，抗体均需配成4倍浓度再补入，所以抗体先稀释至40μg/ml，从40Pg/ml开始10倍稀释，9个梯度，体积50μl/孔；
6)镜下观察96孔板，保证细胞均匀分散在培养孔，放置5％CO2、37℃细胞培养箱培养，待检测；
7)到达检测时间后，贴壁细胞处理：吸出细胞上清，30μl/孔PBS洗涤，吸出洗涤液体并入之前吸出的上清；细胞孔内加入胰酶30μl/孔，放置5％CO2、37℃细胞培养箱消化3-5min，加入之前收集到的上清，吹打各孔细胞为单细胞悬液；悬浮细胞处理：多次吹打混匀；
8)各样品于流式上机前1015min加入PI(终浓度为10μg/ml)，10ul/孔；
9)流式细胞仪上机检测；将流式细胞仪检测结果在ElowJo软件分析，MicrosoftExcel导出数据分析，GraphPad进行制表分析，杀伤计算公式：CFSE、PI双阳性细胞占CFSE阳性细胞比例为靶细胞的死亡率。
计算公式如下：
Figure BDA0002923590610000751
10)抗体对肿瘤细胞的杀伤能力计算：根据靶细胞死亡率计算公式，计算在每一个抗体浓度下的靶细胞死亡率，并以抗体浓度为横坐标、靶细胞死亡率为纵坐标绘图，数据分析软件为Graphpad Prism 5，得到EC50值，即为该抗体的细胞杀伤能力。
部分多功能抗体具体的结合活性见表28。
部分多功能抗体具体的T细胞激活能力见图7和表29。
部分多功能抗体的细胞杀伤能力见图8和9，以及表30和表31。
Figure BDA0002923590610000761
Figure BDA0002923590610000771
Figure BDA0002923590610000781
Figure BDA0002923590610000791
Figure BDA0002923590610000801
Figure BDA0002923590610000811
Figure BDA0002923590610000821
Figure BDA0002923590610000831
Figure BDA0002923590610000841
Figure BDA0002923590610000851
Figure BDA0002923590610000861
(2)本发明的多功能抗体与对比多功能抗体的细胞亲和力检测
多功能抗体的亲和力检测结果见下表：
[表28]不同多功能抗体的细胞亲和力
Figure BDA0002923590610000871
表28显示本发明的CD3人源化抗体，与不同CD38单抗组合成多功能抗体后，两端亲和力会受到不同程度的影响。
(3)本发明的多功能抗体对T细胞的激活水平检测
本发明的多功能抗体Y150-F8-9，Y150-F8-10，Y150-F8-12，Y150-F9-11，
MS-hCD3-IC-17对人T细胞的激活水平检测见图7(其中效应细胞人PBMC与靶细胞MC/CAR数量之比为5∶1，处理时间48h)。图7显示了不同的本发明的多功能抗体对T细胞的体外激活能力。
[表29]不同的多功能抗体体外激活T细胞的EC50值
Figure BDA0002923590610000872
Figure BDA0002923590610000881
“*”表示未到平台，曲线拟合不准确。实际的EC50值可能比表中数值更大。
在图7中，Y150-F8-9具有最强的T细胞激活功能，该抗体与两种抗原(CD38和CD3)的结合能力都是图中抗体里最强；Y150-F8-8具有与Y150-F8-9近似水平的T细胞激活功能(数据未展示)；Y150-F8-9、Y150-F8-10和Y150-F8-12这几个抗体，抗CD38的抗体序列完全一致，对CD38的亲和力也一致，但是这几个抗体的抗CD3抗体序列不完全一致，对CD3的亲和力存在1～3个氨基酸点突变的差异，并且对T细胞激活的能力也具有显著差异：Y150-F8-9具有最强的T细胞激活功能，其次是Y150-F8-10，而Y150-F8-12具有弱的T细胞激活功能。Y150-F9-11具有显著的激活T细胞的功能。
(4)本发明的多功能抗体与对比多功能抗体的细胞杀伤能力检测
本发明的多功能抗体Y150-F8-5，Y150-F8-6与对比多功能抗体Y150-F8-1对多发性骨髓瘤细胞MC/CAR的杀伤能力检测结果见图8(其中效应细胞人PBMC与靶细胞MC/CAR数量之比为5∶1，处理时间为72h)：
图8显示了不同的多功能抗体对多发性骨髓瘤细胞MC/CAR的体外杀伤能力。
[表30]不同的多功能抗体杀伤肿瘤细胞MC/CAR的EC50值
Figure BDA0002923590610000882
在图8中，Y150-8-5和Y150-8-6的抗CD3 scFv序列均为新的人源化CD3抗体序列，除此之外，抗体的其他部分(包括Fab和Fc)序列与Y150-F8-1完全相同。Y150-F8-1的抗CD3scFv序列为已知抗体SP34的序列。从以上数据可知，本发明的多功能抗体具有近似甚至更强的杀伤肿瘤细胞能力。对照抗体无杀伤能力，表明多功能抗体的杀伤细胞能力是通过双特异性靶向结合肿瘤和免疫细胞，从而诱导免疫细胞攻击肿瘤细胞产生的。CD38单抗为已上市的CD38抗体药物
Figure BDA0002923590610000884
本发明的多功能抗体Y105与对比多功能抗体Y106对肺癌细胞H358的杀伤能力检测结果见图9(其中效应细胞人PBMC与靶细胞MC/CAR数量之比为10：1，处理时间为48h)。
图9显示了不同的多功能抗体对肺癌细胞H358的体外杀伤能力。
[表31]不同的多功能抗体杀伤肿瘤细胞H358的EC50值
Figure BDA0002923590610000883
在图9中，Y105的抗CD3 scFv序列为新的人源化CD3抗体序列，除此之外，抗体的其他部分(包括Fab和Fc)序列与Y106完全相同。Y106的抗CD3 scFv序列为已知抗体SP34的序列。从以上数据可知，本发明的多功能抗体具有相近甚至更强的杀伤肿瘤细胞能力。对照抗体杀伤很弱，表明多功能抗体的杀伤细胞能力是通过双特异性靶向结合肿瘤和免疫细胞，从而诱导免疫细胞攻击肿瘤细胞产生的。S70 mAb为已上市的PD-L1抗体药物
Figure BDA0002923590610000891
(5)本发明的多功能抗体与对比多功能抗体的稳定性检测
实验一：40℃热加速稳定性检测，具体操作步骤为：
1，将样品置换到特定缓冲液中，缓冲液的成分为(a)柠檬酸缓冲液：20mM柠檬酸，pH5.5，或者(b)组氨酸缓冲液：50mM组氨酸，pH5.5，并将样品浓度调整至1mg/mL；
2，将样品分装为500μL每管密封后放置于40℃的水浴中，每隔24h取样进行HPLC-SEC检测，水浴时间共计14天。
检测结果见图1016。
图10显示了本发明的多功能抗体Y105与对比抗体Y106、CT-F4、CT-F5和CT-F6在柠檬酸缓冲液体系的40℃加速热稳定性检测。由图10可知，本发明的多功能抗体具有良好的热稳定性，14天的40℃处理，该抗体无显著变化，与对比抗体Y100近似，而显著优于CT-F4、CT-F5和CT-F6。其中Y105与所有对比抗体具有相同的Fab和Fc序列，ScFv不同，Y105为本发明的CD3抗体VH2a和VL5序列，Y106为SP34抗体序列，CT-F4为CD3抗体1序列，CT-F5为CD3抗体2序列，CT-F6为CD3抗体1VH和CD3抗体2VL序列。
图11显示了本发明的多功能抗体Y150-F8-5、Y150-F8-6、Y150-F8-7及Y150-F8-8与对比抗体Y150-F8-1、Y150-F8-2、CT-F1、CT-F2及CT-F3在柠檬酸缓冲液体系中的40℃加速热稳定性检测。图11中所有多功能抗体的Fab序列均相同，且Y150-F8-5、Y150-F8-6、Y150-F8-1、CT-F1、CT-F2和CT-F3之间Fc序列相同；Y150-F8-5、Y150-F8-6、Y150-F8-7和Y150-F8-8的CD3抗体序列为VH2a和VL5；Y150-F8-1和Y150-F8-2的CD3抗体序列为SP34，CT-F1的CD3抗体序列为CD3抗体1，CT-F2的CD3抗体序列为CD3抗体2，CT-F3的CD3抗体序列为CD3抗体1VH和CD3抗体2VL。由图中数据可知，本发明的多功能抗体具有显著优于对比抗体的热稳定性。
图12显示了本发明的多功能抗体Y150-F8-9、F8-10、F8-12、F9-7及F9-11与对比抗体Y150-F8-1、Y150-F9-6、CT-F1、CT-F2及CT-F3在柠檬酸缓冲液体系中的40℃加速热稳定性检测。图12中Y150-F8-9、F8-10、F8-12、F9-7及F9-11为本发明的多功能抗体，CD3抗体序列为VH2a和VL5，或VH2j和VL5a(F8-10)，或VH2l和VL5b(F8-12)；Y150-F8-1、Y150-F9-6、CT-F1、CT-F2及CT-F3为对比多功能抗体，CD3序列分别为SP34(Y150-F8-1，Y150-F9-6)，CD3抗体1(CT-F1)，CD3抗体2(CT-F2)，CD3抗体1VH和CD3抗体2VL(CT-F3)。由图12数据可知，本发明的多功能抗体具有显著优于对比抗体的热稳定性。
图13显示了本发明的多功能抗体MS-hCD3-IC15、IC16、IC17及IC18与对比抗体IC-2至IC-7在柠檬酸缓冲液体系中的40℃加速热稳定性检测。图13中所有抗体的Fab序列完全一致，其中MS-hCD3-IC15、IC16、IC17和IC18为本发明的多功能抗体，CD3抗体序列为VH2a和VL5，或者VH2j和VL5a(IC18)。IC-2至IC-7为对比多功能抗体，CD3抗体序列分别为SP34(IC-2和IC-3)，CD3抗体1(IC-4)，CD3抗体2(IC-5)，CD3抗体1VH和CD3抗体2VL(IC-6和IC-7)。由该图数据可知，本发明的多功能抗体具有显著优于对比抗体的热稳定性。
图14显示了本发明的多功能抗体Y150-F8-5、Y150-F8-6、Y150-F8-7及Y150-F8-8与对比抗体Y150-F8-1、Y150-F8-2、CT-F1、CT-F2及CT-F3在组氨酸缓冲液体系中的40℃加速热稳定性检测。图14中所有多功能抗体的Fab序列均相同，且Y150-F8-5、Y150-F8-6、Y150-F8-1、CT-F1、CT-F2和CT-F3之间Fc序列相同；Y150-F8-5、Y150-F8-6、Y150-F8-7和Y150-F8-8的CD3抗体序列为VH2a和VL5；Y150-F8-1和Y150-F8-2的CD3抗体序列为SP34，CT-F1的CD3抗体序列为CD3抗体1，CT-F2的CD3抗体序列为CD3抗体2，CT-F3的CD3抗体序列为CD3抗体1VH和CD3抗体2VL。由图中数据可知，本发明的多功能抗体均具有良好的热稳定性，而对比抗体Y150-F8-1、Y150-F8-2、CT-F1、CT-F2及CT-F3热稳定性则显著弱于本发明的多功能抗体。
图15显示了本发明的多功能抗体Y150-F8-9、F8-10、F8-12、F9-7及F9-11与对比抗体Y150-F8-1、Y150-F9-6、CT-F1、CT-F2及CT-F3在组氨酸缓冲液体系中的40℃加速热稳定性检测。图15中Y150-F8-9、F8-10、F8-12、F9-7及F9-11为本发明的多功能抗体，CD3抗体序列为VH2a和VL5，或VH2j和VL5a(F8-10)，或VH2l和VL5b(F8-12)；Y150-F8-1、Y150-F9-6、CT-F1、CT-F2及CT-F3为对比多功能抗体，CD3序列分别为SP34(Y150-F8-1和Y150-F9-6)，CD3抗体1(CT-F1)，CD3抗体2(CT-F2)，CD3抗体1VH和CD3抗体2VL(CT-F3)。由图15数据可知，本发明的多功能抗体具有显著优于对比抗体的热稳定性。
图16显示了本发明的多功能抗体MS-hCD3-IC15、IC16、IC17以及IC18与对比抗体IC-2至IC-7在组氨酸缓冲液体系中的40℃加速热稳定性检测。图16中所有抗体的Fab序列完全一致，其中MS-hCD3-IC15、IC16、IC17和IC18为本发明的多功能抗体，CD3抗体序列为VH2a和VL5，或者VH2j和VL5a(IC18)。IC-2至IC-7为对比多功能抗体，CD3抗体序列分别为SP34(IC-2和IC-3)，CD3抗体1(IC-4)，CD3抗体2(IC-5)，CD3抗体1VM和CD3抗体2VL(IC-6和IC-7)。由该图数据可知，本发明的多功能抗体具有显著优于对比抗体的热稳定性。
实验二：低pH稳定性检测。
低pH稳定性，也称为耐酸性，是考察抗体分子在酸性环境中处理一段时间后再中和至生理条件是否还能保持原来的状态。具体方法为，在抗体分子进行protein A亲和层析时，在酸洗脱步骤中(使用pH3.5的柠檬酸缓冲液)，洗脱下来的抗体溶液不进行中和，在该缓冲液中保持一段时间后，在第30min和第60min取样加入1/10体积的1M Tris-HCl(pH8.0)进行中和，并进行该样品的HPLC-SEC检测。
图17显示了本发明的多功能抗体Y105与对比抗体Y106、CT-F4、CT-F5和CT-F6在pH3.5的柠檬酸缓冲液体系的耐酸性稳定性检测。由图17可知，本发明的多功能抗体具有良好的耐酸性，60min的低pH处理，该抗体无显著变化，其耐酸性显著优于Y106、CT-F4、CT-F5和CT-F6。
图18显示了本发明的多功能抗体Y150-F8-5、Y150-F8-6、Y150-F8-7及Y150-F8-8与对比抗体Y150-F8-1、Y150-F8-2、CT-F1、CT-F2及CT-F3在pH3.5柠檬酸缓冲液体系中的耐酸性稳定性检测。图18中所有多功能抗体的Fab序列均相同，且Y150-F8-5、Y150-F8-6、Y150-F8-1、CT-F1、CT-F2和CT-F3之间Fc序列相同；Y150-F8-5、Y150-F8-6、Y150-F8-7和Y150-F8-8的CD3抗体序列为VH2a和VL5；Y150-F8-1和Y150-F8-2的CD3抗体序列为SP34，CT-F1的CD3抗体序列为CD3抗体1，CT-F2的CD3抗体序列为CD3抗体2，CT-F3的CD3抗体序列为CD3抗体1VH和CD3抗体2VL。由图中数据可知，本发明的多功能抗体具有显著优于对比抗体的耐酸性。
图19显示了本发明的多功能抗体Y150-F8-9、F8-10、F8-12、F9-7及F9-11与对比抗体Y150-F8-1、Y150-F9-6、CT-F1、CT-F2及CT-F3在pH3.5柠檬酸缓冲液体系中的耐酸性稳定性检测。图19中Y150-F8-9、Y150-F9-7及Y150-F9-11为本发明的多功能抗体，CD3抗体序列为VH2a和VL5，或VH2j和VL5a(F8-10)，或VH21和VL5b(F8-12)；Y150-F8-1、CT-F1、CT-F2及CT-F3为对比多功能抗体，CD3序列分别为SP34(Y150-F8-1和Y150-F9-6)，CD3抗体1(CT-F1)，CD3抗体2(CT-F2)，CD3抗体1VH和CD3抗体2VL(CT-F3)。由图19数据可知，本发明的多功能抗体具有显著优于对比抗体的耐酸性。
图20显示了本发明的多功能抗体MS-hCD3-IC15、IC16、IC17和IC18与对比抗体IC-2至IC-7在pH3.5柠檬酸缓冲液体系中的耐酸性检测。图20中所有抗体的Fab序列完全一致，其中MS-hCD3-IC15、IC16、IC17和IC18为本发明的多功能抗体，CD3抗体序列为VH2a和VL5，或VH2j和VL5a(IC18)。IC-2至IC-7为对比多功能抗体，CD3抗体序列分别为SP34(IC-2和IC-3)，CD3抗体1(IC-4)，CD3抗体2(IC-5)，CD3抗体1VH和CD3抗体2VL(IC-6和IC-7)。由该图数据可知，本发明的多功能抗体具有显著优于对比抗体的耐酸性。
(6)本发明的多功能抗体与对比多功能抗体的体内药效实验
一、实验材料：
细胞：Daudi(人多发性骨髓瘤细胞株，购自ATCC)，人PBMC；
小鼠：NOD/SCID 5周龄雌性北京维通利华；
接种方式：Daudi细胞-右侧后背部皮下；人PBMC-尾静脉，D0同时接种Daudi和PBMC细胞；
受试药：(B)Y150-F8-8，(C)Y150-F8-9，(D)Y150-F9-11；
阴性对照：(A)空白对照；(H)MS-hCD3-IC-17；
阳性对照：(G)CD38mAb(CD38单抗，
Figure BDA0002923590610000912
)；
给药方式：(1)Y150-F8-8，Y150-F8-9，Y150-F9-11和MS-hCD3-17，分别设置不同剂量进行尾静脉给药，D0开始给药，TIW×2；(2)CD38mAb，D0和D7给药，D0剂量为5mg/kg，D7剂量为15mg/kg；每组6只；
体重：给药期间每周测量体重3次，之后每周测量体重2次肿瘤体积：肿瘤潜伏期920天，平均瘤体积达到30mm3后每周2次对肿瘤长宽进行测量，监测时间约30天或待阴性对照组平均肿瘤体积近2000mm3左右时对所有剩余荷瘤小鼠进行拍照。一组瘤体积接近2000mm3或单只小鼠肿瘤体积达3000mm3时将结束该组。
二、实验结果
Y150-F8-8实验结果显示于图21A；Y150-F8-9实验结果显示于图21B；Y150-F9-11实验结果显示于图21C。
图21显示了不同多功能抗体在小鼠肿瘤模型中的体内药效及瘤体积监测；其中Y150-F8-8(A)，F8-9(B)和F9-11(C)均为本发明的多功能抗体，抗CD3抗体序列均为VH2a和VL5，抗CD38抗体序列均不相同。
[表32]不同的多功能抗体的体内药效(给药后第29天)
Figure BDA0002923590610000911
由图21中，可以看到本发明的多功能抗体Y150-F8-8，F8-9和F9-11具有显著的抑瘤效果，与对照单抗相比也没有显著差异，在有效剂量下均可以完全抑瘤，且动物没有表现出明显的毒副反应。
(7)本发明的多功能抗体的猴毒性实验
2F5mAb为抗CD38的单抗，可交叉结合人猴CD38，具体序列为：
[表33]2F5单抗序列
Figure BDA0002923590610000921
多功能抗体Y150-F810，F911，F912，与对比抗体Y150-F96和单抗2F5mAb分别进行猴毒性实验，静脉输注单次给药，剂量如下表：
[表34]猴毒性实验给药剂量
抗体 数量(只) 剂量(mg/kg) 毒性反应
Y150F96 2 0.5 死亡率100％
Y150F810 2 1.0 无死亡
Y150F911 2 1.0 无死亡
Y150F912 2 1.0 无死亡
Y150-F810，F911，F912各组猴淋巴细胞亚群CD38+CD20+细胞数量在给药后24h内均显著下降为完全清除，2F5mAb组(剂量为20mg/kg)该群细胞则下降到给药前30％左右，未完全清除。这些数据显示出Y150-F8-10，F9-11，F9-12分子具有显著清除CD38+细胞的药效，且由表34可知，Y150-F8-10、Y150-F9-11、Y150-F9-12具有比Y150-F9-6更弱的毒性。

Claims (67)

1.人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体特异性结合灵长类CD3，所述人源化抗体包括构架区，分别为FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4、FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，和互补性决定区（CDR），其中重链可变区的CDR1和 CDR2氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，
重链可变区的CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:11, SEQID NO:12, SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:191所示的序列的任一种，其中所述人源化抗体的构架区由以下框架区组成：
a)SEQ ID NO: 16的FR-H1；
b)SEQ ID NO: 17的FR-H2；
c)SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24中任一个的FR-H3；
d)SEQ ID NO: 25的FR-H4；
e)SEQ ID NO: 31的FR-L1；
f)SEQ ID NO: 34和SEQ ID NO:36中任一个的FR-L2；
g) SEQ ID NO: 41的FR-L3；和
h) SEQ ID NO: 43的FR-L4，
其中所述抗原结合片段选自F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv或scFv。
2.权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体特异性结合人和/或猴CD3。
3.权利要求1或2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区选自下述任一项的序列：
SEQ ID NO: 49的氨基酸序列;或
与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区包括下述任一项的序列：
SEQ ID NO: 71或SEQ ID NO:73的氨基酸序列;或
与SEQ ID NO: 71的氨基酸序列具有80%、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO: 73的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列。
4.权利要求1或2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别选自下组的氨基酸序列：
SEQ ID Nos: 49或与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列，SEQ ID NO:71或与SEQ ID NOs: 71的氨基酸序列具有80%、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列。
5.多特异性抗体，其包含权利要求1-4任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，以及针对其他抗原和/或其他抗原表位的抗体或抗原结合片段。
6.权利要求5所述的多特异性抗体，其为双特异性抗体。
7.权利要求5或6所述的多特异性抗体，其中所述其他抗原和/或其他抗原表位选自相对于对应的非肿瘤细胞而言在肿瘤细胞上过表达的蛋白。
8.权利要求5或6所述的多特异性抗体，其中所述其他抗原和/或其他抗原表位选自肿瘤抗原。
9.权利要求5或6所述的多特异性抗体，其中所述其他抗原和/或其他抗原表位选自病毒。
10.权利要求5或6所述的多特异性抗体，其中所述其他抗原和/或其他抗原表位选自细菌。
11.权利要求5或6所述的多特异性抗体，其中所述其他抗原和/或其他抗原表位选自内毒素。
12.权利要求8所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤抗原选自CD38，BCMA，PD-L1，SLAMF7，Claudin18.2或CEA。
13.一种抗体，该抗体包括(a)轻链-重链对，该轻链-重链对针对肿瘤细胞或微生物具有特异性；和(b)融合肽，该融合肽包括单链可变片段和单链Fc片段，其中所述单链可变片段包含含有权利要求1-4任一项中定义的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区，该融合肽针对免疫细胞具有特异性。
14.权利要求13的抗体，其中Fc片段包含选自SEQ ID NO: 155-161或SEQ ID NO:192任一项的序列的CH2和/或SEQ ID NO:162-183任一项的序列的CH3。
15.权利要求13或14任一项所述的抗体，其中融合肽包括VHs-接头1-VLs-铰链1-CH2-CH3-b，重链包括VHm-CH1-铰链2-CH2-CH3-a，轻链包括VLm-CL。
16.权利要求13或14所述的抗体，其中所述轻链-重链对特异性结合：相对于对应的非肿瘤细胞而言在肿瘤细胞上过表达的蛋白。
17.权利要求13或14所述的抗体，其中所述轻链-重链对特异性结合：肿瘤抗原。
18.权利要求13或14所述的抗体，其中所述轻链-重链对特异性结合：病毒。
19.权利要求13或14所述的抗体，其中所述轻链-重链对特异性结合：细菌。
20.权利要求13或14所述的抗体，其中所述轻链-重链对特异性结合：内毒素。
21.权利要求17所述的抗体，其中所述肿瘤抗原是CD38，BCMA，PD-L1，SLAMF7,Claudin18.2或CEA。
22.权利要求13或14所述的抗体，其中所述融合肽特异性结合免疫细胞抗原。
23.权利要求13或14所述的抗体，其中该重链或融合肽的重链包含人或者人源化的Fc片段。
24.权利要求23所述的抗体，其中所述Fc片段选自人IgG Fc片段。
25.权利要求24所述的抗体，其中所述Fc片段选自IgG1 Fc片段、IgG2 Fc片段、IgG3 Fc片段、IgG4 Fc片段或IgG5 Fc片段。
26.权利要求13或14所述的抗体，其中与野生型抗体比，该重链、融合肽的重链和/或该融合肽的Fc片段包含一处或多处替换，该替换在该重链和融合肽之间形成杵-臼结构配对，其中所述替换为一个CH3结构域上的T366被酪氨酸或色氨酸替换，另一CH3结构域上的Y407被苏氨酸，丙氨酸或缬氨酸。
27.权利要求26所述的抗体，其中所述替换选自：
(1)一个CH3结构域上的替换为T366W，另一个CH3上的替换为Y407A，
(2) 一个CH3结构域上的替换为T366W，另一个CH3上的替换为Y407V，
(3) 一个CH3结构域上的替换为T366Y，另一个CH3上的替换为Y407A，
(4) 一个CH3结构域上的替换为T366Y，另一个CH3上的替换为Y407V，和/或
(5) 一个CH3结构域上的替换为T366W，另一个CH3上的替换为T366S，L368A，Y407V。
28.权利要求13或14所述的抗体，其中该重链和/或该融合肽的Fc片段包含一处或多处替换，1）该替换在该重链和融合肽之间形成盐桥配对，
2）该替换在该重链和融合肽之间形成二硫键，和/或
3）该替换导致Fc与蛋白A之间的结合能力显著降低，即一个CH3结构域上的H435和Y436分别被替换为精氨酸和苯丙氨酸，或者一个CH3上的替换为S354C,另一个CH3上的替换为Y349C，
其中所述形成盐桥配对的替换为该CH3结构域之一含有一处或多处替换，经在生理条件下有正电荷的氨基酸残基替换，而另一CH3结构域包含一处或多处替换，经一个或多个在生理条件下具有负电荷的氨基酸残基替换，
其中所述带正电的氨基酸残基为精氨酸，组氨酸或赖氨酸，所述带负电荷的氨基酸残基可为天冬氨酸或谷氨酸，其中被替换的氨基酸残基包括D356、L368、K392、D399和K409中的一个或多个。
29.权利要求28所述的抗体，其中所述替换选自
(1) 一个CH3上的替换为D356K，D399K,另一个CH3上的替换为K392D, K409D；
(2) 一个CH3上的替换为L368R，D399K,另一个CH3上的替换为K392D, K409D；
(3) 一个CH3上的替换为L368K，D399K,另一个CH3上的替换为K392D, K409D；
(4) 一个CH3上的替换为L368R，D399K,另一个CH3上的替换为K409D；
(5) 一个CH3上的替换为L368K，D399K,另一个CH3上的替换为K409D；
(6) 一个CH3上的替换为L368R,另一个CH3上的替换为K409D；和/或
(7) 一个CH3上的替换为L368K,另一个CH3上的替换为K409D。
30.权利要求13或14所述的抗体，其中融合肽的VH包括SEQ ID NO: 49的序列或由其组成；融合肽的VL包括SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:73任一项的序列或由其组成；融合肽的接头1包括选自SEQ ID NO: 120-138任一项的序列或由其组成；融合肽的铰链1和重链的铰链2包括选自SEQ ID NO: 139-147任一项的序列或由其组成；融合肽的CH2和重链的CH2包括选自SEQ ID NO: 155-161或SEQ ID NO:192任一项的序列或由其组成；融合肽的CH3-b包括选自SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183任一项的序列或由其组成；重链的CH3-a包括选自SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO:164、SEQID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182任一项的序列或由其组成；重链的VHm选自以下各项组成的组：SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO:91；SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO:93；SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO:95；SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO:97；SEQ ID NO: 98、SEQ IDNO:99；SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO:101；SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO:103；SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105；SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO:107；SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO:109；SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO:111；SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO:113；SEQ ID NO: 114、SEQID NO:115；SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO:117；SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO:119；SEQ IDNO: 193、SEQ ID NO:194。
31.权利要求13或14所述的抗体，其中融合肽的VH和融合肽的VL分别包含选自下组的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO: 49或与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列，SEQ ID NO: 71或与SEQ ID NO: 71的氨基酸序列具有80%、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列；
和/或
所述重链的VHm和轻链的VLm分别包含选自下组的氨基酸序列或由其组成： SEQ IDNO: 90、SEQ ID NO: 91；SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93；SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95；SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97；SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99；SEQ ID NO: 100、SEQ IDNO: 101；SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103；SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105；SEQ IDNO: 106、SEQ ID NO: 107；SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109；SEQ ID NO: 110、SEQ IDNO: 111；SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113；SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115；SEQ IDNO: 116、SEQ ID NO: 117；SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119；SEQ ID NO: 193、SEQ IDNO: 194。
32.权利要求13或14所述的抗体，其中所述抗体选自Y105, Y150-F8-5, Y150-F8-7,Y150-F8-8, Y150-F8-9, Y150-F8-10, Y150-F8-12, Y150-F9-7, Y150-F9-11, Y150-F9-12, MS-hCD3-IC15, MS-hCD3-IC16, MS-hCD3-IC17和MS-hCD3-IC18，其中按照融合肽VHs-接头1-VLs-铰链1-CH2-CH3-b，重链VHm-CH1-铰链2-CH2-CH3-a，轻链VLm-CL各组分的顺序，
Y105由下述序列组成：SEQ ID NO: 49或者与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:154、SEQID NO:139、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:148；
Y150-F8-5由下述序列组成：SEQ ID NO: 49或者与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO: 129、SEQID NO:71、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:148；
Y150-F8-7由下述序列组成：SEQ ID NO: 49或者与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:148；
Y150-F8-8由下述序列组成：SEQ ID NO: 49或者与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:148；
Y150-F8-9由下述序列组成：SEQ ID NO: 49或者与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:148；
Y150-F8-12由下述序列组成：SEQ ID NO: 60或者与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:154、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:148；
Y150-F9-7由下述序列组成：SEQ ID NO:49或者与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:150；
Y150-F9-11由下述序列组成：SEQ ID NO:49或者与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:148；
Y150-F9-12由下述序列组成：SEQ ID NO:49或者与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:148；
MS-hCD3-IC15由下述序列组成：SEQ ID NO:49或者与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:148；
MS-hCD3-IC16由下述序列组成：SEQ ID NO:49或者与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:148；
MS-hCD3-IC17由下述序列组成：SEQ ID NO:49或者与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:148。
33.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以小于10-8 M的KD结合靶标。
34.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以小于10-8 M的KD结合靶标。
35.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以10-9 M的KD结合靶标。
36.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以10-10 M或更小的KD结合靶标。
37.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以小于100 nM的EC50结合靶标。
38.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以小于10 nM的EC50结合靶标。
39.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以1 nM的EC50结合靶标。
40.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以0.9 nM的EC50结合靶标。
41.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以0.8 nM的EC50结合靶标。
42.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以0.7 nM的EC50结合靶标。
43.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以0.6 nM的EC50结合靶标。
44.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以0.5 nM的EC50结合靶标。
45.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以0.4 nM的EC50结合靶标。
46.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以0.3 nM的EC50结合靶标。
47.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以0.2 nM的EC50结合靶标。
48.权利要求1-4和13、14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以0.1 nM或更小的EC50结合靶标。
49.一种多核苷酸，其编码权利要求1-4和13-48任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
50.一种表达载体，其包含权利要求49所述的多核苷酸。
51.一种宿主细胞，其包含权利要求49所述的多核苷酸或权利要求50所述的表达载体。
52.制备权利要求1-4、13-48任一项所述抗体的方法，其包括将权利要求49所述的多核苷酸或权利要求50所述的表达载体引入到宿主细胞中，以制备所述抗体。
53.抗体偶联物，其包含权利要求1-4、13-48任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及与其偶联的偶联部分。
54.权利要求53所述的抗体偶联物，其中，所述偶联部分选自纯化标签、细胞毒性剂，可检测的标记，放射性同位素、发光物质、有色物质、酶或聚乙二醇。
55.权利要求54所述的抗体偶联物，其中所述纯化标签为His标签。
56.融合蛋白，其包含权利要求1-4、13-48任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
57.一种药物组合物，其包括权利要求1-4、13-48任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求53-55任一项所述的抗体偶联物，或权利要求56所述的融合蛋白。
58.权利要求57所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
59.权利要求57或58所述的药物组合物，所述药物组合物为适合于口服施用于胃肠道的剂型；或所述药物为适合于通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射，病灶内注射的剂型。
60.权利要求59所述的药物组合物，其中所述剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂组成的组。
61.试剂盒，其包括权利要求1-4和13-48任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求53-55任一项所述的抗体偶联物，或权利要求56所述的融合蛋白。
62.权利要求61所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别权利要求1-4和13-48任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求53-55任一项所述的抗体偶联物，或权利要求56所述的融合蛋白。
63.权利要求62所述的试剂盒，其中所述第二抗体还包括可检测的标记。
64.权利要求63所述的试剂盒，其中所述可检测的标记选自放射性同位素、发光物质、有色物质、酶。
65.权利要求1-4和13-48任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗疾病的药物中用途，其中所述疾病包括癌症或肿瘤。
66.权利要求65所述的用途，其中所述疾病为多发性骨髓瘤，肺癌。
67.权利要求66所述的用途，其中所述肺癌为小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌或肺鳞癌。
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