JP2023106392A - Ｃｄ３抗原結合性断片及びその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】改善された生物学的活性、熱安定性及び/又は耐酸性を有する、ヒト化、多機能抗ＣＤ３抗体を提供する。【解決手段】ヒト化抗体又はその抗原結合性断片であって、ヒト及び／又はサルなどの霊長類のＣＤ３に特異的に結合し、フレームワーク領域ＦＲ-Ｈ１、ＦＲ-Ｈ２、ＦＲ-Ｈ３、ＦＲ-Ｈ４、ＦＲ-Ｌ１、ＦＲ-Ｌ２、ＦＲ-Ｌ３及びＦＲ-Ｌ４と、相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含み、重鎖可変領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列、重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列、および前記ヒト化抗体のフレームワーク領域が、特定の配列を含む、ヒト化抗体又はその抗原結合性断片により、上記課題を解決する。【選択図】なし

Description

本発明は、遺伝子工学分野に関し、特に抗体工学分野に関する。具体的には、本発明は抗体、例えば多機能抗体、例えばＣＤ３に対する抗体、特にヒト化抗体、前記抗体の抗原結合性断片及び関連した使用に関する。

ＣＤ３はＴ細胞表面分子であり、Ｔ細胞の表面のＴ細胞受容体と結合してＴＣＲ-ＣＤ３複合体を形成し、Ｔ細胞を活性化できる。抗原認識、免疫シグナル伝達に重要な役割を果たしている。抗ＣＤ３抗体は、移植拒絶反応、自己免疫疾患等の治療に汎用されている。ＯＫＴ３のようなネズミ由来の抗ＣＤ３抗体は、ＨＡＭＡ(ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ)反応をもたらした可能性があり、ヒトでの使用には好ましくないことが知られている。したがって、副作用を軽減するために、これらのネズミ由来抗体に対してヒト化又は他の処理を行う必要がある。従来、ＨＡＭＡ反応を避ける又は低減するための主なルートは、ネズミ由来のモノクローナル抗体をヒト化するか、又は完全ヒト化抗体を開発することである。例えば、ネズミ由来抗体にヒト抗体タンパク質と同様の配列断片を導入することで、ＨＡＭＡ反応を低減することができる。しかし、構造的に類似したタンパク質はヒトには存在しない場合があるので、このような処理を行うことができない場合もある。さらに、抗体のヒト化では、抗体の親和性の低下、活力の低下、安定性の低下又は収量の低下などの技術難点も出くわすため、有効な治療タンパク質が得られないことが多い。

WO2013/158856 WO2007/019620 WO2017/023761

本発明は抗体例えば多機能抗体、例えばＣＤ３に対する抗体、特にヒト化抗体、前記抗体の抗原結合性断片及び関連した使用を提供する。

いくつかの実施態様において、本発明は、以下を提供する：抗体又はその抗原結合性断片、特にヒト化抗体又はその抗原結合性断片であって、
ヒト及び／又はサルなどの霊長類のＣＤ３に特異的に結合し、
フレームワーク領域ＦＲ-Ｈ１、ＦＲ-Ｈ２、ＦＲ-Ｈ３、ＦＲ-Ｈ４、ＦＲ-Ｌ１、ＦＲ-Ｌ２、ＦＲ-Ｌ３及びＦＲ-Ｌ４と、相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含み、
重鎖可変領域のＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２及びＣＤＲ-Ｈ３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１、２及び３に示されるアミノ酸配列、又はその変異体配列、例えば、ＣＤＲ-Ｈ３の変異体配列である配列番号４-１４及び１９０-１９１に示される配列のいずれか一つの配列であり、
軽鎖可変領域のＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２及びＣＤＲ-Ｌ３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２６、２７及び２８に示されるアミノ酸配列、又はその変異体配列であり、
前記ヒト化抗体のフレームワーク領域が、
ａ) 配列番号１５又は１６のＦＲ-Ｈ１
ｂ) 配列番号１７のＦＲ-Ｈ２
ｃ) 配列番号１８-２４のいずれか一つのＦＲ-Ｈ３
ｄ) 配列番号２５のＦＲ-Ｈ４
ｅ) 配列番号２９-３１のいずれか一つのＦＲ-Ｌ１
ｆ) 配列番号３２-３８のいずれか一つのＦＲ-Ｌ２
ｇ) 配列番号３９-４２のいずれか一つのＦＲ-Ｌ３、及び/又は
ｈ) 配列番号４３-４４のいずれか一つのＦＲ-Ｌ４
の群から選択される一つ以上の配列を含む、抗体又はその抗原結合性断片。

いくつかの実施態様において、本発明は、以下を提供する：抗体又はその抗原結合性断片、特にヒト化抗体又はその抗原結合性断片であって、
ヒト及び／又はサルなどの霊長類のＣＤ３に特異的に結合し、
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域が、
ａ) 配列番号４５-６２のアミノ酸配列、
ｂ) 配列番号４５-６２の少なくとも一つのアミノ酸配列と８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｃ) 配列番号４５-６２の少なくとも一つのアミノ酸配列と一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列、
の群から選択されるいずれか一つの配列を含み
前記軽鎖可変領域が、
ｄ) 配列番号６３-７３のアミノ酸配列、
ｅ) 配列番号６３-７３の少なくとも一つのアミノ酸配列と８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｆ) 配列番号６３-７３の少なくとも一つのアミノ酸配列と一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列
の群から選択されるいずれか一つの配列を含む、抗体又はその抗原結合性断片。

いくつかの実施態様において、本発明は、以下を提供する：抗体又はその抗原結合性断片、特にヒト化抗体又はその抗原結合性断片であって、
ヒト及び／又はサルなどの霊長類のＣＤ３に特異的に結合し、
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、それぞれ、
ａ) 配列番号４６、６３；配列番号４７、６３；配列番号４９、６３；配列番号５０、６３；配列番号５１、６３；配列番号４６、７１；配列番号４７、７１；配列番号４９、７１；配列番号５１、７１；配列番号５２、７２；配列番号５３、７２；配列番号５４、７２；配列番号５５、７２；配列番号５６、７２；配列番号５７、７２；配列番号５８、７２；配列番号６２、７２；配列番号５２、７３；配列番号５３、７３；配列番号５４、７３；配列番号５５、７３；配列番号５６、７３；配列番号５７、７３；配列番号５８、７３；配列番号６１、７３；配列番号６２、７３；配列番号４５、６３；配列番号４８、６３；配列番号４５、６４；配列番号４５、６７；配列番号４８、６４；配列番号４８、６７；配列番号４５、７１；配列番号４８、７１；配列番号５０、７１；配列番号６１、７２；配列番号６０、７３；配列番号６０、７２；配列番号５９、７２
ｂ) ａ)の少なくとも一つのアミノ酸配列と、８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｃ) ａ)の少なくとも一つのアミノ酸配列と一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列
の群から選択されるアミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合性断片。

いくつかの実施態様において、本発明は、以下を提供する：多重特異性抗体、好ましくは二重特異性抗体であって、
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片と、他の抗原及び/又は他の抗原エピトープに対する抗体又は抗原結合性断片とを含み、
前記他の抗原及び/又は他の抗原エピトープが、例えば、対応する非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞上で過剰発現しているタンパク質；腫瘍抗原、例えば、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＰＤ-Ｌ１、ＳＬＡＭＦ７、Ｃｌａｕｄｉｎ １８.２又はＣＥＡ；ウィルス；細菌；及び/又はエンドトキシンである、多重特異性抗体。

いくつかの実施態様において、本発明は、以下を提供する：ポリペプチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号４５-６２のいずれか一つのアミノ酸配列、又は配列番号４５-６２の少なくとも一つのアミノ酸配列と８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号４５-６２の少なくとも一つのアミノ酸配列と一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列、を含む又はこれらのアミノ酸配列から選択されるものである、ポリペプチド。

いくつかの実施態様において、本発明は、以下を提供する：ポリペプチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号６３-７３のいずれか一つのアミノ酸配列、又は配列番号６３-７３の少なくとも一つのアミノ酸配列と８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号６３-７３の少なくとも一つのアミノ酸配列と一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列、を含む又はこれらのアミノ酸配列から選択されるものである、ポリペプチド。

いくつかの実施態様において、対照抗体と比べて、前記ヒト化抗体が同等の親和性、改善した生物学活性、熱安定性及び/又は耐酸性を有する。

いくつかの実施態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを提供する。

いくつかの実施態様において、本発明は、以下を提供する：抗体であって、(ａ) 軽鎖-重鎖対と(ｂ) 融合ペプチドとを含み、前記軽鎖-重鎖対が、腫瘍細胞又は微生物に対して特異性を有し、前記融合ペプチドが、単鎖可変領域断片と単鎖Ｆｃ断片とを含み、免疫細胞に対して特異性を有する、抗体。いくつかの実施態様において、前記単鎖Ｆｃ断片が、本明細書に記載のＣＨ２及び/又はＣＨ３を含み、例えば、配列番号１５５-１６１又は１９２のいずれか一つの配列を有するＣＨ２、及び/又は配列番号１６２-１８３のいずれか一つの配列を有するＣＨ３を含む。一部の実施態様には、前記融合ペプチドが、本明細書に記載の抗体の対応する配列又はその部分配列を含む。例えば、前記融合ペプチドは、本明細書に記載のヒト化抗体の軽鎖及び/又は重鎖可変領域及び/又はフレームワーク領域の配列を含む。一部の実施態様には、前記融合ペプチドの単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）が、本明細書に記載のヒト化抗体のｓｃＦＶを含む。

いくつかの実施態様において、本発明の抗体における融合ペプチドが、ＶＨｓ-リンカー１-ＶＬｓ-ヒンジ１-ＣＨ２-ＣＨ３-ｂを含み、重鎖が、ＶＨｍ-ＣＨ１-ヒンジ２－ＣＨ２-ＣＨ３-ａを含み、軽鎖がＶＬｍ-ＣＬを含む。

いくつかの実施態様において、本発明の抗体における軽鎖-重鎖対がａ) 対応する非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞上で過剰発現しているタンパク質、ｂ) 腫瘍抗原、例えば、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＰＤ-Ｌ１、ＳＬＡＭＦ７、Ｃｌａｕｄｉｎ １８.２又はＣＥＡ、ｃ) ウィルス、ｄ) 細菌、及び/又はｅ) エンドトキシン、に特異的に結合する。

いくつかの実施態様において、本発明の抗体における融合ペプチドが、免疫細胞抗原に特異的に結合する。例えば、前記融合ペプチドは、ヒト及び/又はサルなどの霊長類のＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を含む。例えば、前記融合ペプチドは、本明細書に記載の抗体の軽鎖と重鎖の可変領域を含む。

いくつかの実施態様において、本発明の抗体における融合ペプチドのＶＨが、配列番号４５-６２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８のいずれか一つの配列を含み、前記融合ペプチドのＶＬが、配列番号６３-７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９のいずれか一つの配列を含み、前記融合ペプチドのリンカー１が、配列番号１２０-１３８のいずれか一つの配列を含み、前記融合ペプチドのヒンジ１、前記重鎖のヒンジ２が、配列番号１３９-１４７のいずれか一つの配列を含み、前記融合ペプチドのＣＨ２、前記重鎖のＣＨ２が、配列番号１５５-１６１又は１９２のいずれか一つの配列を含み、前記融合ペプチドのＣＨ３-ｂが、配列番号１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３のいずれか一つの配列を含み、前記重鎖のＣＨ３-ａが配列番号１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２のいずれか一つの配列を含み、前記重鎖のＶＨｍが、配列番号９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１９３のいずれか一つの配列を含み、前記重鎖のＣＨ１が配列番号１５４の配列を含み、前記軽鎖のＶＬｍが、配列番号９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１９４のいずれか一つの配列を含み、及び/又は、前記軽鎖のＣＬが配列番号１４８-１５３のいずれか一つの配列を含む。

いくつかの実施態様において、本発明の抗体における融合ペプチドのＶＨ及びＶＬが、それぞれ以下の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ａ) 配列番号４５、６３；配列番号４８、６３；配列番号４８、７１；配列番号４９、６３；配列番号４９、７１；配列番号５１、７１；配列番号５８、７２；配列番号６０、７２；配列番号６０、７３；配列番号５９、７２；配列番号６１、７３；配列番号６２、７３；配列番号５８、７２；配列番号７４、７５；配列番号７６、７７；配列番号７８、７９；配列番号８０、８１；配列番号８２、８３；配列番号８４、８５；配列番号８６、８７；配列番号８８、８９、ｂ) ａ)の少なくとも一つのアミノ酸配列と、８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及びｃ) ａ)の少なくとも一つのアミノ酸配列と一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列、及び/又は
前記重鎖のＶＨｍ及び前記軽鎖のＶＬｍが、それぞれ以下の群から選択されるアミノ酸配列を含む：
ｄ) 配列番号９０、９１；配列番号９２、９３；配列番号９４、９５；配列番号９６、９７；配列番号９８、９９；配列番号１００、１０１；配列番号１０２、１０３；配列番号１０４、１０５；配列番号１０６、１０７；配列番号１０８、１０９；配列番号１１０、１１１；配列番号１１２、１１３；配列番号１１４、１１５；配列番号１１６、１１７；配列番号１１８、１１９；配列番号１９３、１９４
ｅ) ｄ)の少なくとも一つのアミノ酸配列と、８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｆ) ｄ)の少なくとも一つのアミノ酸配列と一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列。

一部の実施態様には、本発明の抗体において、以下を有する：
ａ)融合ペプチドのＣＨ３-ｂ及び重鎖のＣＨ３-ａが、突起-空隙構造を形成する置換対を有し、前記置換が、例えば表１５の置換を１つ以上含み、例えば、一方のＣＨ３ドメインのＴ３６６が、比較的大きなアミノ酸残基、例えばチロシン(Ｙ)又はトリプトファン(Ｗ)に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＹ４０７が、比較的小さなアミノ酸残基、例えばスレオニン (Ｔ)、アラニン(Ａ）又はバリン(Ｖ)に置換され、
ｂ)前記融合ペプチドのＣＨ３-ｂ及び前記重鎖のＣＨ３-ａが、イオン結合を形成する置換対を有し、前記置換が、例えば、表１６の１つ以上の置換を含み、例えば、一方のＣＨ３ドメインが、生理条件下で正電荷を有するアミノ酸残基の置換を１つ以上含み、他方のＣＨ３ドメインが、生理条件下で負電荷を有するアミノ酸残基の置換を１つ以上含み、前記正電荷を有するアミノ酸残基が、例えばアルギニン(Ｒ)、ヒスチジン(Ｈ)又はリジン(Ｋ)であり、前記負電荷を有するアミノ酸残基が、例えばアスパラギン酸(Ｄ)又はグルタミン酸(Ｅ)であってもよく、置換されるアミノ酸残基が、例えばＤ３５６、Ｌ３６８、Ｋ３９２、Ｄ３９９及びＫ４０９の一つ以上であり、
ｃ)前記融合ペプチドのＣＨ３-ｂ及び前記重鎖のＣＨ３-ａが、ジスルフィド結合を形成する置換対を有し、前記置換が、例えば、表１７の置換であり、及び/又は
ｄ)前記融合ペプチドのＣＨ３-ｂ及び前記重鎖のＣＨ３-ａが、タンパク質Ａへの結合能の低下をもたらした置換を有し、前記置換が、例えば、表１８の置換であり、例えば、一つのＣＨ３ドメインのＨ４３５及びＹ４３６が、それぞれ、アルギニン及びフェニルアラニンに置換される。

一部の実施態様には、本発明の抗体において、Ｆｃ断片が、配列番号１５５-１６１又は１９２から選ばれるいずれかの配列を有するＣＨ２、及び/又は配列番号１６２-１８３から選ばれるいずれかの配列を有するＣＨ３を含む。

一部の実施態様には、本発明の抗体の前記重鎖又は融合ペプチドの重鎖が、ヒトＦｃ断片又はヒト化Ｆｃ断片、例えばヒトＩｇＧ Ｆｃ断片、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５ Ｆｃ断片を含む。

一部の実施態様には、本発明の抗体の前記重鎖、融合ペプチドの重鎖、及び/又は前記融合ペプチドのＦｃ断片が、野生型抗体と比較して、前記重鎖と前記融合ペプチドとの間に突起-空隙構造ペアリングを形成する置換を１つ以上含む。

一部の実施態様には、本発明の抗体の前記重鎖及び/又は前記融合ペプチドのＦｃ断片が、前記重鎖と融合ペプチドとの間に塩橋ペアリングを形成する置換を１つ以上含む。

いくつかの実施態様において、本発明の抗体が、Ｙ１０１、Ｙ１０２、Ｙ１０３、Ｙ１０４、Ｙ１０５、Ｙ１５０-８-３、Ｙ１５０-Ｆ８-４、Ｙ１５０-Ｆ８-５、Ｙ１５０-Ｆ８-６、Ｙ１５０-Ｆ８-７、Ｙ１５０-Ｆ８-８、Ｙ１５０-Ｆ８-９、Ｙ１５０-Ｆ８-１０、Ｙ１５０-Ｆ８-１１、Ｙ１５０-Ｆ８-１２、Ｙ１５０-Ｆ８-１３、Ｙ１５０-Ｆ８-１４、Ｙ１５０-Ｆ８-１５、Ｙ１５０-Ｆ９-７、Ｙ１５０-Ｆ９-１１、Ｙ１５０-Ｆ９-１２、ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１５、ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１６、ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１７及びＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１８を含み、
ここで、各成分が融合ペプチドＶＨｓ-リンカー１-ＶＬｓ-ヒンジ１-ＣＨ２-ＣＨ３-ｂ、重鎖ＶＨｍ-ＣＨ１-ヒンジ２－ＣＨ２-ＣＨ３-ａ、軽鎖ＶＬｍ-ＣＬの順に従い、
Ｙ１０１が、それぞれ配列番号４５、１２９、６３、１４２、１５９、１６７、１０６、１５４、１３９、１５９、１６６、１０７、１４８、又は、前記アミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、前記アミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１０２が、それぞれ配列番号４８、１２９、６３、１４２、１５９、１６７、１０６、１５４、１３９、１５９、１６６、１０７、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１０３が、それぞれ配列番号４８、１２９、７１、１４２、１５９、１６７、１０６、１５４、１３９、１５９、１６６、１０７、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１０４が、それぞれ配列番号４９、１２９、６３、１４２、１３９、１６７、１０６、１５４、１３９、１５９、１６６、１０７、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１０５が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４２、１３９、１６７、１０６、１５４、１３９、１５９、１６６、１０７、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-８-３が、それぞれ配列番号４５、１２９、６３、１４１、１５７、１６７、９０、１５４、１３９、１５７、１６６、９１、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-Ｆ８-４が、それぞれ配列番号４８、１２９、６３、１４１、１５７、１６７、９０、１５４、１３９、１５７、１６６、９１、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-Ｆ８-５が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４１、１３９、１６７、９０、１５４、１３９、１５７、１６６、９１、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-Ｆ８-６が、それぞれ配列番号５１、１２９、７１、１４１、１３９、１６７、９０、１５４、１３９、１５７、１６６、９１、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-Ｆ８-７が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４４、１５８、１６７、９０、１５４、１３９、１５８、１６６、９１、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-Ｆ８-８が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４４、１６１、１６７、９０、１５４、１３９、１６１、１６６、９１、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-Ｆ８-９が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４４、１６１、１６７、９６、１５４、１３９、１６１、１６６、９７、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-Ｆ８-１０が、それぞれ配列番号５８、１２９、７２、１４４、１６１、１６７、９６、１５４、１３９、１６１、１６６、９７、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-Ｆ８-１１が、それぞれ配列番号６０、１２９、７２、１４４、１６１、１６７、９６、１５４、１３９、１６１、１６６、９７、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-Ｆ８-１２が、それぞれ配列番号６０、１２９、７３、１４４、１６１、１６７、９６、１５４、１３９、１６１、１６６、９７、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-Ｆ８-１３が、それぞれ配列番号５９、１２９、７２、１４４、１６１、１６７、９６、１５４、１３９、１６１、１６６、９７、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-Ｆ８-１４が、それぞれ配列番号６１、１２９、７３、１４４、１６１、１６７、９６、１５４、１３９、１６１、１６６、９７、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-Ｆ８-１５が、それぞれ６２、１２９、７３、１４４、１６１、１６７、９６、１５４、１３９、１６１、１６６、９７、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-Ｆ９-７が、それぞれ４９、１２９、７１、１４１、１３９、１６７、９２、１５４、１３９、１５７、１６６、９３、１５０、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-Ｆ９-１１が、それぞれ４９、１２９、７１、１４４、１６１、１６７、９２、１５４、１３９、１６１、１６６、９３、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
Ｙ１５０-Ｆ９-１２が、それぞれ４９、１２９、７１、１４４、１９２、１６７、９２、１５４、１３９、１９２、１６６、９３、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１５が、それぞれ４９、１２９、７１、１４１、１５９、１６７、１１８、１５４、１３９、１５９、１６６、１１９、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１６が、それぞれ４９、１２９、７１、１４１、１５７、１６７、１１８、１５４、１３９、１５７、１６６、１１９、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１７が、それぞれ４９、１２９、７１、１４１、１６１、１６７、１１８、１５４、１３９、１６１、１６６、１１９、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、
ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１８が、それぞれ５８、１２９、７２、１４１、１６１、１６７、１１８、１５４、１３９、１６１、１６６、１１９、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと一つ以上（好ましくは一つ又はいくつか、より好ましくは1つ、2つ又は3つ）の異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、本発明は、以下を提供する：抗体又はその抗原結合性断片であって、約１０^-８ Ｍ以下、例えば約１０^-８ Ｍ、１０^-９ Ｍ、１０^-１０ Ｍ又はそれ以下のＫＤでターゲットに結合でき、又は約１００ ｎＭ以下、例えば約１０ ｎＭ、１ ｎＭ、０.９ ｎＭ、０.８ ｎＭ、０.７ ｎＭ、０.６ ｎＭ、０.５ ｎＭ、０.４ ｎＭ、０.３ ｎＭ、０.２ ｎＭ、０.１ ｎＭ又はそれ以下のＥＣ５０でターゲットに結合し、好ましくは、前記抗原結合性断片がＦ(ａｂ')２、Ｆ(ａｂ)２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、ｓｃＦｖから選択される、抗体又はその抗原結合性断片。

いくつかの実施態様において、本発明が本明細書に記載の抗体又はその抗原結合性断片をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。

いくつかの実施態様において、本発明が本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを提供する。

いくつかの実施態様において、本発明が、本明細書に記載のポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。

いくつかの実施態様において、本発明が、本明細書に記載のポリヌクレオチド又は発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、前記抗体を調製することを含む、本発明の抗体の調製方法を提供する。

いくつかの実施態様において、本発明が、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合性断片、及びそれらにコンジュゲートするコンジュゲート部を含む、抗体コンジュゲートを提供する。好ましくは、前記コンジュゲート部が、精製タグ（例えば、Ｈｉｓタグ）、細胞傷害性薬剤、検出可能な標識、放射性同位元素、発光物質、着色物質、酵素又はポリエチレングリコールから選択されるものである。

いくつかの実施態様において、本発明が抗体コンジュゲートを提供する。ここで、前記抗体は、治療剤、プロドラッグ体、ペプチド、タンパク質、酵素、ウィルス、脂質、生物学的応答修飾剤、薬剤又はマクロゴールに結合されていてもよい。

いくつかの実施態様において、当該抗体が治療剤に連結又は融合されていてもよい。ここで、治療剤は、放射性標識、免疫調整剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療剤又は診断剤、細胞傷害性薬剤（医薬、又はケモカインであってもよい）、超音波増強剤、非放射性標識のような検出可能な標識、それらの組み合わせ、および当業界が知られている同じタイプの他の成分を含んでもよい。

いくつかの実施態様において、当該抗体が化学発光化合物とコンジュゲートすることで、検出可能に標識される。そして、化学反応の過程に発生する発光を検出することで、化学発光物で標識された抗原結合ポリペプチドの存在を判定できる。特に有用な化学発光物標識化合物としては、ルミノール、イソルミノース、セラマティック(ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩とオキサレートが挙げられる。

いくつかの実施態様において、当該抗体がまた蛍光発光金属、例えば、１５２Ｅｕ、又は他のランタン系金属を用いて検出可能に標識されてもよい。これら金属は、金属キレート基、例えば、ジエチレン－トリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)で抗体に連結されてもよい。多様な基を抗体に連結する技術は公知のものであり、例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら(編集．)、ｐｐ．２４３-５６(Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．(１９８５);Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ(第２版)、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら(編集)、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、ｐｐ．６２３-５３(１９８７);Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ:Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ'８４:Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら(編集)、ｐｐ．４７５-５０６(１９８５);「Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｒｅｓｕｌｔｓ、 Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら(編集)、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．３０３-１６(１９８５)、及びＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ-Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．(５２:１１９-５８(１９８２))を参照する。

いくつかの実施態様において、本発明が、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合性断片を含む、融合タンパク質を提供する。

いくつかの実施態様において、本発明が、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合性断片、抗体コンジュゲート、又は融合タンパク質を含み、場合により、さらに薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。

いくつかの実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物が、胃腸（ＧＩ）管への経口投与に好適な剤形であり、好ましくは、前記剤形が錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、エマルション剤、マイクロエマルジョン、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤及びエリキシル剤から選択され、又は、前記医薬組成物が、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射、病巣内注射に好適な剤形である。

いくつかの実施態様において、本発明が、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合性断片、抗体コンジュゲート、又は融合タンパク質を含むキットを提供する。好ましくは、前記キットは、さらに、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合性断片、抗体コンジュゲート、又は融合タンパク質を特異的に認識する第２の抗体を含む。前記第２の抗体は、場合により、例えば放射性同位元素、発光物質、着色物質、酵素の検出可能な標識をさらに含む。

いくつかの実施態様において、本発明が、疾患の治療のための前記抗体又はその抗原結合性断片を提供し、又は疾患の治療のための、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合性断片の使用、又は疾患の治療のための薬剤の調製における、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合性断片の使用を提供する。

いくつかの実施態様において、本明細書に記載の抗体が、他の治療剤（例えば、腫瘍又は癌を治療するための治療剤）と併用することができる。

いくつかの実施態様において、本発明が、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合性断片、薬用担体、使用説明書、及び任意の他の治療剤（例えば、腫瘍又は癌を治療するための治療剤）を含むキットを提供する。

いくつかの実施態様において、本明細書に記載の組成物及び/又はキットにおいて、前記抗体又はその抗原結合性断片が、細胞毒性部、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、ターゲット又は報告部とコンジュゲートしている。

いくつかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合性断片が、疾患例えば癌又は腫瘍を治療するために使用することができる。

いくつかの実施態様において、本発明が、疾患例えば癌又は腫瘍を治療するための、前記抗体又はその抗原結合性断片の使用を提供する。

いくつかの実施態様において、本発明が、疾患例えば癌又は腫瘍を治療するための医薬を調製するための、抗体又はその抗原結合性断片の使用を提供する。

いくつかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合性断片が、疾患例えば癌又は腫瘍を治療するために使用できる。前記疾患は、多発性骨髄腫、肺癌（例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌）を含むが、これらに限るものではない。

いくつかの実施態様において、本発明が抗ＣＤ３抗体をヒト化する方法、およびそれより得られるヒト化配列を提供する。当該ヒト化抗体配列を基に調製されたモノクローナル抗体と多機能抗体は、適切な親和性、高い安定性と良好な細胞殺傷能を有する。

いくつかの実施態様において、本明細書に記載のヒト化抗ＣＤ３抗体が、対照抗体、例えば元の抗体ＳＰ３４、及び他の文献で提供された高い相同性を有する抗ＣＤ３抗体と比べて、多機能抗体の生物学的活性および安定性の面で、他の抗ＣＤ３抗体よりも優れた生物学的活性及び/又は安定性を示す。

いくつかの実施態様において、本発明が、多機能抗体および製造方法を提供する。当該抗体は、(ａ) 軽鎖-重鎖対と(ｂ) 融合ペプチドとを含み、前記軽鎖-重鎖対が、腫瘍細胞又は微生物に対して特異性を有し、前記融合ペプチドが、単鎖可変領域断片(ＳｃＦｖ)とＣＨ２ドメイン及び/又はＣＨ３ドメインを有するＦｃ断片とを含み、免疫細胞に対して特異性を有する抗体である。

いくつかの実施態様において、本発明の抗体の軽鎖-重鎖対又はＶＬｍ-ＶＨｍペアリングが、腫瘍抗原に対する特異性を有する。いくつかの実施態様において、当該腫瘍抗原が、ＰＤ-Ｌ１、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３８とＢＣＭＡ等から選択されるものである。いくつかの実施態様において、該軽鎖-重鎖対又はＶＬｍ-ＶＨｍペアリングが、対応する非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞上で過剰発現しているタンパク質に対する特異性を有する。

いくつかの実施態様において、該軽鎖-重鎖対又はＶＬｍ-ＶＨｍペアリングが、ウィルス又は細菌に対する特異性を有する。一態様で、該軽鎖-重鎖対又はＶＬｍ-ＶＨｍペアリングが、エンドトキシンに対する特異性を有する。

いくつかの実施態様において、当該免疫細胞が、Ｔ細胞、ＣＩＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、単核球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、好酸球、好塩基球及びマスト細胞から選択されるものである。

いくつかの実施態様において、当該ＳｃＦｖ又はＶＬｓ-ＶＨｓペアリングが、抗原（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ９４、ＣＤ１５８、ＣＤ１６１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ４０を含む）に対する特異性を有する。いくつかの実施態様において、当該抗原がＣＤ３である。

いくつかの実施態様において、該軽鎖がジスルフィド結合で当該重鎖又は融合重鎖に結合する。いくつかの実施態様において、当該重鎖が一つまたは複数のジスルフィド結合で前記融合ペプチドに結合する。いくつかの実施態様において、前記融合重鎖１が一つまたは複数ジスルフィド結合で前記融合重鎖２に結合する。いくつかの実施態様において、当該重鎖又は融合重鎖が、ヒトＦｃ断片又はヒト化Ｆｃ断片を含む。いくつかの実施態様において、当該重鎖又は融合重鎖のＦｃ断片がヒトＩｇＧ Ｆｃ断片を含む。いくつかの実施態様において、前記融合ペプチドのＦｃ断片が、ヒトＦｃ断片又はヒト化Ｆｃ断片を含む。いくつかの実施態様において、前記融合ペプチドのＦｃ断片がヒトＩｇＧ Ｆｃ断片を含む。

一部の場合には、当該重鎖、融合重鎖及び/又は前記融合ペプチドのＦｃ断片は、野生型抗体断片と比べて、前記重鎖と融合ペプチドとの間に突起-空隙構造ペアリング（ｋｎｏｂｓ-ｉｎｔｏ-ｈｏｌｅｓ）を形成する置換を１つ以上含む。当該ペアリングは、重鎖と融合ペプチドとのヘテロダイマーのペアリング効率を著しく向上することができる。

一部の場合には、当該重鎖及び/又は前記融合ペプチドのＦｃ断片が、前記重鎖と融合ペプチドとの間に塩橋ペアリング（ｓａｌｔ-ｂｒｉｄｇｅ）を形成する置換を１つ以上含む。当該ペアリングは、重鎖と融合ペプチドとのヘテロダイマーのペアリング効率を著しく向上することができる。

一部の場合には、前記融合ペプチドの前記ＣＨ２ドメインが、当該ｓｃＦｖ断片とＣＨ３ドメインとの間に位置している。一態様で、前記融合ペプチドはＣＨ１ドメインを含まない。

一つの実施形態には、本発明は、前記のいずれかの実施形態の抗体を含む組成物をさらに提供する。一態様で、担体は医薬担体である。

別の実施形態には、本発明は、一つまたは複数の抗原に結合する前記のいずれかの実施形態の抗体を含む、複合体を提供する。

図１Ａは抗体構造の模式図を示す。図１Ｂは、抗体の各成分のタンパク質の一次構造の模式図を示す。 図２は、モノクローナル抗体の各成分のタンパク質一次構造の模式図を示す。 図３は、ヒト化ＣＤ３モノクローナル抗体の発現量を示す。 図４は、モノクローナル抗体とＣＤ３+Ｔ細胞への結合能を示す。 図５は、ヒト化抗ＣＤ３抗体で組み立てられた多機能抗体の、ＣＨＯ細胞へ一過性トランスフェクションした発現レベルを示す。 図６は、既存の抗ＣＤ３抗体であるモノクローナル抗体の細胞との親和性を示す。 図７は、様々な本発明の多機能抗体が、Ｔ細胞に対してのＩｎ Ｖｉｔｒｏ活性化能を示す。 図８は、様々な多機能抗体が、多発性骨髄腫細胞ＭＣ/ＣＡＲに対してのＩｎ Ｖｉｔｒｏ殺傷能を示す。 図９は、様々な多機能抗体が肺癌細胞Ｈ３５８に対してのＩｎ Ｖｉｔｒｏ殺傷能を示す。 図１０は、本発明の多機能抗体Ｙ１０５、比較抗体Ｙ１０６、ＣＴ-Ｆ４、ＣＴ-Ｆ５、ＣＴ-Ｆ６が、クエン酸緩衝系での４０^ｏＣの加速熱安定性試験を示す。 図１１は、本発明の多機能抗体Ｙ１５０-Ｆ８-５、Ｙ１５０-Ｆ８-６、Ｙ１５０-Ｆ８-７、Ｙ１５０-Ｆ８-８、比較抗体Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ８-２、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３が、クエン酸緩衝系での４０^ｏＣの加速熱安定性試験を示す。 図１２は、本発明の多機能抗体Ｙ１５０-Ｆ８-９、Ｆ８-１０、Ｆ８-１２、Ｆ９-７、Ｆ９-１１、比較抗体Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ９-６、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３が、クエン酸緩衝系での４０^ｏＣの加速熱安定性試験を示す。 図１３は、本発明の多機能抗体ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１５、ＩＣ１６、ＩＣ１７、ＩＣ１８、比較抗体ＩＣ-２からＩＣ-７までが、クエン酸緩衝系での４０^ｏＣの加速熱安定性試験を示す。 図１４は、本発明の多機能抗体Ｙ１５０-Ｆ８-５、Ｙ１５０-Ｆ８-６、Ｙ１５０-Ｆ８-７、Ｙ１５０-Ｆ８-８、比較抗体Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ８-２、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３がヒスチジン緩衝系での４０^ｏＣの加速熱安定性試験を示す。 図１５は、本発明の多機能抗体Ｙ１５０-Ｆ８-９、Ｆ８-１０、Ｆ８-１２、Ｆ９-７、Ｆ９-１１、比較抗体Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ９-６、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３がヒスチジン緩衝系での４０^ｏＣの加速熱安定性試験を示す。 図１６は、本発明の多機能抗体ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１５、ＩＣ１６、ＩＣ１７、ＩＣ１８、比較抗体ＩＣ-２からＩＣ-７までが、ヒスチジン緩衝系での４０^ｏＣの加速熱安定性試験を示す。 図１７は、本発明の多機能抗体Ｙ１０５、比較抗体Ｙ１０６、ＣＴ-Ｆ４、ＣＴ-Ｆ５、ＣＴ-Ｆ６が、ｐＨ ３.５のクエン酸緩衝系での耐酸性安定性試験を示す。 図１８は、本発明の多機能抗体Ｙ１５０-Ｆ８-５、Ｙ１５０-Ｆ８-６、Ｙ１５０-Ｆ８-７、Ｙ１５０-Ｆ８-８、比較抗体Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ８-２、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３が、ｐＨ ３.５のクエン酸緩衝系での耐酸性安定性試験を示す。 図１９は、本発明の多機能抗体Ｙ１５０-Ｆ８-９、Ｆ８-１０、Ｆ８-１２、Ｆ９-７、Ｆ９-１１、比較抗体Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ９-６、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３がｐＨ ３.５のクエン酸緩衝系での耐酸性安定性試験を示す。 図２０は、本発明の多機能抗体ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１５、ＩＣ１６、ＩＣ１７とＩＣ１８、比較抗体ＩＣ-２からＩＣ-７までが、ｐＨ ３.５のクエン酸緩衝系での耐酸性テストを示す。 図２１は、マウス腫瘍モデルにおいて、様々な多機能抗体のＩｎ ｖｉｖｏ効果、および瘤のボリュームのモニタリングを示す。ここで、図２１Ａは本発明の多機能抗体Ｙ１５０-Ｆ８-８を示し、図２１Ｂは本発明の多機能抗体Ｆ８-９を示し、図２１Ｃは本発明の多機能抗体Ｆ９-１１を示す。抗ＣＤ３抗体の配列はいずれもＶＨ２ａとＶＬ５であり、抗ＣＤ３８抗体の配列は互いに異なる。

定義
天然に存在する抗体は、抗原結合ドメインを形成するために特異的に位置された六つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」を含む。当該抗原結合ドメインの残りアミノ酸は、「フレームワーク」領域と呼び、より少ないの分子内変更可能を持っている。当該フレームワーク領域は主としてβフォールディングシート構造をとる同時、ＣＤＲはループを形成している。当該ループは前記βフォールディングシート構造に連結し、当該フォールディングシート構造の一部になる場合がある。このように、フレームワーク領域は、鎖内の非共価作用によってＣＤＲを正しく方向に位置する足場を形成している。前記位置されたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫活性抗原エピトープに相補的な表面を定義している。当該相補表面は、抗体とそのホモログエピトープとの非共価結合を寄与する。当業者は、ＣＤＲとフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸から、いかなる所定の重鎖又は軽鎖可変領域を容易に認識できる(「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,」Ｋａｂａｔ,Ｅ.,ら, 米国衛生と公共サービス部門(Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ,),(１９８３); ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ,Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．,１９６:９０１-９１７(１９８７)を参照)。

本明細書では、用語「相補性決定領域」(「ＣＤＲ」)とは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域に存在する非連続的な抗原結合部位を意味する。このような特異的領域は、Ｋａｂａｔらにより米国衛生と公共サービス部門、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」(１９８３)に記載されており、また、ＣｈｏｔｈｉａらによりＪ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１９６:９０１-９１７(１９８７)に記載されている。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａによって定義されるように、ＣＤＲは、互いに比較したときにオーバーラップするアミノ酸残基、又はアミノ酸のサブ構造を含む。しかし、抗体又はその変異体のＣＤＲに関する定義の全ての応用は、本明細書で定義され、使用される用語の範囲内に含まれる。当該抗体の可変領域アミノ酸配列が指定された場合、当業者は一般に、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを判断することができる。

Ｋａｂａｔらはまた、いずれの抗体にも適用可能な、可変ドメインの配列に向ける番号付けシステムを定義した。当該「Ｋａｂａｔ番号付け」システムは、当業者により何の疑いもなしに、当該配列自体以外の一切実験データも依存することなくで、いかなる可変ドメイン配列に使用されることができる。本明細書で使用される「Ｋａｂａｔ番号」とは、Ｋａｂａｔらより説明された番号付けシステムである。その内容は米国衛生と公共サービス部門、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」(１９８３)に記載されている。

Ｋａｂａｔ番号付けシステムで説明されたＣＤＲ領域は以下の通りである。ＣＤＲ-Ｈ１は、およそ３１番目のアミノ酸(すなわち、１番目のシステイン残基から約９つの残基であり)の位置から始まり、次のトリプトファン残基まで終了し、約５-７つのアミノ酸を含む。ＣＤＲ-Ｈ２は、ＣＤＲ-Ｈ１の末端後から１５番目の残基の位置に始まり、次のアルギニン又はリジン残基まで終了し、約１６-１９つのアミノ酸を含む。ＣＤＲ-Ｈ３は、ＣＤＲ-Ｈ２の末端後からおよそ３３番目のアミノ酸残基の位置から始まり、３-２５つのアミノ酸を含み、配列Ｗ-Ｇ-Ｘ-Ｇの位置まで終了し、この中、Ｘは任意のアミノ酸である。ＣＤＲ-Ｌ１は、およそ２４番目の残基の位置(すなわち、システイン残基の後)から始まり、次のトリプトファン残基まで終了し、約１０-１７つの残基を含む。ＣＤＲ-Ｌ２は、ＣＤＲ-Ｌ１の末端後から約１６つの残基から始まり、約７つの残基を含む。ＣＤＲ-Ｌ３は、ＣＤＲ-Ｌ２の末端後からおよそ３３番目の残基の位置(すなわち、システイン残基の後)に始まり、約７-１１つの残基を含み、配列Ｆ又はＷ-Ｇ-Ｘ-Ｇまで終了し、この中、Ｘは任意のアミノ酸である。

本明細書に記載の抗体は、任意の動物由来のものでもよい。前記動物として、鳥類と哺乳類が挙げられ、霊長類も含まれている。好ましくは、抗体は、ヒト、ヒヒ、アカゲザル、カニクイザル、ネズミ、ロバ、ウサギ、ヤギ、ギニアピッグ、ラクダ、アルパカ、馬又は鶏の抗体である。

本明細書に記載のヒト化抗体は、ＣＤ３例えば霊長類のＣＤ３に特異的に結合することができ、前記霊長類のＣＤ３は、例えばヒト及び/又はサルのＣＤ３を含む。

本明細書で使用される用語「重鎖定常領域」は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、少なくとも、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ(例えば、上部ヒンジ領域、中間ヒンジ領域、及び/又は下部ヒンジ領域)ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はその変異体又は断片のいずれを含む。例えば、本発明に用いる抗原結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを有するポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインと、ヒンジドメインの少なくとも一部とＣＨ２ドメインを有するポリペプチド；ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部とＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖、または、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖、を含んでもよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドがＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖を含む。また、本発明の抗体は、少なくとも一部のＣＨ２ドメイン(例えば、全部の又は一部のＣＨ２ドメイン)を欠いていてもよい。重鎖定常領域は、天然に存在する免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように改変されてもよいことは、本分野の普通当業者が理解されるべきである。

本明細書に記載の抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来するものであってもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧｌ分子由来のＣＨ１ドメインとＩｇＧ３の分子由来のヒンジ領域を含んでいてもよい。もう一つつの形態では、重鎖定常領域が、部分的にＩｇＧｌ分子由来、かつ部分的にＩｇＧ３分子由来であるヒンジ領域を含んでいてもよい。もう一つつの形態では、重鎖部は、一部がＩｇＧｌ分子由来、且つ一部がＩｇＧ４分子由来であるキメラヒンジを含んでもよい。

本明細書で使用される用語「軽鎖定常領域」は、抗体軽鎖由来のアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記軽鎖定常領域はｋａｐｐａ定常ドメインとｌａｍｂｄａ定常ドメインの少なくとも一つを含む。

「軽鎖-重鎖対」とは軽鎖と重鎖の集合体を指す。軽鎖と重鎖は、軽鎖のＣＬドメインとＣＨ１ドメインとのジスルフィド結合を介して二量体を形成することができる。

様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブイル構造と３次元構造が知られている。用語「ＶＨドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含む。用語「ＣＨ１ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の１番目の(多くはアミノ末端である)定常領域を含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに近接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端である。

本明細書で使用される用語「ＣＨ２ドメイン」は一部の重鎖分子を含む。当該部分の範囲として、例えば、一般的な番号付けスキームで抗体のおよそ２４４番目の残基から３６０番目の残基までの範囲である(Ｋａｂａｔ番号付けシステムで２４４番目の残基から３６０番目、ＥＵ番号付けシステムで２３１-３４０番目の残基に相当し、Ｋａｂａｔら、米国衛生と公共サービス部門、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」(１９８３)を参照する）。ＣＨ２ドメインは、他方のドメインと緊密にペアリングしていないという点でユニークである。代わりに、両つのＮ-連結の側鎖の糖鎖が、無傷の天然ＩｇＧ分子の両つのＣＨ２ドメインの間に挿入されている。文献により、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ-末端に延ばされ、約１０８つの残基を含むことが記載されている。

本明細書で使用される用語「ヒンジ領域」は、重鎖分子の中の、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する一部を含む。当該ヒンジ領域は約２５つの残基を含み、柔軟性があるので、両つのＮ-末端抗原結合領域が独立して移動可能である。ヒンジ領域は、三つの異なるドメイン：上部、中部、と下部ヒンジドメインに分けることができる(Ｒｏｕｘら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６１:４０８３(１９９８))。

本明細書で使用される用語「ジスルフィド結合」は、両つの硫黄原子の間に形成される共有結合を含む。アミノ酸であるシステインは、もう一つのスルフヒドリル基とジスルフィド結合を形成する又は架橋できるスルフヒドリル基を含む。大抵の天然に存在するＩｇＧ分子において、ＣＨ１とＣＬ領域はジスルフィド結合で連結されており、両つの重鎖は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムで２３９と２４２番目の位置(ＥＵ番号付けシステムで、２２６又は２２９番目の位置)に対応する両つのジスルフィド結合によって連結されている。

本明細書で使用される用語「キメラの抗体」は、以下のような抗体を意味する：この中、その免疫反応領域又は部位は、第一物種由来又は第一物種より得られるものであり、かつ、その定常領域(当該定常領域は、完整であってもよく、部分的又は本発明で改変されたものでもよい)は、第二物種由来である。一部の実施形態には、標的結合領域又は部位が、非ヒト(例えば、マウス又は霊長類)由来であり、かつ、定常領域がヒト由来である。

本明細書で使用される「ヒト化パーセンタイル」は、ヒト化ドメインと、その種のドメインとのフレームアミノ酸の差値の数(すなわち、非ＣＤＲでの差値)を測定して、当該数をアミノ酸の総数から引いて、アミノ酸総数で割った値に１００を乗じることによって算出する。

用語「特異的に結合する」又は「・・・に対して特異性を有する」は、一般的、抗体がその抗原結合ドメインにより抗原エピトープと結合して、当該結合によって、抗原結合ドメインと抗原エピトープとの間に必ず一定の相補性を有することを意味している。この定義により、当該抗原エピトープに結合するとき、ランダムの、無関係な抗原エピトープに対する結合より、抗原結合ドメインによる結合がよりも容易である抗体は、抗原エピトープに「特異的に結合する」と認められる。本明細書において、用語「特異性」は、ある抗体が特定の抗原エピトープに結合する親和性の決定に用いられる。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも、特定の抗原エピトープに対して高い特異性を有すると見なされる場合がある。又は、抗体「Ａ」は、抗原エピトープ「Ｃ」と比べて、相関抗原エピトープ「Ｄ」への結合が高い特異性を有すると言われる場合がある。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は約１０^-８ Ｍ未満、例えば約１０^-８ Ｍ、１０^-９ Ｍ、１０^-１０ Ｍ未満又はそれ以下のＫＤでターゲットに結合する。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、約１００ ｎＭ未満、例えば約１０ ｎＭ、１ ｎＭ、０.９ ｎＭ、０.８ ｎＭ、０.７ ｎＭ、０.６ ｎＭ、０.５ ｎＭ、０.４ ｎＭ、０.３ ｎＭ、０.２ ｎＭ、０.１ ｎＭ未満又はそれ以下のＥＣ５０でターゲットに結合する。

なお、数には明確な制限がない場合、実体は、一つ又は複数(種)の当該実体を指すと理解される。例えば、「多機能抗体」は一つ又は複数(種)の多機能抗体を指すと理解される。同様に、数には明確な制限がない場合、用語「一つまたは複数」と「少なくとも一つ」は、本明細書において互換的に使用できる。

本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、単数形の「ポリペプチド」だけでなく、複数形の「ポリペプチド」も含まれ、また、アミド結合(ペプチド結合とも称する)を介して線状連結される単量体(アミノ酸)からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」とは、両つ又は複数のアミノ酸からなる一つ又は複数の鎖を意味し、特定長さのものを意味するものではない。このため、ペプチド、ジペプチド、ターペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸の鎖」、又はいかなる両つ又は複数のアミノ酸からなる１つ又は複数の鎖を指す他の用語は、いずれも「ポリペプチド」の定義に含まれる。また、用語「ポリペプチド」は、これらの用語に代えて、または互換的に使用することができる。用語「ポリペプチド」とは、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指し、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質の加水分解的溶解、又は、非自然発生したアミノ酸の修飾を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドは、天然の生物から誘導されるもの、又は相同組み換え技術にて作製するものであってもよいが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。それらは、化学合成を含むいかなる方法で作製することができる。

本明細書で使用される、細胞、核酸(例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ)に関する用語「単離される」とは、それぞれ、他の天然由来の大きな分子として存在するＤＮＡ又はＲＮＡから単離される分子を指す。本明細書で使用される用語「単離される」とは、また、組み換えＤＮＡ技術にて作製する場合に、細胞材、ウィルス材又は培地をほぼ含まない核酸又はペプチド、又は化学合成にて作製する場合に、化学前駆体又は他の化学品をほぼ含まないものを指す。また、「単離される核酸」とは、非自然発生したフラグメントを含む、天然状態では存在しない核酸フラグメントを指す。本明細書では、用語「単離される」から他にも細胞タンパク質又は組織単離される細胞又はポリペプチド。単離されるポリペプチドには、精製した又は組み換えたポリペプチドを含む。

本明細書で使用される用語「組み換え」とは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関連する場合に、天然状態では存在しないポリペプチド又はポリヌクレオチドの形態を指す。ここで、非限定的な例の一つは、通常一緒に存在しないポリヌクレオチド、又はポリペプチドを組み合わせることによって達成され得る。

「相同性」又は「同一性」又は「類似性」とは、両つのペプチド鎖分子の間、又は両つの核酸分子の間に、配列の類似の程度を指す。相同性は、各配列の位置を比較することで測ることができる。比較は、アラインメントにより行うことができる。比較対象の配列において、ある位置に同じ塩基又はアミノ酸が存在する場合、その位置の分子は相同性を有すると見なされる。複数の配列間の相同性の度は、これら配列が共有しているペアリング、又は相同サイト数の関数を指す。「非関連性」又は「非相同性」の配列は、本発明の配列の一つと４０％以下の相同性、好ましい２５％以下の相同性を有することを指す。

ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域(又は、ポリペプチド又はポリペプチド領域)が、他の一つの配列と、所定のパーセンタイル(例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％)の「配列同一性」を有するとは、アラインメントする時に、この両つの配列を比較すれば、当該パーセンタイルで同様の塩基(又はアミノ酸)を持つことを意味している。上述のようなアラインメント、パーセンタイル相同性又は配列同一性は、当業界で知られているソフトプログラム、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌらが編集した(２００７)Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているものにより測定できる。好ましくは、アラインメントには、初期設定パラメータを使用する。生物学的に等価なポリヌクレオチドとは、上に述べられた特定のパーセンタイルの相同性を有する同時に、同じ又は類似の生物活性ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを指す。

用語「等価な核酸又はポリヌクレオチド」とは、当該核酸のヌクレオチド配列又はその相補配列との間に、所定の程度の相同性又は配列同一性を有するヌクレオチド配列の核酸を指す。二本鎖核酸のホモログとは、他の一つの核酸又はその相補配列との間に、所定の程度の相同性を有する特定のヌクレオチド配列を含む、核酸を指す。一態様で、ある核酸のホモログ/同族体は、当該核酸又はその相補配列とハイブリダイズ可能なものである。同様に、「等価なポリペプチド」とは、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と所定の程度の相同性、又は配列同一性を有するポリペプチドを意味する。一部の場合には、当該配列同一性が少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％である。ある場合には、当該等価配列が参照配列の活性(例えば、抗原エピトープへの結合する能)又は構造(例えば、塩橋)を保持している。

ハイブリダイズ反応は、異なる「ストリンジェントな」条件で行ってもよい。一般的には、低等のストリンジェントなハイブリダイズ反応は、約４０℃で、約１０×ＳＳＣ、又は同等のイオン強度／温度の溶液で行われる。中等のストリンジェントなハイブリダイズは、一般的は、約５０℃で、約６×ＳＳＣにて行われ、高さストリンジェントハイブリダイズ反応一般的は、約６０℃で、約１×ＳＳＣにて行われる。ハイブリダイズ反応は、本技術分野の当業者が良く知られている「生理学的条件」で行われてもよい。生理学的条件として、非限定的な例の一つは、細胞内に通常の温度、イオン強さ、ｐＨ値、Ｍｇ２+濃度を挙げられる。

ポリヌクレオチドは、アデニン(Ａ）、シトシン(Ｃ)、グアニン(Ｇ)、チミン(Ｔ)の４つのヌクレオチド塩基からなる特定の配列により構成されている。当該ポリヌクレオチドはＲＮＡである場合、チミンがウラシル(Ｕ)に置換される。そのため、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子を並べる順序文字表示である。当該順序文字表示は、バイオインフォマティクス、例えば機能ゲノミクス、相同性の検索への応用に使用する、中央処理ユニットを持つコンピュータに対して、データベースに入力することができる。用語「多型」とは、一つ以上の遺伝子又はその一部が共存していることを指す。遺伝子の一部は、少なくとも２種の異なるタイプ、すなわち、２種の異なるヌクレオチド配列を有する場合、当該遺伝子の当該部分は「遺伝子の多型領域」と呼ばれる。多型領域は、異なるアレルによって異なる同一性を有するモノヌクレオチドであってもよい。

用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用でき、いかなる長さを持つヌクレオチドのポリマー形態を関連している。前記ヌクレオチドのポリマー形態として、デオキシリボースヌクレオチドでも、リボースヌクレオチドでも、そのアナログであってもよい。ポリヌクレオチドは、任意な３次元構造を取っていてもよく、どのような既知又は未知の機能を備えていてもよい。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子又は遺伝子断片(例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ又はＳＡＧＥタグ)、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単独の任意な配列を有するＤＮＡ、単独の任意な配列を有するＲＮＡ、核酸プローブ、プライマーを挙げられる。ポリヌクレオチドは、修飾したヌクレオチド、例えばメチル化したヌクレオチド又はヌクレオチドのアナログを含んでもよく。前記修飾したヌクレオチドがある場合、ポリヌクレオチドの組み立てる前又は後に、塩基構造が修飾される。当該ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後にさらに修飾されていてもく、例えば標識成分によって結合されている。当該用語も二本鎖と一本鎖の分子を指す。本発明のポリヌクレオチドの各実施形態としては、特に指摘又は主張した場合を除き、二本鎖形態と、知られている相補的な二つの一本鎖形態と、二本鎖形態になることが期待されるものを含む。

ポリヌクレオチドに適用される場合、用語「コードする」は、特定のポリペプチドを「コードする」と考えられるポリヌクレオチドを指す。前記ポリヌクレオチドが天然の状態で、又は当業者が知られている方法で作業される場合は、トランスクリプトーム及び/又は翻訳されて当該ポリペプチドのｍＲＮＡ及び/又はその断片を生成できる。アンチセンス鎖とは、そのような核酸の相補体である。当該コード配列は前記アンチセンス鎖から導出できる。

本明細書で使用される用語「検出可能なタグ」とは、直接又は間接に検出可能な化合物又は組成物を指す。当該化合物又は組成物は、直接又は間接に、検出される組成物(例えば、ポリヌクレオチド又はタンパク質、当該タンパク質として抗体を挙げれる)に結合して、「タグ付けた」組成物を得ることができる。当該用語には、また、挿入された配列を発現されることでシグナル、例えば緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)等を提供する、当該ポリヌクレオチドに結合する配列を指す。当該タグは、自体が検出可能なもの(例えば、放射性同位元素タグ、蛍光タグ)、または、基質化合物又は組成物の検出可能な化学変化を触媒し得る酵素タグである。当該タグは、小規模なアッセイに用いられ得るが、高フラックススクリーニングにより適している。同様に、適当なタグとしては、放射性同位元素、蛍光染料、化学発光化合物、染料、タンパク質(酵素を含む)を含むが、これらに限定されない。当該タグは検出可能のみであってもよいし、さらに定量可能であってもよい。検出可能のみの反応として、典型的には、存在が確認のみが可能な反応を含む。ここで、定量可能な反応として、典型的には、強さ、分極及び/又は他の特性の定量可能な(例えば、数値的に報告可能な)値を有する反応を含む。発光又は蛍光分析において、検出可能な反応では、直接的に、分析成分と相関な、実際に結合に係る発光体又は蛍光基を、用いることでもよいが、間接的に、別の成分(例えば、レポーター分子又は指示薬)に連結された発光体又は蛍光基を用いることでもよい。

本明細書で使用される「抗体」または「抗原結合ポリペプチド」は、抗原に特異的に認識して結合するポリペプチド又はポリペプチド複合体を指す。抗体は、全抗体であってもよいし、任意の抗原結合性断片またはその単鎖であってもよい。このため、用語「抗体」には、抗原への結合生物活性を持つ免疫グロブリン分子の一部を、少なくとも含む特定の分子を含有する任意のタンパク質又はペプチドが含まれている。そのような実施形態の例には、重鎖又は軽鎖又はそのリガンド結合部の相補性決定領域(ＣＤＲ)、重鎖又は軽鎖の可変領域、重鎖又は軽鎖の定常領域、フレーム(ＦＲ)領域又はその任意の部分、又は結合タンパク質の少なくとも一部が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される用語「抗体断片」又は「抗原結合性断片」は、抗体の一部であり、例えばＦ(ａｂ')２、Ｆ(ａｂ)２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどである。構造にかかわらず、同様の抗原に結合する抗体断片は完全な抗体とされている。用語「抗体断片」は、アプタマー、アプタマーのエナンチオマーとダイマーを含む。用語「抗体断片」には、抗体のように、特定の抗原に結合して、複合体を形成することができる合成タンパク質又は遺伝子改変タンパク質も含まれる。

「単鎖可変領域断片」又は「ｓｃＦｖ」とは、免疫グロブリンの重鎖(ＶＨ)と軽鎖(ＶＬ)の可変領域の融合タンパク質を指す。一部の場合には、これらの領域が１０～約２５つのアミノ酸を有する短いリンカーペプチドで連結されている。当該リンカーは、柔軟性を有するためにグリシンに富むでもよいし、可溶性を有するためにセリン又はスレオニンを含んでもよい。また、ＶＨのＮ-末端がＶＬのＣ末端に連結されることはできるが、逆にも可能である。当該タンパク質は、定常領域が除去されてリンカーが導入されているだけのもの、元の免疫グロブリンの特性が保留される。ＳｃＦｖ分子は当業界が知られており、米国特許５,８９２,０１９に記載されるものを挙げられる。

当業者が理解されるべき、重鎖は、ｇａｍｍａ、ｍｕ、ａｌｐｈａ、ｄｅｌｔａ、およびｅｐｓｉｌｏｎ(γ、μ、α、δ、ε)に分けており、いくつかのサブクラス(例えば、γｌ-４)を有する。抗体の「クラス」、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥは、当該鎖の特性により決められる。免疫グロブリンのサブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５等は、よく特徴づけられ、機能的に特異的である。本明細書を参照し、当業者は、これらのクラスとアイソタイプの全ての改変された形態を容易に識別することができ、したがって、これらの形態は、本発明の範囲内である。全ての免疫グロブリンのクラスは、明らかに本願の範囲内にあり、以下の説明は一般的に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに向けている。ＩｇＧは、標準的な免疫グロブリン分子は、２本の同じの軽鎖ポリペプチド(いずれも、約２３,０００ドルトンの分子量を有する)と、２本の同じの重鎖ポリペプチド(いずれも、５３,０００-７０,０００の分子量有する)を含む。これらの４本の鎖は、典型的には、ジスルフィド結合によって「Ｙ」型に繋げている。ここで、軽鎖は、「Ｙ」構造の口部から重鎖を支持して、さらに、延ばされて可変領域を通過している。

本発明の抗体、抗原結合ポリペプチド、これらの変異体又は誘導体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化(ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ)抗体、又はキメラ抗体、単鎖抗体、抗原エピトープ結合性断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'とＦ(ａｂ')２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、単鎖抗体、ジスルフィド結合で連結されたＦｖ(ｓｄＦｖ)、ＶＬ ドメイン又はＶＨ ドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリにより生じた断片、抗イディオタイプ(ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ)(抗-Ｉｄ)抗体(例えば、本明細書に開示された抗Ｉｄ抗体ないしＬＩＧＨＴ抗体を含む)を含むが、これらに限定されない。本発明の免疫グロブリン分子又は抗体分子は、任意のタイプのもの(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡとＩｇＹ)、免疫グロブリン分子の任意のクラス(例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌとＩｇＡ２)又はサブクラスでもよい。

軽鎖は、ｋａｐｐａ又はｌａｍｂｄａ(κ、λ)に分けている。重鎖の各クラスは、いずれもｋａｐｐａ又はｌａｍｂｄａ軽鎖に結合することができる。常に、軽鎖は重鎖と、共有結合的に結合している。さらに、これらの免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞又は遺伝子改変された宿主細胞によって産生される場合、２本の重鎖の「尾部」の部分は、共有結合であるジスルフィド結合又は非共有結合によって結合している。前記重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ型構造のフォークのＮ末端から、各鎖の底部Ｃ末端に向かって伸びている。

軽鎖と重鎖の両方は、構造領域と機能的ホモログ領域に分けられる。用語「定常」と「可変」は、機能的な目的で使用されている。ここで、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)は、重鎖可変ドメイン(ＶＨ)と共に、抗原認識と特異性を決めることを認識べきである。一方、軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)と重鎖定常ドメイン(ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３)は、例えば分泌、胎盤を通過する移動性、Ｆｃ受容体への結合、補体への結合等の、重要な生物学特性を提供している。一般的に、定常領域ドメインの数は、抗体の抗原結合部位又はアミノ端の末端位置から離れるにつれて増大する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域であり、ＣＨ３とＣＬドメインは、実際には、それぞれ重鎖と軽鎖のカルボキシ末端を含んでいる。

上述したように、可変領域により、抗体は抗原の抗原エピトープを選択的に認識して特異的に結合することができる。すなわち、抗体のＶＬドメインとＶＨドメイン、又は相補性決定領域(ＣＤＲ)のサブクラスは組み合わせて、３次元抗原結合部位を定義する可変領域を構成している。当該４価の抗体構造は、抗原結合部位を形成している。当該抗原結合部位は、Ｙ字型の各アームの末端に存在している。より詳細には、当該抗原結合部位は、それぞれのＶＨとＶＬ鎖(すなわち、ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２、ＣＤＲ-Ｈ３、ＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２とＣＤＲ-Ｌ３)の三つのＣＤＲで定義されている。いくつかの例において、例えば、ある種のものから誘導された又は免疫グロブリンに基づいて改変された免疫グロブリンには、完全な免疫グロブリン分子が重鎖だけで構成され、軽鎖を含まないでもよい。例えば、Ｈａｍｅｒｓ-Ｃａｓｔｅｒｍａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３６３:４４６-４４８(１９９３)を参照。

本明細書で使用される用語「治療」とは、被験者に対して望ましくない生理変化又は疾患、例えば癌の進行を予防又は遅らせる(軽減する)、治療的治療と予防、又は予防・治癒的処置を意味する。有益または所望の臨床結果としては、検出可能かどうかにかかわらず、症状の軽減、病気のステージの低減、疾患状態の安定化(例えば、増悪しないようにする)、疾患の進行の遅延又は遅らせ、疾患状態の改善又は緩和、および寛解(部分又は全体的かどうかにかかわらず)を含むが、これらに限定されない。「治療」とは、治療を受けていない場合の予想生存期間と比べて、生存期間は延長されることを指す場合もあります。治療を必要とする状態には、既に病気又は症状があったもの、病気又は症状になりやすいもの、又は病気又は症状を予防するものを含む。

ここで、「被験者」、「個体」、「動物」、「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後又は治療を必要とするいかなる被験者、特に哺乳動物被験者を意味する。哺乳動物被験者としては、ヒト、家畜化された動物、農場動物、動物園、運動場、又は愛玩動物、例えばイヌ、ネコ、ギニアピッグ、ウサギ、ラット、マウス、ネズミ、ウマ、ウシ、乳牛、霊長類（例えば、ヒト、カニクイザル、アカゲザルなどのサル、ヒヒ、チンパンジー等）等が挙げられる。

本明細書で使用される用語、例えば「治療を必要とする患者」又は「治療を必要とする被験者」は、本発明の抗体と組成物の投与、例えば検査、診断工程及び/又は治療から利益を受ける哺乳動物被験者、例えばヒトを含む。

多機能抗体
本発明の一つ実施例は、両つの異なる抗原結合ポリペプチド単位からなるヘテロダイマー抗体を提供する。一部の場合には、当該ヘテロダイマーが、その対応するホモダイマーとはサイズが異なる。このサイズの違いを活用することで、ヘテロダイマーとホモダイマーの分離に寄与していることができる。

一部の場合には、図１のように、前記両つの抗原結合ポリペプチド単位の一つは、野生型抗体に似ている軽鎖-重鎖対を含む。本明細書を通して、当該単位は、「一価の単位」とも称される。

一部の場合には、図１のように、他の抗原結合ポリペプチド単位は単鎖可変領域断片(ｓｃＦｖ)を含む。当該ｓｃＦｖは、抗体の定常断片(Ｆｃ)のＮ端に融合することができ、融合ペプチドと呼ばれる。本明細書を通して、この融合ペプチドは「単鎖ユニット」とも称される。

本発明は、多機能抗体および製造方法を提供しており、当該抗体は、(ａ)腫瘍細胞に対して特異性を有する軽鎖-重鎖対、(ｂ)単鎖可変領域断片(ＳｃＦｖ)と、ＣＨ２ドメイン及び/又はＣＨ３ドメインを有するＦｃ断片を含む免疫細胞に特異性な融合ペプチドと、を含む抗体である。前記抗体は多機能抗体と呼ばれる。

前述のいかなる抗体又はポリペプチドは、また、追加のポリペプチドを含んでもよい。追加のポリペプチドとしては、例えば、本明細書に記載のポリペプチド、分泌を指導するための抗体の定常領域のシグナルペプチド、又は本明細書に記載の他の異種ポリペプチドを挙げられる。

本分野の普通当業者が理解すべきように、本明細書に記載された天然に存在する結合ポリペプチド由来の抗体は、これらの天然に存在する結合ポリペプチドとは、アミノ酸配列が異なるように改変されてもよい。例えば、特定のタンパク質由来のポリペプチド又はアミノ酸配列は、出発配列と類似していてもよく、例えば、出発配列と一定の割合の同一性を有する。例えば、出発配列とは６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有することができる。

また、「非必須」アミノ酸領域に対して保存的置換又は変更を行うために、ヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を行われてもよい。例えば、特定のタンパク質由来のポリペプチド又はアミノ酸配列は、一つまたは複数の独立したアミノ酸の置換、挿入、又は欠失、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ、１５つ、２０つ以上の独立したアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有する以外、出発配列と同一であることができる。一部の態様において、特定のタンパク質由来のポリペプチド又はアミノ酸配列は、出発配列と１～５つ、１～１０つ、１～１５つ又は１～２０つの独立したアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有する。

一部の態様において、抗原結合ポリペプチドは、抗体と一般的に結合しないアミノ酸配列、又は一つまたは複数の基を含む。以下、例示的な改変をより詳細に説明する。例えば、本発明の単鎖Ｆｖ抗体断片は、可撓性のリンカー配列を含んてもよいし、官能基(例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、医薬、毒素又は標識)を付加するために改変されてもよい。

本発明の抗体、その変異体又は誘導体は、改変された誘導体を含む。すなわち、いかなるタイプの分子を共有結合で抗体に連結し、かつ、当該共有結合は、抗体の抗原エピトープへの結合を妨げないことである。例えば、限定されるものではないが、当該抗体は、例えばグリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、リン酸化、アミド化にて、既知の保護／切離基による誘導、タンパク質加水分解による溶解、細胞リガンド又は他のタンパク質への連接などで、改変されてもよい。数多くの化学修飾のいずれかは、既知の技術によって行うことができる。前記技術として、特定の化学溶解、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンメタボリズム合成等を含むが、これらに限定されるものではない。さらに、当該抗体は１種又複数の非古典的アミノ酸を含んでいてもよい。

他の態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、保守的アミノ酸置換を含んでいてもよい。

「保守的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基と、類似の側鎖を有するアミノ酸残基との置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界で定義定義されており、塩基性側鎖(例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電の極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン 、スレオニン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分岐の側鎖(例えば、スレオニン 、バリン、イソロイシン)と芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。そのため、免疫グロブリンポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基に置換されることが好ましい。別の実施形態において、連続のアミノ酸は、順序及び/又は側鎖ファミリーの組成が異なる構造的に類似した連続のアミノ酸に置換されることができる。

抗体の製造方法
抗体の製造方法は、本技術分野の公知の技術であり、ここで説明する。一部の態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドの可変領域と定常領域は、完ヒトのものである。完全ヒト抗体は、従来技術に記載された技術で調製することができ、本出願に記載した通りである。例えば、特定抗原に対する完全ヒト抗体は、この種の抗原刺激を応答する抗体を産生するように改変され、その内因性遺伝子座が禁止された遺伝子改変動物に、当該抗原を投与することで調製することができる。当該抗体を製造できる例示的な技術は、米国特許：６,１５０,５８４、６,４５８,５９２、６,４２０,１４０に記載し、その全体が引用により本出願に組み込まれる。

一部の態様において、調製された抗体は、治療する動物(例えば、ヒト)に有害な免疫反応を生じない。一つの態様において、本発明の抗原結合ポリペプチド、その変異体又は誘導体は、その免疫原性を低下されるために、当業界で公知の技術にて改変されている。例えば、抗体は、ヒト化もの、霊長類化したもの、脱免疫化したもの、又はキメラ化ものとすることもできる。これらのタイプの抗体は、非ヒト抗体に由来するものであり、通常はネズミ又は霊長類動物の抗体である。前記抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持しているか、又は大きく保持しているが、人体における免疫原性が低い。これは、複数種の方法により実現でき、(ａ)非ヒトの可変ドメイン全体を、ヒト定常領域にグラフトしてキメラ抗体を作製すること、(ｂ)１種又複数の非ヒトの相補性決定領域(ＣＤＲ)の少なくとも一部を、ヒトフレームワーク領域と定常領域にグラフトし、場合により、重要なフレーム残基を保留すること、又は(ｃ)非ヒトの可変ドメイン全体を移植しているが、表面の残基の置換によって、ヒトに類似した部分でそれを「カバー」することを挙げられる。

脱免疫化は、抗体の免疫原性を低下されるために使用できる。本明細書で使用される用語「脱免疫化」は、抗体を改変することでＴ細胞抗原エピトープを変更することを含む(例えば、国際出願公開号ＷＯ/９８５２９７６ Ａ１とＷＯ/００３４３１７ Ａ２を参照する)。例えば、本出願は、出発抗体からの可変重鎖と可変軽鎖配列を分析し、それぞれのＶ領域からのヒトＴ細胞抗原エピトープの「マップ」を作製している。当該マップは、相補性決定領域(ＣＤＲ)や、当該配列中の他の重要な残基に関連する抗原エピトープの位置を示す。当該Ｔ細胞抗原エピトープマップから、単一のＴ細胞エピトープを分析することで、最終的な抗体の活性を変更するリスクの低い代替的なアミノ酸置換を同定することができる。本出願は、一連の選択可能な可変重鎖と軽鎖配列を設計し、アミノ酸の置換の組み合せも含くまれており、これらの配列は、その後、一連の結合ポリペプチドに組み込まれる。通常、１２～２４種類の抗体が生成され、それらに対して結合性及び/又は機能性をテストしている。そして、改変された可変領域とヒト定常領域を含む完整の重鎖と軽鎖の遺伝子を、発現ベクターにクローニングし、得たプラスミドを細胞株に導入することにより、全抗体を産生する。その後、これら抗体は、適切な生化と生物学分析によって比較され、最良の変数が同定される。

本発明の抗原結合ポリペプチドの結合特異性は、例えば免疫沈殿、放射免疫測定(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)などのインビトロ実験にて測定することができる。

本発明の単鎖ユニットの調製には、(米国特許４,６９４,７７８号;Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２:４２３-４４２(１９８８);Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５５:５８７９-５８８３(１９８８);Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４:５４４-５５４(１９８９))に記載された単鎖ユニットを調製する技術が使用できる。単鎖融合ペプチドは、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖と軽鎖断片を結合され、単鎖ユニットを形成することにより得られる。大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)において機能性Ｆｖ断片を合成する技術(Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２:１０３８-１０４１(１９８８))も使用することができる。

単鎖Ｆｖｓ(ｓｃＦｖｓ)と抗体の産生に用いられる技術の例は、米国特許第４,９４６,７７８号と５,２５８,４９８号;Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３:４６-８８(１９９１);Ｓｈｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０:１９９５-１９９９(１９９３);とＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０:１０３８-１０４０(１９８８)に記載されたものを含む。ヒト体内において抗体の使用、体外のアッセイ分析を含むある特定の応用では、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体が好適に用いられる。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、ネズミモノクローナル抗体からの可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域とを含む抗体である。キメラ抗体の製造方法は、当業界で知られている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９:１２０２(１９８５);Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４:２１４(１９８６);Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５:１９１-２０２(１９８９)；米国特許第５,８０７,７１５;４,８１６,５６７と４、８１６３９７号を参照し、その全体が引用により本出願に組み込まれる。

ヒト化抗体は非ヒト物種由来の、所要の抗原に結合する抗体分子であり、当該抗体分子は、一つまたは複数の非ヒトに物種由来の相補性決定領域(ＣＤＲ)と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する。一般的には、ヒトフレームワーク領域におけるフレーム残基は、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基の置換によって、好ましくは、抗原結合能を上げるように改変される。これらのフレームの置換は、当業界が知られている方法で認識できる。例えば、ＣＤＲとフレーム残基の相互作用モデルを樹立することで、抗原結合と配列に比較的重要なフレーム残基を同定して、特定位置での異常なフレーム残基を求める(例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５,５８５,０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２:３２３(１９８８)を参照し、その全体が引用により本出願に組み込まれる)。抗体のヒト化には、当業界が知られている複数種の技術が使用される。前記技術としては、例えば、ＣＤＲ-移植(ＥＰ２３９,４００；ＰＣＴ公開号ＷＯ ９１/０９９６７；米国特許第５,２２５,５３９；５,５３０,１０１と５,５８５,０８９号)、ベニアリング(ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ)又は表面置換(ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ)(ＥＰ５９２,１０６;ＥＰ５１９,５９６;Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８(４/５):４８９-４９８(１９９１);Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７(６):８０５-８１４(１９９４);Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１:９６９-９７３(１９９４))、と、チェーンシャッフル (ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ)(米国特許第５,５６５,３３２号、その全体が引用により本出願に組み込まれる)を挙げられる。

完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療には特に好ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリを用いたバクテリオファージ展示方法を含む、当業界が知られている多くの方法により調製することができる。また、米国特許第４,４４４,８８７号と４,７１６,１１１号と、ＰＣＴ公開号ＷＯ ９８/４６６４５、ＷＯ ９８/５０４３３、ＷＯ ９８/２４８９３、ＷＯ ９８/１６６５４、ＷＯ ９６/３４０９６、ＷＯ ９６/３３７３５とＷＯ ９１/１０７４１を参照し、これらの書類のそれぞれは引用により本出願に組み込まれる。

機能性内因性免疫グロブリンを発現不能、且つヒト免疫グロブリン遺伝子を発現可能なトランスゲニックマウスを用いて、ヒト抗体を産生することもよい。例えば、マウス胎性幹細胞に、ヒト重鎖と軽鎖免疫グロブリン遺伝子との複合体を、ランダム的に導入又は相同組み換えによって導入されてもよい。あるいは、ヒト重鎖と軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域と多変領域をマウス胎性幹細胞に導入してもよい。また、相同組み換えによって、当該マウス重鎖と軽鎖免疫グロブリン遺伝子に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を非機能性的にそれぞれ付加されること、又は同時に導入されることもよい。具体的には、ＪＨ領域のホモ接合欠失（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）により、内因性抗体の産生が阻害される。改変された胎性幹細胞を展開し、胚盤胞にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製している。そして、キメラ体マウスを飼育して、ヒト抗体を発現するホモ接合型の子孫を産生している。当該トランスゲニックマウスは、選定された抗原で通常の方法にて、例えば、所要の標的ポリペプチドの全体、又は一部を用いて免疫される。当該抗原に対するモノクローナル抗体は、免疫されたトランスゲニックマウスから、常法のハイブリドーマ技術により得ることができる。当該トランスゲニックマウスに持っている編集したヒト免疫グロブリン遺伝子は、Ｂ細胞の分化過程において改めて配列され、その後、クラススイッチ（ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）と体細胞変異（ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）されている。そのため、当該技術を用いて、治療に有用であるＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭとＩｇＥ抗体を産生することができる。ヒト抗体を生産する前記技術の概要は、ＬｏｎｂｅｒｇとＨｕｓｚａｒ Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７３:６５-９３(１９９５)を参照。ヒト抗体とヒトモノクローナル抗体の生産に用いる技術と、これらの抗体の生産に用いる技術構成について、詳細な説明は、例えばＰＣＴ公開号ＷＯ ９８/２４８９３；ＷＯ ９６/３４０９６；ＷＯ ９６/３３７３５；米国特許第５,４１３,９２３；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,５６９,８２５；５,６６１,０１６；５,５４５,８０６；５,８１４,３１８、と５,９３９,５９８号を参照し、それらが引用により本出願に組み込まれる。また、例えばＡｂｇｅｎｉｘ会社(Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．)とＧｅｎＰｈａｒｍ（(Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）等の会社は、前記に類似する技術で得られる、選定の抗原に対するヒト抗体を提供することができる。

選定の抗原エピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」と呼ばれる技術を用いて産生されても良い。当該方法において、選定の非ヒトモノクローナル抗体例えばマウス抗体は、同じ抗原エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択のガイドをしている(Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７２:８９９-９０３(１９８８)。また、米国特許第５,５６５,３３２号を参照し、その全体が引用により本出願に組み込まれる)。

いくつかの実施態様において、所要のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法（例えば、ネズミ抗体の重鎖と軽鎖のエンコード遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用すること）により、容易に単離されてシークエンサーされる。当該ＤＮＡの好ましい供給源は、単独又はサブクローニングのハイブリドーマ細胞である。分離した当該ＤＮＡは、発現ベクターに挿入されてもよい。その後，当該ベクターを原核又は真核宿主細胞、例えば、大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ヒト胚腎細胞２９３又はミエローマ細胞に形質転換している。これら細胞は、免疫グロブリンを産生しない。より詳細には、Ｎｅｗｍａｎら、１９９５年１月２５日に提出した米国特許５,６５８,５７０のように、単独のＤＮＡ(本明細書の記載により合成されることができる)を用いて定常領域と可変領域配列をクローンして抗体を調製することができ、それは引用により本出願に組み込まれる。本質的には、そのために選定した細胞からＲＮＡを抽出して、ｃＤＮＡに形質転換し、ＰＣＲにてＩｇ特異的プライマーを使用して増幅することが必要となる。当該目的に使用し得る適当なプライマーは、米国特許５,６５８,５７０号にも記載されている。以下でより詳細に検討されるように、臨床応用および商業応用の免疫グロブリンを提供するために、所要の抗体を発現する形質転換された細胞を比較的大量に培養することができる。

また、従来の組み換えＤＮＡ技術によって、本発明の抗原結合ポリペプチドの一つまたは複数ＣＤＲは、フレームワーク領域に挿入されることができる。例えば、ヒトフレームワーク領域に挿入されて非ヒト抗体をヒト化される。当該フレームワーク領域としては、天然に存在する又は共有するフレームワーク領域であってもよく、好ましくはヒトのフレームワーク領域である(例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８:４５７-４７９(１９９８)、ヒトのフレームワーク領域のリスト、を参照する)。好ましくは、当該フレームワーク領域とＣＤＲの組み合わせにより生じるポリヌクレオチドは、所要のポリペプチドの少なくとも一つの抗原エピトープ（例えば、ＬＩＧＨＴ）に特異性的に結合するポリペプチドをコードする。好ましくは、フレームワーク領域内で、一つまたは複数のアミノ酸置換が行われてもよい。ここで、好ましくは、当該アミノ酸置換は、当該抗体の抗原に対する結合能を向上される。また、当該方法により、一つまたは複数の可変領域のシステイン残基(鎖内のジスルフィド結合の形成を関与するシステイン残基である)に対するアミノ酸置換又は欠失を得ることができる。そして、一つまたは複数の鎖内のジスルフィド結合を欠いた抗体分子が得られる。当該ポリヌクレオチドに対して行われる他の変更は、一切本願の範囲、されに先行技術の範囲内に含まれる。

また、適当な抗原特異性を有するマウス由来の抗体分子と、適切なバイオ活性を有するヒト抗体分子遺伝子とを組み合わせて、遺伝子スプライシングすることで「キメラ抗体」を生産する技術(Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ:８５１-８５５(１９８４);Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３７２:６０４-６０８(１９８４);Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４:４５２-４５４(１９８５))も、用いることができる。本明細書で使用されるように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、ネズミ由来のモノクローナル抗体の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを含む抗体である。

しかし、組み換え抗体の産生に使用されるもう一つの効率的な方法は、Ｎｅｗｍａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０:１４５５-１４６０(１９９２)により開示される。具体的には、当該技術によって、サル可変ドメインとヒト定常配列を含む霊長類化した抗体が生じる。該書類は、引用により本出願に組み込まれる。また、当該技術は、共同譲渡された米国特許番号５,６５８,５７０、５,６９３,７８０と５,７５６,０９６にも記載されており、各文献は引用により本出願に組み込まれる。

いくつかの実施態様において、抗体を産生する細胞株が、当業者熟知の技術で選択され、培養されてもよい。このような技術は、様々な研究室のマニュアルや主要な刊行物に記載されている。これに関して、本明細書での使用に適している技術は、下記のように、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎ等編、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ-Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙとＳｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ(１９９１)に記載されており、それは補足的な参照を含め、引用により本出願に組み込まれる。

いくつかの実施態様において、当業者公知のクライテリア技術が、本発明の抗体コードするヌクレオチド配列に変異をいれるに使用されできる。前記変異としては、アミノ酸置換を産生する、部位特異的変異誘発やＰＣＲによる変異を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記変異体(誘導体を含む)において、ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２、ＣＤＲ-Ｈ３、軽鎖可変領域、ＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２又はＣＤＲ-Ｌ３は、参照の可変重鎖領域に対する５０つ未満のアミノ酸置換、４０つ未満のアミノ酸置換、３０つ未満のアミノ酸置換、２５つ未満のアミノ酸置換、２０つ未満のアミノ酸置換、１５つ未満のアミノ酸置換、１０つ未満のアミノ酸置換、５つ未満のアミノ酸置換、４つ未満のアミノ酸置換、３つ未満アミノ酸置換、又は２つ未満のアミノ酸置換をコードする。、または、コード配列の全部または一部に沿ってランダムに変異を導入されてもよい。例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を利用している場合、得られた変異体を、活性を持つ変異の保有を確保する目的で、バイオ活性についてスクリーニングすることができる。

治療と診断方法
本発明の抗原結合ポリペプチド、変異体又は誘導体は、癌又は感染症に関連するある特定の治療と診断方法に使用することができる。

本出願は、また、抗体による治療に関する。その治療は、本明細書に記載の１種又複数の疾患又は状態を治療するために、本出願のバイスペシフィックを患者、例えば動物、哺乳動物、ヒトに投与することを含む。本出願の治療化合物は、本出願の抗体(本出願に記載されたこれらの変異体、誘導体を含む)と核酸、又は本出願の抗体をコードするポリヌクレオチド(本出願に記載されたこれらの変異体、誘導体を含む)を含むが、これらに限定されない。

本出願の抗体は、悪性の疾患や病症、又は当該疾患や病症に関連した状態、例えば、免疫応答に関連した疾患を含む、疾患、病症又は状態の治療、抑制又は予防に用いることができる。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、免疫抑制剤として用いることができる。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は自己免疫疾患の治療に用いることができる。本出願の抗原結合ポリペプチド、その変異体又は誘導体は、癌、特に、上に述べられた又は以下の段落に述べられたものの増殖、進展及び/又は増殖を抑制するために使用する。

本出願の抗体又はその変異体又は誘導体により、細胞の生存率の増加に関連した他の疾患又は状態を、治療、予防、診断及び/又は予測することができる。前記他の疾患又は状態は、悪性腫瘍を含む癌又は腫瘍の進展及び/又は移行、及び関連した疾患、例えば多発性骨髄腫、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌）等を含むが、これらに限定されない。

任意の特定の患者に対して使用される具体的な剤量と治療案は、使われている特定の抗原結合ポリペプチド、その変異体又は誘導体、患者の年齢、体重、全般的健康状態、性別や飲食および投与時間、排泄率、医薬の組み合わせ、治療とする具体的疾患の重症度を含む、様々な要因に依存している。医療介護者がこれらの要因に対する判断は、本技術分野の通常の技術範囲内である。使用量も、治療とする患者の個体、投与ルート、製剤のタイプ、使用される化合物の特性、疾患の重症度と所望の効果に依存する。使用量は、当業界が知られている医薬学と薬物動態学の原理によって決められることができる。

抗原結合ポリペプチド、その変異体又は誘導体を投与する方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外および経口ルートを含むが、これらに限定されない。当該抗原結合ポリペプチド又は組成物は、任意の便利なルート、例えば、輸液もしくは大剤量注射、又は上皮、粘膜もしくは皮膚インナー層(例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等)による吸収で、投与することができる。また、他のバイオ活性剤とともに投与されていてもよい。そのため、本出願の抗原結合ポリペプチドを含む医薬組成物は、経口投与、直腸投与、非経口投与、脳槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ）投与、膣内投与、腹腔内投与、局所(例えば、粉末剤、軟膏、点滴薬又は経皮貼付剤による)投与、舌下・バッカル投与、又は口腔用スプレーもしくは点鼻スプレーとして投与することができる。

本明細書で使用される用語「非経口」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下と関節内の注射及び点滴を含む投与形態を指す。

投与としては、全身投与でも、又は局所投与であってもよい。また、本出願の抗体は、脳室内（Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）及びくも膜下での注入を含む任意の適切なルートにて、中枢神経システムに導入することが必要な場合もある。脳室カテーテルは、例えば、カテーテルをリザーバに接続されることにより、脳室注入を寄与することができる。また、肺投与であっても良く、例えば、吸入器もしくはアトマイザ、又はネブライザー用製剤を含有する処方により行う。

また、本出願の抗原結合ポリペプチド又は組成物を、治療が必要とされた領域に局所投与することが必要な場合もある。これは、例えば、手術の過程の局所灌流又は局所適用、例えば、術後創傷被覆材との組み合わせ、注射、カテーテル、坐剤、又はインプラント物によって達成されるが、これらに限定されるものではない。前記インプラント物としては、多孔質、無孔質、又はゲル状材であり、フィルム又はファイバを含む。好ましくは、本出願のタンパク質（抗体を含む）を投与する際、タンパク質を吸収しない材料を使用するように注意しなければならない。

本出願の抗体の用量は、標準的な臨床技術に従って決定できる炎症、免疫又は悪性疾患、病症又は症状を治療、抑制および予防する面に、有効な量である。また、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ実験において、最適な剤量範囲の決定を容易にするために、使用量を任意に選択することもできる。処方に用いる精確な剤量は、投与ルートや疾患、病症又は状態の重さに依存しており、さらに医師の判断と患者個々の具体的な状況によって決定されるべきである。有効剤量は、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ又は動物モデル試験系から得られた用量-反応曲線から推定できる。

本発明の１つの実施態様では、本出願の抗体、当該抗体の変異体を投与えることを含む、感染又は悪性の疾患、症状又は病症の治療方法に関する。前記治療は、通常、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏで試験された後、許容される動物モデルにおいて、Ｉｎ ｖｉｖｏで所望の治療又は予防活性について試験され、その後ヒトに使用される。遺伝子改変動物を含む適当な動物モデルは、本分野における普通当業者にとって公知のものである。例えば、本明細書に記載の抗原結合ポリペプチドの治療効果を実証するためのＩｎ Ｖｉｔｒｏ分析は、抗原結合ポリペプチドの、細胞株又は患者組織標本に対する作用効果を含む。抗原結合ポリペプチドの、細胞株及び/又は組織標本に対する作用効果は、当業者が知られている技術で測定することができる。これら技術は、例えば本出願の他の部分により披露された分析である。本出願によれば、特定の抗原結合ポリペプチドの投与が指示されているかどうかを決定するために、患者組織の標本を培地にて培養して、化合物に曝露され又は他の方法で化合物を投与し、その化合物の前記組織標本に対する作用を観察する、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ細胞培養分析を含むＩｎ Ｖｉｔｒｏ分析を使用できる。

抗体の構造情報
モノクローナル抗体の構造は、両つの同じの軽鎖と両つの同じの重鎖を有し、軽-重鎖ペアリングと重鎖-重鎖ペアリングを含む対称的なモノスペシフィック抗体であって、ここで、軽-重鎖ペアリングは、同一の標的を標的とする。

多機能抗体の構造は、軽鎖、重鎖と融合ペプチドを有し、軽-重鎖ペアリングと重鎖-融合ペプチドペアリングとを含む非対称バイスペシフィック抗体であって、ここで、軽-重鎖ペアリングは腫瘍抗原を標的とし、融合ペプチドＳｃＦｖは免疫細胞抗原ＣＤ３を標的とするものである。

一部の場合には、当該重鎖が、一つまたは複数のジスルフィド結合で融合ペプチドに結合しているか、または両つの異なる融合重鎖の間に一つまたは複数のジスルフィド結合が形成されている。一態様で、その一つまたは複数のジスルフィド結合は、前記ＣＨ１(又はＶＬｓ)とＣＨ２ドメインとの間のヒンジ領域でのアミノ酸残基との間に形成されている。

一部の場合には、前記融合ペプチドのＣＨ２ドメインが、ｓｃＦｖ断片とＣＨ３ドメインとの間に位置している。言い換えれば、前記ｓｃＦｖ断片は、前記Ｆｃ断片のＣＨ２末端に連接している。一部の場合には、当該単鎖ユニットがＣＨ１ドメインを含まない。

一態様で、当該一価の単位と単鎖ユニットの一方又は両方が、ヒト抗体配列又はヒト化配列を含む。例えば、一態様では、当該一価の単位の重鎖が、ヒト又はヒト化Ｆｃ断片を含む。一具体な態様では、当該重鎖のＦｃ断片がヒトＩｇＧ Ｆｃ断片を含む。

一態様で、前記融合ペプチドのＦｃ断片がヒト又はヒト化Ｆｃ断片を含む。一具体な態様では、前記融合ペプチドのＦｃ断片がヒトＩｇＧ Ｆｃ断片を含む。

図１Ａは、多機能抗体１の構造の模式図であり、図１Ｂは、抗体の各成分のタンパク質一次構造の模式図。

本発明の改変したヒト化抗ＣＤ３抗体
（１）ヒト化抗ＣＤ３抗体の可変領域のＣＤＲとＦＲ配列

（２）新規ヒト化抗ＣＤ３抗体の配列（部分例）

注意：ＶＨｓとＶＬｓとの間は、任意にペアリングすることができる。

抗体の配列情報
（１）免疫細胞抗原を標的とした抗体

（2）腫瘍抗原又は他の抗原を標的とした抗体

他のドメインの配列
（１）リンカードメインのアミノ酸配列

（２）ヒンジドメインのアミノ酸配列

（３）軽鎖定常領域ＣＬドメインのアミノ酸配列

（４）重鎖定常領域ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列

Ｆｃアミノ酸の番号は、Ｋａｂａｔ番号に準拠している。「Ｋａｂａｔ番号」とは、Ｋａｂａｔらによって説明された番号付けシステムを指し、その内容は、米国衛生と公共サービス部門、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」(１９８３)に記載されている。具体的な番号は下表に示す。

ここで、
アミノ酸２２１-２２７はヒンジ（ｈｉｎｇｅ）ドメインであり、
アミノ酸２２８-３４０は重鎖の第二定常領域のＣＨ２ドメインであり、
アミノ酸３４１-４４７は、重鎖第三定常領域のＣＨ３ドメインである。

抗体は、ヘテロダイマーのペアリング効率を向上されるために、改変してもよい。例えば、一部の場合には、野生型の抗体断片と比較して、当該一価の単位重鎖のＦｃ断片及び/又は前記融合ペプチドのＦｃ断片は、１つ以上の置換（これらの置換の間に、突起-空隙構造対を形成している）を含んでいてもよい。突起-空隙構造は、当業界で知られている。例えば、Ｒｉｄｇｗａｙら、「‘Ｋｎｏｂ-ｉｎｔｏ-ｈｏｌｅｓ’ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９(７):６１７-２１(１９９６)を参照する。

一態様で、一つのＣＨ３ドメインのＴ３６６は、比較的大きなアミノ酸残基、例えばチロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）に置換されている。そして、他のＣＨ３ドメインのＹ４０７は、比較的小さなのアミノ酸残基、例えばスレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）またはバリン（Ｖ）に置換されていてもよい。

一態様で、前記ＣＨ３ドメインの一方は１つ以上の置換を含み、そして、生理的条件下で正電荷を有するアミノ酸残基に置換されており、他のＣＨ３ドメインは１つ以上の置換を含み、そして、一つまたは複数の、生理的条件下で負電荷を有するアミノ酸残基に置換されている。一態様で、前記正電荷を有するアミノ酸残基は、アルギニン(Ｒ)、ヒスチジン(Ｈ)又はリジン(Ｋ)であってもよい。一方、前記負電荷を有するアミノ酸残基は、アスパラギン酸(Ｄ)又はグルタミン酸(Ｅ)であってもよい。置換されていてもよいアミノ酸残基は、Ｄ３５６、Ｌ３６８、Ｋ３９２、Ｄ３９９とＫ４０９を含むが、これらに限定されない。

一態様で、一つのＣＨ３ドメインはＳ３５４がシステインに置換され、他のＣＨ３ドメインはＹ３４９がシステインに置換され、両つの置換位置にいる残基によりジスルフィド結合を形成している。

一態様で、一つのＣＨ３ドメインは、Ｈ４３５とＹ４３６が、それぞれアルギニンとフェニルアラニンに置換されており、その置換により、Ｆｃとタンパク質Ａへの結合能の有意な低下をもたらした。その結果、ヘテロダイマーとホモダイマーとは、異なるタンパク質Ａの結合活性を有しており、アフィニティークロマトグラフィーの際に、両者を容易に分離することが可能となる。

抗原の具体的な配列

実施例１：ヒト化改変したＳＰ３４
（１）ＳＰ３４配列解析
ＳＰ３４重鎖可変領域(ＳＰ３４ＶＨ)のアミノ酸配列は以下である。この中、ＣＤＲ領域は太字下線で表示し、残りがＦＲ領域である。

ＳＰ３４軽鎖可変領域(ＳＰ３４ＶＬ)のアミノ酸配列は以下である。ＣＤＲ領域は太字下線で表示し、残りがＦＲ領域である。

（２）ヒト化改変
（２.１）重鎖可変領域の改変：
市販の全ての完全ヒト又はヒト化抗体配列を解析し、以下のヒト由来の重鎖可変領域のＦＲ配列を選択した。
（ｉ）第１グループのＦＲ（ＶＨＦＲ-１）、…はＣＤＲを意味する。

ＳＰ３４ＶＨとＶＨＦＲ-１とのアラインメント。枠内はＣＤＲ領域、-はアミノ酸が一致している領域を示し、*は当該部位のアミノ酸に差異があるのを意味する。

相同性の解析及びアミノ酸の保存的置換によって得られた第１グループのヒト化抗体ＶＨｓ配列

（ｉｉ）第２グループのＦＲ（ＶＨＦＲ－２）、…はＣＤＲを意味する。

ＳＰ３４ＶＨのＶＨＦＲ-２とのアラインメント。枠内はＣＤＲ領域、-はアミノ酸が一致している領域を示し、*は当該サイトのアミノ酸に差異があるのを意味する。

相同性の解析及びアミノ酸の保存的置換によって得られた第２グループのヒト化抗体ＶＨｓ配列

（２.２）軽鎖可変領域の改変：
以下のヒト由来のＦＲ配列を選択した：
（ｉ）市販の全ての完全ヒト又はヒト化抗体の軽鎖可変領域配列を解析し、第１グループのＦＲ（ＶＬＦＲ-１）が得られている。…はＣＤＲを意味する。

ＳＰ３４ＶＬとＶＬＦＲ-１のアラインメント、枠内はＣＤＲ領域、-はアミノ酸が一致している領域を示し、*は当該サイトのアミノ酸に差異があるのを意味する。

相同性の解析及びアミノ酸の保存的置換によって得られた第１グループのヒト化抗体ＶＬｓ配列

（ｉｉ）ＮＣＢＩ-ＩｇＢｌａｓｔで、ＳＰ３４ＶＬのＦＲと高い相同性を有する抗体軽鎖可変領域をサーチして、第２グループのＦＲ（ＶＬＦＲ-２）が得られている、…はＣＤＲを意味する。

ＳＰ３４ＶＬとＶＬＦＲ-２のアラインメント、枠内はＣＤＲ領域、-はアミノ酸が一致している領域を示し、*は当該サイトのアミノ酸に差異があるのを意味する。

相同性の解析及びアミノ酸の保存的置換によって、以下の第２グループのヒト化抗体ＶＬｓ配列が得られた。

実施例２：ヒト化抗体の調製および抗体活性アッセイ
１．抗体発現プラスミドの構築方法。使用したベクターは、ｐｃＤＮＡ ３.１である。
（１）標的断片ＤＮＡは、ポリメラーゼ鎖式反応（ＰＣＲ）にて増幅した。ポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ（２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ、ＴａＫａＲａ、商品番号Ｒ４０５Ａ）が挙げられる。ＤＮＡ配列は、配列番号４５-７３のアミノ酸配列から逆翻訳して得た。得られたＰＣＲ生成物は、標的断片ＤＮＡである。
（２）ベクタープラスミドは、制限エンドヌクレアーゼで酵素消化した。制限エンドヌクレアーゼとしては、例えばＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ又はＢａｍＨＩ-ＨＦなどが挙げられる。得られた酵素消化生成物は、酵素により切断されたベクターＤＮＡである。
* ベクターは、重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターの２種に分けている。ここで、重鎖発現ベクターは、シグナルペプチドおよびヒトのＩＧＧ１重鎖の定常領域のＤＮＡ配列を有しており、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２とＣＨ３、重鎖可変領域からなるものである。ここで、酵素消化サイトは、シグナルペプチドの３’末端とＣＨ１の５’末端との間に位置している。軽鎖発現ベクターは、シグナルペプチドおよびヒトのｋａｐｐａ軽鎖の定常領域のＤＮＡ配列、と軽鎖可変領域を有しており、ここで、酵素消化サイトは、シグナルペプチドの３’末端と軽鎖定常領域の５’末端との間に位置している。
（３）ＴｉａｎｇｅｎのＤＮＡピュリフィケーションキットを用いて、ＰＣＲ生成物又は酵素消化生成物を精製した。具体的な作業ステップは、Ｔｉａｎｇｅｎのキットに添付した明細書を参照した。得られた精製生成物は、精製した標的断片ＤＮＡと、精製した酵素消化ベクターのＤＮＡである。
（４）標的断片の遺伝子組み換え。リコンビナーゼ（ＥｘｎａｓｅＩＩ、Ｖａｚｙｍｅ、商品番号Ｃ１１２-０１）を用いた。
重鎖断片は、酵素消化した重鎖発現ベクターＤＮＡと組み換えられ、軽鎖断片は、酵素消化の軽鎖発現ベクターＤＮＡと組み換ええられた。
（５）熱ショックによる形質転換
１０μｌの組み換え生成物を、１００μｌのＴｒａｎｓ１０コンピテント細胞に加えて、軽く混ぜ、氷浴で３０分間放置して、チューブを４２℃の水浴に浸し、６０秒間保持し、揺動しないで、速やかに氷浴に移し、２分間保持した。それに６００μｌ ＬＢ液培地（抗生物質含有）を加えて、ロータリーシェーカーにて３７℃で１時間培養した。適量菌液を、対応する抗生物質を含むＬＢタブレット上に塗布し、タブレットを反転させて、３７℃の恒温インキュベータ内でオーバーナイト培養した。単独のコロニーをピックアップし、サンプルとしてＷｕｈａｎ ｇｅｎｅｃｒｅａｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ., Ｌｔｄ.に送ってシークエンサーした。シークエンサーの結果が正しい単独のコロニーを選択して拡大培養し、プラスミドを大量抽出し、哺乳動物細胞へのトランスフェクト実験に使用する。重鎖断片と酵素消化した重鎖発現ベクターＤＮＡとの組み換えプラスミドは、重鎖発現プラスミドと呼ばれる。軽鎖断片と酵素消化した軽鎖発現ベクターＤＮＡとの組み換えプラスミドは、軽鎖発現プラスミドと呼ばれる。

１.抗体の発現方法
ここで、２種の一過性のトランスフェクション発現系、ＣＨＯ-Ｓと２９３Ｅを使用した。詳細は以下の通りである。
（１）ＣＨＯ-Ｓ一過性のトランスフェクション工程（例として、トランスフェクション総ボリュームが１００ｍｌである場合）
a)トランスフェクション前日、細胞を継代し（ここで、例えばＣＤ-ＣＨＯが使用できる）、浮遊細胞の密度を１×１０^６ 細胞／ｍｌに調整して、ボリュームを９０ｍｌにした。これは、細胞が対数増殖期であることを保証し、二日目のトランスフェクション際までに、細胞の密度が２×１０^６ 細胞／ｍｌに達することができるからである。
b)３７℃、１２５ｒｐｍで、５%ＣＯ２でロータリーシェーカーオーバーナイトにて培養した。
c)トランスフェクション当日は、ＦｅｃｔｏＰＲＯトランスフェクション試薬を室温に予熱して、軽く混ぜた。
d)１０ｍｌの無血清培地（例えば、ｏｐｔｉ ＰＲＯ-ＳＦＭ）にて５０μｇ ＤＮＡを希釈し、軽く混ぜて、１００μｌのトランスフェクション試薬に加えて、均一に混合して、室温で１０分間インキュベートし、トランスフェクション複合体を形成した。
e)トランスフェクション複合体を均一にするように、準備しておいた９０ｍｌの対数増殖期の細胞に加えた。添加直後に均一にまでに振盪し、ロータリーシェーカーにて３７℃、１２５ｒｐｍ、５%ＣＯ２で培養した。
f)トランスフェクション後２～４時間に、７５μｌのトランスフェクション補強剤Ｆｅｃｔｏ ＰＲＯ（登録商標）Ｂｏｏｓｔｅｒを加えた。
g)トランスフェクション後１８-２４時間に、温度を３２℃までに低下されて培養した。
h)トランスフェクション後の３、５、７日目に材料補充し、材料補充のボリュームは、細胞の総ボリュームの３.５%である。
i)細胞の活力が７０%まで下回る時に収穫した。発現時間は９-１３日間である。
（２）２９３Ｅ一過性のトランスフェクション工程（例として、トランスフェクション総ボリュームが２０ｍｌである場合）
a)トランスフェクション前日、細胞を継代し（ここで、例えばＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３が使用できる）、浮遊細胞の密度を０.６-０.８×１０^６ 細胞／ｍｌに調整して、ボリュームを２０ｍｌにした。これは、細胞が対数増殖期であることを保証し、二日目のトランスフェクション際までに、細胞の密度が１.２-１.６×１０^６ 細胞／ｍｌに達することができるからである。
b)３７℃、１２５ｒｐｍで、５%ＣＯ２でロータリーシェーカーオーバーナイトにて培養した。
c)トランスフェクション当日は、ＬＰＥＩを使用の前に、室温までに予熱して、軽く混ぜた。
d)０.６７ ｍｌの無血清培地（例えば、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３）にて、２０μｇ ＤＮＡを希釈し、よく混ぜた。
e)０.６７ ｍｌ の無血清培地（例えば、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３）にて、４０μｇ ＬＰＥＩを希釈し、よく混ぜた；
f)工程５で希釈したＬＰＥＩを、工程４で希釈したＤＮＡに加えて、速やかに混ぜて、室温で１５分間インキュベーションして、複合体を形成された。
g)工程６のトランスフェクション複合体を均一にするように、準備しておいた２０ｍｌの対数増殖期の細胞に加えた。添加直後に均一にまでに振盪し、ロータリーシェーカーにて３７℃、１２５ｒｐｍ、５%ＣＯ２で培養した。
h)トランスフェクション後１日目、３日目に材料補充し、材料補充のボリュームは、細胞総ボリュームの５%である。
i)６日目までに発現して、抗体を収穫した。
（３）トランスフェクションは、コトランスフェクションであり、軽鎖発現プラスミドのいずれかと、重鎖発現プラスミドのいずれかとを、等割合で前記哺乳動物細胞へトランスフェクトした。発現により得られた抗体はモノクローナル抗体であり、天然抗体と一致する二価対称のＹ型構造を有している。この構造の一次構造の模式図は、図２に示す。
（４）発現したモノクローナル抗体の略称およびその発現量（２９３Ｅ細胞内）は以下である。

前記Ｂ８-Ｂ５７のモノクローナル抗体が有する同じの重鎖定常領域と軽鎖定常領域について、具体的な配列は以下である。

図３は、ヒト化ＣＤ３モノクローナル抗体の発現量を示す。抗体発現量からわかるように、モノクローナル抗体Ｂ２５-Ｂ３３、Ｂ３５-Ｂ４２、Ｂ４６-Ｂ５３、Ｂ５６-Ｂ５７等は、１５ｍｇ/Ｌ超の一過性トランスフェクションの発現レベルを有している。

2.抗体の精製
抗体の精製は、アフィニティークロマトグラフィーが主に用いられてきた。具体的には以下の通りである：
（１）収穫：抗体を発現した細胞培養液を、３０００×ｇで１０分間遠心し、上清を取って、０.２２μｍのフィルターでろ過し、４ｏＣで保存して使われるのを待っていた。
（２）アフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＧＥ １７-５４３８-０１、例として、カラム体積が１８ｍｌである場合）
a)平衡化：結合バッファー(２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ/トリメチロールアミノメタン、ｐＨ ７.０-７.４)で、ＵＶ検出器、電導度の数値が安定安定した又はベースラインを維持するまでカラムを平衡化し、少なくとも５倍のカラム体積を平衡化した。
b)ローディング：ろ過した上清を５ｍｌ/ｍｉｎの流速でローディングした。
c)洗浄・平衡化：結合バッファーで５倍のカラム体積を洗い流した。
d)溶出：溶出バッファー(５０ｍＭ Ｃｉｔｒａｔｅ クエン酸、ｐＨ ３.４±０.１)でサンプルを溶出した。５ｍｌ/ｍｉｎの流速で、５倍のカラム体積を溶出し、溶出したピークを収集した。
e)中和：１Ｍ Ｔｒｉｓトリメチロールアミノメタン（ｐＨ ８.０）で、溶出液を中和し、サンプルをｐＨ６.０±０.１に調整した。精製により得られた抗体はモノクローナル抗体であり、天然抗体と一致する二価対称のＹ型構造を有している。
f)

3.抗体活性アッセイ
本実施例では、抗体活性アッセイが主に抗体のＣＤ３陽性細胞に対する結合活性のアッセイである。
１)細胞の準備：ＣＤ３親和性テストには、ＣＤ３陽性である誘導培養したＣＩＫ細胞／ヒト全血から単離されたＴ細胞を用いた。十分な量の細胞を、３００ｇで５ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、１%ＦＢＳ-ＰＢＳで細胞を再縣濁して密度が４×１０^６／ｍｌになるように調整した。ウェル毎に５０μｌを加えて、ウェル毎に２×１０^５個になるように、細胞をプレートに播種した。遠心機にて４℃、３００×ｇで、５ｍｉｎ遠心し、上清を廃棄した。なお、細胞の播種は、氷上で行った。
２)抗体の添加：実験デザインに従って、抗体を階段希釈した。なお、抗体の希釈は、氷上で行った。例えば、抗体希釈の初始濃度が３０００ｎＭであり、３倍希釈で、１１つの濃度勾配に希釈した。希釈した抗体は、細胞が存在しているウェルへ、ウェル毎に５０μｌを加え、軽くピペッティングしてよく混ぜ、４°Ｃ、１１００ｒｐｍ/ｍｉｎで振盪しながら２ｈインキュベーションした。
３)洗浄：１５０μｌ １%ＦＢＳ-ＰＢＳで細胞を再縣濁し、４°Ｃ、３００×ｇで５ｍｉｎ遠心し、上清を廃棄した。１回の洗浄を繰り返した。
４)第二の抗体インキュベーション：第二の抗体終濃度は８μｇ/ｍｌ、ボリュームは５０μｌ／ウェルになるように、希釈した第二の抗体であるＰＥ ａｎｔｉ-ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＦＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０９３０４）を加えた。これと共に、対照として細胞と第二の抗体のみを添加したウェルを設け、軽くピペッティングしてよく混ぜ、４°Ｃで避光下、１１００ｒｐｍ/ｍｉｎで振盪しながら１ｈインキュベーションした。
５)洗浄：１５０μｌ １%ＦＢＳ-ＰＢＳで細胞を再縣濁し、４°Ｃ、３００×ｇで５ｍｉｎ遠心し、上清を廃棄した。１回の洗浄を繰り返した。
６)固定：ウェル毎に２００μｌの２%パラホルムアルデヒドを加えて、細胞を再縣濁し、室温で細胞を２０ｍｉｎ固定した。３００×ｇで５ｍｉｎ遠心し、上清を廃棄した。
７)細胞の再縣濁：２００μｌ １%ＦＢＳ-ＰＢＳで細胞を再縣濁し、３００ｇで５ｍｉｎ遠心し、上清を廃棄した。
８)フローサイトメーターへのローディング：１５０μｌ １%ＦＢＳ-ＰＢＳで細胞を再縣濁し、フローサイトメーターにセットしてテストした。
９)データ解析：フローサイトメーター解析ソフトであるＦｌｏｗＪｏ ７.６でデータを解析し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５でＥＣ５０値をプロットして算出した。

抗体がヒト、サルのＴ細胞に対する結合活性の検出結果は、図４に示す。図４は、モノクローナル抗体がＣＤ３+Ｔ細胞に対する結合能を示す。

細胞に対する結合活性の検出結果からわかるように、これらの抗体は、モノクローナル抗体ｓｐ３４と比べて、いずれも高い親和性(ＥＣ５０<１００ｎＭ)を有しており、さらに、ヒト及びサルのＣＤ３の両方に対しても結合できる。

実施例３：本発明の多機能抗体の調製
一、プラスミドの構築方法
作業工程は、本出願の実施例２の「１、抗体発現プラスミドの構築方法」と同様である。具体的には、軽鎖発現プラスミド（ｐＬ）、重鎖発現プラスミド（ｐＨ）と融合ペプチド発現プラスミド（ｐＦ１）の３つのプラスミドの構築に関する。

多機能抗体の発現方法は、本出願の実施例２の「２、抗体の発現方法」と同様である。トランスフェクションの際は、３つのプラスミドはコトランスフェクションした。図１に示す多機能抗体１を発現するために、プラスミドｐＬ、ｐＨとｐＦ１を共に、ＣＨＯ-Ｓ又は２９３Ｅ細胞へトランスフェクションして発現することは必要とする。

本発明の多機能抗体は、以下の三つのポリペプチドからなる。
（１）融合ペプチド：重鎖可変領域（ＶＨｓ）、リンカー１、軽鎖可変領域（ＶＬｓ）、ヒンジ１、重鎖定常領域２（ＣＨ２）と重鎖定常領域３（ＣＨ３-ｂ）からなる。リンカー１の配列は表１０に示し、ヒンジ１は表１１のＨｉｎ２-９の配列に示し、ＣＨ２の配列は表１９に示し、ＣＨ３の配列は表２０のＣＨ３-ｂ配列に示す。ＶＨｓ、ＶＬｓの配列は、すべて本出願の新規ヒト化ＳＰ３４の配列からのものであり、詳細は表２を示す。
（２）重鎖：重鎖可変領域（ＶＨｍ）、重鎖定常領域１（ＣＨ１）、ヒンジ（Ｈｉｎｇｅ）、重鎖定常領域２（ＣＨ２）と重鎖定常領域３（ＣＨ３-ａ）からなる。ＣＨ１配列は表１３に示し、ヒンジの配列は表１１のＨｉｎ１配列に示した。ＣＨ２配列は、融合ペプチドのＣＨ２と同様であり（表１９に示し）、ＣＨ３の配列は表２０のＣＨ３-ａ配列に示す。ＣＨ３-ａと融合ペプチドのＣＨ３-ｂは、表２０に示す対応関係で１対１に対応している。
（３）軽鎖：軽鎖可変領域（ＶＬｍ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＣＬの配列は、表１２に示す。
多機能抗体の構造の模式図は、図１Ｂに示す。

二、多機能抗体の精製方法：
抗体の精製は、主にアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィおよびモレキュラシーブを用いた。具体的には以下の通りである：
（１）収穫：抗体を発現した細胞培養液を、３０００×ｇで１０分間遠心し、上清を取って、０.２２μｍのフィルターでろ過し、４ｏＣで保存して使われるのを待っていた。
（２）アフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＧＥ １７-５４３８-０１、例として、カラム体積が１８ｍｌである場合）
a)平衡化：結合バッファー(２５ ｍＭ トリメチロールアミノメタン、ｐＨ ７.０-７.４)で、ＵＶ検出器、電導度の数値が安定した又はベースラインを維持するまでカラムを平衡化し、少なくとも５倍のカラム体積を平衡化した。
b)ローディング：ろ過した上清を５ｍｌ/ｍｉｎの流速でローディングした。
c)洗浄・平衡化：結合バッファーで５倍のカラム体積を洗い流した。
d)溶出：溶出バッファー(５０ｍＭ クエン酸、ｐＨ ３.４±０.１)でサンプルを溶出した。５ｍｌ/ｍｉｎの流速で、５倍のカラム体積を溶出して、溶出したピークを収集した。
e)中和：１Ｍ Ｔｒｉｓ/トリメチロールアミノメタン（ｐＨ ８.０）で溶出液を中和し、サンプルをｐＨ６.０±０.１に調整した。
（３）イオン交換層析（陽イオン交換クロマトグラフィーを例として、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ-ＨＰ ＧＥ １７-１１５１-０１ 、５ｍｌのカラム体積）
a)サンプルの準備：アフィニティークロマトグラフィーのサンプルを精密濾過した後、電導度が５ ｍＳ／ｃｍ以下になるように超純水で希釈した。その後、ｐＨを６.０±０.１に調整した。
b)平衡化およびローディング：まず、５倍のカラム体積のバッファーＢ(２５ｍＭ クエン酸+１Ｍ塩化ナトリウム、電導度が８０～９０ ｍＳ／ｃｍであるべき、ｐＨが６.０±０.１である)で平衡化した。さらに、少なくとも５倍のカラム体積のバッファーＡ(２５ｍＭ クエン酸、電導度が５ ｍＳ／ｃｍ以下であるべき、ｐＨが６.０±０.１である)にて、電導度、ｐＨ、紫外ベースラインが安定したまでカラムを平衡化し、その後、３ｍｌ/ｍｉｎの流速でローディングした。
c)洗浄・平衡化：５倍のカラム体積のバッファーＡにて、５ｍｌ/ｍｉｎの流速で洗浄した。
d)溶出：０-３０%のバッファーＢ、２０倍のカラム体積で溶出し、１００%のバッファーＢ、１０倍のカラム体積で溶出した。全過程において、流速は３ｍｌ/ｍｉｎであった。異なるチューブに溶離液を収集して検出した。
（４）疎水性クロマトグラフィ（Ｃａｐｔｏ ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓ、フィラー：ＧＥ ＸＫ１６/２０ １１.５ ｃｍ／２３ｍｌ）
a)サンプル処理：５Ｍ塩化ナトリウムで、塩化ナトリウムが１Ｍになるまでにサンプルを調節し、ｐＨを６.０に調節した。
b)平衡化およびローディング：まず、バッファーＡ（２５ｍＭ Ｃｉｔｒａｔｅ クエン酸塩+１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨが６.０±０.１）にて５倍のカラム体積を用いて、５ｍｌ/ｍｉｎの流速で平衡化した。そして、３.３ ｍｌ／ｍｉｎの流速でローディングした。
c)洗浄・平衡化：５倍のカラム体積のバッファーＡにて、５ｍｌ/ｍｉｎの流速で洗浄した。１０%バッファーＢ（２５ｍＭ Ｃｉｔｒａｔｅクエン酸塩、ｐＨは６.０±０.１である）にて、５倍のカラム体積を用いて、５ｍｌ/ｍｉｎの流速で洗浄した。
d)溶出：９０%バッファーＢにて、５ｍｌ/ｍｉｎの流速で溶出し、異なるチューブに溶出ピークを収集して検出した。
（５）モレキュラシーブ（ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ ＧＥ ２８９８９３３６ ２６/６００）
a)平衡化およびローディング：バッファー(２０ｍＭ ヒスチジン+０.１５Ｍ塩化ナトリウム、ＰＨ６.０±０.１)にて２倍のカラム体積を用いて平衡化した後、３ｍｌ/ｍｉｎの流速でローディングした。
溶出：バッファーにて２倍のカラム体積で溶出し、異なるチューブに溶出ピークを収集して検出した。

具体的な発現されている抗体の一部の略称、および対応する抗体可変領域アミノ酸配列は、下表に示す。

本発明の多機能抗体の発現レベルは、図５に示す。図５は、ＣＨＯ細胞において、ヒト化抗ＣＤ３抗体より組み立てられた多機能抗体の、一過性のトランスフェクションの発現レベルを示した。

図５から分かるように、ＣＨＯ細胞において、一過性のトランスフェクションの発現レベルは、異なる抗ＣＤ３抗体より組み立てられた多機能抗体で、ある程度の差異が認められた。Ｙ１０２、Ｙ１５０-Ｆ８-３/Ｆ８-４/Ｆ８-６/Ｆ８-７/Ｆ８-８/Ｆ８-９/Ｆ８-１０/Ｆ９-１１/Ｆ９-１２、ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１５／ＩＣ１６／ＩＣ１７では、発現レベルが有意に高く、抗体発現量が４０ｍｇ/Ｌ以上である。

実施例４:多機能抗体の生物学的活性アッセイ
１、細胞との親和性
１)細胞の準備：ヒト全血から単離されたＣＤ３陽性であるＴ細胞を用いて、多機能抗体分子のＣＤ３末端親和性テストを行い、対応する抗原が陽性である腫瘍細胞を用いて腫瘍抗原の親和性テストを行った。例えば、ＣＤ３８抗原テストでは、ＣＤ３８陽性であるＭＭ.１Ｓ細胞（中国科学院上海生命科学研究所細胞資源センターより購入）又はＲＰＭＩ ８２２６細胞（中国科学院上海生命科学研究所細胞資源センターより購入）が用いられ、ＰＤ-Ｌ１抗原テストでは、ＰＤ-Ｌ１陽性であるＨ３５８細胞（中国科学院上海生命科学研究所細胞資源センターより購入）等が用いられることを挙げられる。十分な量の細胞を、３００×ｇで５ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、１%ＦＢＳ-ＰＢＳで細胞を再縣濁し、密度が４×１０^６／ｍｌになるように調整した。ウェル毎に５０μｌを加えて、ウェル毎に２×１０^５個になるように、細胞をプレートに播種した。４°Ｃ、３００×ｇで、５ｍｉｎ遠心した、上清を廃棄した。なお、細胞の播種は、氷上で行った。
２)抗体の添加：実験デザインに従って、抗体を階段希釈した。なお、抗体の希釈は、氷上で行った。例えば、抗体希釈の初期濃度が３０００ｎＭであり、３倍希釈で、１１つの濃度勾配に希釈した。希釈した抗体は、細胞が存在しているウェルへ、ウェル毎に５０μｌを加え、軽くピペッティングしてよく混ぜ、４°Ｃ、１１００ｒｐｍ/ｍｉｎで振盪しながら２ｈインキュベーションした。
３)洗浄：１５０μｌ １%ＦＢＳ-ＰＢＳで細胞を再縣濁し、４°Ｃ、３００×ｇで５ｍｉｎ遠心し、上清を廃棄した。１回の洗浄を繰り返した。
４)第二の抗体インキュベーション：第二の抗体の終濃度は８ｕｇ/ｍｌで、ボリュームは５０μｌ／ウェルになるように、希釈した第二の抗体であるＰＥ ａｎｔｉ-ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＦＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０９３０４）を加えた。これと共に、対照として細胞と第二の抗体のみを添加したウェルを設け、軽くピペッティングしてよく混ぜ、４°Ｃで避光下、１１００ｒｐｍ/ｍｉｎで振盪しながら１ｈインキュベーションした。
５)洗浄：１５０μｌ １%ＦＢＳ-ＰＢＳで細胞を再縣濁し、４°Ｃ、３００ｇで５ｍｉｎ遠心し、上清を廃棄した。１回の洗浄を繰り返した。
６)固定：ウェル毎に２００μｌの２%パラホルムアルデヒドを加えて、細胞を再縣濁し、室温で細胞を２０ｍｉｎ固定した。３００×ｇで５ｍｉｎ遠心し、上清を廃棄した。
７)細胞再縣濁：２００μｌ １%ＦＢＳ-ＰＢＳで細胞を再縣濁し、３００×ｇで５ｍｉｎ遠心した、上清を廃棄した；
８)フローサイトメーターへのローディング：１５０μｌ １%ＦＢＳ-ＰＢＳで細胞を再縣濁し、フローサイトメーターにセットして検出した。
９)データ解析：データは、フローサイトメーター解析ソフトであるＦｌｏｗＪｏ ７.６で解析し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５でＫｄ値をプロットして算出した。

２、Ｔ細胞の活性化
１）培養状態の良い腫瘍細胞（非小細胞肺癌細胞Ｈ３５８、中国科学院上海生命科学研究所細胞資源センターより購入；ミエローマ細胞ＭＣ/ＣＡＲ、ＡＴＣＣより購入）を用いて、単一細胞の懸濁液を調製して、細胞数２Ｅ４／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。
２）健康なボランティアの全血から、密度勾配遠心法によりＰＢＭＣを分離した。ＰＢＭＣは、実験デザインのＥ:Ｔ ｒａｔｉｏ（エフェクター細胞：標的細胞）に従って、腫瘍細胞を播種したプレートに加えた。
３）実験デザインに従って、抗体を一連の濃度階段で希釈し、各濃度の抗体を加えた。
４）９６ウェルプレートを３７°Ｃ、５%ＣＯ２のインキュベータで、テスト時間までにインキュベーションした。懸濁したＰＢＭＣ細胞をまとめ、対応するＣＤ３、ＣＤ６９のテスト抗体を加えて、１ｈインキュベーションした後、余分な抗体を洗い流した。細胞を再縣濁し、フローサイトメーターでＣＤ３とＣＤ６９のダブルポジティブ細胞の割合を検出して、それを抗体により誘導されたＰＢＭＣにおけるＴ細胞の活性化割合とした。具体的に、下式で算出した。
ＣＤ３とＣＤ６９ダブルポジティブ細胞の割合（%）=ＣＤ３とＣＤ６９ダブルポジティブ細胞数／ＣＤ３陽性細胞総数×１００%
「ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５」ソフトで、バイボディ濃度を横軸、ＣＤ３&ＣＤ６９）%値を縦軸として、非線形フィッティング（ｌｏｇ(ａｇｏｎｉｓｔ)ｖｓ．ｒｅｓｐｏｎｓｅ--Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ）し、Ｔ細胞活性化曲線およびＥＣ５０値を算出した。

３、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ細胞毒性
１)十分な量の腫瘍細胞（例えば、Ｈ３５８細胞とＭＣ/ＣＡＲ細胞）を用いて、単細胞の懸濁液を調製した。
２)腫瘍細胞のＣＦＳＥ染色：一定量の細胞懸濁液を遠心（３００×ｇ、５ｍｉｎ）して上清を除去した。ＣＦＳＥの終濃度が５μＭになるように、２ｍｌ ＰＢＳで配製したＣＦＳＥ溶液を加えた。細胞を５%ＣＯ２、３７℃のインキュベータに置いて、１５ｍｉｎインキュベーションした。細胞をインキュベータから取り出し、ＰＢＳで洗浄し、遠心（３００×ｇ、５ｍｉｎ）して上清を除去した。洗浄を３回繰り返し、完全培地で細胞を再縣濁し、懸濁液を取ってカウントした。
３)腫瘍細胞の播種：完全培地で細胞密度が２×１０^５／ｍｌになるように細胞を再縣濁し、２×１０^４個／ウェル、即ち１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに加えた。
４)エフェクター細胞であるＰＢＭＣ（ヒト全血から分離され）の添加：実験系における腫瘍細胞に用いる完全培地でエフェクター細胞を再縣濁し、実験デザインのＥ:Ｔ ｒａｔｉｏにより換算した対応するエフェクター細胞の量で前記プレートに添加した。添加ボリュームは、５０μｌ／ウェルである。
５)希釈抗体の添加：実験デザインによると、抗体の最高濃度は１０μｇ/ｍｌである。５０μｌの抗体を追加する場合、総ボリュームである２００μｌの１／４に相当するので、抗体を追加する前にそれぞれ前記濃度の４倍に調製する必要がある。つまり、抗体は最初４０μｇ/ｍｌに希釈して、４０μｇ/ｍｌから１０倍希釈（９つの階段、ボリューム５０μｌ／ウェル）を始めた。
６)顕微鏡下で９６ウェルプレートを観察し、細胞が培養ウェル内に均一に分散していることを確認し、５%ＣＯ２、３７℃の細胞インキュベータに入れて培養し、検出を待っていた。
７)検出時間に達した後、接着細胞についての処理は：細胞上清を吸い出し、ＰＢＳを用いて３０μｌ／ウェルで洗浄し、洗浄液を吸い出して、前の吸い出した上清と合わせた。細胞ウェル内にトリプシン３０μｌ／ウェルを加えて、５%ＣＯ２、３７℃の細胞インキュベータにいれて３-５ｍｉｎ消化し、前の収集した上清を加えて、単細胞懸濁液になるまで各孔の細胞をピペッティングした。懸濁細胞についての処理は：複数回ピペッティングして均一に混合した。
８)フローサイトメーターへのローディングの１０-１５ｍｉｎ前に、各サンプルにＰＩ（終濃度が１０μｇ/ｍｌ）を、１０ｕｌ／ウェルで加えた。
９)フローサイトメーター検出；フローサイトメーターの検出結果は、ＦｌｏｗＪｏソフトで解析し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌでデータの解析をエクスポートし、ＧｒａｐｈＰａｄでフォームを作成して分析した。殺傷性の計算式：ＣＦＳＥ、ＰＩダブルポジティブ細胞がＣＦＳＥ陽性細胞に占める割合を標的細胞の死亡率とした。
計算式は以下である。
標的細胞死亡率(%)=ｐＩとＣＦＳＥダブルポジティブ細胞数／ＣＦＥＳ陽性細胞数×１００
１０）腫瘍細胞に対する抗体の殺傷能の算出：標的細胞死亡率計算式によって、すべての抗体濃度の標的細胞死亡率を算出し、さらに、抗体濃度を横軸、標的細胞の死亡率を縦軸として曲線を作成した。データ解析ソフトとしてはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を利用し、得られたＥＣ５０値は、当該抗体の細胞殺傷能とした。

多機能抗体の一部の具体的な結合活性を表２８に示した。

多機能抗体の一部の具体的なＴ細胞活性化能を図７と表２９に示した。

多機能抗体の一部の細胞殺傷能を図８と９、表３０と表３１に示した。

比較実施例１：
一、ヒト化抗体と既存抗ＣＤ３抗体の配列アラインメント：
抗ＣＤ３抗体１の可変領域配列は、特許ＵＳ８８４６０４２Ｂ２に記載され、この中、重鎖可変領域は当該特許の配列番号４４に対応し、軽鎖可変領域は当該特許の配列番号５６に対応している。

抗ＣＤ３抗体２の可変領域配列は特許ＵＳ９６５０４４６Ｂ２に記載され、この中、重鎖可変領域は当該特許の配列番号８５にに対応し、軽鎖可変領域は当該特許の配列番号１９４に対応している。

（１）重鎖可変領域のアラインメント：

ＶＨ２ａと抗ＣＤ３抗体１ ＶＨのアミノ酸配列の類似度は９６.８%であり、ＦＲ-Ｈ１とＦＲ-Ｈ４に相違が認められた。

ＶＨ２ａと抗ＣＤ３抗体２ ＶＨのアミノ酸配列の類似度は９５.２%であり、ＦＲ-Ｈ１、ＦＲ-Ｈ２とＣＤＲ-Ｈ２に相違が認められた。

（２）軽鎖可変領域のアラインメント：

ＶＬ５と抗ＣＤ３抗体１ ＶＬのアミノ酸配列の類似度は９４.５%であり、ＦＲ-Ｌ１、ＦＲ-Ｌ３とＦＲ-Ｌ４に相違が認められた。

ＶＬ５と抗ＣＤ３抗体２ ＶＬのアミノ酸配列の類似度は９６.３%であり、ＦＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ１、ＦＲ-Ｌ３とＦＲ-Ｌ４に相違が認められた。

二、ヒト化抗体と、既存の抗ＣＤ３抗体であるモノクローナル抗体との生物学的活性比較：
（１）既存抗ＣＤ３抗体の親和性テスト
表２６ 既存抗ＣＤ３抗体の略称およびアミノ酸配列

既存モノクローナル抗体の製造方法は、実施例２、３の抗体製造方法と同様であった。細胞結合活性アッセイのデータは、図６に示した。図６は、既存抗ＣＤ３抗体であるモノクローナル抗体の細胞との親和性を示した。

比較実施例２：
（１）比較多機能抗体の一部の略称および可変領域アミノ酸配列
具体的には、下表に示した。

（二）本発明の多機能抗体と比較多機能抗体の細胞との親和性テスト
多機能抗体の親和性テスト結果は下表に示した。

表２８から、本発明のＣＤ３ヒト化抗体と、異なるＣＤ３８モノクローナル抗体と組み合せて多機能抗体を形成する場合、両端の親和性が異なる程度の影響を受けることが認められた。

（３）本発明の多機能抗体がＴ細胞に対する活性化レベルのテスト
本発明の多機能抗体であるＹ１５０-Ｆ８-９、Ｙ１５０-Ｆ８-１０、Ｙ１５０-Ｆ８-１２、Ｙ１５０-Ｆ９-１１、ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ-１７の、ヒトＴ細胞に対する活性化レベルのテスト結果を図７に示した（この中、エフェクター細胞であるヒトＰＢＭＣと、標的細胞であるＭＣ/ＣＡＲの数の比は、５:１であり、処理時間：４８ｈ）。図７は、異なる本発明の多機能抗体のＴ細胞に対するＩｎ Ｖｉｔｒｏ活性化能を示した。

「*」は、プラットフォーム期に到達していなく、カーブフィッティングは不正確であるのを表した。実際のＥＣ５０値は、表に示した数値より大きい可能性がある。

図７では、Ｙ１５０-Ｆ８-９は最も強いＴ細胞活性化能を有しており、当該抗体と２種抗原（ＣＤ３８、ＣＤ３）への結合能の両方がいずれも図中の抗体の中に最も強い。Ｙ１５０-Ｆ８-８は、Ｙ１５０-Ｆ８-９とレベル近似的なＴ細胞活性化能を有する（データは、示されていない）。抗体Ｙ１５０-Ｆ８-９、Ｙ１５０-Ｆ８-１０とＹ１５０-Ｆ８-１２は、完全一致した抗ＣＤ３８の抗体配列を有し、ＣＤ３８に対する親和性も完全一致であるが、これらの抗体は、完全一致ではない抗ＣＤ３抗体配列を有しており、ＣＤ３に対する親和性で１～３つのアミノ酸点変異による差異があり、さらに、Ｔ細胞に対する活性化の能力も有意な差異を有する。最も強いＴ細胞活性化能を有するのはＹ１５０-Ｆ８-９であり、次はＹ１５０-Ｆ８-１０であり、そして、Ｙ１５０-Ｆ８-１２は弱のＴ細胞活性化能を有する。Ｙ１５０-Ｆ９-１１は、有意なＴ細胞活性化の機能を有する。

（４）本発明の多機能抗体、比較多機能抗体の細胞殺傷能のテスト
本発明の多機能抗体であるＹ１５０-Ｆ８-５、Ｙ１５０-Ｆ８-６、比較多機能抗体であるＹ１５０-Ｆ８-１の、多発性骨髄腫細胞ＭＣ/ＣＡＲに対する殺傷能のテスト結果を、図８に示した（ここで、エフェクター細胞であるヒトＰＢＭＣと標的細胞であるＭＣ/ＣＡＲの数の比は５：１であり、処理時間：７２ｈ）：

図８は、多発性骨髄腫細胞ＭＣ/ＣＡＲに対する、異なる多機能抗体のＩｎ Ｖｉｔｒｏ殺傷能を示した。

図８において、Ｙ１５０-８-５とＹ１５０-８-６には、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列がいずれも新規ヒト化抗ＣＤ３抗体配列であった以外、抗体の他の部分（ＦａｂとＦｃを含む）の配列が完全にＹ１５０-Ｆ８-１と同じであった。Ｙ１５０-Ｆ８-１の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列は、既知の抗体ＳＰ３４の配列であった。以上のデータから分かるように、本発明の多機能抗体は近似的な、またはそれ以上の腫瘍細胞殺傷能を有する。対照抗体は殺傷能を有しないことから、多機能抗体の細胞殺傷能は、腫瘍又は免疫細胞にバイスペシフィックな標的化して結合して、免疫細胞から腫瘍細胞への攻撃を誘導することによって生み出されていることが示された。ＣＤ３８モノクローナル抗体は市販されたＣＤ３８抗体薬ＤＡＲＺＡＬＥＸ（登録商標）である。

本発明の多機能抗体であるＹ１０５、比較多機能抗体であるＹ１０６の、肺癌細胞Ｈ３５８に対する殺傷能のテスト結果は、図９に示した（この中、エフェクター細胞であるヒトＰＢＭＣと標的細胞であるＭＣ/ＣＡＲの数の比は１０：１であり、処理時間：４８ｈ）。

図９は、異なる多機能抗体の肺癌細胞Ｈ３５８に対するＩｎ Ｖｉｔｒｏ殺傷能を示した。

図９において、Ｙ１０５は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列が新規ヒト化抗ＣＤ３抗体配列であった以外、抗体の他の部分（ＦａｂとＦｃを含む）の配列が完全にＹ１０６と同じであった。Ｙ１０６の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列は、既知の抗体ＳＰ３４の配列。以上のデータから分かるように、本発明の多機能抗体は、近似的な、またはそれ以上の腫瘍細胞殺傷能を有する。対照抗体の殺傷性が弱いことから、多機能抗体の細胞殺傷能は、腫瘍又は免疫細胞にバイスペシフィックな標的化して結合して、免疫細胞から腫瘍細胞への攻撃を誘導することによって生み出されていることが示された。Ｓ７０ ｍＡｂは市販されたＰＤ-Ｌ１抗体薬Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）であった。

（5）本発明の多機能抗体、比較多機能抗体の安定性試験
実験一：４０^ｏＣの熱加速安定性試験、具体的な作業ステップは以下のように行った。
１、サンプルを、（ａ）クエン酸バッファー：２０ｍＭ クエン酸、ｐＨ ５.５、または（ｂ）ヒスチジンバッファー：５０ｍＭ ヒスチジン、ｐＨ ５.５の組成を有する特定のバッファーに置換され、そして、サンプルの濃度を１ｍｇ/ｍＬに調整した。
２、サンプルをチューブ毎に５００μＬで入れて封止した後、４０^ｏＣの水浴に放置した。２４ｈおきにサンプリングしてＨＰＬＣ-ＳＥＣ検出し、水浴時間は計１４日であった。

検出結果を図１０-１６に示した。

図１０は、本発明の多機能抗体Ｙ１０５、比較抗体Ｙ１０６、ＣＴ-Ｆ４、ＣＴ-Ｆ５とＣＴ-Ｆ６について、クエン酸緩衝系での４０^ｏＣの加速熱安定性試験を示した。図１０から分かるように、本発明の多機能抗体は、良好な熱安定性を有する。当該抗体は、１４日間の４０ｏＣ処理を経っても、有意な変化がなく、これは比較抗体Ｙ１００に近似し、ＣＴ-Ｆ４、ＣＴ-Ｆ５とＣＴ-Ｆ６よりも有意に優れていた。ここで、Ｙ１０５は、ＦａｂとＦｃ配列が全ての比較抗体と同じであり、ＳｃＦｖが異なる。Ｙ１０５は、本発明の抗ＣＤ３抗体ＶＨ２ａとＶＬ５配列を有する。Ｙ１０６は、ＳＰ３４抗体配列で、ＣＴ-Ｆ４は抗ＣＤ３抗体１配列で、ＣＴ-Ｆ５は抗ＣＤ３抗体２配列であり、ＣＴ-Ｆ６は、抗ＣＤ３抗体１ＶＨと抗ＣＤ３抗体２ＶＬ配列を有する。

図１１は、本発明の多機能抗体Ｙ１５０-Ｆ８-５、Ｙ１５０-Ｆ８-６、Ｙ１５０-Ｆ８-７、Ｙ１５０-Ｆ８-８、比較抗体Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ８-２、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３について、クエン酸緩衝系での４０^ｏＣの加速熱安定性試験を示した。図１１の全ての多機能抗体は同じＦａｂ配列を有し、Ｙ１５０-Ｆ８-５、Ｙ１５０-Ｆ８-６、Ｙ１５０-Ｆ８-１、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２とＣＴ-Ｆ３の間に同じＦｃ配列を有する。Ｙ１５０-Ｆ８-５、Ｙ１５０-Ｆ８-６、Ｙ１５０-Ｆ８-７とＹ１５０-Ｆ８-８の抗ＣＤ３抗体配列は、ＶＨ２ａとＶＬ５であり、Ｙ１５０-Ｆ８-１とＹ１５０-Ｆ８-２の抗ＣＤ３抗体配列は、ＳＰ３４であり、ＣＴ-Ｆ１の抗ＣＤ３抗体配列は、抗ＣＤ３抗体１であり、ＣＴ-Ｆ２の抗ＣＤ３抗体配列は、抗ＣＤ３抗体２であり、ＣＴ-Ｆ３の抗ＣＤ３抗体配列は、抗ＣＤ３抗体１ＶＨと抗ＣＤ３抗体２ＶＬであった。図中のデータから分かるように、本発明の多機能抗体は比較抗体よりも有意に優れた熱安定性を有する。

図１２は、本発明の多機能抗体Ｙ１５０-Ｆ８-９、Ｆ８-１０、Ｆ８-１２、Ｆ９-７、Ｆ９-１１、比較抗体Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ９-６、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３について、クエン酸緩衝系での４０^ｏＣの加速熱安定性試験を示した。図１２中のＹ１５０-Ｆ８-９、Ｆ８-１０、Ｆ８-１２、Ｆ９-７、Ｆ９-１１は本発明の多機能抗体であり、それらの抗ＣＤ３抗体配列がＶＨ２ａとＶＬ５、又はＶＨ２ｊとＶＬ５ａ（Ｆ８-１０）、又はＶＨ２ｌとＶＬ５ｂ（Ｆ８-１２）であった。Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ９-６、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３は比較多機能抗体であり、それらのＣＤ３配列が、それぞれＳＰ３４（Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ９-６）、抗ＣＤ３抗体１（ＣＴ-Ｆ１）、抗ＣＤ３抗体２（ＣＴ-Ｆ２）、抗ＣＤ３抗体１ＶＨと抗ＣＤ３抗体２ＶＬ（ＣＴ-Ｆ３）であった。図１２のデータから分かるように、本発明の多機能抗体は比較抗体よりも有意に優れた熱安定性を有する。

図１３本発明の多機能抗体ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１５、ＩＣ１６、ＩＣ１７およびＩＣ１８、比較抗体ＩＣ-２からＩＣ-７までについて、クエン酸緩衝系での４０^ｏＣの加速熱安定性試験を示した。図１３中の全ての抗体はＦａｂ配列が完全一致であった。この中、ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１５、ＩＣ１６、ＩＣ１７とＩＣ１８は本発明の多機能抗体であり、それらの抗ＣＤ３抗体配列がＶＨ２ａとＶＬ５、またはＶＨ２ｊとＶＬ５ａ（ＩＣ１８）であった。ＩＣ-２からＩＣ-７までは比較多機能抗体であり、それらの抗ＣＤ３抗体配列は、それぞれＳＰ３４（ＩＣ-２とＩＣ-３）、抗ＣＤ３抗体１（ＩＣ-４）、抗ＣＤ３抗体２（ＩＣ-５）、抗ＣＤ３抗体１ＶＨと抗ＣＤ３抗体２ＶＬ（ＩＣ-６とＩＣ-７）であった。図中のデータから分かるように、本発明の多機能抗体は比較抗体よりも有意に優れた熱安定性を有する。

図１４は、本発明の多機能抗体Ｙ１５０-Ｆ８-５、Ｙ１５０-Ｆ８-６、Ｙ１５０-Ｆ８-７、Ｙ１５０-Ｆ８-８、比較抗体Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ８-２、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３について、ヒスチジン緩衝系での４０^ｏＣの加速熱安定性試験を示した。図１４の全ての多機能抗体は同じＦａｂ配列を有し、Ｙ１５０-Ｆ８-５、Ｙ１５０-Ｆ８-６、Ｙ１５０-Ｆ８-１、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２とＣＴ-Ｆ３との間に同じＦｃ配列を有する。Ｙ１５０-Ｆ８-５、Ｙ１５０-Ｆ８-６、Ｙ１５０-Ｆ８-７とＹ１５０-Ｆ８-８の抗ＣＤ３抗体配列はＶＨ２ａとＶＬ５であり、Ｙ１５０-Ｆ８-１とＹ１５０-Ｆ８-２の抗ＣＤ３抗体配列はＳＰ３４であり、ＣＴ-Ｆ１の抗ＣＤ３抗体配列は抗ＣＤ３抗体１であり、ＣＴ-Ｆ２の抗ＣＤ３抗体配列は抗ＣＤ３抗体２であり、ＣＴ-Ｆ３の抗ＣＤ３抗体配列は抗ＣＤ３抗体１ＶＨと抗ＣＤ３抗体２ＶＬであった。図中のデータから分かるように、本発明の多機能抗体はいすれも良好な熱安定性を有する。比較抗体Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ８-２、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３は、本発明の多機能抗体より有意に弱い熱安定性を有する。

図１５は、本発明の多機能抗体Ｙ１５０-Ｆ８-９、Ｆ８-１０、Ｆ８-１２、Ｆ９-７、Ｆ９-１１、比較抗体Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ９-６、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３について、ヒスチジン緩衝系での４０^ｏＣの加速熱安定性試験を示した。図１５の中、Ｙ１５０-Ｆ８-９、Ｆ８-１０、Ｆ８-１２、Ｆ９-７、Ｆ９-１１は本発明の多機能抗体であり、それらの抗ＣＤ３抗体配列がＶＨ２ａとＶＬ５、又はＶＨ２ｊとＶＬ５ａ（Ｆ８-１０）、又はＶＨ２ｌとＶＬ５ｂ（Ｆ８-１２）であった。Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ９-６、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３は比較多機能抗体であり、それらのＣＤ３配列は、それぞれＳＰ３４（Ｙ１５０-Ｆ８-１とＹ１５０-Ｆ９-６）、抗ＣＤ３抗体１（ＣＴ-Ｆ１）、抗ＣＤ３抗体２（ＣＴ-Ｆ２）、抗ＣＤ３抗体１ＶＨと抗ＣＤ３抗体２ＶＬ（ＣＴ-Ｆ３）であった。図１５のデータから分かるように、本発明の多機能抗体は比較抗体よりも有意に優れた熱安定性を有する。

図１６は、本発明の多機能抗体ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１５、ＩＣ１６、ＩＣ１７、ＩＣ１８、比較抗体ＩＣ-２からＩＣ-７までについて、ヒスチジン緩衝系での４０^ｏＣの加速熱安定性試験を示した。図１６の全ての抗体のＦａｂ配列は完全一致であった。この中、ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１５、ＩＣ１６、ＩＣ１７とＩＣ１８は本発明の多機能抗体であり、それらの抗ＣＤ３抗体配列はＶＨ２ａとＶＬ５、またはＶＨ２ｊとＶＬ５ａ（ＩＣ１８）であった。ＩＣ-２からＩＣ-７までは比較多機能抗体であり、それらの抗ＣＤ３抗体配列は、それぞれＳＰ３４（ＩＣ-２とＩＣ-３）、抗ＣＤ３抗体１（ＩＣ-４）、抗ＣＤ３抗体２（ＩＣ-５）、抗ＣＤ３抗体１ＶＨと抗ＣＤ３抗体２ＶＬ（ＩＣ-６とＩＣ-７）であった。図中のデータから分かるように、本発明の多機能抗体は比較抗体よりも有意に優れた熱安定性を有する。

実験２：低ｐＨでの安定性試験。
低ｐＨでの安定性は、耐酸性とも称され、抗体分子が酸性環境で一定期間処理された後、再度生理学的条件までに中和された際に元の状態を維持できるかどうかを調査する指標である。その方法として、具体的に、抗体分子のｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーにおいて、酸溶出する工程で（ｐＨ ３.５のクエン酸バッファーを用いた）溶出せれた抗体溶液は、中和せず前記バッファーにおいて一定時間を維持した後、３０分目、６０分目にサンプリングしてボリュームの１/１０の１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ ８.０）を加えて中和し、このサンプルのＨＰＬＣ-ＳＥＣテストを行った。

図１７は、本発明の多機能抗体Ｙ１０５、比較抗体Ｙ１０６、ＣＴ-Ｆ４、ＣＴ-Ｆ５とＣＴ-Ｆ６について、ｐＨ ３.５のクエン酸緩衝系での耐酸性安定性試験を示した。図１７から分かるように、本発明の多機能抗体は良好な耐酸性を有する。当該抗体は低ｐＨで処理を６０ｍｉｎ行っても、大きな変化はなく、Ｙ１０６、ＣＴ-Ｆ４、ＣＴ-Ｆ５とＣＴ-Ｆ６に比べて有意に優れた耐酸性を有する。

図１８は、本発明の多機能抗体Ｙ１５０-Ｆ８-５、Ｙ１５０-Ｆ８-６、Ｙ１５０-Ｆ８-７、Ｙ１５０-Ｆ８-８、比較抗体Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ８-２、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３について、ｐＨ ３.５ のクエン酸緩衝系での耐酸性安定性試験を示した。図１８の全ての多機能抗体は同じＦａｂ配列を有し、Ｙ１５０-Ｆ８-５、Ｙ１５０-Ｆ８-６、Ｙ１５０-Ｆ８-１、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２とＣＴ-Ｆ３との間に同じＦｃ配列を有する。Ｙ１５０-Ｆ８-５、Ｙ１５０-Ｆ８-６、Ｙ１５０-Ｆ８-７とＹ１５０-Ｆ８-８の抗ＣＤ３抗体配列は、ＶＨ２ａとＶＬ５であり、Ｙ１５０-Ｆ８-１とＹ１５０-Ｆ８-２の抗ＣＤ３抗体配列は、ＳＰ３４であり、ＣＴ-Ｆ１の抗ＣＤ３抗体配列は、抗ＣＤ３抗体１であり、ＣＴ-Ｆ２の抗ＣＤ３抗体配列は、抗ＣＤ３抗体２であり、ＣＴ-Ｆ３の抗ＣＤ３抗体配列は、抗ＣＤ３抗体１ＶＨと抗ＣＤ３抗体２ＶＬであった。図中のデータから分かるように、本発明の多機能抗体は、比較抗体よりも有意に優れた耐酸性を有する。

図１９本発明の多機能抗体Ｙ１５０-Ｆ８-９、Ｆ８-１０、Ｆ８-１２、Ｆ９-７、Ｆ９-１１、比較抗体Ｙ１５０-Ｆ８-１、Ｙ１５０-Ｆ９-６、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３について、ｐＨ ３.５ のクエン酸緩衝系での耐酸性安定性試験を示した。図１９中のＹ１５０-Ｆ８-９、Ｙ１５０-Ｆ９-７、Ｙ１５０-Ｆ９-１１は本発明の多機能抗体であり、それらの抗ＣＤ３抗体配列はＶＨ２ａとＶＬ５、又はＶＨ２ｊとＶＬ５ａ（Ｆ８-１０）、又はＶＨ２ｌとＶＬ５ｂ（Ｆ８-１２）であった。Ｙ１５０-Ｆ８-１、ＣＴ-Ｆ１、ＣＴ-Ｆ２、ＣＴ-Ｆ３は比較多機能抗体であり、それらのＣＤ３配列は、それぞれＳＰ３４（Ｙ１５０-Ｆ８-１とＹ１５０-Ｆ９-６）、抗ＣＤ３抗体１（ＣＴ-Ｆ１）、抗ＣＤ３抗体２（ＣＴ-Ｆ２）、抗ＣＤ３抗体１ＶＨと抗ＣＤ３抗体２ＶＬ（ＣＴ-Ｆ３）であった。図１９のデータから分かるように、本発明の多機能抗体は、比較抗体よりも有意に優れた耐酸性を有する。

図２０は、本発明の多機能抗体ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１５、ＩＣ１６、ＩＣ１７とＩＣ１８、比較抗体ＩＣ-２からＩＣ-７までについて、ｐＨ ３.５ のクエン酸緩衝系での耐酸性テストを示した。図２０の全ての抗体のＦａｂ配列は完全一致であった。この中、ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１５、ＩＣ１６、ＩＣ１７とＩＣ１８は本発明の多機能抗体であり、それらの抗ＣＤ３抗体配列はＶＨ２ａとＶＬ５、又はＶＨ２ｊとＶＬ５ａ（ＩＣ１８）であった。ＩＣ-２からＩＣ-７までは、比較多機能抗体であり、それらの抗ＣＤ３抗体配列は、それぞれＳＰ３４（ＩＣ-２とＩＣ-３）、抗ＣＤ３抗体１（ＩＣ-４）、抗ＣＤ３抗体２（ＩＣ-５）、抗ＣＤ３抗体１ＶＨと抗ＣＤ３抗体２ＶＬ（ＩＣ-６とＩＣ-７）であった。該図のデータから分かるように、本発明の多機能抗体は比較抗体よりも有意に優れた耐酸性を有する。

（６）本発明の多機能抗体と比較多機能抗体のＩｎ ｖｉｖｏ有効性試験
１、試験材料：
細胞：Ｄａｕｄｉ（ヒト多発性骨髄腫細胞株、ＡＴＣＣから購入）、ヒトＰＢＭＣ；
マウス：ＮＯＤ/ＳＣＩＤ、５週齢、メス、Ｂｅｉｊｉｎｇ ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．。

接種方法：Ｄａｕｄｉ細胞を右側背中部皮下に、ヒトＰＢＭＣを尾静脈から、Ｄ０に、ＤａｕｄｉとＰＢＭＣ細胞の両方を接種した。

試験用薬：（Ｂ）Ｙ１５０-Ｆ８-８、（Ｃ）Ｙ１５０-Ｆ８-９、（Ｄ）Ｙ１５０-Ｆ９-１１。
ネガティブ対照：（Ａ）ブランク対照；（Ｈ）ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ-１７。
ポジティブ対照：（Ｇ）ＣＤ３８ｍＡｂ（ＣＤ３８モノクローナル抗体、Ｄａｒｚａｌｅｘ（登録商標））。

投与方法：（１）Ｙ１５０-Ｆ８-８、Ｙ１５０-Ｆ８-９、Ｙ１５０-Ｆ９-１１とＭＳ-ｈＣＤ３-１７は、それぞれ、異なる剤量をデザインして尾静脈から投与され、投与は、Ｄ０から始まって、ＴＩＷ（週に３回）×２でした。（２）ＣＤ３８ｍＡｂは、Ｄ０とＤ７に投与され、Ｄ０の剤量は５ｍｇ/ｋｇで、Ｄ７の剤量は１５ｍｇ/ｋｇであった。群各６匹にした。

体重：投与期間において体重を週に３回計測し、その後、体重を週に２回計測した。

腫瘍体積：腫瘍の潜伏期は９-２０日間であり、平均腫瘍体積が３０ｍｍ３に達した後、週に２回で腫瘍の長さ、幅を計測した。モニタリング時間としては、約３０日間又は陰性対照群での平均腫瘍体積は２０００ｍｍ３に接近した程度の時、残りの全ての担癌マウスに対して写真を撮った。また、各群について、一つの群全体の腫瘍体積が２０００ｍｍ３に接近した時、又はある一つのマウスの腫瘍体積が３０００ｍｍ３に達した時、当該群を終止した。

２、実験結果
Ｙ１５０-Ｆ８-８の実験結果は図２１Ａに示し、Ｙ１５０-Ｆ８-９の実験結果は図２１Ｂに示し、Ｙ１５０-Ｆ９-１１の実験結果は図２１Ｃに示した。

図２１は、マウス腫瘍モデルにおいて、異なる多機能抗体によるＩｎ ｖｉｖｏ効果、および腫瘍体積のモニタリングを示した。この中、Ｙ１５０-Ｆ８-８（Ａ）、Ｆ８-９（Ｂ）とＦ９-１１（Ｃ）はいずれも本発明の多機能抗体であり、それらの抗ＣＤ３抗体配列がいずれもＶＨ２ａとＶＬ５であり、抗ＣＤ３８抗体配列がそれぞれに異なるであった。

図２１から、本発明の多機能抗体Ｙ１５０-Ｆ８-８、Ｆ８-９とＦ９-１１は、有意な腫瘍抑制効果を有しており、対照モノクローナル抗体と比べても有意な差はなく、いずれも有効剤量で腫瘍を完全に抑制でき、そして動物にも顕著な毒性反応、副反応を示さないことが認められた。

（7）本発明の多機能抗体のサルでの毒性試験
２Ｆ５ｍＡｂは抗ＣＤ３８のモ
ノクローナル抗体であり、ヒトサルＣＤ３８に交差反応的な結合することができる。その具体的な配列は以下である：

多機能抗体Ｙ１５０-Ｆ８-１０、Ｆ９-１１、Ｆ９-１２、比較抗体Ｙ１５０-Ｆ９-６とモノクローナル抗体２Ｆ５ｍＡｂについて、それぞれサルでの毒性試験を行った。静脈輸液で単回投与し、剤量は下表に示した。

Ｙ１５０-Ｆ８-１０、Ｆ９-１１、Ｆ９-１２群では、サルのリンパ球サブセットＣＤ３８+ＣＤ２０+細胞の数は、投与２４ｈ後まで、有意に低減して完全排除に達した。２Ｆ５ｍＡｂ群（剤量：２０ｍｇ/ｋｇ）では、当該群細胞が有意に低減して投与前の３０%程度になって、完全排除されなかった。これらデータから、Ｙ１５０-Ｆ８-１０、Ｆ９-１１、Ｆ９-１２分子は有意なＣＤ３８+細胞排除効果を有することが認められ、また、表３４から分かるように、Ｙ１５０-Ｆ８-１０、Ｙ１５０-Ｆ９-１１、Ｙ１５０-Ｆ９-１２はＹ１５０-Ｆ９-６よりも弱い毒性を有する。

Claims (21)

1. ヒト化抗体又はその抗原結合性断片であって、
   ヒト及び／又はサルなどの霊長類のＣＤ３に特異的に結合し、
   フレームワーク領域ＦＲ-Ｈ１、ＦＲ-Ｈ２、ＦＲ-Ｈ３、ＦＲ-Ｈ４、ＦＲ-Ｌ１、ＦＲ-Ｌ２、ＦＲ-Ｌ３及びＦＲ-Ｌ４と、相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含み、
   重鎖可変領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１及び２に示されるアミノ酸配列であり、重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３又はその変異体配列である配列番号４、１０、１１、１２、１３、１４又は１９１に示される配列のいずれか一つの配列であり、
   軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２６、２７及び２８に示されるアミノ酸配列であり、
   前記ヒト化抗体のフレームワーク領域が、
   ａ) 配列番号１６のＦＲ-Ｈ１
   ｂ) 配列番号１７のＦＲ-Ｈ２
   ｃ) 配列番号２３又はその変異体配列である配列番号１９、２０及び２４のいずれか一つのＦＲ-Ｈ３
   ｄ) 配列番号２５のＦＲ-Ｈ４
   ｅ) 配列番号３１のＦＲ-Ｌ１
   ｆ) 配列番号３６又はその変異体配列である配列番号３３、３４のいずれか一つのＦＲ-Ｌ２
   ｇ) 配列番号４１のＦＲ-Ｌ３、及び
   ｈ) 配列番号４３のＦＲ-Ｌ４
   の配列を含む、ヒト化抗体又はその抗原結合性断片。
2. 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
   前記重鎖可変領域が、
   ａ) 配列番号４９又は５８のアミノ酸配列、又は
   ｂ) 配列番号４９又は５８のアミノ酸配列と８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列
   の群から選択されるいずれか一つの配列を含み
   前記軽鎖可変領域が、
   ｄ) 配列番号７１、７２又は７３のアミノ酸配列、又は
   ｅ) 配列番号７１、７２又は７３のアミノ酸配列と８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列
   の群から選択されるいずれか一つの配列を含み、
   好ましくは、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、それぞれ、
   配列番号４９、７１；配列番号４９、７３；配列番号５８、７２
   の群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗体又はその抗原結合性断片。
3. 多重特異性抗体、好ましくは二重特異性抗体であって、
   請求項１～２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片と、他の抗原及び/又は他の抗原エピトープに対する抗体又は抗原結合性断片とを含み、
   前記他の抗原及び/又は他の抗原エピトープが、例えば、対応する非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞上で過剰発現しているタンパク質；腫瘍抗原、例えば、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＰＤ-Ｌ１、ＳＬＡＭＦ７、Ｃｌａｕｄｉｎ １８.２又はＣＥＡ；ウィルス；細菌；及び/又はエンドトキシンである、
   多重特異性抗体。
4. 抗体であって、
   (ａ) 軽鎖-重鎖対と(ｂ) 融合ペプチドとを含み、前記軽鎖-重鎖対が、腫瘍細胞又は微生物に対して特異性を有し、前記融合ペプチドが、単鎖可変領域断片と単鎖Ｆｃ断片とを含み、免疫細胞に対して特異性を有し、前記単鎖可変領域断片が、請求項１～２のいずれか１項に記載のアミノ酸配列の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗体。
5. 前記Ｆｃ断片が、配列番号１５５-１６１又は１９２のいずれか一つの配列を有するＣＨ２、及び/又は配列番号１６２-１８３のいずれか一つの配列を有するＣＨ３を含み、及び／又は
   前記融合ペプチドが、ＶＨｓ-リンカー１-ＶＬｓ-ヒンジ１-ＣＨ２-ＣＨ３-ｂを含み、前記重鎖が、ＶＨｍ-ＣＨ１-ヒンジ２－ＣＨ２-ＣＨ３-ａを含み、前記軽鎖がＶＬｍ-ＣＬを含む、
   請求項４に記載の抗体。
6. 前記軽鎖-重鎖対が
   ａ) 対応する非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞上で過剰発現しているタンパク質、
   ｂ) 腫瘍抗原、例えば、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＰＤ-Ｌ１、ＳＬＡＭＦ７、Ｃｌａｕｄｉｎ １８.２又はＣＥＡ、
   ｃ) ウィルス、
   ｄ) 細菌、及び/又は
   ｅ) エンドトキシン、
   に特異的に結合する、請求項４～５のいずれか１項に記載の抗体。
7. 前記重鎖、前記融合ペプチドの重鎖及び/又は前記融合ペプチドのＦｃ断片が、野生型抗体と比較して、前記重鎖と前記融合ペプチドとの間に突起-空隙構造ペアリングを形成する置換、例えば表１５の置換を１つ以上含み、
   例えば、一方のＣＨ３ドメインのＴ３６６が、比較的大きなアミノ酸残基、例えばチロシン(Ｙ)又はトリプトファン(Ｗ)に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＹ４０７が、比較的小さなアミノ酸残基、例えばスレオニン (Ｔ)、アラニン(Ａ）又はバリン(Ｖ)に置換され、及び／又は
   前記重鎖及び/又は前記融合ペプチドのＦｃ断片が、１つ以上の置換を含み、
   １）前記置換が、前記重鎖と前記融合ペプチドとの間に塩橋ペアリングを形成する置換であり、例えば、表１６の１つ以上の置換を含み、
   例えば、一方のＣＨ３ドメインが、生理条件下で正電荷を有するアミノ酸残基の置換を１つ以上含み、他方のＣＨ３ドメインが、生理条件下で負電荷を有するアミノ酸残基の置換を１つ以上含み、
   前記正電荷を有するアミノ酸残基が、例えばアルギニン(Ｒ)、ヒスチジン(Ｈ)又はリジン(Ｋ)であり、前記負電荷を有するアミノ酸残基が、例えばアスパラギン酸(Ｄ)又はグルタミン酸(Ｅ)であってもよく、置換されるアミノ酸残基が、例えばＤ３５６、Ｌ３６８、Ｋ３９２、Ｄ３９９及びＫ４０９の一つ以上であり、
   ２）前記置換が、前記重鎖と前記融合ペプチドとの間にジスルフィド結合を形成する置換、例えば、表１７の置換であり、及び/又は、
   ３）前記置換が、Ｆｃとタンパク質Ａへの結合能の有意な低下をもたらした置換であり、例えば、一つのＣＨ３ドメインのＨ４３５及びＹ４３６が、それぞれ、アルギニン及びフェニルアラニンに置換される、
   請求項４～６のいずれか１項に記載の抗体。
8. 前記融合ペプチドのＶＨが、配列番号４９又は５８の配列を含み、
   前記融合ペプチドのＶＬが、配列番号７１、７２又は７３の配列を含み、
   前記融合ペプチドのリンカー１が、配列番号１２０-１３８のいずれか一つの配列を含み、
   前記融合ペプチドのヒンジ１、前記重鎖のヒンジ２が、配列番号１３９-１４７のいずれか一つの配列を含み、
   前記融合ペプチドのＣＨ２、前記重鎖のＣＨ２が、配列番号１５５-１６１又は１９２のいずれか一つの配列を含み、
   前記融合ペプチドのＣＨ３-ｂが、配列番号１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３のいずれか一つの配列を含み、
   前記重鎖のＣＨ３-ａが配列番号１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２のいずれか一つの配列を含み、
   前記重鎖のＶＨｍが、配列番号９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１９３のいずれか一つの配列を含み、
   前記重鎖のＣＨ１が配列番号１５４の配列を含み、
   前記軽鎖のＶＬｍが、配列番号９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１９４のいずれか一つの配列を含み、及び/又は、
   前記軽鎖のＣＬが配列番号１４８-１５３のいずれか一つの配列を含む、請求項５に記載の抗体。
9. 前記融合ペプチドのＶＨ及び前記融合ペプチドのＶＬが、それぞれ以下の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
   ａ) 配列番号４９、７１；配列番号４９、７３；配列番号５８、７２
   ｂ) ａ)の少なくとも一つのアミノ酸配列と、８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び/又は
   前記重鎖のＶＨｍ及び前記軽鎖のＶＬｍが、それぞれ以下の群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗体：
   ｄ) 配列番号９０、９１；配列番号９２、９３；配列番号９４、９５；配列番号９６、９７；配列番号９８、９９；配列番号１００、１０１；配列番号１０２、１０３；配列番号１０４、１０５；配列番号１０６、１０７；配列番号１０８、１０９；配列番号１１０、１１１；配列番号１１２、１１３；配列番号１１４、１１５；配列番号１１６、１１７；配列番号１１８、１１９；配列番号１９３、１９４、又は
   ｅ) ｄ)の少なくとも一つのアミノ酸配列と、８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列。
10. ａ)前記融合ペプチドのＣＨ３-ｂ及び前記重鎖のＣＨ３-ａが、突起-空隙構造を形成する置換対を有し、
    ｂ)前記融合ペプチドのＣＨ３-ｂ及び前記重鎖のＣＨ３-ａが、イオン結合を形成する置換対を有し、
    ｃ)前記融合ペプチドのＣＨ３-ｂ及び前記重鎖のＣＨ３-ａが、ジスルフィド結合を形成する置換対を有し、及び/又は
    ｄ)前記融合ペプチドのＣＨ３-ｂ及び前記重鎖のＣＨ３-ａが、タンパク質Ａへの結合能の低下をもたらした置換を有する、
    請求項５に記載の抗体。
11. Ｙ１５０-Ｆ９-１２、Ｙ１０５、Ｙ１５０-Ｆ８-５、Ｙ１５０-Ｆ８-７、Ｙ１５０-Ｆ８-８、Ｙ１５０-Ｆ８-９、Ｙ１５０-Ｆ８-１０、Ｙ１５０-Ｆ９-７、Ｙ１５０-Ｆ９-１１、ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１５、ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１６、ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１７及びＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１８から選択され、
    ここで、各成分が融合ペプチドＶＨｓ-リンカー１-ＶＬｓ-ヒンジ１-ＣＨ２-ＣＨ３-ｂ、重鎖ＶＨｍ-ＣＨ１-ヒンジ２－ＣＨ２-ＣＨ３-ａ、軽鎖ＶＬｍ-ＣＬの順に従い、
    Ｙ１５０-Ｆ９-１２が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４４、１９２、１６７、９２、１５４、１３９、１９２、１６６、９３、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    Ｙ１０５が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４２、１３９、１６７、１０６、１５４、１３９、１５９、１６６、１０７、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    Ｙ１５０-Ｆ８-５が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４１、１３９、１６７、９０、１５４、１３９、１５７、１６６、９１、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    Ｙ１５０-Ｆ８-７が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４４、１５８、１６７、９０、１５４、１３９、１５８、１６６、９１、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    Ｙ１５０-Ｆ８-８が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４４、１６１、１６７、９０、１５４、１３９、１６１、１６６、９１、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    Ｙ１５０-Ｆ８-９が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４４、１６１、１６７、９６、１５４、１３９、１６１、１６６、９７、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    Ｙ１５０-Ｆ８-１０が、それぞれ配列番号５８、１２９、７２、１４４、１６１、１６７、９６、１５４、１３９、１６１、１６６、９７、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    Ｙ１５０-Ｆ９-７が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４１、１３９、１６７、９２、１５４、１３９、１５７、１６６、９３、１５０、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    Ｙ１５０-Ｆ９-１１が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４４、１６１、１６７、９２、１５４、１３９、１６１、１６６、９３、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１５が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４１、１５９、１６７、１１８、１５４、１３９、１５９、１６６、１１９、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１６が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４１、１５７、１６７、１１８、１５４、１３９、１５７、１６６、１１９、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１７が、それぞれ配列番号４９、１２９、７１、１４１、１６１、１６７、１１８、１５４、１３９、１６１、１６６、１１９、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    ＭＳ-ｈＣＤ３-ＩＣ１８が、それぞれ配列番号５８、１２９、７２、１４１、１６１、１６７、１１８、１５４、１３９、１６１、１６６、１１９、１４８、又は、これらのアミノ酸配列の少なくとも一つと８０%、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項４～１０のいずれか１項に記載の抗体。
12. 請求項１～３及び４～１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片であって、
    約１０^-８ Ｍ以下、例えば約１０^-８ Ｍ、１０^-９ Ｍ、１０^-１０ Ｍ又はそれ以下のＫＤでターゲットに結合し、又は約１００ ｎＭ以下、例えば約１０ ｎＭ、１ ｎＭ、０.９ ｎＭ、０.８ ｎＭ、０.７ ｎＭ、０.６ ｎＭ、０.５ ｎＭ、０.４ ｎＭ、０.３ ｎＭ、０.２ ｎＭ、０.１ ｎＭ又はそれ以下のＥＣ５０でターゲットに結合し、好ましくは、前記抗原結合性断片が、請求項４～１１のいずれか１項に記載の抗体における融合ペプチド又は請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体由来のＦ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、ｓｃＦｖから選択される、抗体又はその抗原結合性断片。
13. 請求項１～３及び４～１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片をコードする、ポリヌクレオチド。
14. 請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
15. 請求項１３に記載のポリヌクレオチド又は請求項１４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
16. 請求項１～３及び４～１２のいずれか１項に記載の抗体の調製方法であって、
    請求項１３に記載のポリヌクレオチド又は請求項１４に記載の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、前記抗体を調製することを含む、方法。
17. 抗体コンジュゲートであって、
    請求項１～３及び４～１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片と、それらにコンジュゲートするコンジュゲート部とを含み、
    好ましくは、前記コンジュゲート部が、精製タグ（例えば、Ｈｉｓタグ）、細胞傷害性薬剤、検出可能な標識、放射性同位元素、発光物質、着色物質、酵素又はポリエチレングリコールから選択される、抗体コンジュゲート。
18. 請求項１～３及び４～１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片を含む、融合タンパク質。
19. 請求項１～３及び４～１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片、請求項１７に記載の抗体コンジュゲート、又は請求項１８に記載の融合タンパク質を含み、
    場合により、更に薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤を含み、
    好ましくは、胃腸（ＧＩ）管への経口投与に好適な剤形であり、好ましくは、前記剤形が錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、エマルション剤、マイクロエマルジョン、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤及びエリキシル剤から選択される剤形であるか；又は皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射又は病巣内注射に好適な剤形である、
    医薬組成物。
20. 請求項１～３及び４～１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片、請求項１７に記載の抗体コンジュゲート、又は請求項１８に記載の融合タンパク質を含むキットであって、好ましくは、前記キットが、請求項１～３及び４～１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片、請求項１７に記載の抗体コンジュゲート、又は請求項１８に記載の融合タンパク質を特異的に認識する第２の抗体を更に含み；場合により、前記第２の抗体が、放射性同位元素、発光物質、着色物質、又は酵素などの検出可能な標識を更に含む、キット。
21. 疾患の治療のための請求項１～３及び４～１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片であって、
    好ましくは、前記疾患が、癌又は腫瘍、例えば、多発性骨髄腫、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌などの肺癌を含む、抗体又はその抗原結合性断片。