JP7011574B2 - Ｆｌｔ３及びｃｄ３に対する抗体構築物 - Google Patents

Ｆｌｔ３及びｃｄ３に対する抗体構築物 Download PDF

Info

Publication number
JP7011574B2
JP7011574B2 JP2018504926A JP2018504926A JP7011574B2 JP 7011574 B2 JP7011574 B2 JP 7011574B2 JP 2018504926 A JP2018504926 A JP 2018504926A JP 2018504926 A JP2018504926 A JP 2018504926A JP 7011574 B2 JP7011574 B2 JP 7011574B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
nos
amino acid
acid sequence
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2018504926A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018527909A (ja
Inventor
トビアス ラウム
ヨッヒェン ペンジアレク
クラウディア ブルーメル
フランツィスカ ボット
クリストフ ダールホフ
パトリック ホフマン
エリーザベト ナールヴォルト
マルクス ミュエンツ
ヨハネス ブロジー
ピーター クファー
マティアス フリードリヒ
ベンノ ラテル
パメラ ボグナー
アンドレアス ウォルフ
コーネリアス ポンペ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amgen Research Munich GmbH
Original Assignee
Amgen Research Munich GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Research Munich GmbH filed Critical Amgen Research Munich GmbH
Publication of JP2018527909A publication Critical patent/JP2018527909A/ja
Priority to JP2022004318A priority Critical patent/JP2022062061A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7011574B2 publication Critical patent/JP7011574B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Description

本発明は、標的細胞の表面に存在するヒトＦＬＴ３に結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインと、を含む二重特異性抗体構築物に関する。さらに、本発明は、抗体構築物をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含むベクター、及び当該ポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換されたかまたはそれを遺伝子導入された宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、本発明の抗体構築物の産生のための方法、当該抗体構築物の医学的使用、及び当該抗体構築物を含むキットを提供する。
導入
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、異種性の血液学的悪性腫瘍であり、これは、成人で診断される最も一般的な型の急性白血病である。ＡＭＬは、すべての白血病のおよそ３分の１を占め、２０１３年に報告された米国単独の新規症例数は１４，５００と推計されており、その全生存率は思わしくない。過去３０年にわたってＡＭＬ患者の治療標準に改善はほとんど見られなかった。しかしながら、分子細胞生物学における最近の進歩によって、正常状況及び疾患状況の両方において、ヒトの造血に対する我々の理解は一変してきた。疾患の病態形成に関与する重要プレーヤーがいくつか同定されたことで、それらを実用的な標的として調べることができるようになった。ＡＭＬの約３０％に変異が生じ、最も一般的であるそのような活性化「ドライバー」遺伝子の１つはＦＬＴ３である。
Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）は、胎児肝臓キナーゼ２（ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｋｉｎａｓｅ ２）（ＦＬＫ－２）、ヒト幹細胞キナーゼ１（ＳＣＫ－１）、または表面抗原分類（ＣＤ１３５）としても知られ、１９９０年代に２つの独立したグループによってクローニングされた造血性受容体型チロシンキナーゼである。ＦＬＴ３遺伝子は、ヒトの染色体の１３ｑ１２に位置し、クラスＩＩＩファミリーの他のメンバーと相同性を共有するクラスＩＩＩの受容体型チロシンキナーゼタンパク質をコードする。こうした他のメンバーには、幹細胞因子受容体（ｃ－ＫＩＴ）、マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＦＭＳ）、及び血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）が含まれる。
ＦＬＴ３リガンドと結合すると、ＦＬＴ３受容体はホモ二量体化し、それによって膜近傍ドメインにおける特定のチロシン残基の自己リン酸、ならびにＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路、ＭＡＰＫ経路、及びＳＴＡＴ５経路を介した下流の活性化が可能になる。したがって、ＦＬＴ３は、正常な造血細胞の増殖、生存、及び分化の制御において極めて重要な役割を担っている。
ヒトＦＬＴ３は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－造血幹細胞（ＨＳＣ）、ならびに樹状前駆細胞のサブセットにおいて発現している。ＦＬＴ３の発現は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ１２３低骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１２３低顆粒球単球系前駆細胞（ＧＭＰ）、及びＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０＋ＣＤ１９－リンパ球系共通前駆細胞（Ｃｏｍｍｏｎ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）（ＣＬＰ）のような多能性前駆細胞においても検出することができる。興味深いことに、ＦＬＴ３の発現は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ１２３－巨核球赤芽球系前駆細胞（Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）（ＭＥＰ）にはほとんど存在しない。したがって、ＦＬＴ３の発現は、主に初期の骨髄系前駆細胞及びリンパ球系前駆細胞に限定され、成熟が進んだ単球系細胞での発現は、ある程度のものである。ＦＬＴ３のこの限定発現パターンは、ＦＬＴ３リガンドのそれとは著しく対照的であり、ＦＬＴ３リガンドは、ほとんどの造血組織、ならびに前立腺、腎臓、肺、結腸、及び心臓において発現している。このように発現パターンが異なる結果、ＦＬＴ３の発現は、ＦＬＴ３シグナル伝達経路の組織特異性の決定において律速段階となっている。
ＡＭＬにおける最も一般的なＦＬＴ３変異は、細胞遺伝学的に正常なＡＭＬを有する患者の２０～３８％に見られるＦＬＴ３遺伝子内縦列重複（ＦＬＴ３－ＩＴＤ）である。ＦＬＴ３－ＩＴＤは、膜近傍ドメインをコードする配列の一部が重複化し、ヘッドトゥーテールの配向で挿入されると形成される。ＦＬＴ３変異は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、及び多発性骨髄腫を有する患者では同定されておらず、このことは、ＡＭＬには強い疾患特異性が存在することを示唆している。変異ＦＬＴ３の活性化は、一般に、すべてのＦＡＢサブタイプにまたがって観測されるが、ＦＡＢ Ｍ５（単球性白血病）を有するＡＭＬ患者では顕著に増加する一方で、ＦＡＢサブタイプであるＭ２及びＭ６（顆粒球性白血病または赤血球性白血病）がＦＬＴ３の活性化と関連する頻度はかなり低く、ＦＬＴ３の正常発現パターンの範囲内である。
ＦＬＴ３チロシンキナーゼドメイン（ＦＬＴ３ ＴＫＤ）に単一アミノ酸変異を有するＡＭＬ患者の割合は少なく（５～７％）、こうした単一アミノ酸変異は、最も一般的にはＤ８３５に生じるか、または場合によっては、Ｔ８４２またはＩ８３６に生じるものであり、一方、ＦＬＴ３膜近傍ドメインにおける変異を有する患者はさらに少なく（約１％）、こうした変異には、残基５７９、残基５９０、残基５９１、及び残基５９４が関与する。ＦＬＴ３－ＩＴＤ変異を有するＡＭＬ患者は、早期再発及び生存不良によって特徴付けられる高悪性度の疾患形態を有する一方で、ＦＬＴ３－ＴＫＤ変異の存在によって全生存率及び無再発生存率が顕著に影響を受けることはない。さらに、ＦＬＴ３－ＩＴＤ変異を有するＡＭＬ患者が、野生型のＴＥＴ２またはＤＮＭＴ３Ａを有すると場合と比較して、ＦＬＴ３－ＩＴＤ変異を有するＡＭＬ患者が、ＴＥＴ２またはＤＮＭＴ３Ａに同時に変異を有していると、全危険プロファイルは好ましくないものとなっており、このことは、ＡＭＬが臨床的及び生物学的に不均一性を有していることを強調するものである。
ＦＬＴ３－ＩＴＤ変異及びＦＬＴ３ ＴＫＤ変異の両方が、ＦＬＴ３のリガンド非依存性の活性化を誘導し、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の下流活性化を引き起こす。しかしながら、いずれの変異と関連する下流シグナル伝達経路も、ＦＬＴ３－ＩＴＤによってＳＴＡＴ５が優先的に活性化し、それによって増殖潜在力の増加及びＤＮＡ修復経路の異常制御につながるという点において根本的に異なる。
ＦＬＴ３の変異状況とは無関係に、３分の２を超えるＡＭＬ患者においてＦＬＴ３のリン酸化が明確に認められ、ＡＭＬ芽球の８０％超、及びすべてのＡＭＬ患者の約９０％においてＦＬＴ３が発現しており、このことによって、ＦＬＴ３は大きな標本サイズにおいて疾患病態形成と関連する魅力的な治療標的となっている。
いくつかの小分子阻害剤が、ＦＬＴ３変異を有するＡＭＬ患者にとっての魅力的な治療選択肢として登場してきた。第１世代のＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、選択性の欠如、効力の欠如、及び好ましくない薬物動態特性によって特徴付けられるものであった。この問題に対処するために、さらに新しく、選択性が向上した薬剤が開発されたが、その効力は二次性の抵抗性の出現によって限定されている。
ＦＬＴ３の初期のＴＫＩのいくつかには、数ある中でも特に、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２）、レスタウルチニブ（ＣＥＰ－７０１）、スニチニブ（ＳＵＩ１２４８）、及びソラフィニブ（ｓｏｒａｆｉｎｉｂ）（ＢＡＹ４３－９００６）が含まれる。再発または難治性のＡＭＬを有する患者では、こうした多標的キナーゼ薬剤の第Ｉ相及び第ＩＩ相における奏効率は限定的であり、このことは、こうした薬剤が用量制限毒性を生じさせずに有効なＦＬＴ３阻害を達成する能力を有していないことに起因すると考えられる。キザルチニブ（ＡＣ２２０）は、ＦＬＴ３の第２世代のＴＫＩとして開発され、野生型ＦＬＴ３及びＦＬＴ３－ＩＴＤに高い選択性を有し、移植前後の状況にある若年患者コホートでは特に有益であることが示された。しかしながら、キザルチニブを投与された再発患者においてＦＬＴ３の二次性変異が同定されたことは、ＡＭＬ患者にとってより良い治療方針を開発する必要性を際立たせており、一方で、ＦＬＴ３の治療標的としての妥当性を強調するものである。
いくつかの標的指向薬剤が、デノボ疾患、再発／難治性疾患または二次性疾患のいずれかを有するＡＭＬ患者において試験された。がん抑制遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングは、ＡＭＬ疾患の病態形成において重要な役割を担っており、アザシタジン（ａｚａｃｉｔａｄｉｎｅ）及びデシタビンのようなＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤は、何らかの臨床的な成功を収めてきた。さらに、ヒストンの翻訳後修飾（例えば、ＥＺＨ２及びＡＳＸＬ１の変異）またはＤＮＡのメチル化（例えば、ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、ＩＤＨ１／２）に影響する変異がＡＭＬ患者のサブセットにおいて最近同定されたことは、ＥＺＨ２阻害剤、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤、ＩＤＨ１／２阻害剤、ならびにＨＤＡＣ阻害剤及びプロテアソーム阻害剤を含む、さまざまな治療選択肢の開発につながるものであった。しかしながら、ＡＭＬ細胞における多くのこうした化合物の前臨床試験は、こうした阻害剤がＡＭＬ芽球に直接的な細胞毒性を生じさせるのではなく、造血分化の形質及び遺伝子発現特性を変化させ得るものであることを示唆している。したがって、ＡＭＬに対処し、ＡＭＬ芽球細胞を標的とする溶解を引き起こすための新規の標的／様式を同定することが医療的に強く求められているが、未だ対処されないままである。ＡＭＬの他の治療候補には、ＡＭＧ９００を含むオーロラキナーゼ阻害剤、及び細胞周期進行において重要な役割を担うポロ様キナーゼに対する阻害剤が含まれる。
ＡＭＬ患者のための治療標準は化学療法に留まっており、可能なときは幹細胞移植が実施される。しかしながら、治療される患者の大多数において再発性／難治性の症例が発生していることは、治療様式を追加するに値することである。白血病特異的抗原のいくつかが、免疫媒介性の移植片対白血病効果の明瞭な理解を伴って同定及び説明されたことによって、血液学的悪性腫瘍に対処するための免疫調節方針の開発への道が開かれてきており、これについては、いくつかの文献において概説されている。
ゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）は、ＣＤ３３を標的とする抗体－薬物複合体であり、ＣＤ３３は、骨髄系細胞の遍在性表面マーカーである。ＧＯは、無作為化試験でＧＯ治療での転帰に改善が見られず、その後市場から引き揚げられた。しかしながら、ＡＭＬにおけるＧＯの再評価が求められており、完全様式においてＧＯの効力及び毒性を評価ためにいくつかの試験が開始されている。ＡＭＬに対する他の生物学的薬剤には、ヒト化抗ＣＤ３３モノクローナル抗体であるリンツズマブ（ＳＧＮ－３３）が含まれ、この抗体は、非複合化形態であるか、または放射性ビスマス及びＳＬ－４０１と複合化される。ＳＬ－４０１は、ジフテリア毒素負荷と結合したヒトＩＬ－３から構成されており、ＡＭＬ芽球の大多数で過剰発現するＩＬ－３受容体を標的としている。腫瘍関連抗原と細胞溶解性エフェクターＴ細胞との両方を標的とする次世代のモノクローナル抗体には、ＡＭＧ３３０（ＣＤ３３を標的とする二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）またはＢｉＴＥ分子）、ならびにＣＤ１２３及びＣＤ３に結合する二重親和性再標的指向分子であるＭＧＤ００６が含まれる。
難治性ＣＬＬ及び急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）においてキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞が最近成功を収めたことによって、ＣＤ１２３ ＣＡＲ－Ｔ治療及びＣＤ３３ ＣＡＲ－Ｔ治療を含む、骨髄特異的なＣＡＲ－Ｔ細胞の開発へと続く道が開かれてきた。転帰を改善するために樹状細胞ワクチンの生成ならびにチェックポイント封鎖阻害剤（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）との組み合わせにもいくつかの労力が注がれてきた。
ＦＬＴ３に対する治療抗体もこれまでに調製されてきた。抗体治療は、より効果的であり、二次性の抵抗機構が生じる可能性が低いと想定される。この理由は、抗体がＦＬＴ３の細胞外ドメインを標的にしており、このドメインは、細胞内キナーゼドメインと比較して変異する傾向が低いためである。Ｉｍｃｌｏｎｅの抗体であるＩＭＣ－ＥＢ１０は、再発ＡＭＬ患者において第Ｉ相試験で評価されたが、効力不足により試験は打ち切られた（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ００８８７９２６）。したがって、ＡＭＬの治療のための二重特異性抗体を含む、第２世代のモノクローナル抗体を評価することが引き続き強く求められている。
ＦＬＴ３の発現と関連する血液学的疾患の治療のための利用可能な追加選択肢が依然として求められていることから、本明細書では、この問題の解決手段及び解決方法が、腫瘍標的細胞の表面に存在するＦＬＴ３を標的とする結合ドメインと、Ｔ細胞の表面に存在するＣＤ３を標的とする第２の結合ドメインと、を有する二重特異性抗体構築物の形態において提供される。
したがって、第１の態様では、本発明は、標的細胞の表面に存在するヒトＦＬＴ３に結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインと、を含む二重特異性抗体構築物を提供し、第１の結合ドメインは、配列番号８０１～８０４に示されるＦＬＴ３の細胞外領域内に含まれるＦＬＴ３のエピトープに結合する。
[本発明1001]
標的細胞の表面に存在するヒトＦＬＴ3及びマカクＦＬＴ3に結合する第1の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ3に結合する第2の結合ドメインと、を含む二重特異性抗体構築物であって、前記第1の結合ドメインが、配列番号801～804に示されるＦＬＴ3の細胞外領域内に含まれるＦＬＴ3のエピトープに結合する、前記二重特異性抗体構築物。
[本発明1002]
前記第1の結合ドメインが、配列番号814（クラスター1）または配列番号816（クラスター3）に示される配列を有するヒトＦＬＴ3の領域内に含まれるＦＬＴ3のエピトープに結合する、本発明1001の抗体構築物。
[本発明1003]
（ｓｃＦｖ） 2 、ｓｃＦｖ－単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ、及びそれらの形式のオリゴマーからなる群より選択される形式である、先行本発明のいずれかの抗体構築物。
[本発明1004]
前記第1の結合ドメインが、配列番号151～156、配列番号161～166、配列番号171～176、配列番号181～186、配列番号191～196、配列番号201～206、配列番号211～216、配列番号221～226、配列番号231～236、配列番号241～246、配列番号251～256、配列番号261～266、配列番号271～276、配列番号281～286、配列番号291～296、配列番号301～306、配列番号311～316、配列番号321～326、配列番号331～336、配列番号341～346、配列番号351～356、配列番号361～366、配列番号371～376、配列番号381～386、配列番号391～396、配列番号401～406、配列番号411～416、配列番号421～426、配列番号431～436、配列番号441～446、配列番号451～456、配列番号461～466、配列番号471～476、配列番号481～486、配列番号491～496、配列番号501～506、配列番号511～516、配列番号521～526、配列番号531～536、配列番号541～546、配列番号551～556、配列番号561～566、配列番号571～576、配列番号581～586、配列番号591～596、配列番号601～606、配列番号611～616、配列番号621～626、配列番号631～636、配列番号641～646、配列番号651～656、配列番号661～666、配列番号671～676、配列番号681～686、配列番号691～696、配列番号701～706、配列番号711～716、配列番号721～726、配列番号731～736、配列番号741～746、配列番号751～756、配列番号761～766、配列番号771～776、配列番号781～786、配列番号791～796からなる群より選択されるＣＤＲ－Ｈ1、ＣＤＲ－Ｈ2、及びＣＤＲ－Ｈ3を含むＶＨ領域とＣＤＲ－Ｌ1、ＣＤＲ－Ｌ2、及びＣＤＲ－Ｌ3を含むＶＬ領域とを含む、本発明1002または本発明1003の抗体構築物。
[本発明1005]
前記第1の結合ドメインが、配列番号157、配列番号167、配列番号177、配列番号187、配列番号197、配列番号207、配列番号217、配列番号227、配列番号237、配列番号247、配列番号257、配列番号267、配列番号277、配列番号287、配列番号297、配列番号307、配列番号317、配列番号327、配列番号337、配列番号347、配列番号357、配列番号367、配列番号377、配列番号387、配列番号397、配列番号407、配列番号417、配列番号427、配列番号437、配列番号447、配列番号457、配列番号467、配列番号477、配列番号487、配列番号497、配列番号507、配列番号517、配列番号527、配列番号537、配列番号547、配列番号557、配列番号567、配列番号577、配列番号587、配列番号597、配列番号607、配列番号617、配列番号627、配列番号637、配列番号647、配列番号657、配列番号667、配列番号677、配列番号687、配列番号697、配列番号707、配列番号717、配列番号727、配列番号737、配列番号747、配列番号757、配列番号767、配列番号777、配列番号787、及び配列番号797に示されるものからなる群より選択されるＶＨ領域を含む、本発明1004の抗体構築物。
[本発明1006]
前記第1の結合ドメインが、配列番号158、配列番号168、配列番号178、配列番号188、配列番号198、配列番号208、配列番号218、配列番号228、配列番号238、配列番号248、配列番号258、配列番号268、配列番号278、配列番号288、配列番号298、配列番号308、配列番号318、配列番号328、配列番号338、配列番号348、配列番号358、配列番号368、配列番号378、配列番号388、配列番号398、配列番号408、配列番号418、配列番号428、配列番号438、配列番号448、配列番号458、配列番号468、配列番号478、配列番号488、配列番号498、配列番号508、配列番号518、配列番号528、配列番号538、配列番号548、配列番号558、配列番号568、配列番号578、配列番号588、配列番号598、配列番号608、配列番号618、配列番号628、配列番号638、配列番号648、配列番号658、配列番号668、配列番号678、配列番号688、配列番号698、配列番号708、配列番号718、配列番号728、配列番号738、配列番号748、配列番号758、配列番号768、配列番号778、配列番号788、及び配列番号798に示されるものからなる群より選択されるＶＬ領域を含む、本発明1004または本発明1005のいずれかの抗体構築物。
[本発明1007]
前記第1の結合ドメインが、配列番号157＋158、配列番号167＋168、配列番号177＋178、配列番号187＋188、配列番号197＋198、配列番号207＋208、配列番号217＋218、配列番号227＋228、配列番号237＋238、配列番号247＋248、配列番号257＋258、配列番号267＋268、配列番号277＋278、配列番号287＋288、配列番号297＋298、配列番号307＋308、配列番号317＋318、配列番号327＋328、配列番号337＋338、配列番号347＋348、配列番号357＋358、配列番号367＋368、配列番号377＋378、配列番号387＋388、配列番号397＋398、配列番号407＋408、配列番号417＋418、配列番号427＋428、配列番号437＋438、配列番号447＋448、配列番号457＋458、配列番号467＋468、配列番号477＋478、配列番号487＋488、配列番号497＋498、配列番号507＋508、配列番号517＋518、配列番号527＋528、配列番号537＋538、配列番号547＋548、配列番号557＋558、配列番号567＋568、配列番号577＋578、配列番号587＋588、配列番号597＋598、配列番号607＋608、配列番号617＋618、配列番号627＋628、配列番号637＋638、配列番号647＋648、配列番号657＋658、配列番号667＋668、配列番号677＋678、配列番号687＋688、配列番号697＋698、配列番号707＋708、配列番号717＋718、配列番号727＋728、配列番号737＋738、配列番号747＋748、配列番号757＋758、配列番号767＋768、配列番号777＋778、配列番号787＋788、及び配列番号797＋798に示されるＶＨ領域とＶＬ領域との対からなる群より選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、本発明1004～1006のいずれかの抗体構築物。
[本発明1008]
前記第1の結合ドメインが、配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229、配列番号239、配列番号249、及び配列番号259、配列番号269、配列番号279、及び配列番号289、配列番号299、配列番号309、配列番号319、及び配列番号329、配列番号339、配列番号349、及び配列番号359、配列番号369、配列番号379、及び配列番号389、配列番号399、配列番号409、配列番号419、及び配列番号429、配列番号439、配列番号449、及び配列番号459、配列番号469、配列番号479、及び配列番号489、配列番号499、配列番号509、配列番号519、及び配列番号529、配列番号539、配列番号549、及び配列番号559、配列番号569、配列番号579、及び配列番号589、配列番号599、配列番号609、配列番号619、及び配列番号629、配列番号639、配列番号649、及び配列番号659、配列番号669、配列番号679、及び配列番号689、配列番号699、配列番号709、配列番号719、及び配列番号729、配列番号739、配列番号749、及び配列番号759、配列番号769、配列番号779、及び配列番号789、及び配列番号799に示されるものからなる群より選択されるポリペプチドを含む、本発明1004～1007のいずれかの抗体構築物。
[本発明1009]
前記第2の結合ドメインが、ヒトＣＤ3イプシロン、及びコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）、またはコモンリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＣＤ3イプシロンに結合する、本発明1001～1008のいずれかの抗体構築物。
[本発明1010]
（ａ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229、配列番号239、配列番号249、及び配列番号259、配列番号269、配列番号279、及び配列番号289、配列番号299、配列番号309、配列番号319、及び配列番号329、配列番号339、配列番号349、及び配列番号359、配列番号369、配列番号379、及び配列番号389、配列番号399、配列番号409、配列番号419、及び配列番号429、配列番号439、配列番号449、及び配列番号459、配列番号469、配列番号479、及び配列番号489、配列番号499、配列番号509、配列番号519、及び配列番号529、配列番号539、配列番号549、及び配列番号559、配列番号569、配列番号579、及び配列番号589、配列番号599、配列番号609、配列番号619、及び配列番号629、配列番号639、配列番号649、及び配列番号659、配列番号669、配列番号679、及び配列番号689、配列番号699、配列番号709、配列番号719、及び配列番号729、配列番号739、配列番号749、及び配列番号759、配列番号769、配列番号779、及び配列番号789、及び配列番号799からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号1～9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・任意選択で、配列番号10に示されるものなどのＨｉｓ－タグ、
（ｂ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229、配列番号239、配列番号249、及び配列番号259、配列番号269、配列番号279、及び配列番号289、配列番号299、配列番号309、配列番号319、及び配列番号329、配列番号339、配列番号349、及び配列番号359、配列番号369、配列番号379、及び配列番号389、配列番号399、配列番号409、配列番号419、及び配列番号429、配列番号439、配列番号449、及び配列番号459、配列番号469、配列番号479、及び配列番号489、配列番号499、配列番号509、配列番号519、及び配列番号529、配列番号539、配列番号549、及び配列番号559、配列番号569、配列番号579、及び配列番号589、配列番号599、配列番号609、配列番号619、及び配列番号629、配列番号639、配列番号649、及び配列番号659、配列番号669、配列番号679、及び配列番号689、配列番号699、配列番号709、配列番号719、及び配列番号729、配列番号739、配列番号749、及び配列番号759、配列番号769、配列番号779、及び配列番号789、及び配列番号799からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号1～9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・任意選択で、配列番号1～9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号104～134からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・任意選択で、配列番号10に示されるものなどのＨｉｓ－タグ、
（ｃ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・Ｘ 1 がＹまたはＨであるアミノ酸配列
Figure 0007011574000001
を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229、配列番号239、配列番号249、及び配列番号259、配列番号269、配列番号279、及び配列番号289、配列番号299、配列番号309、配列番号319、及び配列番号329、配列番号339、配列番号349、及び配列番号359、配列番号369、配列番号379、及び配列番号389、配列番号399、配列番号409、配列番号419、及び配列番号429、配列番号439、配列番号449、及び配列番号459、配列番号469、配列番号479、及び配列番号489、配列番号499、配列番号509、配列番号519、及び配列番号529、配列番号539、配列番号549、及び配列番号559、配列番号569、配列番号579、及び配列番号589、配列番号599、配列番号609、配列番号619、及び配列番号629、配列番号639、配列番号649、及び配列番号659、配列番号669、配列番号679、及び配列番号689、配列番号699、配列番号709、配列番号719、及び配列番号729、配列番号739、配列番号749、及び配列番号759、配列番号769、配列番号779、及び配列番号789、及び配列番号799からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号1～9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・アミノ酸配列
Figure 0007011574000002
を有するポリペプチド；ならびに
・任意選択で、配列番号10に示されるものなどのＨｉｓ－タグ、
（ｄ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号17、配列番号26、配列番号35、配列番号44、配列番号53、配列番号62、配列番号71、配列番号80、配列番号89、配列番号98、及び配列番号101からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号158、配列番号168、配列番号178、配列番号188、配列番号198、配列番号208、配列番号218、配列番号228、配列番号238、配列番号248、配列番号258、配列番号268、配列番号278、配列番号288、配列番号298、配列番号308、配列番号318、配列番号328、配列番号338、配列番号348、配列番号358、配列番号368、配列番号378、配列番号388、配列番号398、配列番号408、配列番号418、配列番号428、配列番号438、配列番号448、配列番号458、配列番号468、配列番号478、配列番号488、配列番号498、配列番号508、配列番号518、配列番号528、配列番号538、配列番号548、配列番号558、配列番号568、配列番号578、配列番号588、配列番号598、配列番号608、配列番号618、配列番号628、配列番号638、配列番号648、配列番号658、配列番号668、配列番号678、配列番号688、配列番号698、配列番号708、配列番号718、配列番号728、配列番号738、配列番号748、配列番号758、配列番号768、配列番号778、配列番号788、及び配列番号798からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつＣ末端にセリン残基を有するポリペプチド；
・配列番号140に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号157、配列番号167、配列番号177、配列番号187、配列番号197、配列番号207、配列番号217、配列番号227、配列番号237、配列番号247、配列番号257、配列番号267、配列番号277、配列番号287、配列番号297、配列番号307、配列番号317、配列番号327、配列番号337、配列番号347、配列番号357、配列番号367、配列番号377、配列番号387、配列番号397、配列番号407、配列番号417、配列番号427、配列番号437、配列番号447、配列番号457、配列番号467、配列番号477、配列番号487、配列番号497、配列番号507、配列番号517、配列番号527、配列番号537、配列番号547、配列番号557、配列番号567、配列番号577、配列番号587、配列番号597、配列番号607、配列番号617、配列番号627、配列番号637、配列番号647、配列番号657、配列番号667、配列番号677、配列番号687、配列番号697、配列番号707、配列番号717、配列番号727、配列番号737、配列番号747、配列番号757、配列番号767、配列番号777、配列番号787、及び配列番号797からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号18、配列番号27、配列番号36、配列番号45、配列番号54、配列番号63、配列番号72、配列番号81、配列番号90、配列番号99、及び配列番号102からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつＣ末端にセリン残基を有するポリペプチド；
・配列番号141に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｅ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号17、配列番号26、配列番号35、配列番号44、配列番号53、配列番号62、配列番号71、配列番号80、配列番号89、配列番号98、及び配列番号101からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号158、配列番号168、配列番号178、配列番号188、配列番号198、配列番号208、配列番号218、配列番号228、配列番号238、配列番号248、配列番号258、配列番号268、配列番号278、配列番号288、配列番号298、配列番号308、配列番号318、配列番号328、配列番号338、配列番号348、配列番号358、配列番号368、配列番号378、配列番号388、配列番号398、配列番号408、配列番号418、配列番号428、配列番号438、配列番号448、配列番号458、配列番号468、配列番号478、配列番号488、配列番号498、配列番号508、配列番号518、配列番号528、配列番号538、配列番号548、配列番号558、配列番号568、配列番号578、配列番号588、配列番号598、配列番号608、配列番号618、配列番号628、配列番号638、配列番号648、配列番号658、配列番号668、配列番号678、配列番号688、配列番号698、配列番号708、配列番号718、配列番号728、配列番号738、配列番号748、配列番号758、配列番号768、配列番号778、配列番号788、及び配列番号798からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号142に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号157、配列番号167、配列番号177、配列番号187、配列番号197、配列番号207、配列番号217、配列番号227、配列番号237、配列番号247、配列番号257、配列番号267、配列番号277、配列番号287、配列番号297、配列番号307、配列番号317、配列番号327、配列番号337、配列番号347、配列番号357、配列番号367、配列番号377、配列番号387、配列番号397、配列番号407、配列番号417、配列番号427、配列番号437、配列番号447、配列番号457、配列番号467、配列番号477、配列番号487、配列番号497、配列番号507、配列番号517、配列番号527、配列番号537、配列番号547、配列番号557、配列番号567、配列番号577、配列番号587、配列番号597、配列番号607、配列番号617、配列番号627、配列番号637、配列番号647、配列番号657、配列番号667、配列番号677、配列番号687、配列番号697、配列番号707、配列番号717、配列番号727、配列番号737、配列番号747、配列番号757、配列番号767、配列番号777、配列番号787、及び配列番号797からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号18、配列番号27、配列番号36、配列番号45、配列番号54、配列番号63、配列番号72、配列番号81、配列番号90、配列番号99、及び配列番号102からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつＣ末端にセリン残基を有するポリペプチド；
・配列番号143に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｆ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229、配列番号239、配列番号249、及び配列番号259、配列番号269、配列番号279、及び配列番号289、配列番号299、配列番号309、配列番号319、及び配列番号329、配列番号339、配列番号349、及び配列番号359、配列番号369、配列番号379、及び配列番号389、配列番号399、配列番号409、配列番号419、及び配列番号429、配列番号439、配列番号449、及び配列番号459、配列番号469、配列番号479、及び配列番号489、配列番号499、配列番号509、配列番号519、及び配列番号529、配列番号539、配列番号549、及び配列番号559、配列番号569、配列番号579、及び配列番号589、配列番号599、配列番号609、配列番号619、及び配列番号629、配列番号639、配列番号649、及び配列番号659、配列番号669、配列番号679、及び配列番号689、配列番号699、配列番号709、配列番号719、及び配列番号729、配列番号739、配列番号749、及び配列番号759、配列番号769、配列番号779、及び配列番号789、及び配列番号799からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号1～9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号144に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列番号145に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｇ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229、配列番号239、配列番号249、及び配列番号259、配列番号269、配列番号279、及び配列番号289、配列番号299、配列番号309、配列番号319、及び配列番号329、配列番号339、配列番号349、及び配列番号359、配列番号369、配列番号379、及び配列番号389、配列番号399、配列番号409、配列番号419、及び配列番号429、配列番号439、配列番号449、及び配列番号459、配列番号469、配列番号479、及び配列番号489、配列番号499、配列番号509、配列番号519、及び配列番号529、配列番号539、配列番号549、及び配列番号559、配列番号569、配列番号579、及び配列番号589、配列番号599、配列番号609、配列番号619、及び配列番号629、配列番号639、配列番号649、及び配列番号659、配列番号669、配列番号679、及び配列番号689、配列番号699、配列番号709、配列番号719、及び配列番号729、配列番号739、配列番号749、及び配列番号759、配列番号769、配列番号779、及び配列番号789、及び配列番号799からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号146に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号147に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｈ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229、配列番号239、配列番号249、及び配列番号259、配列番号269、配列番号279、及び配列番号289、配列番号299、配列番号309、配列番号319、及び配列番号329、配列番号339、配列番号349、及び配列番号359、配列番号369、配列番号379、及び配列番号389、配列番号399、配列番号409、配列番号419、及び配列番号429、配列番号439、配列番号449、及び配列番号459、配列番号469、配列番号479、及び配列番号489、配列番号499、配列番号509、配列番号519、及び配列番号529、配列番号539、配列番号549、及び配列番号559、配列番号569、配列番号579、及び配列番号589、配列番号599、配列番号609、配列番号619、及び配列番号629、配列番号639、配列番号649、及び配列番号659、配列番号669、配列番号679、及び配列番号689、配列番号699、配列番号709、配列番号719、及び配列番号729、配列番号739、配列番号749、及び配列番号759、配列番号769、配列番号779、及び配列番号789、及び配列番号799からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号148に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号149に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
（ｉ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229、配列番号239、配列番号249、及び配列番号259、配列番号269、配列番号279、及び配列番号289、配列番号299、配列番号309、配列番号319、及び配列番号329、配列番号339、配列番号349、及び配列番号359、配列番号369、配列番号379、及び配列番号389、配列番号399、配列番号409、配列番号419、及び配列番号429、配列番号439、配列番号449、及び配列番号459、配列番号469、配列番号479、及び配列番号489、配列番号499、配列番号509、配列番号519、及び配列番号529、配列番号539、配列番号549、及び配列番号559、配列番号569、配列番号579、及び配列番号589、配列番号599、配列番号609、配列番号619、及び配列番号629、配列番号639、配列番号649、及び配列番号659、配列番号669、配列番号679、及び配列番号689、配列番号699、配列番号709、配列番号719、及び配列番号729、配列番号739、配列番号749、及び配列番号759、配列番号769、配列番号779、及び配列番号789、ならびに配列番号799からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号1～9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号150に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｊ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号159、配列番号169、配列番号179、配列番号189、配列番号199、配列番号209、配列番号219、及び配列番号229、配列番号239、配列番号249、及び配列番号259、配列番号269、配列番号279、及び配列番号289、配列番号299、配列番号309、配列番号319、及び配列番号329、配列番号339、配列番号349、及び配列番号359、配列番号369、配列番号379、及び配列番号389、配列番号399、配列番号409、配列番号419、及び配列番号429、配列番号439、配列番号449、及び配列番号459、配列番号469、配列番号479、及び配列番号489、配列番号499、配列番号509、配列番号519、及び配列番号529、配列番号539、配列番号549、及び配列番号559、配列番号569、配列番号579、及び配列番号589、配列番号599、配列番号609、配列番号619、及び配列番号629、配列番号639、配列番号649、及び配列番号659、配列番号669、配列番号679、及び配列番号689、配列番号699、配列番号709、配列番号719、及び配列番号729、配列番号739、配列番号749、及び配列番号759、配列番号769、配列番号779、及び配列番号789、及び配列番号799からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号1～9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
・配列番号19、配列番号28、配列番号37、配列番号46、配列番号55、配列番号64、配列番号73、配列番号82、配列番号91、配列番号100、及び配列番号103からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号1～9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
・配列番号843～850からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第3のドメイン
を含む、本発明1001～1009のいずれかの抗体構築物。
[本発明1011]
配列番号856～871に示されるポリペプチドを含むかまたはそれからなる、本発明1001～1010のいずれかの抗体構築物。
[本発明1012]
ヒトＦＬＴ3に対する前記第1の結合ドメインの結合が、ＦＬＴ3－リガンドによって、≦25％、好ましくは≦20％、より好ましくは≦15％、さらに好ましくは≦10％、さらにより好ましくは≦8％、より好ましくは≦6％、及び最も好ましくは≦2％減少する、本発明1001～1011のいずれかの抗体構築物。
[本発明1013]
先行請求項のいずれかに定義される抗体構築物をコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1014]
本発明1013に定義されるポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1015]
本発明1013に定義されるポリヌクレオチドまたは本発明1014に定義されるベクターで形質転換されたかまたはそれを遺伝子導入された、宿主細胞。
[本発明1016]
本発明1001～1012のいずれかの抗体構築物の産生方法であって、
本発明1001～1012のいずれかに定義される抗体構築物の発現が可能になる条件下で本発明1015に定義される宿主細胞を培養することと、
産生した抗体構築物を前記培養物から回収することと
を含む、前記方法。
[本発明1017]
本発明1001～1012のいずれかの抗体構築物または本発明1016の方法に従って産生した抗体構築物を含む、医薬組成物。
[本発明1018]
血液がん疾患または転移性がん疾患の予防、治療、または寛解において使用するための、本発明1001～1012のいずれかの抗体構築物または本発明1016の方法に従って産生した抗体構築物。
[本発明1019]
血液がん疾患または転移性がん疾患の治療方法または寛解方法であって、それを必要とする対象に対して、本発明1001～1012のいずれかの抗体構築物または本発明1016の方法に従って産生した抗体構築物を投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1020]
前記血液がん疾患がＡＭＬであるかまたは前述のもののいずれかに由来する転移性がん疾患である、本発明1019の方法または本発明1018の抗体構築物。
[本発明1021]
本発明1001～1012のいずれかの抗体構築物、本発明1016の方法に従って産生した抗体構築物、本発明1013に定義されるポリヌクレオチド、本発明1014に定義されるベクター、及び／または本発明1015に定義される宿主細胞を含む、キット。
本明細書で使用される「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という単数形は、別段の記載がない限り、複数の参照を含むことに留意されなくてはならない。したがって、例えば、「試薬」に対する参照は、１つまたは複数のそのような異なる試薬を含み、「方法」に対する参照は、本明細書に記載の方法のために改変またはそれとの置き換えが可能な、当業者に知られる同等の段階及び方法に対する参照を含む。
別段の記載がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の各要素を指すと理解されることになる。当業者であれば、単に日常の実験法を使用するだけで、本明細書に記載の発明の特定の実施形態に対する多くの同等形態を認識、または思いつくことが可能であろう。そのような同等形態は、本発明によって包含されることが意図される。
本明細書で使用される「及び／または」という用語は、記載箇所を問わず、「及び」、「または」、及び「当該用語によって連結される要素のすべてまたは任意の他の組み合わせ」という意味を含む。
本明細書で使用される「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、所与の値または範囲の±２０％以内を意味し、好ましくは、±１５％以内、より好ましくは、±１０％以内、及び最も好ましくは、±５％以内を意味する。
本明細書及び後に続く特許請求の範囲を通じて、別段の記載がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という言葉、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形形態は、記載の整数もしくは段階、または整数もしくは段階の群を含むが、任意の他の整数もしくは段階、または整数もしくは段階の群を除外しないことを暗示すると理解されることになる。本明細書で使用されるとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語で置き換えることができ、または本明細書での使用によっては、「有する」という用語で置き換えることができる。
本明細書で使用されるとき、「からなる」は、請求要素において特定されない要素、段階、または成分をいずれも除外する。本明細書で使用されるとき、「から本質的になる」は、請求の基礎及び新規の特性に実質的に影響を与えない材料または段階を除外しない。
本明細書のそれぞれの実例では、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という用語はいずれも、残りの二つの用語のいずれかで置き換えてよい。
「抗体構築物」という用語は、構造及び／または機能が、例えば、全長免疫グロブリン分子または全免疫グロブリン分子である抗体の構造及び／または機能に基づく分子を指す。したがって、抗体構築物は、その特定の標的または抗原に結合する能力を有する。さらに、本発明による抗体構築物は、抗体の標的結合が可能になる最低限の構造要件を含む。この最低限の要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）の存在、ならびに／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）の存在、好ましくは６つすべてのＣＤＲの存在によって定義され得る。本発明による構築物の基礎となる抗体には、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が含まれる。
本発明による「抗体構築物」の定義は、全長抗体または全抗体を含み、これには、キメラ抗体、及び生物工学的またはタンパク質操作の方法またはプロセスによって産生される他の免疫グロブリン抗体も含まれる。こうした全長抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体であり得る。「抗体構築物」の定義は、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または「ｒＩｇＧ」（「半抗体（ｈａｌｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」）などの、全長抗体の断片も含む。本発明による抗体構築物は、改変された抗体断片でもあり得る。こうした改変抗体断片は、抗体変異体とも呼ばれ、ｓｃＦｖ、ジ－ｓｃＦｖまたはビ（ス）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、単鎖ダイアボディ、タンデム型ダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデム型ジ－ｓｃＦｖ、タンデム型トリ－ｓｃＦｖ、「ｍｉｎｉｂｏｄｙ（ミニボディ）」などであり、下記の構造によって例示される：（ＶＨ－ＶＬ－ＣＨ３）２、（ｓｃＦｖ－ＣＨ３）２、（（ｓｃＦｖ）２－ＣＨ３＋ＣＨ３）、（（ｓｃＦｖ）２－ＣＨ３）、または（ｓｃＦｖ－ＣＨ３－ｓｃＦｖ）２、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）またはテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）などのマルチボディ（ｍｕｌｔｉｂｏｄｙ）、及びナノボディなどの単一ドメイン抗体または単に１つの可変ドメインを含む単一可変ドメイン抗体。こうした可変ドメインは、他のＶ領域またはドメインとは無関係に、抗原またはエピトープに特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨ、またはＶＬであり得る。
結合ドメインは、典型的には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得るが、両方を含む必要はない。Ｆｄ断片は、例えば、２つのＶＨ領域を有し、未変化の抗原結合ドメインの抗原結合機能を幾分か保持することが多い。抗体断片、抗体変異体、または結合ドメインの形式の追加の例には、（１）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインを有する１価の断片であるＦａｂ断片、（２）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を有する２価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（３）２つのＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片、（４）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインを有するＦｖ断片、（５）ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）（ＶＨドメインを有する）、（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（７）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）。好ましくは、後者である（例えば、ｓｃＦＶライブラリーから得られたもの）。本発明による抗体構築物の実施形態の例は、例えば、ＷＯ００／００６６０５、ＷＯ２００５／０４０２２０、ＷＯ２００８／１１９５６７、ＷＯ２０１０／０３７８３８、ＷＯ２０１３／０２６８３７、ＷＯ２０１３／０２６８３３、ＵＳ２０１４／０３０８２８５、ＵＳ２０１４／０３０２０３７、ＷＯ２０１４／１４４７２２、ＷＯ２０１４／１５１９１０、及びＷＯ２０１５／０４８２７２において説明されている。
さらに、「抗体構築物」という用語の定義は、１価、２価、及び多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）／多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）の構築物を含み、したがって、１つの抗原構造のみに特異的に結合する単一特異性の構築物、ならびに二重特異性及び多特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）／多特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）の構築物を含み、こうした二重特異性及び多特異性の構築物は、異なる結合ドメインを介して複数の抗原構造に特異的に結合し、例えば、２つ、３つ、またはそれより多い数の抗原構造に特異的に結合する。さらに「抗体構築物」という用語の定義は、１つポリペプチド鎖のみからなる分子、ならびに複数のポリペプチド鎖からなる分子を含み、複数のポリペプチド鎖からなる分子の鎖は、同一であり得るか（ホモ二量体、ホモ三量体、もしくはホモオリゴマー）、または異なり得る（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、もしくはヘテロオリゴマー）。上記の抗体、及びその変異体または誘導体の例は、数ある中でも特に、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）及びＵｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄ ｅｄ．２０１０、ならびにＬｉｔｔｌｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ２００９において説明されている。
本発明の抗体構築物は、好ましくは、「インビトロで産生した抗体構築物」である。この用語は、可変領域（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）のすべてまたは一部が、非免疫細胞選択において産生する、上記定義による抗体構築物を指す。こうした非免疫細胞選択は、例えば、インビトロのファージディスプレイ、タンパク質チップ、または候補配列が抗原に結合する能力を有しているかを試験することができる任意の他の方法である。したがって、好ましくは、単に動物の免疫細胞におけるゲノム再編成によって産生しただけの配列は、この用語から除外される。「組換え抗体」は、組換えＤＮＡ技術または遺伝子工学を使用することによって調製された抗体である。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）またはモノクローナル抗体構築物という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、天然に生じる可能性のある、少量存在し得る変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、抗原に存在する単一の抗原部位または抗原決定基を標的としており、典型的には異なる決定基（またはエピトープ）を標的とする異なる抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的である。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマの培養によってそれが合成されることから、他の免疫グロブリンが混入しないという点において有利である。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体産生が必要になると解釈されることにはならない。
モノクローナル抗体の調製には、細胞株を連続培養することによって産生する抗体を得る任意の手法を使用することができる。例えば、使用されることになるモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に説明されたハイブリドーマ法によって調製され得るか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって調製され得る。ヒトモノクローナル抗体の追加の産生手法の例には、トリオーマを用いる手法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマを用いる手法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４（１９８３），７２）、及びＥＢＶ－ハイブリドーマを用いる手法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７－９６）が含まれる。
続いて、ハイブリドーマは、特定の抗原と特異的に結合する抗体を産生する１つまたは複数のハイブリドーマを同定するために、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの、標準的な方法を使用して選別することができる。関連抗原の任意の形態を免疫原として使用してよく、例えば、組換え抗原、天然に生じる形態、その任意の変異体または断片、ならびにその抗原ペプチドを使用してよい。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで用いられる表面プラズモン共鳴は、ＦＬＴ３またはＣＤ３イプシロンなどの標的抗原のエピトープに結合するファージ抗体の効率を上げるために使用することができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７（１９９６），９７－１０５、Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５），７－１３）。
モノクローナル抗体の調製方法の別の例には、例えば、ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイによるライブラリーといったタンパク質発現ライブラリーの選別が含まれる。ファージディスプレイは、例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２２３，４０９号、Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５－１３１７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）、及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）において説明されている。
ディスプレイライブラリーの使用に加えて、非ヒト動物を免疫化するために関連抗原を使用することができ、こうした非ヒト動物は、例えば、げっ歯類（マウス、ハムスター、ウサギ、またはラットなど）である。１つの実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウス抗体の産生が欠損しているマウス系統に、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大型断片を操作導入することが可能である。ハイブリドーマ技術を使用し、所望の特異性を有する遺伝子から得られた抗原特異的なモノクローナル抗体を産生及び選択してよい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１、ＵＳ２００３－００７０１８５、ＷＯ９６／３４０９６、及びＷＯ９６／３３７３５を参照のこと。
モノクローナル抗体は、非ヒト動物から得ることもでき、その後、当該技術分野において知られる組換えＤＮＡ手法を使用して改変することができ、例えば、ヒト化、脱免疫化、キメラ化等を実施することができる。改変抗体構築物の例には、非ヒト抗体のヒト化変異体、「親和性成熟」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９－８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，１０８３２－１０８３７（１９９１）を参照のこと）、ならびにエフェクター機能（複数可）が変更された抗体変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号、前出のＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ（２０１０）、及び前出のＬｉｔｔｌｅ（２００９）を参照のこと）が含まれる。
免疫学では、親和性成熟は、免疫応答の過程の間に、抗原に対する親和性が増加した抗体をＢ細胞が産生するプロセスである。同一の抗原に対する反復曝露が生じると、宿主は、親和性を継続的に向上させて抗体を産生することになる。天然のプロトタイプのように、インビトロの親和性成熟は、変異及び選択という原理に基づいている。インビトロの親和性成熟は、抗体、抗体構築物、及び抗体断片を最適化するために継続的に使用されてきた。放射線、化学的変異原、またはエラープローンＰＣＲを使用することでＣＤＲ内に変異が無作為に導入される。さらに、鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）によって遺伝的多様性を増加させることができる。ファージディスプレイのようなディスプレイ法を使用して２ラウンドまたは３ラウンドの変異及び選択を実施すると、通常、低ナノモル濃度範囲において親和性を有する抗体断片が得られる。
抗体構築物の好ましい型のアミノ酸置換変異は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つまたは複数の超可変領域残基の置換を含む。一般に、得られる変異体（複数可）でさらなる開発に選択されるものは、その産生起源である親抗体と比較して改善した生物学的特性を有することになる。そのような置換変異体の産生に便利な手法には、ファージディスプレイを使用した親和性成熟が含まれる。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば６～７つの部位）において、それぞれの部位ですべての可能なアミノ酸置換が生じるように変異が導入される。したがって、産生する抗体変異体は、それぞれの粒子内にパッケージ化されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として、繊維状ファージ粒子から１価の様式でディスプレイされる。その後、ファージディスプレイされた変異体は、本明細書に開示の生物学的活性（例えば、結合親和性）で選別される。改変の候補となる超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異導入法を実施して抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を同定することができる。あるいは、またはさらに、結合ドメインと、例えば、ヒトＦＬＴ３との接触点を同定するために、抗原－抗体複合体の結晶構造を解析することが有利であり得る。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書に記載の手法による置換の候補である。そのような変異体が産生されると、変異体の一団は、本明細書に記載の選別に供され、１つまたは複数の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体が、さらなる開発に向けて選択され得る。
本発明のモノクローナル抗体及び抗体構築物には、具体的には、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体における対応配列と同一であるか、またはそれに対する相同性を有する一方で、鎖（複数可）の残部が、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体における対応配列と同一であるか、またはそれに対する相同性を有する「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が含まれ、それに加えて、そのような抗体の断片が、所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片も含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））。本明細書の関心対象であるキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）に由来する可変ドメイン抗原結合配列、及びヒト定常領域配列を含む「ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ」抗体が含まれる。キメラ抗体のさまざまな調製手法がこれまでに説明されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８５、Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，１９８５、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号、Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号、Ｔａｎａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＰ０１７１４９６、ＥＰ０１７３４９４、及びＧＢ２１７７０９６を参照のこと。
抗体、抗体構築物、抗体断片、または抗体変異体は、例えば、ＷＯ９８／５２９７６またはＷＯ００／３４３１７において開示される方法によってヒトＴ細胞エピトープを特異的に欠失させることによっても改変され得る（「ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ（脱免疫化）」と呼ばれる方法）。簡潔には、抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて分析することができ、こうしたペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープ（ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７において定義される）に相当する。潜在的なＴ細胞エピトープの欠失には、「ペプチドスレッディング（ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」と命名されたコンピュータモデリング手法を適用することができ、さらに、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを使用してＶＨ配列及びＶＬ配列に存在するモチーフを検索することができる。こうしたことは、ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７において説明されている。こうしたモチーフは、ＭＨＣクラスＩＩの１８ある主要なＤＲアロタイプのいずれにも結合するものであり、したがって、潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的なＴ細胞エピトープは、可変ドメインにおける少数のアミノ酸残基の置換、または好ましくは、単一のアミノ酸の置換によって除外することができる。典型的には、保存性の置換が実施される。限定はされないが、ヒト生殖系列抗体配列における一定位置に共通するアミノ酸が使用され得ることが多い。ヒト生殖系列配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８、Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ Ｖｏｌ．１６（５）：２３７－２４２、及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１４：４６２８－４６３８において開示されている。Ｖ ＢＡＳＥディレクトリでは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリが提供されている（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＬＡ．ｅｔ ａｌ．ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによって編集されている）。こうした配列は、例えば、フレームワーク領域及びＣＤＲためのヒト配列の供給源として使用することができる。ヒトのコンセンサスフレームワーク領域を使用することもでき、これについては、例えば、米国特許第６，３００，０６４号において説明されている。
「ヒト化された」抗体、抗体構築物、その変異体または断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合配列）は、その大部分がヒト配列である抗体または免疫グロブリンであり、こうした抗体または免疫グロブリンが含む、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列（複数可）は最小限である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲとも呼ばれる）に由来する残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する、マウス、ラット、ハムスター、またはウサギなどの非ヒト（例えば、げっ歯類）種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基によって交換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの実例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって交換される。さらに、本明細書で使用される「ヒト化抗体」は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基も含み得る。こうした改変は、抗体の能力をさらに洗練及び最適化するために実施される。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含み得、こうした定常領域は、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものである。追加詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－５９６（１９９２）を参照のこと。
ヒト化抗体またはその断片は、抗原結合に直接的に関与しないＦｖ可変ドメインの配列を、ヒトＦｖ可変ドメインに由来する同等配列と交換することによって産生させることができる。ヒト化抗体またはその断片の産生方法の例は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－１２０７、Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、ならびにＵＳ５，５８５，０８９、ＵＳ５，６９３，７６１、ＵＳ５，６９３，７６２、ＵＳ５，８５９，２０５、及びＵＳ６，４０７，２１３によって提供されている。こうした方法は、少なくとも１つの重鎖または軽鎖に由来する免疫グロブリンＦｖ可変ドメインのすべてまたは一部をコードする核酸配列の単離、操作、及び発現を含む。そのような核酸は、上記のように、所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマ、ならびに他の供給源から得てよい。その後、ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡは、適した発現ベクターにクローニングすることができる。
ヒト化抗体は、ヒトの重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を発現するが、マウスの内在性の免疫グロブリン重鎖遺伝子及び免疫グロブリン軽鎖遺伝子を発現する能力を有さない、マウスなどの遺伝子導入動物を使用して産生させてもよい。本明細書に記載のヒト化抗体の調製に使用され得るＣＤＲ移植方法の例については、Ｗｉｎｔｅｒによって説明されている（米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体のＣＤＲのすべてが非ヒトＣＤＲの少なくとも一部と交換され得るか、またはＣＤＲのいくつかのみが非ヒトＣＤＲと交換され得る。所定の抗原にヒト化抗体が結合するために必要な数のＣＤＲの交換のみが必要である。
ヒト化抗体は、保存性の置換、コンセンサス配列の置換、生殖系列の置換、及び／または復帰変異（ｂａｃｋ ｍｕｔａｔｉｏｎ）の導入によって最適化することができる。免疫グロブリン分子のそのような変更は、当該技術分野において知られるいくつかの手法のいずれかによって実施することができる（例えば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８－７３１２，１９８３、Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３、Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３－１６，１９８２、及びＥＰ２３９４００）。
「ヒト抗体」、「ヒト抗体構築物」、及び「ヒト結合ドメイン」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（前出）によって説明されるものを含む、当該技術分野において知られるヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変領域もしくは定常領域または可変ドメインもしくは定常ドメインなどの抗体領域を有する抗体、抗体構築物、及び結合ドメインを含む。本発明のヒト抗体、ヒト抗体構築物、またはヒト結合ドメインは、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロの無作為もしくは部位特異的な変異導入、またはインビボの体細胞変異によって導入される変異）を例えば、ＣＤＲ、特に、ＣＤＲ３に含み得る。ヒト抗体、ヒト抗体構築物、またはヒト結合ドメインでは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれより多くの位置が、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基と交換され得る。本明細書で使用されるヒト抗体、ヒト抗体構築物、及びヒト結合ドメインの定義は、完全ヒト型抗体も企図し、こうした完全ヒト型抗体には、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅなどの技術またはシステムを使用することによって得ることができるもののような、抗体のヒト配列が非人工的及び／または遺伝的に変わっただけのものが含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体構築物は、「単離された」抗体構築物であるか、または「実質的に純粋な」抗体構築物である。「単離された」または「実質的に純粋な」が、本明細書に開示の抗体構築物の説明に使用されるとき、その産生環境の成分から同定、分離、及び／または回収された抗体構築物であることを意味する。好ましくは、抗体構築物は、その産生環境に由来する他のすべての成分とのつながりがないか、またはそれとのつながりが実質的にない。組換え遺伝子導入細胞に由来するものなどの、その産生環境から混入する成分は、典型的には、ポリペプチドの診断的または治療的な使用を妨害することが想定される材料であり、こうした混入成分には、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質が含まれ得る。抗体構築物は、例えば、所与の試料において総タンパク質の少なくとも約５重量％、または少なくとも約５０重量％を構成し得る。単離されたタンパク質は、状況に応じて、総タンパク質含量の５重量％～９９．９重量％を構成し得ると理解される。ポリペプチドは、その濃度レベルが高まって調製されるように、誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターを使用することによって濃度を顕著に高めて調製され得る。定義は、当該技術分野において知られる多種多様な生物及び／または宿主細胞における抗体構築物の産生を含む。好ましい実施形態では、抗体構築物は、（１）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度にまで精製されるか、または（２）クマシーブルーもしくは好ましくは、銀染色を使用して、非還元条件下もしくは還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一となるまで精製されることになる。しかしながら、通常、単離された抗体構築物は、少なくとも１回の精製段階によって調製されることになる。
「結合ドメイン」という用語は、本発明に従って、標的分子（抗原）（本明細書ではそれぞれＦＬＴ３及びＣＤ３）に存在する所与の標的エピトープまたは所与の標的部位に（特異的に）結合／と相互作用／を認識するドメインであるということを特徴付ける。第１の結合ドメイン（ＦＬＴ３を認識する）の構造及び機能、ならびに好ましくは、第２の結合ドメイン（ＣＤ３を認識する）の構造及び／または機能もまた、例えば、全長免疫グロブリン分子または全免疫グロブリン分子である抗体の構造及び／または機能に基づく。本発明によれば、第１の結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）の存在、ならびに／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）の存在によって特徴付けられる。第２の結合ドメインもまた、好ましくは、抗体の標的結合が可能になる最低限の構造要件を含む。より好ましくは、第２の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、ならびに／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む。第１の結合ドメイン及び／または第２の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体に由来するＣＤＲ配列の骨格への移植によってではなく、ファージディスプレイまたはライブラリーの選別方法によって産生または入手可能であると想定される。
本発明によれば、結合ドメインは、１つまたは複数のポリペプチドの形態である。そのようなポリペプチドはタンパク質性部分及び非タンパク質性部分（例えば、化学リンカー、またはグルタルアルデヒドなどの化学架橋剤）を含み得る。タンパク質（その断片、好ましくは生物学的に活性な断片、及びペプチドを含み、こうしたものが有するアミノ酸残基数は、通常、３０未満である）は、お互いが共有ペプチド結合を介して結合（結果としてアミノ酸の鎖が生じる）した２つ以上のアミノ酸を含む。本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、通常、３０残基を超えるアミノ酸からなる分子の群を説明するものである。ポリペプチドは、二量体、三量体、及び高重合度のオリゴマーなどの、すなわち、複数のポリペプチド分子からなる多量体をさらに形成し得る。そのような二量体、三量体等を形成するポリペプチド分子は、同一であり得るか、または異なり得る。したがって、そのような多量体の対応する高次構造は、ホモ二量体またはヘテロ二量体、ホモ三量体またはヘテロ三量体等と命名される。ヘテロ多量体の例は、それが天然に生じる形態にあり、２つの同一の軽ポリペプチド鎖、及び２つの同一の重ポリペプチド鎖からなる抗体分子である。「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、天然に修飾されたペプチド／ポリペプチド／タンパク質も指し、修飾は、例えば、糖鎖修飾、アセチル化、リン酸化、及び同様のもののような翻訳後修飾によって影響を受ける。本明細書で称されるとき、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」は、ペグ化などの化学的修飾も受け得る。そのような修飾は、当該技術分野においてよく知られており、本明細書で後述される。
好ましくは、ＦＬＴ３に結合する結合ドメイン及び／またはＣＤ３に結合する結合ドメインは、ヒト結合ドメインである。少なくとも１つのヒト結合ドメインを含む抗体及び抗体構築物では、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、またはウサギ）などの非ヒトの可変領域及び／または定常領域を有する抗体または抗体構築物と関連する問題のいくつかが回避される。げっ歯類に由来するそのようなタンパク質が存在すると、抗体もしくは抗体構築物の急速な排出につながり得るか、または患者による抗体もしくは抗体構築物に対する免疫応答の発生につながり得る。げっ歯類に由来する抗体または抗体構築物の使用を回避するために、げっ歯類が完全ヒト型抗体を産生するようにげっ歯類にヒト抗体の機能を導入することによって、ヒトまたは完全ヒト型の抗体／抗体構築物を産生させることができる。
ＹＡＣにメガ塩基サイズのヒト遺伝子座をクローニングし、それを再構築する能力、及びそれをマウス生殖系列に導入する能力からは、非常に大型であるか、または粗く位置する遺伝子座の機能成分の強力な解明手法、ならびにヒト疾患の有用モデルの強力な創出手法が得られる。さらに、マウスの遺伝子座を、そのヒト同等物で置換するためにそのような手法を使用することで、開発の間のヒト遺伝子産物の発現及び制御、ヒト遺伝子産物と他の系とのコミュニケーション、ならびに疾患の誘導及び進行へのヒト遺伝子産物の関与に対する類のない洞察を得ることが可能である。
そのような方針の重要な実践的応用は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。内在性Ｉｇ遺伝子を不活性化したマウスにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を導入することによって、抗体のプログラム化された発現及び組立の根底に存在する機構、ならびにＢ細胞発生におけるその役割を調べる機会が得られる。さらに、そのような方針によって、完全ヒト型モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の産生に理想的な供給源を得ることが可能であり、これは、ヒト疾患における抗体治療の有望性の充足に向かう重要なマイルストーンである。完全ヒト型の抗体または抗体構築物では、マウスｍＡｂまたはマウス誘導体化ｍＡｂに本質的な免疫原性応答及びアレルギー反応が最小化すると予測され、したがって、投与される抗体／抗体構築物の効力及び安全性が向上する。完全ヒト型の抗体または抗体構築物を使用することで、化合物の反復投与が必要になる炎症、自己免疫、及びがんなどの、慢性及び再発性のヒト疾患の治療において実質的な利点が得られると予測することができる。
この目標に向かう１つの手法は、マウス抗体の産生が欠損しているマウス系統に対してヒトＩｇ遺伝子座の大型断片を操作導入することであった。これは、そのようなマウスであれば、マウス抗体が産生することなくヒト抗体の大型レパートリーが得られるであろうと予測して実施されたものである。大型のヒトＩｇ断片であれば、可変遺伝子多様性の大きさ、ならびに抗体の産生及び発現に対する適切な制御が保たれることになる。抗体の多様化及び選択のためのマウス機構、ならびにヒトタンパク質に対する免疫学的寛容性の欠如を活用することによって、こうしたマウス系統において再現するヒト抗体レパートリーから、ヒト抗原を含む任意の関心対象抗原に対する高親和性抗体が得られることになる。ハイブリドーマ技術を使用することで、所望の特異性を有する抗原特異的なヒトｍＡｂを容易に産生させ、選択することが可能である。この一般的な方針は、最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス系統の創出と関連して示された（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１（１９９４）を参照のこと）。可変領域及び定常領域のコア配列を含む、ヒトの重鎖遺伝子座及びカッパー軽鎖遺伝子座の、それぞれ２４５ｋｂ及び１９０ｋｂサイズの生殖系列構成断片を含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）がＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統に操作導入された。ヒトＩｇを含むＹＡＣは、抗体の再編成及び発現の両方でマウス系と適合性を有することが証明され、不活性化されたマウスＩｇ遺伝子の代わりとなる能力を有していた。このことは、Ｂ細胞発生の誘導能力、完全ヒト型抗体の成人様ヒトレパートリーの産生能力、及び抗原特異的ヒトｍＡｂの産生能力を当該ＹＡＣが有していたことによって示された。こうした結果は、より大きな数のＶ遺伝子を含む、より大型のヒトＩｇ遺伝子座部分、追加の制御要素、及びヒトＩｇＧ定常領域を導入することによって、感染及び免疫化に対するヒト液性応答の特徴である完全なレパートリーが実質的に再現される可能性があることも示唆していた。Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．の研究は、最近、それぞれヒトの重鎖遺伝子座及びカッパー軽鎖遺伝子座を含むメガ塩基サイズの生殖系列構成ＹＡＣ断片を導入することによって、ヒト抗体レパートリーの約８０％超を導入するところまで進展した。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６（１９９７）、及び米国特許出願第０８／７５９，６２０号を参照のこと。
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスの産生については、米国特許出願第０７／４６６，００８号、第０７／６１０，５１５号、第０７／９１９，２９７号、第０７／９２２，６４９号、第０８／０３１，８０１号、第０８／１１２，８４８号、第０８／２３４，１４５号、第０８／３７６，２７９号、第０８／４３０，９３８号、第０８／４６４，５８４号、第０８／４６４，５８２号、第０８／４６３，１９１号、第０８／４６２，８３７号、第０８／４８６，８５３号、第０８／４８６，８５７号、第０８／４８６，８５９号、第０８／４６２，５１３号、第０８／７２４，７５２号、及び第０８／７５９，６２０、ならびに米国特許第６，１６２，９６３号、第６，１５０，５８４号、第６，１１４，５９８号、第６，０７５，１８１号、及び第５，９３９，５９８号、ならびに日本国特許第３０６８１８０号Ｂ２、第３０６８５０６号Ｂ２、及び第３０６８５０７号Ｂ２においてさらに議論及び説明されている。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６（１９９７）、及びＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３－４９５（１９９８）、ＥＰ０４６３１５１Ｂ１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ００／７６３１０、ならびにＷＯ０３／４７３３６も併せて参照のこと。
代替の手法では、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含む他のグループは、「ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ（小型遺伝子座）」手法を利用した。小型遺伝子座手法では、Ｉｇ遺伝子座に由来する断片（個々の遺伝子）を含めることによって外来性のＩｇ遺伝子座を模倣している。したがって、１つまたは複数のＶＨ遺伝子、１つまたは複数のＤＨ遺伝子、１つまたは複数のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域、及び第２の定常領域（好ましくは、ガンマ定常領域）が、動物へ導入するための構築物に導入形成される。この手法については、米国特許第５，５４５，８０７号（Ｓｕｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．に帰属）、ならびに米国特許第５，５４５，８０６号、第５，６２５，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、第５，７７０，４２９号、第５，７８９，６５０号、第５，８１４，３１８号、第５，８７７，３９７号、第５，８７４，２９９号、及び第６，２５５，４５８号（それぞれがＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙに帰属）、米国特許第５，５９１，６６９号及び第６，０２３．０１０号（Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ及びＢｅｒｎｓに帰属）、米国特許第５，６１２，２０５号、第５，７２１，３６７号、及び第５，７８９，２１５号（Ｂｅｒｎｓ ｅｔ ａｌ．に帰属）、ならびに米国特許第５，６４３，７６３号（Ｃｈｏｉ及びＤｕｎｎに帰属）、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによる国際米国特許出願第０７／５７４，７４８号、第０７／５７５，９６２号、第０７／８１０，２７９号、第０７／８５３，４０８号、第０７／９０４，０６８号、第０７／９９０，８６０号、第０８／０５３，１３１号、第０８／０９６，７６２号、第０８／１５５，３０１号、第０８／１６１，７３９号、第０８／１６５，６９９号、第０８／２０９，７４１号において説明されている。ＥＰ０５４６０７３Ｂ１、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６、ＷＯ９７／１３８５２、及びＷＯ９８／２４８８４、ならびに米国特許第５，９８１，１７５号も併せて参照のこと。さらに、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、及びＴｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）を参照のこと。
Ｋｉｒｉｎもまた、微小核融合（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ）を介して染色体の大型断片または全染色体を導入したマウスからヒト抗体が産生することを示した。欧州特許出願第７７３２８８号及び第８４３９６１号を参照のこと。Ｘｅｎｅｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、ヒト抗体の潜在的な産生のための技術を開発中である。この技術では、ＳＣＩＤマウスは、例えば、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞といったヒトリンパ性細胞で再構成される。その後、マウスは抗原で免疫化され、抗原に対する免疫応答の生成が可能になる。米国特許第５，４７６，９９６号、第５，６９８，７６７号、及び第５，９５８，７６５号を参照のこと。
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応が生じることから、産業界は、キメラ抗体あるいはヒト化抗体を調製してきた。しかしながら、一定のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応が観測されることになると想定され、特に、抗体を慢性的または複数回投与で利用する場合はこうしたことが想定される。したがって、ＨＡＭＡ反応またはＨＡＣＡ反応の懸念及び／または作用を検証するために、ＦＬＴ３に対するヒト結合ドメインとＣＤ３に対するヒト結合ドメインとを含む抗体構築物を得ることが望ましいであろう。
「（特異的に）結合する」、「（特異的に）認識する」、「（特異的に）標的とする」、及び「（特異的に）反応する」という用語は、本発明に従って、結合ドメインが、標的分子（抗原）（本明細書ではそれぞれＦＬＴ３及びＣＤ３）に存在する所与のエピトープまたは所与の標的部位と相互作用またはそれと特異的に相互作用することを意味する。
「エピトープ」という用語は、抗体もしくは免疫グロブリン、または抗体もしくは免疫グロブリンの誘導体、断片、もしくは変異体などの結合ドメインが特異的に結合する抗原に存在する部位を指す。「エピトープ」は、抗原性であり、したがって、本明細書では、エピトープという用語は、「抗原構造」または「抗原決定基」と称されることもある。したがって、結合ドメインは、「抗原相互作用部位」である。当該結合／相互作用は、「特異的認識」を定義するものであるとも理解される。
「エピトープ」は、近接アミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングによって並置される非近接アミノ酸の両方によって形成され得る。「直鎖エピトープ」は、アミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープを含むエピトープである。直鎖エピトープは、典型的には、少なくとも３残基または少なくとも４残基、及びより通常は、少なくとも５残基または少なくとも６残基または少なくとも７残基、例えば、約８～約１０残基のアミノ酸を特有の配列で含む。
直鎖エピトープとは対照的に、「立体構造エピトープ」は、エピトープを構成するアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープの唯一の定義成分ではないエピトープである（例えば、アミノ酸の一次配列が、結合ドメインによって必然的に認識されるわけではないエピトープ）。典型的には、直鎖エピトープと比較して、立体構造エピトープは、多くの数のアミノ酸を含む。立体構造エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくは、ペプチドもしくはタンパク質またはその断片の三次元構造を認識する（本発明との関連では、結合ドメインの１つに対する抗原構造は、ＦＬＴ３タンパク質内に含まれる）。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造を形成するとき、立体構造エピトープを形成する特定のアミノ酸及び／またはポリペプチド骨格が並置されることで、抗体がエピトープを認識することが可能になる。エピトープの立体構造の決定方法には、限定はされないが、Ｘ線結晶解析、二次元核磁気共鳴（２Ｄ－ＮＭＲ）分光法、及び部位特異的スピンラベル、ならびに電子常磁体共鳴（ＥＰＲ）分光法が含まれる。
エピトープマッピングの方法は、以下に説明される：ヒトＦＬＴ３タンパク質における領域（近接アミノ酸区間）が、非ヒトかつ非霊長類のＦＬＴ３抗原（例えば、マウスＦＬＴ３であるが、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギ等のような他のものも想定し得る）におけるその対応領域と交換（ｅｘｃｈａｎｇｅ）／交換（ｒｅｐｌａｃｅ）されるとき、結合ドメインが、使用する非ヒトかつ非霊長類のＦＬＴ３に対して交差反応性でない限り、結合ドメインの結合には減少が生じると予測される。ヒトＦＬＴ３タンパク質におけるそれぞれ領域に対する結合を１００％に設定し、ヒトＦＬＴ３タンパク質におけるそれぞれの領域に対する結合と比較すると、上記の減少は、好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％であり、より好ましくは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％であり、及び最も好ましくは、９０％、９５％、または１００％でさえある。上記のヒトＦＬＴ３／非ヒトＦＬＴ３キメラは、ＣＨＯ細胞における発現が想定される。ヒトＦＬＴ３／非ヒトＦＬＴ３キメラは、ＥｐＣＡＭなどの異なる膜結合型タンパク質の膜貫通ドメイン及び／または細胞質ドメインとの融合も想定される。これについては、実施例１及び実施例２を参照のこと。
エピトープマッピングの代替または追加の方法では、結合ドメインによって認識される特定の領域を決定するために、ヒトＦＬＴ３の細胞外ドメインのいくつかの切断型バージョンを産生させることができる。こうした切断型バージョンでは、異なる細胞外ＦＬＴ３ドメイン／サブドメインまたは領域が段階的に除去され、この除去はＮ末端から開始される。本発明との関連において産生させて使用した切断型ＦＬＴ３バージョンは、に示される。切断型ＦＬＴ３バージョンは、ＣＨＯ細胞において発現し得ると想定される。切断型ＦＬＴ３バージョンは、ＥｐＣＡＭなどの異なる膜結合型タンパク質の膜貫通ドメイン及び／または細胞質ドメインと融合し得るとも想定される。切断型ＦＬＴ３バージョンは、そのＮ末端にシグナルペプチドドメインを含み得るとも想定され、こうしたシグナルペプチドドメインは、例えば、マウスＩｇＧ重鎖シグナルペプチドに由来するシグナルペプチドである。さらに、切断型ＦＬＴ３バージョンは、そのＮ末端に（シグナルペプチドに続いて）ｖ５ドメインを含み得、このｖ５ドメインによって切断型ＦＬＴ３バージョンが細胞表面に正しく発現したかを検証することが可能になる。結合の減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）または減少（ｌｏｓｓ）は、結合ドメインによって認識されるＦＬＴ３領域をもはや含まない切断型ＦＬＴ３バージョンで生じると予測される。結合の減少は、全ヒトＦＬＴ３タンパク質（またはその細胞外領域もしくはドメイン）に対する結合を１００％に設定した場合、好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％であり、より好ましくは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％であり、及び最も好ましくは、９０％、９５％、または１００％でさえある。これについては、実施例３を参照のこと。
標的抗原の特定の残基が、抗体構築物または結合ドメインによる認識に寄与していることを決定する追加の方法は、アラニンスキャニングであり（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＫＬ ＆ Ｗｅｉｓｓ ＧＡ．Ｃｕｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｊｕｎ；５（３）：３０２－７を参照のこと）、この方法では、分析されることになるそれぞれの残基が、例えば、部位特異的変異導入を介してアラニンによって交換される。アラニンが使用される理由は、それが嵩高くなく、化学的に不活性であり、それにもかかわらず他のアミノ酸の多くが有する二次構造参照を模倣するメチル官能基を有しているためである。変異残基のサイズ変換が望まれる場合、場合によっては、バリンまたはロイシンなどの嵩高いアミノ酸が使用され得る。アラニンスキャニングは、長期間使用されてきた成熟技術である。
結合ドメインと、エピトープまたはエピトープ含有領域との相互作用は、結合ドメインが、特定のタンパク質または抗原（本明細書では、それぞれＦＬＴ３及びＣＤ３）に存在するエピトープ／エピトープ含有領域に対して認識可能な親和性を示し、一般に、ＦＬＴ３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との顕著な反応性は示さないことを暗示している。「認識可能な親和性」は、約１０－６Ｍ（ＫＤ）またはそれより強い親和性を有する結合を含む。好ましくは、結合親和性が約１０－１２～１０－８Ｍ、約１０－１２～１０－９Ｍ、約１０－１２～１０－１０Ｍ、約１０－１１～１０－８Ｍであり、好ましくは、約１０－１１～１０－９Ｍであるとき、結合は特異的であると考えられる。結合ドメインが、標的と特異的に反応するか、または標的に特異的に結合するかどうかは、数ある中でも特に、当該結合ドメインと標的タンパク質または抗原との反応と、当該結合ドメインとＦＬＴ３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との反応と、を比較することによって容易に試験することができる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、ＦＬＴ３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原には本質的または実質的に結合しない（すなわち、第１の結合ドメインは、ＦＬＴ３以外のタンパク質に結合する能力を有さず、第２の結合ドメインは、ＣＤ３以外のタンパク質に結合する能力を有さない）。
「本質的／実質的に結合しない」または「結合する能力を有さない」という用語は、本発明の結合ドメインが、ＦＬＴ３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に結合せず、すなわち、ＦＬＴ３またはＣＤ３に対する結合をそれぞれ１００％に設定した場合、ＦＬＴ３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との反応性は、３０％以下であり、好ましくは、２０％以下、より好ましくは、１０％以下、特に好ましくは、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、または５％以下であるということを意味する。
特異的な結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列における特定のモチーフによって影響されると考えられる。したがって、結合は、その一次構造、二次構造、及び／または三次構造の結果、ならびに当該構造の二次的な修飾の結果として達成される。抗原相互作用部位とその特定抗原との特異的な相互作用の結果、当該部位と抗原との単純な結合が生じ得る。さらに、抗原相互作用部位とその特定抗原との特異的な相互作用の結果、例えば、抗原の立体構造変化の誘導、抗原のオリゴマー化等に起因して、代替的または付加的にシグナルが開始し得る。
別の態様では、本発明は、標的細胞の表面に存在するヒトＦＬＴ３に結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインと、を含む二重特異性抗体構築物を提供し、第１の結合ドメインは、配列番号８１４（クラスター１）または配列番号８１６（クラスター３）に示される配列を有する、ヒトＦＬＴ３の領域内に含まれるＦＬＴ３のエピトープに結合する。
好ましくは、本発明の二重特異性抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５１～１５６、配列番号１６１～１６６、配列番号１７１～１７６、配列番号１８１～１８６、配列番号１９１～１９６、配列番号２０１～２０６、配列番号２１１～２１６、配列番号２２１～２２６、配列番号２３１～２３６、配列番号２４１～２４６、配列番号２５１～２５６、配列番号２６１～２６６、配列番号２７１～２７６、配列番号２８１～２８６、配列番号２９１～２９６、配列番号３０１～３０６、配列番号３１１～３１６、配列番号３２１～３２６、配列番号３３１～３３６、配列番号３４１～３４６、配列番号３５１～３５６、配列番号３６１～３６６、配列番号３７１～３７６、配列番号３８１～３８６、配列番号３９１～３９６、配列番号４０１～４０６、配列番号４１１～４１６、配列番号４２１～４２６、配列番号４３１～４３６、配列番号４４１～４４６、配列番号４５１～４５６、配列番号４６１～４６６、配列番号４７１～４７６、配列番号４８１～４８６、配列番号４９１～４９６、配列番号５０１～５０６、配列番号５１１～５１６、配列番号５２１～５２６、配列番号５３１～５３６、配列番号５４１～５４６、配列番号５５１～５５６、配列番号５６１～５６６、配列番号５７１～５７６、配列番号５８１～５８６、配列番号５９１～５９６、配列番号６０１～６０６、配列番号６１１～６１６、配列番号６２１～６２６、配列番号６３１～６３６、配列番号６４１～６４６、配列番号６５１～６５６、配列番号６６１～６６６、配列番号６７１～６７６、配列番号６８１～６８６、配列番号６９１～６９６、配列番号７０１～７０６、配列番号７１１～７１６、配列番号７２１～７２６、配列番号７３１～７３６、配列番号７４１～７４６、配列番号７５１～７５６、配列番号７６１～７６６、配列番号７７１～７７６、配列番号７８１～７８６、配列番号７９１～７９６からなる群より選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域とＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域とを含む。
「可変」という用語は、その配列において可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する、抗体または免疫グロブリンドメインの部分を指す（すなわち、「可変ドメイン（複数可）」）。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）とが共に対になることによって、単一の抗原結合部位が形成される。
可変性は、抗体の可変ドメイン全体を通じて均等に分布しておらず、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のそれぞれのサブドメインに集中している。こうしたサブドメインは、「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインにおいて最も保存された（すなわち、非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭまたはＦＲ）と呼ばれ、三次元空間において６つのＣＤＲの骨格となることで抗原結合表面を形成する。天然に生じる重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がβ－シート立体構造をとる４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含んでおり、こうしたＦＲＭ領域は、３つの超可変領域によって連結され、こうした超可変領域は、連結ループを形成し、場合によっては、β－シート構造の一部を形成する。それぞれの鎖における超可変領域はＦＲＭによって近接近して一緒に束ねられ、もう一方の鎖に由来する超可変領域と共に抗原結合部位の形成に寄与する（前出のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）。
「ＣＤＲ」、及びその複数形の「ＣＤＲ」という用語は、その３つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３）、その３つが重鎖可変領域の結合特性を構成する（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）相補性決定領域を指す。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基のほとんどを含み、したがって、抗体分子の機能活性に寄与するため、ＣＤＲは、抗原特異性の主な決定因子である。
ＣＤＲの境界及び長さの正確な定義は、異なる分類及び番号付けシステムに依存している。したがって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、接触（ｃｏｎｔａｃｔ）、または本明細書に記載の番号付けシステムを含む、任意の他の境界定義によって称され得る。境界は異なるものの、こうしたシステムはそれぞれ、可変配列内にいわゆる「超可変領域」を構成するものにおいてある程度の重なりを有している。したがって、こうしたシステムによるＣＤＲの定義は、隣接するフレームワーク領域に関して長さ及び境界域が異なり得る。例えば、Ｋａｂａｔ（種間の配列可変性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原－抗体複合体の結晶学的試験に基づく手法）、及び／またはＭａｃＣａｌｌｕｍ（前出のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１－９１７、及びＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）を参照のこと。さらに、抗原結合部位を特徴付ける別の基準は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるＡｂＭ定義である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照のこと。２つの残基同定手法が、重複するが同一ではない領域を定義するという点において、ハイブリッドＣＤＲを定義するためにそれらを組み合わせることができる。しかしながら、いわゆるＫａｂａｔシステムによる番号付けが好ましい。
典型的には、ＣＤＲは、限界構造として分類することができるループ構造を形成する。「限界構造（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」という用語は、抗原結合（ＣＤＲ）ループがとる主な鎖立体構造を指す。比較構造試験から、６つの抗原結合ループのうちの５つは、利用可能な立体構造のレパートリーが限られたものにすぎないということが明らかになっている。限界構造はそれぞれ、ポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴付けすることができる。したがって、抗体間で対応するループは、ループの大部分においてアミノ酸配列の可変性が高いにも関わらず、非常に類似した三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７、Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらに、採用ループ構造とその周囲のアミノ酸とには関係性が存在する。特定の限界クラスの立体構造は、ループの長さ、及びループ内の重要位置に存在するアミノ酸残基、ならびに保存されたフレームワーク（すなわち、ループの外側）内の重要位置に存在するアミノ酸残基によって定義される。したがって、特定の限界クラスへの割り当ては、こうした重要アミノ酸残基の存在に基づいて実施することができる。
「限界構造」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔ（前出のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．）によって示される、抗体の直鎖配列に関する考慮事項も含み得る。Ｋａｂａｔ番号付けスキーム（システム）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した様式で番号付けするための標準として広く採用されており、本明細書の他の箇所にも記載されるように、本発明において適用される好ましいスキームである。追加の構造考慮事項を、抗体の限界構造の決定に使用することもできる。例えば、Ｋａｂａｔの番号付けによって完全には反映されない差異は、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．の番号付けシステムによって説明することができ、及び／または他の手法によって明らかにすることができる。こうした他の手法は、例えば、結晶学及び二次元または三次元のコンピュータモデリングである。したがって、所与の抗体配列は、数ある中でも特に、適切なシャーシ（ｃｈａｓｓｉｓ）配列の同定が可能な限界クラスへと割り当てられ得る（例えば、ライブラリーにさまざまな限界構造を含めるという意図に基づいて実施される）。Ｋａｂａｔによる抗体アミノ酸配列の番号付け、及び前出のＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．によって説明される構造考慮事項、ならびに抗体構造の限界側面の解釈に対する意義については、文献において説明されている。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は、当該技術分野においてよく知られている。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照のこと。
軽鎖のＣＤＲ３、及び特に重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖可変領域内及び重鎖可変領域内における抗原結合の最も重要な決定因子を構成し得る。いくつかの抗体構築物では、重鎖ＣＤＲ３は、抗原と抗体との接触の主要領域を構成すると思われる。抗体の結合特性の変更、またはどの残基が抗原結合に寄与するかの決定に、ＣＤＲ３単独を変化させるインビトロの選択スキームを使用することができる。したがって、ＣＤＲ３は、典型的には、抗体結合部位内における分子多様性の最大の供給源である。例えば、Ｈ３は、アミノ酸残基数が２という短さになることもあり得、またはアミノ酸残基数が２６を超えることもあり得る。
古典的な全長の抗体または免疫グロブリンでは、軽（Ｌ）鎖はそれぞれ、１つの共有ジスルフィド結合によって重（Ｈ）鎖に連結される一方で、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに依存して１つまたは複数のジスルフィド結合によってお互いが連結される。ＶＨに最も近いＣＨドメインは、通常、ＣＨ１と呼ばれる。定常（「Ｃ」）ドメインは、抗原結合に直接的には関与しないが、抗体依存性細胞傷害、細胞媒介性細胞傷害、及び補体活性化などの、さまざまなエフェクター機能を示す。抗体のＦｃ領域は、重鎖定常ドメイン内に含まれ、例えば、細胞表面に位置するＦｃ受容体と相互作用する能力を有する。
組立及び体細胞変異の後の抗体遺伝子の配列は、高度に変化し、こうした変化遺伝子は、１０１０個の異なる抗体分子をコードすると推計される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。したがって、免疫系から、免疫グロブリンのレパートリーが得られる。「レパートリー」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列から完全または部分的に得られる少なくとも１つのヌクレオチド配列を指す。配列（複数可）は、重鎖のＶセグメント、Ｄセグメント、及びＪセグメント、ならびに軽鎖のＶセグメント及びＪセグメントがインビボで再編成されることによって産生し得る。あるいは、配列（複数可）は、例えば、インビトロの刺激といった、再編成が生じる応答で細胞から産生し得る。あるいは、配列（複数可）の一部またはすべてを、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、変異導入、及び他の方法によって得てよい。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号を参照のこと。レパートリーは、１つのみの配列を含み得るか、または遺伝的に多様な集団のものを含む、複数の配列を含み得る。
本発明による好ましい抗体構築物は、二重特異性抗体構築物としても定義することができ、標的細胞の表面に存在するヒトＦＬＴ３に結合する第１の（好ましくは、ヒト）結合ドメインと、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインと、を含み、第１の結合ドメインは、ＦＬ－１～ＦＬ－６５からなる群より選択される抗体と同一のＦＬＴ３のエピトープに結合し、ＦＬ－１～ＦＬ－６５からなる群より選択される抗体は、すなわち、配列番号１５１～１５６、配列番号１６１～１６６、配列番号１７１～１７６、配列番号１８１～１８６、配列番号１９１～１９６、配列番号２０１～２０６、配列番号２１１～２１６、配列番号２２１～２２６、配列番号２３１～２３６、配列番号２４１～２４６、配列番号２５１～２５６、配列番号２６１～２６６、配列番号２７１～２７６、配列番号２８１～２８６、配列番号２９１～２９６、配列番号３０１～３０６、配列番号３１１～３１６、配列番号３２１～３２６、配列番号３３１～３３６、配列番号３４１～３４６、配列番号３５１～３５６、配列番号３６１～３６６、配列番号３７１～３７６、配列番号３８１～３８６、配列番号３９１～３９６、配列番号４０１～４０６、配列番号４１１～４１６、配列番号４２１～４２６、配列番号４３１～４３６、配列番号４４１～４４６、配列番号４５１～４５６、配列番号４６１～４６６、配列番号４７１～４７６、配列番号４８１～４８６、配列番号４９１～４９６、配列番号５０１～５０６、配列番号５１１～５１６、配列番号５２１～５２６、配列番号５３１～５３６、配列番号５４１～５４６、配列番号５５１～５５６、配列番号５６１～５６６、配列番号５７１～５７６、配列番号５８１～５８６、配列番号５９１～５９６、配列番号６０１～６０６、配列番号６１１～６１６、配列番号６２１～６２６、配列番号６３１～６３６、配列番号６４１～６４６、配列番号６５１～６５６、配列番号６６１～６６６、配列番号６７１～６７６、配列番号６８１～６８６、配列番号６９１～６９６、配列番号７０１～７０６、配列番号７１１～７１６、配列番号７２１～７２６、配列番号７３１～７３６、配列番号７４１～７４６、配列番号７５１～７５６、配列番号７６１～７６６、配列番号７７１～７７６、配列番号７８１～７８６、配列番号７９１～７９６からなる群より選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域とＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域とを含む抗体である。
抗体構築物は、別の所与の抗体構築物と同一のＦＬＴ３のエピトープに結合するかということとは無関係に、例えば、本明細書で上に記載した説明及び添付の実施例のように、例えば、キメラ型または切断型の標的分子を用いるエピトープマッピングによって測定することができる。
本発明による好ましい抗体構築物は、二重特異性抗体構築物としても定義することができ、標的細胞の表面に存在するヒトＦＬＴ３に結合する第１の（好ましくは、ヒト）結合ドメインと、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインと、を含み、第１の結合ドメインは、ＦＬ－１～ＦＬ－６５からなる群より選択される抗体と結合で競合し、ＦＬ－１～ＦＬ－６５からなる群より選択される抗体は、すなわち、前述のものからなる群より選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域とＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域とを含む、抗体である。
抗体構築物は、別の所与の抗体構築物と結合で競合するかということとは無関係に、競合ＥＬＩＳＡ、または細胞に基づく競合アッセイなどの競合アッセイにおいて測定することができる。アビジンが結合した微粒子（ビーズ）を使用することもできる。アビジンをコートしたＥＬＩＳＡプレートと同様に、ビオチン標識タンパク質と反応するとき、こうしたビーズはそれぞれ、アッセイが実施可能な基質として使用することができる。抗原は、ビーズにコートされた後、第１の抗体でプレコートされる。第２の抗体が添加され、付加的に生じる任意の結合が決定される。読み取りに使用可能な手段には、フローサイトメトリーが含まれる。
１つの実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、配列番号２２７、配列番号２３７、配列番号２４７、配列番号２５７、配列番号２６７、配列番号２７７、配列番号２８７、配列番号２９７、配列番号３０７、配列番号３１７、配列番号３２７、配列番号３３７、配列番号３４７、配列番号３５７、配列番号３６７、配列番号３７７、配列番号３８７、配列番号３９７、配列番号４０７、配列番号４１７、配列番号４２７、配列番号４３７、配列番号４４７、配列番号４５７、配列番号４６７、配列番号４７７、配列番号４８７、配列番号４９７、配列番号５０７、配列番号５１７、配列番号５２７、配列番号５３７、配列番号５４７、配列番号５５７、配列番号５６７、配列番号５７７、配列番号５８７、配列番号５９７、配列番号６０７、配列番号６１７、配列番号６２７、配列番号６３７、配列番号６４７、配列番号６５７、配列番号６６７、配列番号６７７、配列番号６８７、配列番号６９７、配列番号７０７、配列番号７１７、配列番号７２７、配列番号７３７、配列番号７４７、配列番号７５７、配列番号７６７、配列番号７７７、配列番号７８７、及び配列番号７９７に示されるものからなる群より選択されるＶＨ領域を含む。
追加の実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２３８、配列番号２４８、配列番号２５８、配列番号２６８、配列番号２７８、配列番号２８８、配列番号２９８、配列番号３０８、配列番号３１８、配列番号３２８、配列番号３３８、配列番号３４８、配列番号３５８、配列番号３６８、配列番号３７８、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４０８、配列番号４１８、配列番号４２８、配列番号４３８、配列番号４４８、配列番号４５８、配列番号４６８、配列番号４７８、配列番号４８８、配列番号４９８、配列番号５０８、配列番号５１８、配列番号５２８、配列番号５３８、配列番号５４８、配列番号５５８、配列番号５６８、配列番号５７８、配列番号５８８、配列番号５９８、配列番号６０８、配列番号６１８、配列番号６２８、配列番号６３８、配列番号６４８、配列番号６５８、配列番号６６８、配列番号６７８、配列番号６８８、配列番号６９８、配列番号７０８、配列番号７１８、配列番号７２８、配列番号７３８、配列番号７４８、配列番号７５８、配列番号７６８、配列番号７７８、配列番号７８８、及び配列番号７９８に示されるものからなる群より選択されるＶＬ領域を含む。
別の実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５７＋１５８、配列番号１６７＋１６８、配列番号１７７＋１７８、配列番号１８７＋１８８、配列番号１９７＋１９８、配列番号２０７＋２０８、配列番号２１７＋２１８、配列番号２２７＋２２８、配列番号２３７＋２３８、配列番号２４７＋２４８、配列番号２５７＋２５８、配列番号２６７＋２６８、配列番号２７７＋２７８、配列番号２８７＋２８８、配列番号２９７＋２９８、配列番号３０７＋３０８、配列番号３１７＋３１８、配列番号３２７＋３２８、配列番号３３７＋３３８、配列番号３４７＋３４８、配列番号３５７＋３５８、配列番号３６７＋３６８、配列番号３７７＋３７８、配列番号３８７＋３８８、配列番号３９７＋３９８、配列番号４０７＋４０８、配列番号４１７＋４１８、配列番号４２７＋４２８、配列番号４３７＋４３８、配列番号４４７＋４４８、配列番号４５７＋４５８、配列番号４６７＋４６８、配列番号４７７＋４７８、配列番号４８７＋４８８、配列番号４９７＋４９８、配列番号５０７＋５０８、配列番号５１７＋５１８、配列番号５２７＋５２８、配列番号５３７＋５３８、配列番号５４７＋５４８、配列番号５５７＋５５８、配列番号５６７＋５６８、配列番号５７７＋５７８、配列番号５８７＋５８８、配列番号５９７＋５９８、配列番号６０７＋６０８、配列番号６１７＋６１８、配列番号６２７＋６２８、配列番号６３７＋６３８、配列番号６４７＋６４８、配列番号６５７＋６５８、配列番号６６７＋６６８、配列番号６７７＋６７８、配列番号６８７＋６８８、配列番号６９７＋６９８、配列番号７０７＋７０８、配列番号７１７＋７１８、配列番号７２７＋７２８、配列番号７３７＋７３８、配列番号７４７＋７４８、配列番号７５７＋７５８、配列番号７６７＋７６８、配列番号７７７＋７７８、配列番号７８７＋７８８、及び配列番号７９７＋７９８に示されるＶＨ領域とＶＬ領域との対からなる群より選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
さらに追加の実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、及び配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７５９、配列番号７６９、配列番号７７９、及び配列番号７８９、ならびに配列番号７９９に示されるものからなる群より選択されるポリペプチドを含む。
上記の第１の結合ドメイン（そのＣＤＲ、ＶＨ領域、及びＶＬ領域、ならびにそれらの組み合わせによって特定される）は、配列番号８１９に示される領域内に含まれるＦＬＴ３のエピトープに結合する結合ドメインとして特徴付けられる。
本明細書で使用される「二重特異性」という用語は、「少なくとも二重特異性」である抗体構築物を指し、すなわち、当該抗体構築物は、少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み、第１の結合ドメインは、１つの抗原または標的（本明細書では、ＦＬＴ３）に結合し、第２の結合ドメインは、別の抗原または標的（本明細書では、ＣＤ３）に結合する。したがって、本発明による抗体構築物は、少なくとも２つの異なる抗原または標的に対する特異性を含む。本発明の「二重特異性抗体構築物」という用語もまた、三重特異性抗体構築物などの多特異性抗体構築物を含み、３つの結合ドメインを含む三重特異性抗体構築物、または４つ以上（例えば、４つ、５つ・・・）の特異性を有する構築物を含む。
本発明による抗体構築物が、（少なくとも）二重特異性であることを考慮すると、それが天然に生じることはなく、天然に生じる産物とは著しく異なる。したがって、「二重特異性」抗体構築物または免疫グロブリンは、異なる特異性を有する少なくとも２つの異なる結合部位を有する、人工的なハイブリッドの抗体または免疫グロブリンである。二重特異性抗体構築物は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む、さまざまな方法によって産生させることができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５－３２１（１９９０）を参照のこと。
本発明の抗体構築物の少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメインは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含み得るか、または含み得ない。「ペプチドリンカー」という用語は、本発明に従って、本発明の抗体構築物の１つの（可変及び／または結合）ドメインのアミノ酸配列と、別の（可変及び／または結合）ドメインのアミノ酸配列と、がそれによってお互いに連結されるアミノ酸配列を含む。そのようなペプチドリンカーに必須となる技術特徴は、それがどのような重合活性も含まないことである。適したペプチドリンカーには、米国特許第４，７５１，１８０号及び第４，９３５，２３３号またはＷＯ８８／０９３４４において説明されるものが含まれる。ペプチドリンカーは、本発明の抗体構築物に他のドメインまたはモジュールまたは領域（半減期延長ドメインなど）を結合するためにも使用することができる。
リンカーが使用される場合、このリンカーは、好ましくは、第１のドメイン及び第２ドメインがそれぞれ、お互いに独立してその異なる結合特異性を確実に保持することができる十分な長さ及び配列を有する。本発明の抗体構築物において少なくとも２つの結合ドメイン（または２つの可変ドメイン）を連結するペプチドリンカーについては、少数のアミノ酸残基のみを含むペプチドリンカーが好ましく、そのアミノ酸残基数は、例えば、１２以下である。したがって、アミノ酸残基数が、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５であるペプチドリンカーが好ましい。有するアミノ酸残基数が４以下の想定ペプチドリンカーが含むアミノ酸残基（複数可）数は、４、３、２、または１であり、Ｇｌｙ含量が高いリンカーが好ましい。当該「ペプチドリンカー」との関連において特定の好ましい「単一」アミノ酸は、Ｇｌｙである。したがって、当該ペプチドリンカーは、単一のアミノ酸であるＧｌｙからなり得る。ペプチドリンカーの別の好ましい実施形態は、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒというアミノ酸配列、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）またはそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘ（ｘは、１以上の整数（例えば、２または３）である）によって特徴付けられる。好ましいリンカーは、配列番号１～９に示される。当該ペプチドリンカーの特徴は、二次構造形成を促進しないことである。こうした特徴は当該技術分野において知られており、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６－９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１－３０）、及びＲａａｇ ａｎｄ Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３－８０）において説明されている。さらに、どのような二次構造形成も促進しないペプチドリンカーが好ましい。当該ドメインのお互いの連結は、例えば、実施例に記載のように、遺伝子工学によってなし得る。融合し、機能可能なように連結された二重特異性単鎖構築物の調製方法、及び哺乳動物細胞または細菌におけるその発現は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、ＷＯ９９／５４４４０、またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１を参照のこと）。
本明細書で上に記載したように、本発明は、抗体構築物が、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ－単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ、及びそれらの形式のいずれかのオリゴマーからなる群より選択される形式である好ましい実施形態を提供する。
特定の好ましい実施形態によれば、及び添付の実施例に記載されるように、本発明の抗体構築物は、「二重特異性単鎖抗体構築物」であり、より好ましくは、二重特異性「単鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）である。Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換えの方法を使用し、それらをＶＬ領域とＶＨ領域とが対となって１価の分子を形成する単一のタンパク質鎖にすることが可能な、本明細書の前述の合成リンカーによって、それらを連結することができる。例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照のこと。こうした抗体断片は、当業者に知られる通常の手法を使用して得られ、断片は、全抗体または全長抗体と同一の様式で機能が評価される。したがって、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変領域と、軽鎖（ＶＬ）の可変領域との融合タンパク質であり、これらの領域は、通常、約１０残基～約２５残基のアミノ酸、好ましくは、約１５～２０残基のアミノ酸の短いリンカーペプチドで連結される。リンカーは、通常、溶解性を得るためのセリンまたはスレオニンに加えて、可動性を得るためにグリシンの含量が高く、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端との連結または逆の連結のいずれも可能である。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されるにもかかわらず、元々の免疫グロブリンの特異性を保持する。
二重特異性単鎖分子は、当該技術分野において知られており、ＷＯ９９／５４４４０、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５－３９７０、Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１－７０２５、Ｋｕｆｅｒ，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３－１９７、Ｌｏｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８－２１０３、Ｂｒｕｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０－２４２６、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１－５６において説明されている。単鎖抗体の産生を目的として説明される手法（数ある中でも特に、米国特許第４，９４６，７７８号、前出のＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ（２０１０）、及び前出のＬｉｔｔｌｅ（２００９）を参照のこと）を、選択標的（複数可）を特異的に認識する単鎖抗体構築物の産生に採用することができる。
２価（Ｂｉｖａｌｅｎｔ）（２価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）とも呼ばれる）または二重特異性の単鎖可変断片（（ｓｃＦｖ）２という形式を有するビ－ｓｃＦｖまたはジ－ｓｃＦｖ）は、（例えば、本明細書の前述のリンカーで）２つのｓｃＦｖ分子を連結することによって操作することができる。これらの２つのｓｃＦｖ分子が同一の結合特異性を有しているのであれば、得られる（ｓｃＦｖ）２分子は、好ましくは、２価（すなわち、同一の標的エピトープに対する２つの結合価を有する）と呼ばれることになる。２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有するのであれば、得られる（ｓｃＦｖ）２分子は、好ましくは、二重特異性と呼ばれることになる。連結は、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を産生させることによって実施することができ、これによってタンデム型のｓｃＦｖが得られる（例えば、Ｋｕｆｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８－２４４を参照のこと）。別の可能性は、２つの可変領域が共に折り畳まれるには短すぎることでｓｃＦｖに二量体化を強いるリンカーペプチド（例えば、約５残基のアミノ酸）を有するｓｃＦｖ分子を創出することである。この型は、ダイアボディ（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｌｙ １９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９０（１４）：６４４４－８を参照のこと）として知られる。
また、本発明の抗体構築物の好ましい実施形態によれば、標的抗原であるＦＬＴ３またはＣＤ３のいずれかに結合する結合ドメインの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）は、上記のペプチドリンカーを介して直接的には連結されないが、結合ドメインは、ダイアボディについて記載されるように、二重特異性分子の形成に起因して形成される。したがって、ＣＤ３結合ドメインのＶＨ鎖と、ＦＬＴ３結合ドメインのＶＬとが、そのようなペプチドリンカーを介して融合され得、一方、ＦＬＴ３結合ドメインのＶＨ鎖と、ＣＤ３結合ドメインのＶＬとが、そのようなペプチドリンカーを介して融合される。
単一ドメイン抗体は、他のＶ領域またはドメインとは独立して、特定の抗原に選択的に結合する能力を有する１つの（単量体）抗体可変ドメインのみを単に含む。最初の単一ドメインは、ラクダ科の動物において発見された重鎖抗体から操作されたものであり、こうしたものは、ＶＨＨ断片と呼ばれる。軟骨魚類もまた、重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を有しており、そこからＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。代替の手法は、例えば、ヒトまたはげっ歯類に由来する通常の免疫グロブリンから二量体可変ドメインを分離して単量体にすることによって、ＶＨまたはＶＬを単一ドメインＡｂとして得るというものである。現在、単一ドメイン抗体に関する研究のほとんどが重鎖可変ドメインに基づいているものの、軽鎖から得られたナノボディもまた、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。単一ドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディ、または単一可変ドメイン抗体と呼ばれるものである。
したがって、（単一ドメインｍＡｂ）２は、（少なくとも）２つの単一ドメインモノクローナル抗体から構成されるモノクローナル抗体構築物であり、こうした単一ドメインモノクローナル抗体は、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、及びＶＮＡＲを含む群から個々に選択される。リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態である。同様に、「ｓｃＦｖ－単一ドメインｍＡｂ」は、上記の単一ドメイン抗体の少なくとも１つと、上記のｓｃＦｖ分子の１つとから構成されるモノクローナル抗体構築物である。また、リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態である。
さらに、本発明は、標的細胞の表面に存在するヒトＦＬＴ３に結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインと、を含む二重特異性抗体構築物を提供することが想定され、第１の結合ドメインは、配列番号８１９（クラスター１）に示される領域内に含まれるＦＬＴ３のエピトープに結合する。
したがって、本発明の追加の態様では、二重特異性抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５１～１５６、配列番号１６１～１６６、配列番号１７１～１７６、配列番号１８１～１８６、配列番号１９１～１９６、配列番号２０１～２０６、配列番号２１１～２１６、配列番号２２１～２２６、配列番号２３１～２３６、配列番号２４１～２４６、配列番号２５１～２５６、配列番号２６１～２６６、配列番号２７１～２７６、配列番号２８１～２８６、配列番号２９１～２９６、配列番号３０１～３０６、配列番号３１１～３１６、配列番号３２１～３２６、配列番号３３１～３３６、配列番号３４１～３４６、配列番号３５１～３５６、配列番号３６１～３６６、配列番号３７１～３７６、配列番号３８１～３８６、配列番号３９１～３９６、配列番号４０１～４０６、配列番号４１１～４１６、配列番号４２１～４２６、配列番号４３１～４３６、配列番号４４１～４４６、配列番号４５１～４５６、配列番号４６１～４６６、配列番号４７１～４７６、配列番号４８１～４８６、配列番号４９１～４９６、配列番号５０１～５０６、配列番号５１１～５１６、配列番号５２１～５２６、配列番号５３１～５３６、配列番号５４１～５４６、配列番号５５１～５５６、配列番号５６１～５６６、配列番号５７１～５７６、配列番号５８１～５８６、配列番号５９１～５９６、配列番号６０１～６０６、配列番号６１１～６１６、配列番号６２１～６２６、配列番号６３１～６３６、配列番号６４１～６４６、配列番号６５１～６５６、配列番号６６１～６６６、配列番号６７１～６７６、配列番号６８１～６８６、配列番号６９１～６９６、配列番号７０１～７０６、配列番号７１１～７１６、配列番号７２１～７２６、配列番号７３１～７３６、配列番号７４１～７４６、配列番号７９１～７９６からなる群より選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域とＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域とを含む。
１つの実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、配列番号２２７、配列番号２３７、配列番号２４７、配列番号２５７、配列番号２６７、配列番号２７７、配列番号２８７、配列番号２９７、配列番号３０７、配列番号３１７、配列番号３２７、配列番号３３７、配列番号３４７、配列番号３５７、配列番号３６７、配列番号３７７、配列番号３８７、配列番号３９７、配列番号４０７、配列番号４１７、配列番号４２７、配列番号４３７、配列番号４４７、配列番号４５７、配列番号４６７、配列番号４７７、配列番号４８７、配列番号４９７、配列番号５０７、配列番号５１７、配列番号５２７、配列番号５３７、配列番号５４７、配列番号５５７、配列番号５６７、配列番号５７７、配列番号５８７、配列番号５９７、配列番号６０７、配列番号６１７、配列番号６２７、配列番号６３７、配列番号６４７、配列番号６５７、配列番号６６７、配列番号６９７、配列番号７０７、配列番号７１７、配列番号７２７、配列番号７３７、配列番号７４７、及び配列番号７９７に示されるものからなる群より選択されるＶＨ領域を含む。
追加の実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２３８、配列番号２４８、配列番号２５８、配列番号２６８、配列番号２７８、配列番号２８８、配列番号２９８、配列番号３０８、配列番号３１８、配列番号３２８、配列番号３３８、配列番号３４８、配列番号３５８、配列番号３６８、配列番号３７８、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４０８、配列番号４１８、配列番号４２８、配列番号４３８、配列番号４４８、配列番号４５８、配列番号４６８、配列番号４７８、配列番号４８８、配列番号４９８、配列番号５０８、配列番号５１８、配列番号５２８、配列番号５３８、配列番号５４８、配列番号５５８、配列番号５６８、配列番号５７８、配列番号５８８、配列番号５９８、配列番号６０８、配列番号６１８、配列番号６２８、配列番号６３８、配列番号６４８、配列番号６５８、配列番号６６８、配列番号６９８、配列番号７０８、配列番号７１８、配列番号７２８、配列番号７３８、配列番号７４８、及び配列番号７９８に示されるものからなる群より選択されるＶＬ領域を含む。
別の実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５７＋１５８、配列番号１６７＋１６８、配列番号１７７＋１７８、配列番号１８７＋１８８、配列番号１９７＋１９８、配列番号２０７＋２０８、配列番号２１７＋２１８、配列番号２２７＋２２８、配列番号２３７＋２３８、配列番号２４７＋２４８、配列番号２５７＋２５８、配列番号２６７＋２６８、配列番号２７７＋２７８、配列番号２８７＋２８８、配列番号２９７＋２９８、配列番号３０７＋３０８、配列番号３１７＋３１８、配列番号３２７＋３２８、配列番号３３７＋３３８、配列番号３４７＋３４８、配列番号３５７＋３５８、配列番号３６７＋３６８、配列番号３７７＋３７８、配列番号３８７＋３８８、配列番号３９７＋３９８、配列番号４０７＋４０８、配列番号４１７＋４１８、配列番号４２７＋４２８、配列番号４３７＋４３８、配列番号４４７＋４４８、配列番号４５７＋４５８、配列番号４６７＋４６８、配列番号４７７＋４７８、配列番号４８７＋４８８、配列番号４９７＋４９８、配列番号５０７＋５０８、配列番号５１７＋５１８、配列番号５２７＋５２８、配列番号５３７＋５３８、配列番号５４７＋５４８、配列番号５５７＋５５８、配列番号５６７＋５６８、配列番号５７７＋５７８、配列番号５８７＋５８８、配列番号５９７＋５９８、配列番号６０７＋６０８、配列番号６１７＋６１８、配列番号６２７＋６２８、配列番号６３７＋６３８、配列番号６４７＋６４８、配列番号６５７＋６５８、配列番号６６７＋６６８、配列番号６９７＋６９８、配列番号７０７＋７０８、配列番号７１７＋７１８、配列番号７２７＋７２８、配列番号７３７＋７３８、配列番号７４７＋７４８、及び配列番号７９７＋７９８に示される、ＶＨ領域とＶＬ領域との対からなる群より選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
追加の実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、ならびに配列番号７９９に示されるものからなる群より選択されるポリペプチドを含む。
本発明は、標的細胞の表面に存在するヒトＦＬＴ３に結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインと、を含む二重特異性抗体構築物を提供することも想定され、第１の結合ドメインは、配列番号８２１（クラスター３）に示される領域内に含まれるＦＬＴ３のエピトープに結合する。
したがって、本発明の追加の態様では、二重特異性抗体構築物の第１の結合ドメインは、下記のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域と、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域と、を含む：
配列番号６７１～６７６、配列番号６８１～６８６、配列番号７５１～７５６、配列番号７６１～７６６、配列番号７７１～７７６、及び配列番号７８１～７８６。
１つの実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号６７７、配列番号６８７、配列番号７５７、配列番号７６７、配列番号７７７、及び配列番号７８７に示されるＶＨ領域を含む。
追加の実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号６７８、配列番号６８８、配列番号７５８、配列番号７６８、配列番号７７８、及び配列番号７８８に示されるＶＬ領域を含む。
別の実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号６７７＋６７８、配列番号６８７＋６８８、配列番号７５７＋７５８、配列番号７６７＋７６８、配列番号７７７＋７７８、及び配列番号７８７＋７８８に示される、ＶＨ領域とＶＬ領域との対からなる群より選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
追加の実施形態では、本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、配列番号６７９、及び配列番号６８９、配列番号７５９、配列番号７６９、配列番号７７９、ならびに配列番号７８９に示されるものからなる群より選択されるポリペプチドを含む。
本発明による別の好ましい抗体構築物は、二重特異性抗体構築物としても定義することができ、標的細胞の表面に存在するヒトＦＬＴ３に結合する第１の（好ましくは、ヒト）結合ドメインと、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインと、を含み、第１の結合ドメインは、ＦＬ－１～ＦＬ－５３、ＦＬ－５５～ＦＬ－６０、及びＦＬ－６５からなる群より選択される抗体と結合で競合し、ＦＬ－１～ＦＬ－５３、ＦＬ－５５～ＦＬ－６０、及びＦＬ－６５からなる群より選択される抗体は、すなわち、前述のものからなる群より選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域とＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域とを含む、抗体である。
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、リンパ球（それ自体が白血球の１つの型）の１つの型であり、細胞媒介性免疫において中心的な役割を担っている。Ｔ細胞にはサブセットがいくつか存在し、それぞれが異なる機能を有している。Ｔ細胞は、細胞表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在することによって、Ｂ細胞及びＮＫ細胞などの他のリンパ球と区別することができる。ＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識する役割を担っており、２つの異なるタンパク質鎖から構成される。Ｔ細胞の９５％で、ＴＣＲは、アルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖からなる。ＴＣＲが、抗原ペプチド及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ複合体）と結合すると、Ｔリンパ球は、関連酵素、共受容体、特殊アダプター分子、及び活性化または放出される転写因子によって媒介される一連の生化学的事象を介して活性化する。
ＣＤ３受容体複合体は、タンパク質複合体であり、４つの鎖から構成される。哺乳動物では、複合体は、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含む。こうした鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びいわゆるζ（ゼータ）鎖と会合することでＴ細胞受容体ＣＤ３複合体を形成し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの、高度に関連する細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内末端は、単一の保存モチーフを含んでおり、このモチーフは、免疫受容体活性化チロシンモチーフまたはその略語のＩＴＡＭとして知られており、ＴＣＲのシグナル伝達能力に必須となるものである。ＣＤ３イプシロン分子は、ヒトでは、染色体１１に存在するＣＤ３Ｅ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。ＣＤ３イプシロンの最も好ましいエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインのアミノ酸残基１～２７の範囲内に含まれる。
少なくとも二重特異性である多特異性の抗体構築物により、Ｔ細胞の動員を介して標的細胞が溶解するように再指向させるには、細胞溶解性シナプスの形成、ならびにパーフォリン及びグランザイムの送達が必要である。関与するＴ細胞は、標的細胞を連続的に溶解させる能力を有し、ペプチド抗原のプロセシング及び提示、またはクローンＴ細胞の分化を妨害する免疫回避機構による影響を受けない。例えば、ＷＯ２００７／０４２２６１を参照のこと。
ＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物によって媒介される細胞傷害性は、さまざまな方法で測定することができる。実施例１０を参照のこと。エフェクター細胞は、例えば、刺激した濃縮（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞または無刺激（ヒト）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。標的細胞がマカク（ｍａｃａｑｕｅ）起源のものであるか、またはマカクＦＬＴ３を発現するか、もしくはマカクＦＬＴ３が遺伝子導入されたものであるならば、エフェクター細胞もまた、例えば、４１１９ＬｎＰｘといったマカクＴ細胞株などのマカク起源のものであるべきである。標的細胞は、例えば、ヒトまたはマカクのＦＬＴ３といったＦＬＴ３（の少なくとも細胞外ドメイン）を発現するべきである。標的細胞は、例えば、ヒトまたはマカクのＦＬＴ３といったＦＬＴ３が安定的または一過性に遺伝子導入された細胞株（ＣＨＯなど）であり得る。あるいは、標的細胞は、ＦＬＴ３陽性ヒトＡＭＬ細胞株であるＥＯＬ－１、ＭＯＬＭ－１３、及びＭＶ４－１１などのＦＬＴ３陽性天然発現細胞株であり得る。通常、細胞表面にＦＬＴ３を高レベルで発現する標的細胞株では、ＥＣ５０値は、低くなることが予測される。エフェクターと標的細胞との比（Ｅ：Ｔ）は、通常、約１０：１であるが、変わることもあり得る。ＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性は、５１－クロム放出アッセイ（約１８時間のインキュベート時間）またはＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ（約４８時間のインキュベート時間）において測定することができる。アッセイのインキュベート時間（細胞傷害反応）を改変することも可能である。細胞傷害性を測定する他の方法は、当業者によく知られており、こうした方法には、ＭＴＴアッセイまたはＭＴＳアッセイ、生物発光アッセイを含むＡＴＰに基づくアッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、ＷＳＴアッセイ、クローン形成アッセイ、及びＥＣＩＳ技術が含まれる。
本発明のＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物によって媒介される細胞傷害活性は、好ましくは、細胞に基づく細胞傷害性アッセイにおいて測定される。５１－クロム放出アッセイにおいても測定され得る。細胞傷害活性は、ＥＣ５０値によって示され、ＥＣ５０値は、５０％有効濃度（ベースラインと最大値との中間の細胞傷害反応を誘導する抗体構築物濃度）に相当する。好ましくは、ＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、≦５０００ｐＭまたは≦４０００ｐＭであり、より好ましくは、≦３０００ｐＭまたは≦２０００ｐＭ、さらにより好ましくは、≦１０００ｐＭまたは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは、≦４００ｐＭまたは≦３００ｐＭ、さらにより好ましくは、≦２００ｐＭ、さらにより好ましくは、≦１００ｐＭ、さらにより好ましくは、≦５０ｐＭ、さらにより好ましくは、≦２０ｐＭまたは≦１０ｐＭ、及び最も好ましくは、≦５ｐＭである。
上記の所与のＥＣ５０値は、異なるアッセイにおいて測定することができる。刺激／濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用すると、無刺激のＰＢＭＣのものと比較してＥＣ５０値が低くなると予測され得ることが当業者に知られている。さらに、標的細胞の標的抗原発現数が多いと、標的の発現数が少ないラットのものと比較してＥＣ５０値が低くなると予測され得る。例えば、刺激／濃縮ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞がエフェクター細胞として使用（ならびにＦＬＴ３を遺伝子導入した、ＣＨＯ細胞などの細胞、またはＦＬＴ３陽性ヒトＡＭＬ細胞株であるＥＯＬ－１、ＭＯＬＭ－１３、及びＭＶ４－１１が標的細胞として使用）されると、ＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは、≦１０００ｐＭ、より好ましくは、≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは、≦２５０ｐＭ、さらにより好ましくは、≦１００ｐＭ、さらにより好ましくは、≦５０ｐＭ、さらにより好ましくは、≦１０ｐＭ、及び最も好ましくは、≦５ｐＭである。ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用されると、ＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは、≦５０００ｐＭまたは≦４０００ｐＭであり（特に、標的細胞がＦＬＴ３陽性ヒトＡＭＬ細胞株であるＥＯＬ－１、ＭＯＬＭ－１３、及びＭＶ４－１１であるとき）、より好ましくは、≦２０００ｐＭ（特に、標的細胞が、ＦＬＴ３を遺伝子導入した、ＣＨＯ細胞などの細胞であるとき）、より好ましくは、≦１０００ｐＭまたは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは、≦２００ｐＭ、さらにより好ましくは、≦１５０ｐＭ、さらにより好ましくは、≦１００ｐＭ、及び最も好ましくは、≦５０ｐＭまたはそれ未満である。ＬｎＰｘ４１１９などのマカクＴ細胞株がエフェクター細胞として使用され、マカクＦＬＴ３を遺伝子導入した、ＣＨＯ細胞などの細胞株が標的細胞株として使用されると、ＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは、≦２０００ｐＭまたは≦１５００ｐＭであり、より好ましくは、≦１０００ｐＭまたは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは、≦３００ｐＭまたは≦２５０ｐＭ、さらにより好ましくは、≦１００ｐＭ、及び最も好ましくは、≦５０ｐＭである。
好ましくは、本発明のＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ＣＨＯ細胞などのＦＬＴ３陰性細胞の溶解を誘導／媒介しないか、または本質的に誘導／媒介しない。「溶解を誘導しない」、「溶解を本質的に誘導しない」、「溶解を媒介しない」、または「溶解を本質的に媒介しない」という用語は、ＦＬＴ３陽性ヒト肺がん細胞株ＳＨＰ－７７（上記を参照のこと）の溶解を１００％に設定した場合、本発明の抗体構築物がＦＬＴ３陰性細胞の溶解を誘導または媒介する割合が、３０％以下であり、好ましくは、２０％以下、より好ましくは、１０％以下、特に好ましくは、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、または５％以下であることを意味する。このことは、通常、抗体構築物の濃度が５００ｎＭに至るまで当てはまる。当業者であれば、細胞溶解の測定方法を知っており、別段の労力はかからない。さらに、本明細書では、細胞溶解の測定方法について具体的な説明が教示される。
個々のＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の単量体アイソフォームと二量体アイソフォームとの細胞傷害活性の差異は、「効力ギャップ」と称される。この効力ギャップは、例えば、分子の単量体形態のＥＣ５０値と二量体形態のＥＣ５０値との比として計算することができ、これについては、実施例１７を参照のこと。本発明のＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力ギャップは、好ましくは、≦５であり、より好ましくは、≦４、さらにより好ましくは、≦３、さらにより好ましくは、≦２、及び最も好ましくは、≦１である。
本発明の抗体構築物の第１及び／または第２の（または任意の追加の）結合ドメイン（複数可）は、好ましくは、霊長類の哺乳類目のメンバーに対して種間にまたがる特異性を有する。種間特異的ＣＤ３結合ドメインは、例えば、ＷＯ２００８／１１９５６７において説明されている。実施形態の１つによれば、第１の結合ドメイン及び／または第２の結合ドメインは、それぞれヒトＦＬＴ３及びヒトＣＤ３に対する結合に加えて、（限定はされないが）、新世界霊長類（コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）、またはコモンリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）など）、旧世界霊長類（ヒヒ及びマカクなど）、テナガザル、オランウータン、ならびに非ヒトであるヒト亜科（ｈｏｍｉｎｉｎａｅ）を含む霊長類のＦＬＴ３／ＣＤ３にも結合することになる。標的細胞の表面に存在するヒトＦＬＴ３に結合する本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、少なくともマカクＦＬＴ３にも結合し、及び／またはＴ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインは、少なくともマカクＣＤ３にも結合すると想定される。好ましいマカクは、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）である。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）も想定される。
本発明の態様の１つでは、第１の結合ドメインは、ヒトＦＬＴ３に結合し、カニクイザルのＦＬＴ３などのマカクＦＬＴ３にさらに結合し、より好ましくは、マカク細胞の表面に発現したマカクＦＬＴ３に結合する。好ましいカニクイザルのＦＬＴ３は、配列番号８０２に示される。マカクＦＬＴ３に対する第１の結合ドメインの親和性は、好ましくは、≦１５ｎＭであり、より好ましくは、≦１０ｎＭ、さらにより好ましくは、≦５ｎＭ、さらにより好ましくは、≦１ｎＭ、さらにより好ましくは、≦０．５ｎＭ、さらにより好ましくは、≦０．１ｎＭ、及び最も好ましくは、≦０．０５ｎＭ、または≦０．０１ｎＭでさえある。
好ましくは、本発明による抗体構築物のマカクＦＬＴ３結合性とヒトＦＬＴ３結合性とを比較した際の親和性ギャップ［マカクＦＬＴ３：ヒトＦＬＴ３］（例えば、ＢｉａＣｏｒｅまたはスキャッチャード解析によって決定される）は、＜１００であり、好ましくは、＜２０、より好ましくは、＜１５、さらに好ましくは、＜１０、さらにより好ましくは、＜８、より好ましくは、＜６、及び最も好ましくは、＜２である。本発明による抗体構築物のマカクＦＬＴ３結合性とヒトＦＬＴ３結合性とを比較した際の親和性ギャップの好ましい範囲は、０．１～２０であり、より好ましくは、０．２～１０、さらにより好ましくは、０．３～６、さらにより好ましくは、０．５～３または０．５～２．５、及び最も好ましくは、０．５～２または０．６～２である。実施例５を参照のこと。
本発明の抗体構築物の実施形態の１つでは、第２の結合ドメインは、ヒトＣＤ３イプシロン、及びコモンマーモセット、ワタボウシタマリン、またはコモンリスザルのＣＤ３イプシロンに結合する。好ましくは、第２の結合ドメインは、こうしたＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合する。第２の結合ドメインは、ヒト及びマカクのＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合するとも想定される。ＣＤ３イプシロンの最も好ましいエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインのアミノ酸残基１～２７の範囲内に含まれる。さらにより具体的には、エピトープは、少なくともＧｌｎ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｇｌｕというアミノ酸配列を含む。コモンマーモセット及びワタボウシタマリンは両方共、マーモセット科（Ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈｉｄａｅ）のファミリー属する新世界霊長類であり、一方、コモンリスザルは、オマキザル科（Ｃｅｂｉｄａｅ）のファミリーに属する新世界霊長類である。
本発明の抗体構築物は、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインが、
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２８に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２９に示されるＣＤＲ－Ｌ３と、
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１１７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１１８に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１１９に示されるＣＤＲ－Ｌ３と、
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５３に示されるＣＤＲ－Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５４に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５５に示されるＣＤＲ－Ｌ３と、
から選択されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが特に好ましい。
本発明の抗体構築物の代替の好ましい実施形態では、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインは、
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４に示されるＣＤＲ－Ｈ３と、
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３０に示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３１に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３２に示されるＣＤＲ－Ｈ３と、
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号４８に示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号５０に示されるＣＤＲ－Ｈ３と、
（ｄ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６６に示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６７に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６８に示されるＣＤＲ－Ｈ３と、
（ｅ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８５に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８６に示されるＣＤＲ－Ｈ３と、
（ｆ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０４に示されるＣＤＲ－Ｈ３と、
（ｇ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２０に示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２１に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２２に示されるＣＤＲ－Ｈ３と、
（ｈ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１３８に示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１３９に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４０に示されるＣＤＲ－Ｈ３と、
（ｉ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５６に示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５７に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５８に示されるＣＤＲ－Ｈ３と、
（ｊ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７５に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７６に示されるＣＤＲ－Ｈ３と、
から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域を含む。
本発明の抗体構築物は、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインが、配列番号１８、配列番号２７、配列番号３６、配列番号４５、配列番号５４、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号９９、及び配列番号１０２（ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３５、配列番号３９、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１６１、または配列番号１６５も併せて参照のこと）に示されるＶＬ領域からなる群より選択されるＶＬ領域を含むことがさらに好ましい。
あるいは、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインは、配列番号１７、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、及び配列番号１０１（ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５、配列番号１９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号８７、配列番号９１、配列番号１０５、配列番号１０９、配列番号１２３、配列番号１２７、配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１７７、または配列番号１８１も併せて参照のこと）に示されるＶＨ領域からなる群より選択されるＶＨ領域を含むことが好ましい。
より好ましくは、本発明の抗体構築物は、
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７または配列番号２１に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５または配列番号１９に示されるＶＨ領域と、
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３５または配列番号３９に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３３または配列番号３７に示されるＶＨ領域と、
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号５３または配列番号５７に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号５１または配列番号５５に示されるＶＨ領域と、
（ｄ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号７１または配列番号７５に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６９または配列番号７３に示されるＶＨ領域と、
（ｅ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８９または配列番号９３に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８７または配列番号９１に示されるＶＨ領域と、
（ｆ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０７または配列番号１１１に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０５または配列番号１０９に示されるＶＨ領域と、
（ｇ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２５または配列番号１２９に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２３または配列番号１２７に示されるＶＨ領域と、
（ｈ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４３または配列番号１４７に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４１または配列番号１４５に示されるＶＨ領域と、
（ｉ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１６１または配列番号１６５に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５９または配列番号１６３に示されるＶＨ領域と、
（ｊ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７９または配列番号１８３に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７７または配列番号１８１に示されるＶＨ領域と、
からなる群より選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含む、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインによって特徴付けられる。
本発明の抗体構築物との関連では、配列番号１０２に示されるＶＬ領域、及び配列番号１０１に示されるＶＨ領域を含む、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインも好ましい。
本発明の抗体構築物の好ましい実施形態によれば、結合ドメイン、特に、第２の結合ドメイン（Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する）は、下記の形式を有する：ＶＨ領域とＶＬ領域との対は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の形式である。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨという順序で配置される。ＶＨ領域は、リンカー配列のＮ末端に位置し、ＶＬ領域は、リンカー配列のＣ末端に位置することが好ましい。
本発明の上記の抗体構築物の好ましい実施形態は、
配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３（ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２３、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５９、配列番号６１、配列番号７７、配列番号７９、配列番号９５、配列番号９７、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１８５、または配列番号１８７も併せて参照のこと）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインによって特徴付けられる。
本発明の抗体構築物は、標的分子であるＦＬＴ３及びＣＤ３に結合するその機能に加えて、追加の機能を有することも想定される。この形式では、抗体構築物は、ＦＬＴ３への結合を介して標的細胞を標的とする、ＣＤ３への結合を介して細胞傷害性Ｔ細胞の活性を媒介する、ならびにＮＫ細胞のようなエフェクター細胞の動員を介して抗体依存性細胞傷害を媒介する完全機能型のＦｃ定常ドメイン、標識（蛍光等）、毒素もしくは放射性核種などの治療薬剤、及び／または血中半減期の増進手段等などの追加機能の提供によって三機能性または多機能性の抗体構築物である。
本発明の抗体構築物の血中半減期の延長手段の例には、ペプチド、タンパク質、またはタンパク質のドメインを抗体構築物に融合あるいは結合させることが含まれる。ペプチド、タンパク質、またはタンパク質ドメインの群には、血清アルブミンなどの、ヒトの体において好ましい薬物動態プロファイルを有する他のタンパク質に結合するペプチドが含まれる（ＷＯ２００９／１２７６９１を参照のこと）。そのような半減期延長ペプチドの代替概念には、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ、ＷＯ２００７／０９８４２０を参照のこと）に結合するペプチドが含まれ、こうしたペプチドを本発明の構築物において使用することもできる。タンパク質の大きなドメイン、または完全なタンパク質を結合させるという概念には、例えば、ヒト血清アルブミンの融合、ヒト血清アルブミンの変異体（ｖａｒｉａｎｔ）もしくは変異体（ｍｕｔａｎｔ）の融合（ＷＯ２０１１／０５１４８９、ＷＯ２０１２／０５９４８６、ＷＯ２０１２／１５０３１９、ＷＯ２０１３／１３５８９６、ＷＯ２０１４／０７２４８１、ＷＯ２０１３／０７５０６６を参照のこと）、またはそのドメインの融合、ならびに免疫グロブリンの定常ドメイン（Ｆｃドメイン）及びその変異体の融合が含まれる。Ｆｃドメインのそのような変異体は、二量体または多量体の所望の対形成を可能にするために、Ｆｃ受容体結合性（例えば、Ｆｃγ受容体）を消去するために、または他の理由で、最適化／改変され得る。ヒトの体において小型のタンパク質化合物の半減期を延長するための、当該技術分野において知られる追加の概念は、本発明の抗体構築物など、それらの化合物のペグ化である。
好ましい実施形態では、本発明の抗体構築物は、下記のように説明される：
（ａ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、及び配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７５９、配列番号７６９、配列番号７７９、及び配列番号７８９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・任意選択で、配列番号１０に示されるものなどのＨｉｓ－タグ、
（ｂ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、及び配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７５９、配列番号７６９、配列番号７７９、及び配列番号７８９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・任意選択で、配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号１０４～１３４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・任意選択で、配列番号１０に示されるものなどのＨｉｓ－タグ、
（ｃ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・Ｘ１がＹまたはＨであるアミノ酸配列
Figure 0007011574000003
を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、及び配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７５９、配列番号７６９、配列番号７７９、及び配列番号７８９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・アミノ酸配列
Figure 0007011574000004
を有するポリペプチド；ならびに
・任意選択で、配列番号１０に示されるものなどのＨｉｓ－タグ、
（ｄ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号１７、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、及び配列番号１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２３８、配列番号２４８、配列番号２５８、配列番号２６８、配列番号２７８、配列番号２８８、配列番号２９８、配列番号３０８、配列番号３１８、配列番号３２８、配列番号３３８、配列番号３４８、配列番号３５８、配列番号３６８、配列番号３７８、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４０８、配列番号４１８、配列番号４２８、配列番号４３８、配列番号４４８、配列番号４５８、配列番号４６８、配列番号４７８、配列番号４８８、配列番号４９８、配列番号５０８、配列番号５１８、配列番号５２８、配列番号５３８、配列番号５４８、配列番号５５８、配列番号５６８、配列番号５７８、配列番号５８８、配列番号５９８、配列番号６０８、配列番号６１８、配列番号６２８、配列番号６３８、配列番号６４８、配列番号６５８、配列番号６６８、配列番号６７８、配列番号６８８、配列番号６９８、配列番号７０８、配列番号７１８、配列番号７２８、配列番号７３８、配列番号７４８、配列番号７５８、配列番号７６８、配列番号７７８、配列番号７８８、及び配列番号７９８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつＣ末端にセリン残基を有するポリペプチド；
・配列番号１４０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、配列番号２２７、配列番号２３７、配列番号２４７、配列番号２５７、配列番号２６７、配列番号２７７、配列番号２８７、配列番号２９７、配列番号３０７、配列番号３１７、配列番号３２７、配列番号３３７、配列番号３４７、配列番号３５７、配列番号３６７、配列番号３７７、配列番号３８７、配列番号３９７、配列番号４０７、配列番号４１７、配列番号４２７、配列番号４３７、配列番号４４７、配列番号４５７、配列番号４６７、配列番号４７７、配列番号４８７、配列番号４９７、配列番号５０７、配列番号５１７、配列番号５２７、配列番号５３７、配列番号５４７、配列番号５５７、配列番号５６７、配列番号５７７、配列番号５８７、配列番号５９７、配列番号６０７、配列番号６１７、配列番号６２７、配列番号６３７、配列番号６４７、配列番号６５７、配列番号６６７、配列番号６７７、配列番号６８７、配列番号６９７、配列番号７０７、配列番号７１７、配列番号７２７、配列番号７３７、配列番号７４７、配列番号７５７、配列番号７６７、配列番号７７７、配列番号７８７、及び配列番号７９７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号１８、配列番号２７、配列番号３６、配列番号４５、配列番号５４、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号９９、及び配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつＣ末端にセリン残基を有するポリペプチド；
・配列番号１４１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｅ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号１７、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、及び配列番号１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２３８、配列番号２４８、配列番号２５８、配列番号２６８、配列番号２７８、配列番号２８８、配列番号２９８、配列番号３０８、配列番号３１８、配列番号３２８、配列番号３３８、配列番号３４８、配列番号３５８、配列番号３６８、配列番号３７８、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４０８、配列番号４１８、配列番号４２８、配列番号４３８、配列番号４４８、配列番号４５８、配列番号４６８、配列番号４７８、配列番号４８８、配列番号４９８、配列番号５０８、配列番号５１８、配列番号５２８、配列番号５３８、配列番号５４８、配列番号５５８、配列番号５６８、配列番号５７８、配列番号５８８、配列番号５９８、配列番号６０８、配列番号６１８、配列番号６２８、配列番号６３８、配列番号６４８、配列番号６５８、配列番号６６８、配列番号６７８、配列番号６８８、配列番号６９８、配列番号７０８、配列番号７１８、配列番号７２８、配列番号７３８、配列番号７４８、配列番号７５８、配列番号７６８、配列番号７７８、配列番号７８８、及び配列番号７９８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号１４２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、配列番号２２７、配列番号２３７、配列番号２４７、配列番号２５７、配列番号２６７、配列番号２７７、配列番号２８７、配列番号２９７、配列番号３０７、配列番号３１７、配列番号３２７、配列番号３３７、配列番号３４７、配列番号３５７、配列番号３６７、配列番号３７７、配列番号３８７、配列番号３９７、配列番号４０７、配列番号４１７、配列番号４２７、配列番号４３７、配列番号４４７、配列番号４５７、配列番号４６７、配列番号４７７、配列番号４８７、配列番号４９７、配列番号５０７、配列番号５１７、配列番号５２７、配列番号５３７、配列番号５４７、配列番号５５７、配列番号５６７、配列番号５７７、配列番号５８７、配列番号５９７、配列番号６０７、配列番号６１７、配列番号６２７、配列番号６３７、配列番号６４７、配列番号６５７、配列番号６６７、配列番号６７７、配列番号６８７、配列番号６９７、配列番号７０７、配列番号７１７、配列番号７２７、配列番号７３７、配列番号７４７、配列番号７５７、配列番号７６７、配列番号７７７、配列番号７８７、及び配列番号７９７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号１８、配列番号２７、配列番号３６、配列番号４５、配列番号５４、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号９９、及び配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつＣ末端にセリン残基を有するポリペプチド［ＣＤ３ ＶＬ］；
・配列番号１４３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｆ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド［Ｖ５ヘテロ－Ｆｃ］：
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、及び配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７５９、配列番号７６９、配列番号７７９、及び配列番号７８９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号１４４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列番号１４５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｇ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、及び配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７５９、配列番号７６９、配列番号７７９、及び配列番号７８９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号１４６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号１４７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｈ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、及び配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７５９、配列番号７６９、配列番号７７９、及び配列番号７８９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号１４８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号１４９に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
（ｉ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、及び配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７５９、配列番号７６９、配列番号７７９、及び配列番号７８９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
・配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｊ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、及び配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７５９、配列番号７６９、配列番号７７９、及び配列番号７８９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
・配列番号８４３～８５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第３のドメイン。
本発明の好ましい態様では、ヒトＦＬＴ３に対する第１の結合ドメインの結合が、ＦＬＴ３－リガンドによって、≦２５％、好ましくは≦２０％、より好ましくは≦１５％、さらに好ましくは≦１０％、さらにより好ましくは≦８％、より好ましくは≦６％、及び最も好ましくは≦２％減少する。
実施例１８に詳細に記載されるように、ＦＬ－５３、ＦＬ－５４、ＦＬ－６１、Ｆ－６２、ＦＬ－６３、及びＦＬ－６４（これらはすべて、ＦＬＴ３のエピトープクラスター３に結合する）は、ＦＬＴ３とのＦＬＴ３－リガンド相互作用について説明される領域にエピトープを有するものの、こうした結合体（ｂｉｎｄｅｒ）を含む構築物は、実施例１８に記載の基準値を依然として上回る結合シグナルを示すことが明らかとなり、これは驚くべきことであった。
さらに、ＦＬＴ３リガンドと、エピトープクラスター３の領域との相互作用の観点から、クラスター１などの、ＦＬＴ３のさらに遠位のエピトープクラスターを標的とする結合体であれば、ＦＬＴ３リガンドによる競合によって影響を受けることはないであろうとも想定された。しかしながら、７５％基準値に到達しない結合体が相当数存在した。ＦＬＴ３リガンドによる競合に感受性を有さない群に属する結合体は、結合体ＦＬ－１～ＦＬ－５３、結合体ＦＬ－５５～ＦＬ－６０、及び結合体ＦＬ－６５であった。
上記のように、本発明の好ましい抗体構築物のいくつかは、アルブミンまたはアルブミン変異体などの別の部分との融合によって改変される。こうした融合構築物が、その特性、特に、標的親和性または細胞傷害活性について特徴付けられるのであれば、類似の融合構築物または未改変の二重特異性抗体構築物は、類似の（または向上した）特性を有すると予測できることを当業者であれば認識するであろう。例えば、アルブミンと融合した二重特異性抗体構築物が、認識可能または望ましい細胞傷害活性または標的親和性を有しているのであれば、アルブミンを含まない構築物では、同一／類似、またはそれより向上した細胞傷害活性／標的親和性でさえ観測されることになると予測できる。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の二重特異性抗体構築物は、（２つの結合ドメインに加えて）それぞれがヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド単量体を含む第３のドメインを含み、当該２つのポリペプチド（またはポリペプチド単量体）は、ペプチドリンカーを介してお互いに融合される。好ましくは、当該第３のドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順序で、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。当該第３のドメインに好ましいアミノ酸配列は、配列番号８４３～８５０に示される。当該２つのポリペプチド単量体はそれぞれ、好ましくは、配列番号８３５～８４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するか、またはそれらの配列との同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体構築物の第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９からなる群より選択されるペプチドリンカーを介して第３のドメインに融合される。
本発明によれば、「ヒンジ」は、ＩｇＧのヒンジ領域である。この領域は、Ｋａｂａｔの番号付けを使用し、類似性によって同定することができる。Ｋａｂａｔによる位置２２３～２４３を参照のこと。上記によれば、「ヒンジ」に最小限必要となるものは、Ｋａｂａｔの番号付けによるＤ２３１～Ｐ２４３のＩｇＧ１配列区間に対応するアミノ酸残基である。ＣＨ２及びＣＨ３という用語は、免疫グロブリン重鎖の定常領域２及び定常領域３を指す。こうした領域もまた、Ｋａｂａｔの番号付けを使用し、類似性によって同定することができる。ＣＨ２については、Ｋａｂａｔによる位置２４４～３６０、及びＣＨ３については、Ｋａｂａｔによる位置３６１～４７８を参照のこと。そのＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ Ｆｃ領域、ＩｇＧ３ Ｆｃ領域、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ＩｇＭ Ｆｃ領域、ＩｇＡ Ｆｃ領域、ＩｇＤ Ｆｃ領域、及びＩｇＥ Ｆｃ領域に関して、免疫グロブリンの間で何らかのばらつきが存在すると理解される（例えば、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３１（３），１６９－２１７（１９９３）を参照のこと）。Ｆｃ単量体という用語は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの重鎖定常領域、ならびにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの重鎖定常領域を指す。Ｆｃ単量体は、こうしたドメインのＮ末端に可動性ヒンジも含み得る。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、Ｆｃ単量体は、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧについては、Ｆｃ部分は、免疫グロブリンドメインであるＣＨ２及びＣＨ３、ならびに最初の２つのドメインとＣＨ２との間にヒンジを含む。免疫グロブリンのＦｃ部分の境界は変わり得るものの、機能性のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ部分の例では、例えば、（ヒンジドメインの）残基Ｄ２３１～（ＣＨ３ドメインのＣ末端の）Ｐ４７６を含むと定義でき、またはＩｇＧ４についてはそれぞれ残基Ｄ２３１～Ｌ４７６を含むと定義することができ、こうした番号付けは、Ｋａｂａｔによるものである。
したがって、本発明の抗体構築物は、Ｎ末端からＣ末端の順序で、
（ａ）第１の結合ドメインと、
（ｂ）配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
（ｃ）第２の結合ドメインと、
（ｄ）配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、及び配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
（ｅ）第３のドメインの第１のポリペプチド単量体（ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む）と、
（ｆ）配列番号８５２、配列番号８５３、配列番号８５４、及び配列番号８５５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
（ｇ）第３のドメインの第２のポリペプチド単量体（ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む）と、
を含み得る。
本発明の抗体構築物は、Ｎ末端からＣ末端の順序で、
・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６７９、及び配列番号６８９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７５９、配列番号７６９、配列番号７７９、及び配列番号７８９、ならびに配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第１の結合ドメインと、
・配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３（ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２３、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５９、配列番号６１、配列番号７７、配列番号７９、配列番号９５、配列番号９７、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１８５、または１８７も併せて参照のこと）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第２の結合ドメインと、
・配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、及び配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
・配列番号８４３～８５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第３のドメインと、
を含むことも好ましい。
好ましい実施形態では、本発明の抗体構築物は、配列番号８５６～８７１に示されるポリペプチドを含むかまたはそれからなる。
本発明の抗体構築物の好ましい実施形態の１つでは、抗体構築物は、配列番号８５６、配列番号８５８、配列番号８６０、配列番号８６２、配列番号８６４、配列番号８６６、配列番号８６８、及び配列番号８７０に示されるポリペプチドの１つを含むか、またはそれからなる。
本発明の抗体構築物の代替の好ましい実施形態の１つでは、抗体構築物は、配列番号８５７、配列番号８５９、配列番号８６１、配列番号８６３、配列番号８６５、配列番号８６７、配列番号８６９、及び配列番号８７１に示されるポリペプチドの１つを含むか、またはそれからなる。
本発明の抗体構築物の好ましい実施形態では、抗体構築物は、配列番号８５８、配列番号８５９、配列番号８６２、配列番号８６３、配列番号８６４、及び配列番号８６５に示されるポリペプチドを含むかまたはそれからなる。
抗体構築物の共有結合修飾もまた、本発明の範囲内に含まれ、一般に、常にではないが、こうした共有結合修飾は、翻訳後になされる。例えば、抗体構築物のいくつかの型の共有結合修飾は、抗体構築物の特定のアミノ酸残基と、選択側鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基と反応する能力を有する有機誘導体化剤と、を反応させることによって分子に導入される。
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα－ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応させることで、カルボキシメチル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体を生成する。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α－ブロモ－β－（５－イミドゾイル（ｉｍｉｄｏｚｏｙｌ））プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ－アルキルマレイミド、３－ニトロ－２－ピリジルジスルフィド、メチル２－ピリジルジスルフィド、ｐ－クロロメルクリ安息香酸（ｐ－ｃｈｌｏｒｏｍｅｒｃｕｒｉｂｅｎｚｏａｔｅ）、２－クロロメルクリ－４－ニトロフェノール、またはクロロ－７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５～７．０でジエチルピロカルボネートと反応させることによって誘導体化される。この理由は、この物質がヒスチジル側鎖に相対的に特異的なためである。パラ－ブロモフェナシルブロミドも有用であり、反応は、好ましくは、ｐＨ６．０の０．１Ｍのカコジル酸ナトリウムにおいて実施される。リジニル残基及びアミノ末端残基は、無水コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。こうした物質を用いた誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆転させる作用を有する。アルファ－アミノ含有残基の誘導体化に適した他の試薬には、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ－メチルイソ尿素、２，４－ペンタンジオン、及びグリオキシルレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
アルギニル残基は、１つまたはいくつかの通常の試薬との反応によって修飾され、こうした試薬には、フェニルグリオキサール、２，３－ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンが含まれる。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルカリ条件下で反応を実施する必要がある。さらに、こうした試薬は、リジンに存在する基、ならびにアルギニンのイプシロン－アミノ基と反応し得る。
チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって、チロシル残基にスペクトル標識を導入するという特定の目的で実施され得る。最も一般的には、Ｎ－アセチルイミジゾール（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）及びテトラニトロメタンが、それぞれＯ－アセチルチロシル種及び３－ニトロ誘導体を形成するために使用される。チロシル残基は、放射免疫アッセイにおいて使用するための標識タンパク質を調製するために、１２５Ｉまたは１３１Ｉを使用してヨウ素化され、このヨウ素化には、上記のクロラミンＴ法が適している。
カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－－Ｒ’）との反応によって選択的に修飾され、ここで、Ｒ及びＲ’は、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－４－エニル）カルボジイミドまたは１－エチル－３－（４－アゾニア－４，４－ジメチルフェニル）カルボジイミドなどの、任意選択で異なるアルキル基である。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基へと変換される。
二官能性物質を用いた誘導体化は、本発明の抗体構築物を架橋して、さまざまな方法において使用するための水不溶性の支持マトリックスまたは表面を得るために有用である。一般に使用される架橋剤には、例えば、１，１－ビス（ジアゾアセチル）－２－フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４－アジドサリチル酸とのエステル、３，３’－ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス－Ｎ－マレイミド－１，８－オクタンなどの二官能性マレイミドが含まれる。メチル－３－［（ｐ－アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤からは、光存在下で架橋形成する能力を有する、光活性化が可能な中間体が得られる。あるいは、臭化シアンで活性化した糖質などの、反応性の水不溶性マトリックス、ならびに米国特許第３，９６９，２８７号、第３，６９１，０１６号、第４，１９５，１２８号、第４，２４７，６４２号、第４，２２９，５３７号、及び第４，３３０，４４０号において説明される反応性物質がタンパク質の固定化に用いられる。
グルタミニル残基及びアスパラギニル残基は、脱アミド化されることが多く、その結果、それぞれ対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基が得られる。あるいは、こうした残基は、穏和な酸性条件下で脱アミド化される。こうした残基のいずれの形態も本発明の範囲に入る。
他の修飾には、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖、及びヒスチジン側鎖のα－アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９－８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびにＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
本発明の範囲に含まれる、抗体構築物の別の型の共有結合修飾には、タンパク質の糖鎖修飾パターンの変更が含まれる。当該技術分野において知られるように、糖鎖修飾パターンは、タンパク質配列（例えば、糖鎖修飾が生じる特定のアミノ酸残基の存在有無であり、これについては以下に議論される）、またはタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物の両方に依存し得る。特定の発現系については以下に議論される。
ポリペプチドの糖鎖修飾は、典型的には、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖に糖質部分が結合していること指す。アスパラギン－Ｘ－セリン、及びアスパラギン－Ｘ－スレオニン（Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸）というトリ－ペプチド配列は、アスパラギン側鎖に糖質部分が酵素的に結合するための認識配列である。したがって、これらのトリ－ペプチド配列のいずれかがポリペプチドに存在すると、潜在的な糖鎖修飾部位が創出される。Ｏ結合型の糖鎖修飾は、糖であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンに結合することを指すが、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリジンも結合先として使用され得る。
糖鎖修飾部位の抗体構築物への追加は、（Ｎ結合型の糖鎖修飾部位については）１つまたは複数の上記のトリ－ペプチド配列を抗体構築物が含むようにアミノ酸配列を変更することによって好都合に達成される。変更は、（Ｏ結合型の糖鎖修飾部位については）１つもしくは複数のセリン残基もしくはスレオニン残基を出発配列に追加するか、または１つもしくは複数のセリン残基もしくはスレオニン残基によって出発配列を置換することによっても実施し得る。簡便には、抗体構築物のアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変更を介して、具体的には、ポリペプチドをコードするＤＮＡの事前選択塩基への変異導入によって変更され、その結果、所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンが生成する。
抗体構築物に存在する糖質部分の数を増やす別の手段は、タンパク質に対するグリコシドの化学的または酵素的なカップリングによるものである。こうした手順は、Ｎ結合型糖鎖修飾及びＯ結合型糖鎖修飾のための糖鎖修飾能力を有する宿主細胞においてタンパク質を産生させる必要がないという点において有利である。使用するカップリングモードに応じて、糖（複数可）は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合し得る。こうした方法は、ＷＯ８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９－３０６において説明されている。
出発抗体構築物に存在する糖質部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的な脱糖鎖修飾には、トリフルオロメタンスルホン酸化合物または同等化合物に対するタンパク質の曝露が必要である。この処理の結果、連結糖（Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたはすべての糖が切断される一方で、ポリペプチドは未変化のまま残る。化学的な脱糖鎖修飾については、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２、及びＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって説明されている。ポリペプチドに存在する糖質部分の酵素的な切断は、さまざまなエンド－グリコシダーゼ及びエキソ－グリコシダーゼを使用することによって達成できる。このことについては、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって説明されている。潜在的な糖鎖修飾部位における糖鎖修飾は、ツニカマイシン化合物を使用することによって阻止し得る。このことについては、Ｄｕｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５によって説明されている。ツニカマイシンは、タンパク質－Ｎ－グリコシド結合の形成を遮断する。
本明細書では、抗体構築物の他の修飾も企図される。例えば、抗体構築物の別の型の共有結合修飾には、さまざまな非タンパク質性ポリマーへの抗体構築物の連結が含まれ、こうした非タンパク質性ポリマーには、限定はされないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーなどのさまざまなポリオールが含まれ、こうしたものは、米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号、または第４，１７９，３３７号において示される様式で使用される。さらに、当該技術分野において知られるように、例えば、ＰＥＧなどのポリマーの付加を容易にするために、抗体構築物内のさまざまな位置にアミノ酸置換が導入され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体構築物の共有結合修飾は、１つまたは複数の標識の付加を含む。標識基は、潜在的な立体障害を低減するために、さまざまな長さのスペーサーアームを介して抗体構築物にカップリングされ得る。タンパク質の標識化については、さまざまな方法が当該技術分野において知られており、本発明の実施において使用することができる。「標識」または「標識基」という用語は、任意の検出可能な標識を指す。一般に、標識は、それが検出されることになるアッセイに応じてさまざまなクラスに分類される。こうした標識には、限定はされないが、下記の例が含まれる：
ａ）放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）などの放射性同位体または重同位体であり得る同位体標識
ｂ）磁性標識（例えば、磁性粒子）
ｃ）酸化還元活性部分
ｄ）蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、化学発光基、及び「小分子」蛍光体またはタンパク質性蛍光体のいずれかであり得るフルオロフォアなどの光学色素（限定はされないが、発色団、リン光体、及びフルオロフォアを含む）
ｅ）酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
ｆ）ビオチン標識基
ｇ）第２のレポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーの対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ等）。
「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性を介して検出し得る任意の分子を意味する。適した蛍光標識には、限定はされないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル－クマリン、ピレン、マラカイトグリーン（Ｍａｌａｃｉｔｅ ｇｒｅｅｎ）、スチルベン、ルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ）、Ｃａｓｃａｄｅ ＢｌｕｅＪ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ７０５、Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ、及びＲ－フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン、ならびにＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）が含まれる。フルオロフォアを含む、適した光学色素については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄにおいて説明されている。
適したタンパク質性蛍光標識には、限定はされないが、Ｒｅｎｉｌｌａ種、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ種、またはＡｅｑｕｏｒｅａ種のＧＦＰを含む緑色蛍光タンパク質（Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２－８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．１８０１ ｄｅ Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ Ｈ３Ｈ １Ｊ９、Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：４６２－４７１、Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８－１８２）、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８－５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３－２６０７）、ならびにＲｅｎｉｌｌａ（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５，２９２，６５８号、第５，４１８，１５５号、第５，６８３，８８８号、第５，７４１，６６８号、第５，７７７，０７９号、第５，８０４，３８７号、第５，８７４，３０４号、第５，８７６，９９５号、第５，９２５，５５８号）もまた含まれる。
ロイシンジッパードメインは、それが存在するタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において最初に同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９）、それ以来、さまざまな異なるタンパク質において見つかっている。既知のロイシンジッパーは、天然に生じ、二量体化または三量体化するペプチド及びその誘導体である。可溶性オリゴマータンパク質の産生に適したロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８において説明されており、肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーについては、Ｈｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１において説明されている。それに融合する異種性タンパク質の安定な三量体化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用については、Ｆａｎｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７－７８において説明されている。１つの手法では、ロイシンジッパーペプチドに融合したＦＬＴ３抗体断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質は、適した宿主細胞において発現され、形成される可溶性のオリゴマー化ＦＬＴ３抗体断片または誘導体は培養上清から回収される。
本発明の抗体構築物は、追加のドメインも含み得、こうした追加ドメインは、例えば、分子の単離に役立つか、または分子の薬物動態プロファイルの適合と関連する。抗体構築物の単離に役立つドメインは、ペプチドモチーフまたは二次的に導入された部分から選択され得、こうしたものは、例えば、単離カラムといった単離方法で捕捉することができる。そのような追加のドメインの実施形態には、限定はされないが、Ｍｙｃ－タグ、ＨＡＴ－タグ、ＨＡ－タグ、ＴＡＰ－タグ、ＧＳＴ－タグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ－タグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ－タグ）、Ｆｌａｇ－タグ、Ｓｔｒｅｐ－タグ及びその変種（例えば、ＳｔｒｅｐＩＩ－タグ）、ならびにＨｉｓ－タグとして知られるペプチドモチーフが含まれる。特定のＣＤＲによって特徴付けられた本明細書に開示の抗体構築物はすべて、Ｈｉｓ－タグドメインを含むことが好ましく、Ｈｉｓ－タグドメインは、一般に、分子のアミノ酸配列においてＨｉｓ残基が連続する反復配列として知られ、Ｈｉｓ残基の数は、好ましくは、５であり、より好ましくは、６（ヘキサ－ヒスチジン）である。Ｈｉｓ－タグは、例えば、抗体構築物のＮ末端またはＣ末端に位置し得、好ましくは、Ｃ末端に位置する。最も好ましくは、ヘキサ－ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１０）が、本発明による抗体構築物のＣ末端にペプチド結合を介して連結される。
本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、標的細胞の表面に存在するヒトＦＬＴ３に結合する。ヒトＦＬＴ３の好ましいアミノ酸配列は、番号８０１、番号８０３、番号８０４、及び番号８０５に示される。本発明との関連では、「表面に存在する」という用語は、結合ドメインが、ＦＬＴ３の細胞外ドメイン（ＦＬＴ３ ＥＣＤ、配列番号８１３を参照のこと）内に含まれるエピトープに特異的に結合することを意味すると理解される。したがって、本発明による第１の結合ドメインは、好ましくは、天然に発現する細胞もしくは細胞株、及び／またはＦＬＴ３が形質転換もしくは（安定的／一過性に）遺伝子導入された細胞もしくは細胞株によってＦＬＴ３が発現するとＦＬＴ３に結合する。好ましい実施形態では、ＢＩＡｃｏｒｅまたはスキャッチャードなどの、インビトロの結合アッセイにおいて「標的」分子または「リガンド」分子としてＦＬＴ３が使用されても、第１の結合ドメインはＦＬＴ３に結合する。「標的細胞」は、その細胞表面にＦＬＴ３を発現する任意の原核細胞または真核細胞であり得、好ましくは、標的細胞は、ヒトまたは動物の体の一部である細胞であり、卵巣がん細胞、膵がん細胞、中皮腫細胞、肺がん細胞、胃がん細胞、及び三種陰性乳がん細胞などである。
「ＦＬＴ３ ＥＣＤ」という用語は、ＦＬＴ３の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを本質的に含まない形態のＦＬＴ３を指す。本発明のＦＬＴ３ポリペプチドを対象として同定される膜貫通ドメインは、当該技術分野においてその型の疎水性ドメインの同定に日常的に用いられる基準に従って同定されることを当業者であれば理解するであろう。膜貫通ドメインの正確な境界は変わり得るものの、こうして変動し得るアミノ酸残基数は、本明細書で具体的に言及されるドメインのいずれかの末端で約５以下である可能性が最も高い。好ましいヒトＦＬＴ３ ＥＣＤは、配列番号８１３に示される。
ヒトＦＬＴ３に対する第１の結合ドメインの親和性は、好ましくは、≦２０ｎＭであり、より好ましくは、≦１０ｎＭ、さらにより好ましくは、≦５ｎＭ、さらにより好ましくは、≦２ｎＭ、さらにより好ましくは、≦１ｎＭ、さらにより好ましくは、≦０．６ｎＭ、さらにより好ましくは、≦０．５ｎＭ、及び最も好ましくは、≦０．４ｎＭである。親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイまたはスキャッチャードアッセイにおいて測定することができ、例えば、実施例に記載されるとおりである。他の親和性決定方法も当業者によく知られている。
本明細書に記載の抗体構築物のアミノ酸配列の改変もまた企図される。例えば、抗体構築物の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。抗体構築物のアミノ酸配列変異体は、抗体構築物の核酸にヌクレオチドの適切な変更を加えることによって調製されるか、またはペプチド合成によって調製される。下記のアミノ酸配列改変はすべて、未改変の親分子の所望の生物学的活性（ＦＬＴ３に対する結合及びＣＤ３に対する結合）を依然として保持した抗体構築物を与えることになる。
「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は、典型的には、下記のものからなる群より選択されるアミノ酸などの、その技術分野において認知された定義を有するアミノ酸を指す：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＨｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、及びバリン（ＶａｌまたはＶ）。しかしながら、望まれるときは、改変アミノ酸、合成アミノ酸、または希少アミノ酸が使用され得る。一般に、アミノ酸は、非極性の側鎖を有するもの（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）、負に荷電した側鎖を有するもの（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、正に荷電した側鎖を有するもの（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）、または電荷の無い極性側鎖を有するもの（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）に分類することができる。
アミノ酸改変には、例えば、抗体構築物のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が含まれる。最終的な構築物を得るために欠失、挿入、及び置換が任意の組み合わせで実施されるが、但し、最終的な構築物は、所望の特性を有する。糖鎖修飾部位の数または位置の変更などの、アミノ酸の変更を実施すると、抗体構築物の翻訳後プロセスにも変化が生じ得る。
例えば、それぞれのＣＤＲにおける挿入アミノ酸または欠失アミノ酸の残基数は、１、２、３、４、５、または６であり得（当然のことながら、ＣＤＲの長さに依存する）、一方、それぞれのＦＲにおける挿入アミノ酸または欠失アミノ酸の残基数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５であり得る。好ましくは、アミノ酸配列の挿入には、単一または複数のアミノ酸残基の内部配列への挿入に加えて、１残基、２残基、３残基、４残基、５残基、６残基、７残基、８残基、９残基、または１０残基から、１００以上の残基を含むポリペプチドまでの範囲の長さでのアミノ末端融合及び／またはカルボキシル末端融合が含まれる。本発明の抗体構築物の挿入変異体には、抗体構築物のＮ末端もしくはＣ末端に対する酵素の融合、または抗体構築物の血中半減期を増加させるポリペプチドに対する融合が含まれる。
置換変異導入に最も関心の高い対象部位には、重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ、具体的には、超可変領域が含まれるが、重鎖及び／または軽鎖のＦＲにおける変更も企図される。置換は、好ましくは、本明細書に記載の保存的置換である。好ましくは、ＣＤＲまたはＦＲの長さに応じて、ＣＤＲにおける置換アミノ酸残基数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得、一方、フレームワーク領域（ＦＲ）における置換アミノ酸残基数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５であり得る。例えば、ＣＤＲ配列が６残基のアミノ酸を含むのであれば、こうしたアミノ酸の１残基、２残基、または３残基が置換されると想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５残基のアミノ酸を含むのであれば、こうしたアミノ酸の１残基、２残基、３残基、４残基、５残基、または６残基が置換されると想定される。
変異導入に好ましい位置となる、抗体構築物のある特定の残基または領域の同定に有用な方法は、「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれ、この方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５（１９８９）によって説明されている。本明細書では、アミノ酸とエピトープとの相互作用に影響を与えるために、抗体構築物内の残基または標的残基群が同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）によって交換される。
置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置は、その後、置換部位において、または置換部位を対象として、追加の変異または別の変異を導入することによって洗練される。したがって、アミノ酸配列変異を導入する部位または領域は事前に決定されるが、変異自体の性質が事前決定される必要はない。例えば、所与の部位における変異能力を分析または最適化するために、標的のコドンまたは領域においてアラニンスキャニングまたは無作為変異導入が実施され得、発現する抗体構築物変異体は、所望の活性の最適な組み合わせが得られるように選別される。既知の配列を有するＤＮＡの所定部位に置換変異を導入する手法はよく知られており、例えば、Ｍ１３プライマーによる変異導入またはＰＣＲによる変異導入である。変異体の選別は、ＦＬＴ３結合性またはＣＤ３結合性などの抗原結合活性のアッセイを使用して実施される。
一般に、重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲの１つもしくは複数またはすべてにおいてアミノ酸置換が実施されるのであれば、そうして得られた「置換」配列は、「元々の」ＣＤＲ配列に対する同一性が、少なくとも６０％または６５％であることが好ましく、より好ましくは、７０％または７５％、さらにより好ましくは、８０％または８５％、及び特に好ましくは、９０％または９５％である。このことは、「置換」配列に対する同一性がどの程度であるかは、ＣＤＲの長さに依存することを意味する。例えば、５残基のアミノ酸を有するＣＤＲが、少なくとも１残基のアミノ酸置換を有するためには、好ましくは、その置換配列に対する同一性は８０％である。したがって、抗体構築物のＣＤＲは、その置換配列に対して異なる程度の同一性を有し得、例えば、ＣＤＲＬ１は、８０％の同一性を有し得、一方、ＣＤＲＬ３は、９０％の同一性を有し得る。
好ましい置換（また交換）は、保存的置換である。しかしながら、抗体構築物が、第１の結合ドメインを介してＦＬＴ３に結合するその能力と共に、第２の結合ドメインを介してＣＤ３またはＣＤ３イプシロンに結合するその能力を保持し、及び／またはそのＣＤＲが、そうして置換された配列に対する同一性を有する（「元々の」ＣＤＲ配列に対する同一性が、少なくとも６０％または６５％、より好ましくは、７０％または７５％、さらにより好ましくは、８０％または８５％、及び特に好ましくは、９０％または９５％）限り、任意の置換（非保存的置換、または以下の表１に記載の「例示の置換」に由来する１つもしくは複数を含む）が想定される。
表１には、保存的置換が「好ましい置換」という見出しの下に示される。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらすのであれば、表１に示される「例示の置換」と命名された追加の実質的な変更、またはアミノ酸のクラスへの参照においてさらに後述される追加の実質的な変更が導入され得、所望の特性が得られるように産物が選別される。
（表１）アミノ酸置換
Figure 0007011574000005
本発明の抗体構築物の生物学的特性の実質的な改変は、下記のものの維持に対するその効果が顕著に異なる置換を選択することによって達成される。（ａ）例えば、シートもしくはらせん状の立体構造といった、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さ。天然に生じる残基は、共通の側鎖特性に基づいて群分けされる：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ、（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、（５）鎖の配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ、及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存的置換は、こうしたクラスの１つに属するメンバーと、別のクラスのメンバーとの交換を伴うことになる。分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を阻止するために、抗体構築物の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基が、一般には、セリンで置換され得る。逆に、（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片であるとき）その安定性を改善するために、システイン結合（複数可）が抗体に追加され得る。
アミノ酸配列については、配列同一性及び／または類似性は、当該技術分野において知られる標準的な手法を使用することによって決定され、こうした手法には、限定はされないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索方法、こうしたアルゴリズムをコンピュータ化して実装したもの（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７－３９５によって説明されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム（こうしたものでは、好ましくは、デフォルトの設定が使用される）、または目視検査（ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）によるものが含まれる。好ましくは、同一性割合は、下記のパラメーターに基づくＦａｓｔＤＢによって計算される：１の不適合ペナルティ、１のギャップペナルティ、０．３３のギャップサイズペナルティ、及び３０の連結ペナルティ、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，” Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ １２７－１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ。
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰでは、進行性のペアワイズアライメントを使用し、関連配列群に由来する複数の配列アライメントが創出される。ＰＩＬＥＵＰでは、アライメントの創出に使用される関係性をクラスター化して示すツリーもプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰでは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１－３６０の進行性アライメント法を単純化したものが使用される。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３によって説明されるものと類似している。ＰＩＬＥＵＰで有用なパラメーターには、３．００のデフォルトギャップウエイト、０．１０のデフォルトギャップ長ウエイト、及びウエイト化末端ギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｅｎｄ ｇａｐ）が含まれる。
有用なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、及びＫａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５７８７において説明されている。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムであり、このプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０－４８０から得られたものである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２では、いくつかの検索パラメーターが使用され、それらのほとんどがデフォルト値に設定される。調整可能なパラメーターは、下記の値に設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード限界値（Ｔ）＝ＩＩ。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２というパラメーターは、動的な値であり、特定の配列の構成、及び関心対象配列が検索される特定のデータベースの構成に応じてプログラム自体によって確立されるが、感度を高めるために値を調整してよい。
追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２によって報告されたギャップ化ＢＬＡＳＴである。ギャップ化ＢＬＡＳＴでは、ＢＬＯＳＵＭ－６２という置換スコアが使用される。限界値Ｔのパラメーターは、９に設定される。非ギャップ化伸長を生じさせるツー・ヒット法（ｔｗｏ－ｈｉｔ ｍｅｔｈｏｄ）では、ｋのギャップ長に１０＋ｋのコストが課される。Ｘｕは、１６に設定され、データベース検索段階については、Ｘｇは４０に設定され、アルゴリズムのアウトプット段階については６７に設定される。ギャップ化アライメントは、スコアが約２２ビットに相当することによって生じる。
一般に、個々の変異体ＣＤＲ間のアミノ酸相同性、類似性、または同一性は、本明細書に示される配列に対して少なくとも６０％であり、より典型的には、相同性または同一性は、少なくとも６５％または７０％、より好ましくは、少なくとも７５％または８０％、さらにより好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びほぼ１００％という、好ましくは高いものになる。類似の様式では、本明細書で同定される結合タンパク質の核酸配列に関する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、候補配列におけるヌクレオチド残基が、抗体構築物のコード配列におけるヌクレオチド残基と同一である割合として定義される。特定の方法では、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２のＢＬＡＳＴＮモジュールは、デフォルトのパラメーター設定で利用され、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションは、それぞれ１及び０．１２５に設定される。
一般に、個々の変異体ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と、本明細書に示されるヌクレオチドとの核酸配列の相同性、類似性、または同一性は、少なくとも６０％であり、より典型的には、相同性及び同一性は、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、及びほぼ１００％という、好ましくは高いものになる。したがって、「変異体ＣＤＲ」は、本発明の親ＣＤＲに対する特定の相同性、類似性、または同一性を有するものであり、限定はされないが、親ＣＤＲの特異性及び／または活性の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含む生物学的機能を共有する。
１つの実施形態では、ヒト生殖系列に対する本発明による抗体構築物の同一性割合は、≧７０％または≧７５％であり、より好ましくは、≧８０％または≧８５％、さらにより好ましくは、≧９０％、及び最も好ましくは、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、または≧９６％でさえある。実施例８を参照のこと。ヒト抗体生殖系列の遺伝子産物に対する同一性は、治療の間に患者において薬物に対する免疫応答を治療タンパク質が誘発する危険を低減するための重要な特徴であると考えられる。Ｈｗａｎｇ ＆ Ｆｏｏｔｅ（“Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”；Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）３－１０）では、薬物である抗体構築物の非ヒト部分を減らすことで、治療の間に患者において抗薬物抗体が誘導される危険の低減につながることが示されている。臨床的に評価された抗体薬物と、それぞれの免疫原性データとを包括的な数で比較することによって、非ヒトＶ領域の変更を有さない抗体のもの（平均２３．５９％の患者）と比較して、抗体のＶ領域をヒト化することでタンパク質の免疫原性が下がる（平均５．１％の患者）という傾向が示されている。したがって、抗体構築物の形態における、Ｖ領域に基づくタンパク質治療学には、ヒト配列に対する同一性の程度が高いことが望ましい。生殖系列同一性を決定するというこの目的については、ベクターＮＴＩソフトウェアを使用し、ＶＬのＶ領域と、ヒト生殖系列のＶセグメント及びＪセグメントのアミノ酸配列と、のアライメントをとることができ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）、アミノ酸配列は、同一のアミノ酸残基をＶＬのアミノ酸残基の総数で割ることによってパーセントで計算される。ＶＨセグメントについて同じことができるが（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）、ＶＨ ＣＤＲ３は、その多様性が大きく、ヒト生殖系列ＶＨ ＣＤＲ３の現存アライメントパートナーが存在しないことから例外として除外され得る。その後、ヒト抗体生殖系列遺伝子に対する配列同一性を増加させるために組換えの手法を使用することができる。
追加の実施形態では、本発明の二重特異性抗体構築物は、例えば、標準的な２段階の精製プロセスといった標準的な研究スケールの条件下で高い単量体収量を示す。好ましくは、本発明による抗体構築物の単量体収量は、上清濃度で≧０．２５ｍｇ／Ｌであり、より好ましくは、上清濃度で≧０．５ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは、≧１ｍｇ／Ｌ、及び最も好ましくは、≧３ｍｇ／Ｌである。
同様に、二量体抗体構築物アイソフォームの収量を決定することができ、したがって、抗体構築物の単量体の割合（すなわち、単量体：（単量体＋二量体））を決定することができる。単量体及び二量体の抗体構築物の生産性、ならびに計算単量体割合は、例えば、ローラーボトルにおける標準化された研究スケールの生産に由来する培養上清のＳＥＣ精製段階において得ることができる。１つの実施形態では、抗体構築物の単量体の割合は、≧８０％であり、より好ましくは、≧８５％、さらにより好ましくは、≧９０％、及び最も好ましくは、≧９５％である。
１つの実施形態では、抗体構築物が有する好ましい血漿中安定性（血漿無しのＥＣ５０に対する血漿有りのＥＣ５０の比率）は、≦５または≦４であり、より好ましくは、≦３．５または≦３、さらにより好ましくは、≦２．５または≦２、及び最も好ましくは、≦１．５または≦１である。抗体構築物の血漿中安定性は、ヒト血漿において構築物を３７℃で２４時間インキュベートした後、５１－クロム放出細胞傷害性アッセイにおいてＥＣ５０を決定することによって試験できる。細胞傷害性アッセイでは、エフェクター細胞は、刺激した濃縮ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞であり得る。標的細胞は、例えば、ヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞であり得る。エフェクターと標的細胞との比（Ｅ：Ｔ）は、１０：１を選択することができる。この目的に使用されるヒト血漿プールは、ＥＤＴＡをコートしたシリンジによって収集した健康なドナーの血液から得られる。細胞成分は、遠心分離によって除去され、上にくる血漿相が収集された後にプールされる。対照としての抗体構築物は、細胞傷害性アッセイの直前にＲＰＭＩ－１６４０培地において希釈される。血漿中安定性は、ＥＣ５０（対照）に対するＥＣ５０（血漿中でのインキュベート後）の比率として計算される。実施例１３を参照のこと。
さらに、本発明の抗体構築物の、単量体から二量体への変換は少ないことが好ましい。変換は、異なる条件下で測定し、高速サイズ排除クロマトグラフィーによって分析することができる。実施例１１を参照のこと。例えば、３７℃で７日間、例えば、１００μｇ／ｍｌまたは２５０μｇ／ｍｌの濃度でインキュベーターにおいて抗体構築物の単量体アイソフォームのインキュベートを実施することができる。こうした条件下で本発明の抗体構築物が示す二量体の割合は、≦５％であることが好ましく、より好ましくは、≦４％、さらにより好ましくは、≦３％、さらにより好ましくは、≦２．５％、さらにより好ましくは、≦２％、さらにより好ましくは、≦１．５％、及び最も好ましくは、≦１％または≦０．５％もしくは０％でさえある。
本発明の二重特異性抗体構築物は、多数の凍結／解凍サイクルを実施した後に生じる二量体への変換が非常に少ないことも好ましい。例えば、抗体構築物単量体は、例えば、一般的な製剤緩衝液においてその濃度を２５０μｇ／ｍｌに調整し、３回の凍結／解凍サイクル（－８０℃で３０分間凍結した後、室温で３０分間解凍）に供した後、高速ＳＥＣを実施することで、初期は単量体抗体構築物であったものが二量体抗体構築物に変換された割合が決定される。例えば、３回の凍結／解凍サイクルの後に二重特異性抗体構築物が二量体である割合は、好ましくは、≦５％であり、より好ましくは、≦４％、さらにより好ましくは、≦３％、さらにより好ましくは、≦２．５％、さらにより好ましくは、≦２％、さらにより好ましくは、≦１．５％、及び最も好ましくは、≦１％であるか、または≦０．５％でさえある。
本発明の二重特異性抗体構築物は、好ましくは、有利な熱安定性を示し、その凝集温度は、≧４５℃または≧５０℃であり、より好ましくは、≧５２℃または≧５４℃、さらにより好ましくは、≧５６℃または≧５７℃、及び最も好ましくは、≧５８℃または≧５９℃である。熱安定性パラメーターは、下記のように抗体凝集温度に関して決定することができる：濃度２５０μｇ／ｍｌの抗体溶液を使い捨てキュベットに移し、動的光散乱（ＤＬＳ）装置に設置する。加熱速度０．５℃／分で４０℃から７０℃に試料を加熱し、径を一定して測定取得する。径の増加がタンパク質の融解及び凝集を示すことを利用することで抗体の凝集温度が計算される。実施例１２を参照のこと。
あるいは、抗体構築物の固有の生物物理学的タンパク質安定性を決定するために、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって温度融解曲線を決定することができる。こうした実験は、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ）ＶＰ－ＤＳＣ装置を使用して実施される。抗体構築物を含む試料のエネルギー取り込みが２０℃～９０℃で記録され、製剤緩衝液のみを含む試料と比較される。抗体構築物は、例えば、ＳＥＣランニング緩衝液において２５０μｇ／ｍｌの最終濃度に調整される。それぞれの融解曲線の記録するために、試料の全体温度が段階的に引き上げられる。それぞれの温度Ｔにおいて、試料及び参照用製剤緩衝液のエネルギー取り込みが記録される。試料のものから参照のものを差し引いたエネルギー取り込みＣｐ（ｋｃａｌ／モル／℃）の差異が、それぞれの温度に対してプロットされる。融点は、最初に最大のエネルギー取り込みが生じた温度として定義される。
さらに、本発明のＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ヒトＦＬＴ３のパラログであるＫＩＴ ｖ１（配列番号８０５）、ＣＳＦ１Ｒ ｖ１（配列番号８０６）、ＰＤＧＦＲＡ（配列番号８０７）、及び／またはＮＴＭ ｖ３（配列番号８０８）と交差反応しない（すなわち、それに本質的に結合しない）と想定される。さらに、本発明のＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物は、マカク／カニクイザルＦＬＴ３のパラログであるＫＩＴ ｖ１、ＣＳＦ１Ｒ ｖ１、ＰＤＧＦＲＡ、及び／またはＮＴＭ ｖ３と交差反応しない（すなわち、それに本質的に結合しない）と想定される。実施例７を参照のこと。
本発明のＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物が有する濁度は、（精製した単量体抗体構築物を２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で一晩インキュベートした後、ＯＤ３４０によって測定すると）≦０．２であり、好ましくは、≦０．１５、より好ましくは、≦０．１２、さらにより好ましくは、≦０．１、及び最も好ましくは、≦０．０８であるとも想定される。実施例１４を参照のこと。
追加の実施形態では、本発明による抗体構築物は、酸性ｐＨにおいて安定である。ｐＨ５．５などの非生理的ｐＨ（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーの実施に必要なｐＨ）における抗体構築物の耐性が高くなればなるほど、イオン交換カラムから溶出される抗体構築物の、負荷タンパク質総量に対する回収率は高くなる。ｐＨ５．５におけるイオン（例えば陽イオン）交換カラムからの抗体構築物の回収率は、好ましくは、≧３０％であり、より好ましくは、≧４０％、より好ましくは、≧５０％、さらにより好ましくは、≧６０％、さらにより好ましくは、≧７０％、さらにより好ましくは、≧８０％、さらにより好ましくは、≧９０％、さらにより好ましくは、≧９５％、及び最も好ましくは、≧９９％である。実施例１５を参照のこと。
さらに、本発明の二重特異性抗体構築物は、治療効果または抗腫瘍活性を示すと想定される。このことは、例えば、ステージが進行したヒト腫瘍異種移植片モデルの下記の例に開示される試験において評価することができる。
試験の１日目に、ヒトＦＬＴ３陽性がん細胞株（例えば、ＯＶＣＡＲ－８）の５ｘ１０６個の細胞を雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右背側側腹部に皮下注射する。平均腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達したときに、動物の腹膜腔に約２ｘ１０７個の細胞を注射することによって、インビトロで増殖させたヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞をマウスに移植する。媒体対照群１のマウスにはエフェクター細胞を投与せず、媒体対照群２（エフェクター細胞を投与）との比較用に移植無しの対照として使用することで、腫瘍増殖に対するＴ細胞単独の影響を監視する。平均腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達したときに抗体処理を開始する。処理の開始日の各処理群の平均腫瘍サイズには、他の群のいずれと比較した際も統計学的差異が存在するべきではない（分散分析）。静脈内ボーラス注射によって０．５ｍｇ／ｋｇ／日のＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物マウスで約１５～２０日間マウスを処理する。試験の間、ノギスで腫瘍を測定し、腫瘍体積（ＴＶ）の群間比較によって進行を評価する。腫瘍増殖阻害Ｔ／Ｃ［％］は、Ｔ／Ｃ％＝１００ｘ（解析群のＴＶ中央値）／（対照群２のＴＶ中央値）としてＴＶを算出することによって決定される。
有意義かつ再現性のある結果を確保しつつ、この試験のある特定のパラメーターを修正または適合させる方法は当業者に知られている。こうしたパラメーターは、注射する腫瘍細胞の数、注射部位、移植するヒトＴ細胞の数、投与されることになる二重特異性抗体構築物の量、及びタイムラインなどである。好ましくは、腫瘍増殖阻害Ｔ／Ｃ［％］は、≦７０もしくは≦６０であり、より好ましくは、≦５０もしくは≦４０、さらにより好ましくは、≦３０もしくは≦２０、及び最も好ましくは、≦１０もしくは≦５、または≦２．５でさえある。
さらに、本発明は、本発明の抗体構築物をコードするポリヌクレオチド／核酸分子を提供する。
ポリヌクレオチドは、鎖において共有結合で結合した１３以上のヌクレオチド単量体から構成される生体ポリマーである。ＤＮＡ（ｃＤＮＡなど）及びＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。ヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸分子の単量体またはサブユニットとして働く有機分子である。核酸分子またはポリヌクレオチドは、二本鎖及び一本鎖の直鎖状及び環状であり得る。核酸分子またはポリヌクレオチドは、好ましくは宿主細胞に含まれるベクターに含まれることが好ましい。当該宿主細胞は、例えば、本発明のベクターまたはポリヌクレオチドで形質転換されたかまたはそれを遺伝子導入された後に、抗体構築物を発現する能力を有する。その目的については、ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、機能可能なように制御配列に連結される。
遺伝暗号は、遺伝材料（核酸）内にコードされる情報がタンパク質に翻訳される規則のセットである。生細胞における生物学的な解読は、アミノ酸を運搬すると共に、ｍＲＮＡの３つのヌクレオチドを同時に読むためのｔＲＮＡ分子を使用し、ｍＲＮＡによって特定される順序でアミノ酸を連結するリボソームによって達成される。暗号は、コドンと呼ばれるこうしたヌクレオチドトリプレットの配列が、タンパク質合成の間にどのアミノ酸が次に付加されることになるかをどのように特定するかということを定義する。幾分かの例外は存在するものの、核酸配列における３つのヌクレオチドであるコドンは、単一のアミノ酸を特定するものである。圧倒的多数の遺伝子が、全く同一の暗号でコードされることから、この特定の暗号は、基準遺伝暗号または標準遺伝暗号と称されることが多い。遺伝暗号は、所与のコード領域のタンパク質配列を決定する一方で、他のゲノム領域は、こうしたタンパク質がいつどこで産生するかということに影響し得る。
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターを提供する。
ベクターは、（外来）遺伝材料を細胞に導入するための媒体として使用される核酸分子である。「ベクター」という用語は、限定はされないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体を包含する。一般に、操作されたベクターは、複製起点、マルチクローニング部位、及び選択可能マーカーを含む。ベクター自体は、一般に、挿入断片（導入遺伝子）、及びベクターの「骨格」として働く長い配列を含むヌクレオチド配列であり、これは通常、ＤＮＡ配列である。現代のベクターは、導入遺伝子挿入断片及び骨格に加えて、プロモーター、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的指向配列、タンパク質精製タグという追加の特徴を含み得る。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは、特に、標的細胞における導入遺伝子の発現を目的とし、一般に、制御配列を有する。
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物において機能可能なように連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択でオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係性を有するように配置されると、「機能可能なように連結されている」。例えば、プレ配列または分泌性リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現するのであれば、ポリペプチドのＤＮＡに機能可能なように連結されている。プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与えるのであれば、コード配列に機能可能なように連結されている。あるいは、リボソーム結合部位は、転写が促進されるように配置されるのであれば、コード配列に機能可能なように連結されている。一般に、「機能可能なように連結されている」は、連結されているＤＮＡ配列が近接していることを意味し、分泌性リーダーの場合、近接してリーディングフェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）内に位置することを意味する。しかしながら、エンハンサーは、近接する必要はない。連結は、簡便な制限部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しないのであれば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが通常の慣例に従って使用される。
「遺伝子導入」は、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）が標的細胞に計画的に導入されるプロセスである。用語は、主に、真核細胞における非ウイルス性の方法に使用される。形質導入は、核酸分子またはポリヌクレオチドのウイルス媒介性の導入を説明するために使用されることが多い。動物細胞の遺伝子導入には、典型的には、材料の取り込みを可能にするために、細胞膜にポアまたは「孔」を一過性に生じさせることが必要とする。遺伝子導入は、リン酸カルシウムを使用して、電気穿孔によって、細胞スクイージング（ｃｅｌｌ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）によって、または陽イオン性脂質とリポソーム生成材料との混合によって実施することができ、こうしたリポソーム生成材料は、細胞膜と融合し、その積荷を内側に移し入れるものである。
「形質転換」という用語は、細菌への核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）の非ウイルス性の導入を説明するために使用されると共に、植物細胞を含む非動物真核細胞へのこうした導入を説明するためにも使用される。したがって、形質転換は、その周辺からの細胞膜（複数可）を介した直接的な取り込み、及びそれに続く外来性遺伝材料（核酸分子）の組み込みから生じる、細菌または非動物真核細胞の遺伝的変更である。形質転換は、人工的な手段によって引き起こすことができる。形質転換を生じさせるには、細胞または細菌は、コンピテンス状態になくてはならず、こうした状態は、飢餓及び細胞密度などの環境条件に対する時限応答として生じる可能性がある。
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子またはベクターで形質転換されたかまたはそれを遺伝子導入された宿主細胞を提供する。
本明細書で使用される「宿主細胞」または「レシピエント細胞」という用語は、ベクターのレシピエント、外来性核酸分子のレシピエント、及び本発明の抗体構築物をコードするポリヌクレオチドのレシピエント、ならびに／または抗体構築物自体のレシピエントとなり得るか、またはそうなった任意の個々の細胞または細胞培養物を含むことが意図される。それぞれの材料の細胞への導入は、形質転換、遺伝子導入、及び同様のものによって実施される。「宿主細胞」という用語は、単一の細胞の子孫または潜在的子孫を含むことも意図される。天然変異、偶発変異、もしくは計画的変異、または環境的な影響のいずれかに起因して、ある特定の改変が後続世代に生じ得るため、そのような子孫は、実際のところ、親細胞と（形態学またはゲノムまたは全ＤＮＡ相補において）完全に同一ではあり得ないが、本明細書で使用される用語の範囲内に依然として含まれる。適した宿主細胞には、原核細胞または真核細胞が含まれ、限定はされないが、細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、ならびに昆虫細胞及び例えば、マウス、ラット、マカク、またはヒトといった哺乳動物細胞などの動物細胞も含まれる。
本発明の抗体構築物は、細菌において産生させることができる。発現の後、本発明の抗体構築物は、可溶性画分において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のペーストから単離され、例えば、親和性クロマトグラフィー及び／またはサイズ排除を介して精製することができる。最終的な精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現した抗体の精製プロセスと同様に実施することができる。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、本発明の抗体構築物に適したクローニング宿主または発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般に使用される。しかしながら、本明細書では、多数の他の属、種、及び株が一般に利用可能かつ有用であり、こうしたものは、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６０４５）、Ｋ．ウィッカーハミー（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４１７８）、Ｋ．ワルティー（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ．マルシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などのクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、ヤロウイア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ ４０２ ２２６）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ １８３ ０７０）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコデルマ・レシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ ２４４ ２３４）、ニューロスポラ・クラシア（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、シュワニオミセス オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、ならびにニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ならびにＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主などの糸状菌などである。
糖鎖修飾された本発明の抗体構築物の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来するものである。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変異体、ならびに対応する許容昆虫宿主細胞が同定されており、こうした対応昆虫宿主細胞としては、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主に由来するものが同定されている。遺伝子導入にはさまざまなウイルス株が公的に利用可能であり、こうしたウイルス株は、例えば、キンウワバ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ－１変異体、及びカイコＮＰＶのＢｍ－５株であり、そのようなウイルスは、本発明による本明細書のウイルスとして使用してよく、特に、ヨトウガ細胞への遺伝子導入に使用してよい。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ豆、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、及びタバコの植物細胞培養物も宿主として使用することができる。植物細胞培養物におけるタンパク質の産生において有用なクローニングベクター及び発現ベクターは当業者に知られている。例えば、Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：７６－７８、Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７９０－７９４、Ａｒｔｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ ８：７４５－７５０、及びＦｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２：９７９－９８６を参照のこと。
しかしながら、脊椎動物が最も関心の高い対象であり、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、日常的な手順となってきた。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０が形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、ヒト胚腎臓株（２９３細胞、または浮遊培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８７）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、１４１３ ８０６５）、マウス乳がん細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５ １）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２）３８３：４４－６８）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝がん株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
追加の実施形態では、本発明は、本発明の抗体構築物の産生方法を提供し、当該方法は、本発明の抗体構築物の発現が可能になる条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、産生した抗体構築物を培養物から回収することとを含む。
本明細書で使用される「培養」という用語は、培地における適した条件下での細胞のインビトロの維持、分化、増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、及び／または増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）を指す。「発現」という用語は、本発明の抗体構築物の産生に伴う任意の段階を含み、こうした段階には、限定はされないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌が含まれる。
組換えの手法を使用すると、抗体構築物を、細胞内に産生、ペリプラズム間隙に産生、または培地に直接分泌させることができる。抗体構築物が細胞内に産生するのであれば、第１段階として、宿主細胞または可溶化断片である粒子状の残骸が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２）では、大腸菌のペリプラズム間隙に分泌される抗体の単離手順について説明されている。簡潔には、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で細胞ペーストが約３０分かけて解凍される。細胞の残骸は、遠心分離によって除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、そのような発現系に由来する上清は、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルターを使用して最初に濃縮される。こうしたフィルターは、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過ユニットである。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために上述の段階のいずれに含めてもよく、外来性の汚染菌の増殖を阻止するために抗生物質を含めてよい。
宿主細胞から調製された本発明の抗体構築物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して回収または精製することができる。回収されることになる抗体に応じて、イオン交換カラム、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿での分画などの、他のタンパク質精製手法も利用可能である。本発明の抗体構築物がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。
親和性クロマトグラフィーは、好ましい精製手法である。親和性リガンドが結合されるマトリックスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも利用可能である。ポア制御型ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの力学的に安定なマトリックスでは、アガロースで達成し得るものと比較して、流速の高速化、及び処理時間の短縮が可能である。
さらに、本発明は、本発明の抗体構築物、または本発明の方法に従って産生した抗体構築物を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物では、抗体構築物の均一性は、≧８０％であることが好ましく、より好ましくは、≧８１％、≧８２％、≧８３％、≧８４％、または≧８５％、さらに好ましくは、≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％、または≧９０％、よりさらに好ましくは、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、または≧９５％、及び最も好ましくは、≧９６％、≧９７％、≧９８％、または≧９９％である。
本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、患者への投与に適した組成物に関し、こうした患者は、好ましくは、ヒト患者である。本発明の特に好ましい医薬組成物は、１つまたは複数の本発明の抗体構築物（複数可）を、好ましくは、治療上有効な量で含む。好ましくは、医薬組成物は、１つまたは複数の（医薬的に有効な）担体、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、サーファクタント、乳化剤、保存剤、及び／または補助剤の適した製剤をさらに含む。組成物の許容可能な構成成分は、好ましくは、用いる投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒なものである。本発明の医薬組成物には、限定はされないが、液体組成物、凍結組成物、及び凍結乾燥組成物が含まれる。
本発明の組成物は、医薬的に許容可能な担体を含み得る。一般に、本明細書で使用される「医薬的に許容可能な担体」は、任意及びすべての水性及び非水性の溶液、無菌溶液、溶媒、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液といった緩衝液、水、懸濁液、油／水乳濁液などの乳濁液、さまざまな型の湿潤剤、リポソーム、分散媒体、及びコーティングを意味し、こうしたものは、医薬的な投与に適合するものであり、特に、非経口投与に適合する。医薬組成物におけるそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野においてよく知られており、そのような担体を含む組成物は、よく知られた通常の方法によって製剤化することができる。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体構築物に加えて、このセクション及び本明細書の他の箇所に例示的に記載されるものなどの、１つまたは複数の賦形剤をさらに含む医薬組成物が提供される。この点に関して、賦形剤は、本発明において多種多様な目的に使用することができ、こうした目的は、粘性の調節などの、製剤の物理的、化学的、もしくは生物学的な特性の調節、ならびにまたはそのような製剤の有効性の改善及びもしくは安定化のための本発明のプロセス、ならびに例えば、製造、配送、貯蔵、使用前の調製、投与、及びその後の期間に生じるストレスに起因する分解及び損傷に対抗するプロセスなどである。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色調、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解速度または放出速度、吸収または浸透の改変、維持、または保全のための製剤材料を含み得る（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８”Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと）。そのような実施形態では、適した製剤材料には、限定はされないが、下記のものが含まれ得る：
・荷電アミノ酸を含む、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、スレオニン、プロリン、２－フェニルアラニンなどのアミノ酸、好ましくは、リジン、リジンアセテート、アルギニン、グルタメート、及び／またはヒスチジン
・抗細菌剤及び抗真菌剤などの抗微生物剤
・アスコルビン酸、メチオニン、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤
・生理学的ｐＨまたは若干低めのｐＨ、典型的には、約５～約８または約９のｐＨ範囲内に組成物のｐＨを維持するために使用される緩衝液、緩衝系、及び緩衝剤。緩衝液の例は、ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸、コハク酸塩、リン酸塩、ヒスチジン、及び酢酸塩を使用するものであり、例えば、約ｐＨ７．０～８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０～５．５の酢酸緩衝液
・プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルなどの非水性溶媒
・生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、乳濁液、または懸濁液を含む水性担体
・ポリエステルなどの生分解性ポリマー
・マンニトールまたはグリシンなどのかさ増し剤
・エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤
・等張剤及び吸収遅延剤
・カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなどの複合化剤
・増量剤
・単糖、二糖、及び他の糖質（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）。糖質は、非還元糖であり得、好ましくは、トレハロース、スクロース、オクタサルフェート、ソルビトール、またはキシリトールである。
・ヒトもしくはウシの血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどの（低分子量）タンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質性の担体であり、好ましくは、ヒト起源のもの
・着色剤及び香味剤
・グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［アルファ］－モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウムなどの含硫還元剤
・希釈剤
・乳化剤
・ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー
・ナトリウムなどの造塩対イオン
・抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス、及び同様のものなどの保存剤。保存剤の例は、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素である。
・Ｚｎ－タンパク質錯体などの金属錯体
・溶媒及び共溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど）
・トレハロース、スクロース、オクタサルフェート、マンニトール、ソルビトール、またはキシリトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコールなどの糖及び糖アルコール、ならびに多価糖アルコール
・懸濁剤
・プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０などのポリソルベート、ポリソルベート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）などのサーファクタントまたは湿潤剤。サーファクタントは、好ましくは、＞１．２ＫＤの分子量を有する界面活性剤、及び／または好ましくは、＞３ＫＤの分子量を有するポリエーテルであり得る。好ましい界面活性剤の例は、限定はされないが、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、及びＴｗｅｅｎ８５である。好ましいポリエーテルの例は、限定はされないが、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、及びＰＥＧ５０００である。
・スクロースまたはソルビトールなどの安定性増進剤
・アルカリ金属ハロゲン化物などの浸透圧増進剤。好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール
・塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油を含む非経口送達媒体
・液体及び栄養の補充剤、電解質補充剤（ブドウ糖リンゲル液に基づくものなど）を含む静脈内送達媒体。
医薬組成物の異なる構成成分（例えば、上記のもの）が異なる作用を有し得ることは、当業者には明らかなことであり、例えば、アミノ酸は、緩衝剤、安定剤、及び／または抗酸化剤として作用し得、マンニトールは、かさ増し剤及び／または浸透圧増進剤として作用し得、塩化ナトリウムは、送達媒体及び／または浸透圧増進剤として作用し得る等である。
本発明の組成物は、本明細書に定義される本発明のポリペプチドに加えて、組成物の意図される使用に応じて、生物学的に活性な薬剤をさらに含む可能性があると想定される。そのような薬剤は、胃腸管系に作用する薬物、サイトスタティカ（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃａ）として作用する薬物、高尿酸血症を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えば、副腎皮質ステロイド）、炎症反応を調節する薬物、循環器系に作用する薬物、及び／またはサイトカインなどの、当該技術分野において知られる薬剤である可能性がある。本発明の抗体構築物は、同時治療、すなわち、別の抗がん薬物との組み合わせで適用されることも想定される。
ある特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、及び所望の投与量に応じて、当業者によって決定されることになる。例えば、前出のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照のこと。ある特定の実施形態では、そのような組成物は、本発明の抗体構築物の物理的状態、安定性、インビボの放出速度、及びインビボの排出速度に影響し得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物における主要な媒体または担体は、水性または非水性のいずれかの性質を有し得る。例えば、適した媒体または担体は、注射用水、生理食塩水、または人工的な脳脊髄液であり得、こうしたものには、非経口投与向けの組成物で一般的な他の材料が添加される可能性がある。血清アルブミンと混合された中性の緩衝生理食塩水または生理食塩水は、媒体の追加例である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物の抗体構築物は、凍結乾燥ケーキまたは水性溶液の形態において、所望の純度を有する選択組成物を、任意選択の製剤化薬剤と混合することによって保存を目的として調製され得る（前出のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）。さらに、ある特定の実施形態では、本発明の抗体構築物は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用し、凍結乾燥物として製剤化され得る。
非経口的投与が企図されるとき、本発明における使用のための治療組成物は、医薬的に許容可能な媒体に含まれる本発明の所望の抗体構築物を発熱物質非含有の非経口的に許容可能な水性溶液に含めた形態で提供され得る。非経口注射に特に適した媒体は、本発明の抗体構築物が、適切に保存処理がなされた無菌等張液として製剤化される無菌蒸留水である。ある特定の実施形態では、調製には、薬剤と共に所望の分子を製剤化することが必要であり得、こうした薬剤は、注射用微粒子、生物侵食性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどであり、デポ注射を介して送達され得る製品の制御放出または持続放出を提供し得る。ある特定の実施形態では、ヒアルロン酸も使用され得、循環における持続期間の促進作用が付与される。ある特定の実施形態では、所望の抗体構築物を導入するために埋め込み可能な薬物送達装置が使用され得る。
追加の医薬組成物には、送達／放出を持続または制御する製剤に本発明の抗体構築物を含めた製剤が含まれることが当業者には明らかであろう。リポソーム担体、生物侵食性微粒子、または多孔性ビーズ、及びデポ注射などの、さまざまな他の持続送達手段または制御送達手段の製剤化手法もまた、当業者に知られている。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照のこと。この文献では、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の制御放出について説明されている。持続放出調製物は、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルといった形成物品の形態の半透性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許出願公開第ＥＰ０５８４８１号において開示されている）、Ｌ－グルタミン酸とガンマエチル－Ｌ－グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２：５４７－５５６）、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７－２７７、及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８－１０５）、エチレンビニルアセテート（前出のＬａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１）、またはポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシブタン酸（欧州特許出願公開第ＥＰ１３３，９８８号）が含まれ得る。持続放出組成物は、当該技術分野において知られるいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームも含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８－３６９２、欧州特許出願公開第ＥＰ０３６，６７６号、第ＥＰ０８８，０４６号、及び第ＥＰ１４３，９４９号を参照のこと。
抗体構築物は、例えば、コアセルベーション手法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース－マイクロカプセルもしくはゼラチン－マイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）、またはマクロエマルションにも封入され得る。そのような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）において開示されている。
インビボ投与に使用される医薬組成物は、典型的には、無菌調製物として提供される。無菌化は、無菌濾過膜に通す濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥されるとき、この方法を使用する無菌化は、凍結乾燥及び再構成の前または後のいずれかに実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態または溶液で保存することができる。非経口組成物は、一般に、無菌のアクセスポートを有する容器に充填され、こうした容器は、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈注射用溶液のバッグまたはバイアルである。
本発明の別の態様は、自己緩衝性の本発明の抗体構築物製剤を含み、これは、医薬組成物として使用することができ、国際特許出願ＷＯ０６１３８１８１Ａ２（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２５９９）において説明されている。この点に関して有用なタンパク質安定化、製剤材料、及び方法についてさまざまな解説文献が利用可能であり、こうした解説文献は、Ａｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｏｌｖｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，”Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．８（３）：２８５－９１（１９９１）、Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ” ｉｎ：ＲＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＳＩＧＮ ＯＦ ＳＴＡＢＬＥ ＰＲＯＴＥＩＮ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１－８４（２００２）、及びＲａｎｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９－７５（２００２）などであり、本発明による自己緩衝性タンパク質製剤について、特に、獣医学及び／またはヒト医学的な使用のためのタンパク質医薬の製品及びプロセスに関し、同文献の賦形剤及びプロセスに関連する部分を特に参照のこと。
例えば、製剤のイオン強度及び／もしくは等張性の調節、ならびに／または本発明による組成物のタンパク質もしくは他の成分の溶解性及び／もしくは物理的安定性の改良のために、本発明のある特定の実施形態に応じて塩が使用され得る。よく知られていることであるが、イオンは、タンパク質表面の荷電残基に結合し、タンパク質における荷電基及び極性基を遮蔽して、その静電相互作用、誘因相互作用、及び反発的相互作用の強度を低減することによってタンパク質の未変性状態を安定化することができる。イオンは、特に、タンパク質の変性したペプチド結合（－－ＣＯＮＨ）に結合することによって、タンパク質の変性状態を安定化することもできる。さらに、タンパク質における荷電基及び極性基とのイオン性相互作用は、分子間静電相互作用も低減することができ、それによって、タンパク質の凝集及び不安定性が阻止または低減される。
イオン種は、タンパク質に対するその作用が顕著に異なる。イオン及びタンパク質に対するその作用について多数の分類順位付けが行われており、こうした分類順位付けを、本発明による医薬組成物の製剤化において使用することができる。１つの例は、ホフマイスター（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ）シリーズであり、これは、イオン性溶質及び非イオン性極性溶質を、溶液におけるタンパク質の立体構造安定性に対するその作用によって順位付けしたものである。安定化溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープ（Ｋｏｓｍｏｔｒｏｐｅ）は、一般に、溶液からタンパク質を沈殿（「塩析」）させるために高濃度（例えば、＞１モル濃度の硫酸アンモニウム）で使用される。カオトロープ（Ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）は、一般に、タンパク質を変性及び／または可溶化（「塩溶」）するために使用される。ホフマイスターシリーズでは、「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対有効性によってその位置が定義される。
遊離アミノ酸は、かさ増し剤、安定剤、及び抗酸化剤として、ならびに他の標準的な用途で、本発明のさまざまな実施形態による本発明の抗体構築物製剤において使用することができる。リジン、プロリン、セリン、及びアラニンは、製剤におけるタンパク質の安定化に使用することができる。グリシンは、ケーキの正しい構造及び特性を確保するために凍結乾燥において有用である。アルギニンは、液体製剤及び凍結乾燥製剤の両方において、タンパク質の凝集阻害に有用であり得る。メチオニンは、抗酸化剤として使用される。
ポリオールには、例えば、マンニトール、スクロース、及びソルビトールといった糖、ならびに例えば、グリセロール及びプロピレングリコールなどの多価アルコール、ならびに本明細書で議論される目的では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質が含まれる。ポリオールは、コスモトロピックである。ポリオールは、液体製剤及び凍結乾燥製剤の両方における、物理的及び化学的な分解プロセスからのタンパク質の保護に有用な安定剤である。ポリオールは、製剤の浸透圧の調節にも有用である。マンニトールは、本発明の選択実施形態において有用なポリオールに含まれ、一般に、凍結乾燥製剤におけるケーキの構造安定性を確保するために使用される。マンニトールは、ケーキの構造安定性を確保するものである。マンニトールは、一般に、例えば、スクロースといった凍結乾燥保護剤と共に使用される。ソルビトール及びスクロースは、好ましい浸透圧調節剤に含まれ、製造プロセスの間のバルクの輸送または調製の間の凍結－解凍ストレスから保護するための安定剤として好ましい。グルコース及びラクトースなどの還元糖（遊離のアルデヒド基またはケトン基を含む）は、表面のリジン残基及びアルギニン残基を糖化し得る。したがって、還元糖は、一般に、本発明による使用に好ましいポリオールには含まれない。さらに、この点に関して、スクロース（酸性条件下で加水分解を受けてフルクトース及びグルコースとなり、結果的に糖化を生じさせる）などの、そのような反応種を形成する糖もまた、本発明の好ましいポリオールには含まれない。この点に関して、ＰＥＧは、タンパク質の安定化のため、及び凍結保護剤として有用であり、本発明において使用することができる。
本発明の抗体構築物製剤のいくつかの実施形態は、サーファクタントをさらに含む。タンパク質分子は、気体－液体、固体－液体、及び液体－液体の界面において表面吸着、ならびに変性及び結果的な凝集が生じ易くあり得る。こうした作用は、一般に、タンパク質濃度とは逆に強弱化する。こうした有害相互作用は、一般に、タンパク質濃度とは逆に強弱化し、典型的には、製品の配送及び取り扱いの間などに発生する物理的な撹拌によって悪化する。サーファクタントは、表面吸着を阻止、最小化、または低減するために日常的に使用される。この点に関して、本発明において有用なサーファクタントには、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル、及びポロキサマー１８８が含まれる。サーファクタントは、一般に、タンパク質の立体構造安定性を制御するためにも使用される。この点に関して、サーファクタントの使用は、タンパク質特異的であり、この理由は、典型的には、任意の所与のサーファクタントによって安定化することになるタンパク質もあれば、不安定化することになるタンパク質もあるためである。
ポリソルベートは、酸化的分解による影響を受け易く、タンパク質の残基側鎖、特にメチオニンの酸化が生じるに足りる量の過酸化物を含んで供給されることが多い。結果的に、ポリソルベートは注意深く使用されるべきであり、使用の際は、その最低有効濃度で用いられるべきである。この点に関して、ポリソルベートは、賦形剤はその最低有効濃度で使用されるべきであるという一般規則の例となるものである。
本発明の抗体構築物製剤のいくつかの実施形態は、１つまたは複数の抗酸化剤をさらに含む。環境中の酸素及び温度を適切なレベルに維持し、光への曝露を避けることによって、医薬製剤におけるタンパク質の有害な酸化はある程度阻止することができる。抗酸化賦形剤もまた、タンパク質の酸化的分解を阻止するために使用することができる。この点に関して、還元剤、酸素／フリーラジカルスカベンジャー、及びキレート剤は、有用な抗酸化剤に含まれる。本発明による治療タンパク質製剤において使用するための抗酸化剤は、好ましくは水溶性であり、製品の有効期間を通じてその活性を維持する。この点に関して、ＥＤＴＡは、本発明による好ましい抗酸化剤である。抗酸化剤は、タンパク質を損ない得るものである。例えば、特にグルタチオンなどの還元剤は、分子内ジスルフィド結合を破壊し得る。したがって、本発明において使用するための抗酸化剤は、とりわけ、それ自体が製剤におけるタンパク質を損なう可能性が排除されるか、または十分に低減するように選択される。
本発明による製剤は、タンパク質補因子である金属イオンであって、ある特定のインスリン懸濁液の形成に必須の亜鉛などの、タンパク質配位錯体の形成に必須となる金属イオンを含み得る。金属イオンは、タンパク質を分解する何らかのプロセスも阻害し得る。しかしながら、金属イオンは、タンパク質を分解する物理的及び化学的なプロセスも触媒する。マグネシウムイオン（１０～１２０ｍＭ）は、アスパラギン酸からイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために使用することができる。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトのデオキシリボヌクレアーゼの安定性を向上させることができる。しかしながら、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化し得る。同様に、第ＶＩＩＩ因子は、Ｃａ＋２及びＳｒ＋２によって安定化し得、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２、ならびにＦｅ＋２によって不安定化し得、Ａｌ＋３イオンによってその凝集は増加し得る。
本発明の抗体構築物製剤のいくつかの実施形態は、１つまたは複数の保存剤をさらに含む。同一の容器からの複数回の取り出しを伴う複数用量の非経口製剤を開発するとき、保存剤は必須である。その主要な機能は、薬物製品の有効期間または使用期間を通じて微生物の増殖を阻害し、製品無菌性を確保することである。一般に使用される保存剤には、ベンジルアルコール、フェノール、及びｍ－クレゾールが含まれる。保存剤が小分子非経口剤と共に使用されてきた歴史は長いが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は難易度が高いものであり得る。保存剤は、タンパク質に対する不安定化作用（凝集）を有することがほぼ常であり、このことが、複数用量のタンパク質製剤におけるその使用を限定する主要因子となってきた。今日までに製剤化されたタンパク質薬物のほとんどが１回のみの使用を目的としたものである。しかしながら、複数用量製剤が可能になると、患者の利便性が実現するという利点が加わり、その市場性が向上する。１つの良い例は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の複数用量製剤であり、この例では、保存剤を含有する製剤が開発されたことによって、利便性が向上した複数回使用が可能なペン型注射器の発表という製品化につながった。ｈＧＨの保存剤含有製剤を含むそのようなペン型機器は、現在、少なくとも４つ市販されている。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥－－デュアルチャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）はフェノールを含んでおり、一方、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）は、ｍ－クレゾールを含めて製剤化されている。保存剤含有剤形の製剤化及び開発の間には、いくつかの側面を考慮する必要がある。薬物製品における有効な保存剤濃度は、最適化されなくてはならない。これには、タンパク質の安定性を損なわずに抗微生物有効性が得られる濃度範囲で、剤形における所与の保存剤を試験することが必要になる。
予測され得ることではあるが、凍結乾燥製剤と比較すると、保存剤を含む液体製剤の開発は、より難易度が高い。凍結乾燥製品は、保存剤を含めずに凍結乾燥し、保存剤を含む希釈剤で使用時に再構成することができる。これによって、保存剤がタンパク質に触れる時間が短縮され、関連する安定性の危険がかなり最小化される。液体製剤では、保存剤の有効性及び安定性は、製品の全有効期間（約１８～２４ヶ月）にわたって維持されるべきである。留意すべき重要な点は、保存剤の有効性は、活性薬物及びすべての賦形剤成分を含む最終製剤において示されるべきであるということである。
本明細書に開示の抗体構築物は、免疫－リポソームとしても製剤化され得る。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物の送達に有用なさまざまな型の液体、リン脂質、及び／またはサーファクタントから構成される小ベシクルである。リポソームの成分は、一般に、二層編成で配置されており、生体膜の脂質配置に類似している。抗体構築物を含むリポソームは、当該技術分野において知られる方法によって調製され、こうした方法は、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）、米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号、ならびにＷ０９７／３８７３１などにおいて説明されている。米国特許第５，０１３，５５６号では、循環時間が増進したリポソームについて開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧで誘導体化したホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む液体組成物を用いて逆相蒸発法によって生成させることができる。定義されたポアサイズのフィルターに通してリポソームを押し出すことで、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体構築物のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６－２８８（１９８２）において説明されるリポソームにジスルフィド交換反応を介して複合化することができる。化学療法剤は、任意選択でリポソーム内に含められる。Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照のこと。
医薬組成物が製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体、結晶、または脱水粉末もしくは凍結乾燥粉末として無菌バイアルにおいて保存され得る。そのような製剤は、即時使用が可能な形態か、または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥品）のいずれかで保存され得る。
本明細書に定義される医薬組成物の生物学的活性は、例えば、細胞傷害性アッセイによって決定することができ、これについては、ＷＯ９９／５４４４０またはＳｃｈｌｅｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１－１２）といった例において説明されている。本明細書で使用される「効力」または「インビボの効力」は、例えば、標準化されたＮＣＩ応答基準を使用した、本発明の医薬組成物による治療に対する応答を指す。本発明の医薬組成物を使用する治療の成功またはインビボの効力は、その意図される目的のための組成物の有効性、すなわち、その所望の作用、すなわち、例えば、腫瘍細胞といった病的細胞の枯渇を引き起こす組成物の能力を指す。インビボの効力は、それぞれの疾患実体向けに確立された標準的な方法によって監視し得、こうした方法には、限定はされないが、白血球の計数、差異、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺が含まれる。さらに、さまざまな疾患特異的臨床化学パラメーター、及び確立された他の標準的な方法が使用され得る。さらに、コンピュータ断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ－ｃｒｉｔｅｒｉａ ｂａｓｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ［Ｃｈｅｓｏｎ ＢＤ，Ｈｏｒｎｉｎｇ ＳＪ，Ｃｏｉｆｆｉｅｒ Ｂ，Ｓｈｉｐｐ ＭＡ，Ｆｉｓｈｅｒ ＲＩ，Ｃｏｎｎｏｒｓ ＪＭ，Ｌｉｓｔｅｒ ＴＡ，Ｖｏｓｅ Ｊ，Ｇｒｉｌｌｏ－Ｌｏｐｅｚ Ａ，Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ Ａ，Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ Ｆ，Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ Ｄ，Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ Ｗ，Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ Ｒ，Ｈａｒｒｉｓ ＮＬ，Ａｒｍｉｔａｇｅ ＪＯ，Ｃａｒｔｅｒ Ｗ，Ｈｏｐｐｅ Ｒ，Ｃａｎｅｌｌｏｓ ＧＰ．Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｔｏ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．ＮＣＩ Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１９９９ Ａｐｒ；１７（４）：１２４４］）、ポジトロン放出断層撮影スキャニング、白血球計数、差異、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺、リンパ節生検／組織学、及びさまざまなリンパ腫特異的臨床化学パラメーター（例えば、乳酸脱水素酵素）、ならびに確立された他の標準的な方法が使用され得る。
本発明の医薬組成物などの薬物の開発における別の主要な課題は、薬物動態特性の予測可能な調節である。この目的では、薬物候補の薬物動態プロファイル、すなわち、特定の薬物が所与の状態を治療する能力に影響する薬物動態パラメーターのプロファイルを確立することができる。薬物がある特定の疾患実体を治療する能力に影響する、薬物の薬物動態パラメーターには、限定はされないが、半減期、分布量、肝臓初回通過代謝、及び血清結合度が含まれる。上述のパラメーターのそれぞれが、所与の薬物物質の効力に影響をし得る。
「半減期」は、投与薬物の５０％が、例えば、代謝、排出等といった生物学的プロセスを介して排出される時間を意味する。「肝臓初回通過代謝」は、薬物が肝臓と最初に接触するとき、すなわち、それが最初に肝臓を通過する間に代謝されることになる傾向が意図される。「分布量」は、例えば、細胞内空間及び細胞外空間、組織、ならびに臓器等のような体のさまざまなコンパートメント全体にわたる薬物の残留度合い、及びこうしたコンパートメント内の薬物の分布を意味する。「血清結合度」は、薬物がアルブミンなどの血清タンパク質と相互作用してそれに結合し、その結果、薬物の生物学的活性の低減または低下が生じる傾向を意味する。
薬物動態パラメーターには、所与の量の投与薬物の生物学的利用性、遅延時間（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、作用発現増加（ｍｏｒｅ ｏｎｓｅｔ）、及び／またはＣｍａｘも含まれる。「生物学的利用性」は、血液コンパートメントにおける薬物量を意味する。「遅延時間」は、薬物投与と、血液または血漿におけるその検出及び測定可能性との時間の遅延を意味する。「Ｔｍａｘ」は、薬物が最大血中濃度に達した時間であり、「Ｃｍａｘ」は、所与の薬物で得られた最大血中濃度である。その生物学的作用に必要な血中または組織中の薬物濃度に達する時間は、すべてのパラメーターによって影響される。種間特異性を示す二重特異性抗体構築物の薬物動態パラメーターは、上に概要を記載したように、非チンパンジー霊長類における前臨床動物試験において決定され得るものであり、例えば、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１－１２）による刊行物においても示されている。
１つの実施形態では、血液がん疾患または転移性がん疾患の予防、治療、または寛解において使用するための、本発明の抗体構築物、または本発明の方法に従って産生した抗体構築物が提供される。
本明細書に記載の製剤は、それを必要とする患者における本明細書に記載の病理学的な医学状態の治療、寛解、及び／または予防における医薬組成物として有用である。「治療」という用語は、治療的な治療と、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）な処置との両方を指す。治療は、疾患／障害、疾患／障害の症状、または疾患／障害に対する素因を有する患者に由来する体、単離組織、または細胞に対する製剤の適用または投与を含み、こうした適用または投与は、疾患、疾患の症状、または疾患に対する素因の治癒（ｃｕｒｅ）、治癒（ｈｅａｌ）、軽減、緩和、変更、治療、寛解、改善、またはそれに影響を与えることを目的とする。
本明細書で使用される「寛解」という用語は、それを必要とする対象に対する、本発明による抗体構築物の投与による、本明細書で以下に特定される腫瘍またはがんもしくは転移性がんを有する患者の疾患状態の任意の改善を指す。そのような改善は、患者の腫瘍またはがんもしくは転移性がんの進行の遅延または停止としても見られ得る。本明細書で使用される「予防」という用語は、それを必要とする対象に対する、本発明による抗体構築物の投与による、本明細書で以下に特定される腫瘍またはがんもしくは転移性がんを有する患者の発症または再発の回避を意味する。
「疾患」という用語は、本明細書に記載の抗体構築物または医薬組成物を用いた治療から利益を享受するであろう任意の状態を指す。これには、哺乳動物を問題の疾患に罹り易くする病理学的な状態を含む慢性及び急性の障害または疾患が含まれる。
「新生物」は、常にではないが、通常、腫瘤が形成される異常な組織成長である。腫瘤の形成が加わると、新生物は、一般に、「腫瘍」と称される。新生物または腫瘍は、良性、潜在的に悪性（前がん性）、または悪性であり得る。悪性新生物は、一般に、がんと呼ばれる。悪性新生物は、通常、周囲組織に侵入してそれを破壊し、転移形成し得、すなわち、体の他の部分、組織、または臓器に広がる。したがって、「転移性がん」という用語は、元々の腫瘍のもの以外の他の組織または臓器への転移を包含する。リンパ腫及び白血病は、リンパ系新生物である。本発明の目的では、それらのものも、「腫瘍」または「がん」という用語によって包含される。
本発明の好ましい実施形態では、血液がん疾患は、ＡＭＬであり、転移性がん疾患は、前述のものに由来し得る。
本発明との関連における好ましい腫瘍疾患またはがん疾患は、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、胃がん、頭頸部がん、中皮腫、肝がん、肺がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、腎がん、及び胃がんからなる群より選択される。より好ましくは、腫瘍疾患またはがん疾患は、好ましくは、固形腫瘍疾患であり、卵巣がん、膵がん、中皮腫、肺がん、胃がん、及び三種陰性乳がんからなる群より選択され得る。転移性がん疾患は、前述のもののいずれかに由来し得る。
本発明は、血液がん疾患または転移性がん疾患の治療方法または寛解方法も提供し、当該方法は、それを必要とする対象に対して、本発明の抗体構築物または本発明の方法に従って産生した抗体構築物を投与する段階を含む。
「必要とする対象」または「治療を必要とする」対象という用語は、障害を既に有する対象、ならびに障害が予防されることになる対象を含む。必要とする対象または「患者」は、予防的または治療的な治療のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物対象を含む。
本発明の抗体構築物は、一般に、とりわけ、特定の投与経路及び投与方法、特定の投与量及び投与頻度、特定の疾患の特定の治療を目的とし、生物学的利用性及び持続性が存在する範囲で設計されることになる。組成物の材料は、好ましくは、投与部位に許容可能な濃度で製剤化される。
したがって、製剤及び組成物は、任意の適した投与経路による送達を目的として、本発明に従って設計され得る。本発明との関連では、投与経路には、限定はされないが、下記のものが含まれる。
・局所経路（皮膚上、吸入、鼻、眼、耳（ａｕｒｉｃｕｌａｒ）／耳（ａｕｒａｌ）、腟、粘膜など）、
・経腸経路（経口、胃腸、舌下、唇下、頬側、直腸など）、及び
・非経口経路（静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、脳内、脳室内、硬膜外、くも膜下腔内、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻腔内、経粘膜、滑液嚢内、腔内など）。
本発明の医薬組成物及び抗体構築物は、例えば、ボーラス注射などの注射、または持続注入などの注入による、例えば、皮下送達または静脈内送達といった非経口投与に特に有用である。医薬組成物は、医療機器を使用して投与され得る。医薬組成物を投与するための医療機器の例は、米国特許第４，４７５，１９６号、第４，４３９，１９６号、第４，４４７，２２４号、第４，４４７，２３３号、第４，４８６，１９４号、第４，４８７，６０３号、第４，５９６，５５６号、第４，７９０，８２４号、第４，９４１，８８０号、第５，０６４，４１３号、第５，３１２，３３５号、第５，３１２，３３５号、第５，３８３，８５１号、及び第５，３９９，１６３号において説明されている。
具体的には、本発明は、適した組成物の無中断投与を提供する。非限定例として、無中断または実質的に無中断、すなわち、連続投与は、患者の体への治療薬剤の流入を計量するための患者着用の小型ポンプシステムによって実現され得る。本発明の抗体構築物を含む医薬組成物は、当該ポンプシステムを使用することによって投与できる。そのようなポンプシステムは、当該技術分野において一般に知られており、一般に、注入されることになる治療薬剤を含むカートリッジの定期的な交換に依存している。そのようなポンプシステムにおいてカートリッジを交換するときは、本来であれば中断することなく治療薬剤が患者の体に流れ込むものが、結果的に一時的に中断され得る。そのような場合、カートリッジ交換前の投与期間、及びカートリッジ交換後の投与期間は、そのような治療薬剤の１つの「無中断投与」を共に構成する本発明の医薬的な手段及び方法の意味の範囲内であると依然として考えられるであろう。
本発明の抗体構築物の連続投与または無中断投与は、リザーバーから液体を送り出すための送液機構、及び送液機構を駆動するための駆動機構を含む液体送達機器または小型ポンプシステムによって静脈内または皮下に実施され得る。皮下投与のためのポンプシステムは、患者の皮膚を貫通し、患者の体へと適した組成物を送達するための針またはカニューレを含み得る。当該ポンプシステムは、静脈、動脈、または血管とは無関係に患者の皮膚に直接的に固定または取り付けられ得るものであり、それによってポンプシステムと患者の皮膚との直接的な接触が可能になる。ポンプシステムは、２４時間から最大で数日間まで患者の皮膚に取り付けておくことができる。ポンプシステムは、少量用のリザーバーを備えた小型サイズのものであり得る。非限定例として、投与されることになる適した医薬組成物用のリザーバーの体積は、０．１～５０ｍｌであり得る。
連続投与は、皮膚に着用して周期的に交換するパッチによって経皮的にも実施され得る。この目的に適した薬物送達のためのパッチシステムを当業者は認識している。経皮投与は、無中断投与に特に適していることに注目すべきであり、この理由は、最初の消耗パッチの交換は、例えば、最初の消耗パッチを除去する直前に、最初の消耗パッチの直近の皮膚表面に対して新たな第２のパッチを設置すると同時に有利に達成することができるためである。流れが中断される、または動力電池が働かなくなるという問題は生じない。
医薬組成物が凍結乾燥されているのであれば、凍結乾燥材料は、適切な液体において投与前に最初に再構成される。凍結乾燥材料は、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または凍結乾燥前にタンパク質が存在したものと同一の製剤において再構成され得る。
本発明の組成物は、例えば、本明細書に記載の種間特異性を示す本発明の抗体構築物の用量を増やしながら、例えば、マカクといった非チンパンジー霊長類に投与することによる用量漸増試験によって決定することができる適切な用量で対象に投与することができる。上記のように、本明細書に記載の種間特異性を示す本発明の抗体構築物は、非チンパンジー霊長類における前臨床試験の形態と同一の形態で、ヒトにおいて薬物として有利に使用することができる。投与レジメンは、担当医及び臨床的な因子によって決定されることになる。医学分野ではよく知られることであるが、任意の１患者に対する投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与されることになる特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、総体的な健康、ならびに同時に投与中の他の薬物を含む多くの因子に依存する。
「有効用量」または「有効投与量」という用語は、所望の作用の達成または少なくとも部分的な達成に十分な量として定義される。「治療上有効な用量」という用語は、疾患に既に苦しんでいる患者における疾患及びその合併症の治癒または少なくとも部分的な抑止に十分な量として定義される。この使用に有効な量または用量は、治療されることになる状態（徴候）、送達される抗体構築物、治療の内容及び目的、疾患の重症度、治療歴、患者の既往歴及び治療薬剤に対する応答、投与経路、患者のサイズ（体重、体表サイズ、もしくは臓器サイズ）ならびに／または状態（年齢及び総体的な健康）、ならびに患者自身の免疫系の総体的な状況に依存することになる。適切な用量は、担当医の判断に従って調節することができ、その結果、１回の投与または一連の投与にわたって、及び最適な治療効果を得るために、患者に適切な用量を投与することができる。
典型的な投与量は、上述の因子に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ～最大約３０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。特定の実施形態では、投与量は、１．０μｇ／ｋｇ～最大約２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得、任意選択で、１０μｇ／ｋｇ～最大約１０ｍｇ／ｋｇまたは１００μｇ／ｋｇ～最大約５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
治療上有効な量の本発明の抗体構築物は、好ましくは、疾患症状の重症度の低減、疾患症状がない期間の頻度もしくは持続期間の増加、または疾患苦痛に起因する機能障害もしくは能力障害の予防をもたらす。ＦＬＴ３発現腫瘍の治療については、例えば、抗ＦＬＴ３／抗ＣＤ３抗体構築物といった本発明の抗体構築物が治療上有効な量で細胞の増殖または腫瘍の増殖を阻害する割合は、未治療の患者と比較して、好ましくは、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％である。化合物が腫瘍の増殖を阻害する能力は、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデルにおいて評価され得る。
医薬組成物は、唯一の治療として投与するか、または例えば、他のタンパク質性薬物及び非タンパク質性薬物といった抗がん治療などの追加治療と必要に応じて組み合わせて投与することができる。こうした薬物は、本明細書に定義される本発明の抗体構築物を含む組成物と同時に投与され得るか、または当該抗体構築物の投与前もしくは投与後に、時宜を得るように定義された間隔及び用量で別々に投与され得る。
本明細書で使用される「有効かつ無毒な用量」という用語は、主な毒性作用を伴わないか、または本質的に伴わずに病的細胞の枯渇、腫瘍の排除、腫瘍の縮小、または疾患の安定化の誘起に十分な高さである、本発明の抗体構築物の耐容用量を指す。そのような有効かつ無毒な用量は、例えば、当該技術分野において説明される用量漸増試験によって決定し得るものであり、重度の有害副事象を誘導する用量（用量制限毒性、ＤＬＴ）未満であるべきである。
本明細書で使用される「毒性」という用語は、有害事象または重度の有害事象において明らかになる薬物の毒性作用を指す。こうした副事象は、投与後の、全身における薬物耐容性の欠如、及び／または局所的な耐性の欠如を指す可能性がある。毒性は、薬物によって引き起こされる催奇作用または発がん作用を含む可能性もある。
本明細書で使用される「安全性」、「インビボの安全性」、または「耐容性」という用語は、投与直後（局所耐性）、及び薬物の長期適用期間の間に重度の有害事象を誘導することない薬物投与を定義する。「安全性」、「インビボの安全性」、または「耐容性」は、例えば、治療期間及び経過観察期間に一定間隔で評価することができる。測定は、例えば、臓器所見といった臨床評価、及び実験室での異常性の選別を含む。臨床評価が実施され得、ＮＣＩ－ＣＴＣ及び／またはＭｅｄＤＲＡの基準に従って逸脱～正常の知見を記録／符号化するものであり得る。臓器所見には、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、不整脈、凝固、及び同様のものなどの基準が含まれ得、こうした基準は、例えば、Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）において示されている。試験され得る実験室パラメーターには、例えば、血液学、臨床化学、凝固プロファイル、及び尿検査、ならびに血清、血漿、リンパ液、または髄液などの他の体液の検査、アルコール検査、ならびに同様のものが含まれる。したがって、安全性は、例えば、物理的検査、画像技術（すなわち、超音波、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、技術的な機器を用いる他の測定（すなわち、心電図））、バイタルサイン、実験室パラメーターの測定、及び有害事象の記録によって評価することができる。例えば、本発明による使用及び方法での非チンパンジー霊長類における有害事象は、病理組織学的及び／または組織化学的方法によって調べてよい。
上記の用語は、例えば、Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｆｅｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓ６、ＩＣＨ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ、ＩＣＨ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｊｕｌｙ １６，１９９７においても言及されている。
追加の実施形態では、本発明は、本発明の抗体構築物、本発明の方法に従って産生した抗体構築物、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、及び／または本発明の宿主細胞を含むキットを提供する。
本発明との関連では、「キット」という用語は、そのうちの１つが本発明の抗体構築物、医薬組成物、ベクター、または宿主細胞に対応する２つ以上の成分が、容器、レシピエント、または別のものに共に梱包されたもの意味する。したがって、キットは、ある特定の目標の達成に十分な一連の製品及び／または用品であると説明することができ、こうしたものは、単一のユニットとして市販することができる。
キットは、投与に適した投与量（上記を参照のこと）で、本発明の抗体構築物または医薬組成物を含む、任意の適した形、サイズ、及び材料（好ましくは、防水性であり、例えば、プラスチックまたはガラス）の１つまたは複数のレシピエント（バイアル、アンプル、容器、シリンジ、ボトル、バッグなど）を含み得る。キットは、使用の指示書（例えば、小冊子もしくは取扱説明書の形態のもの）、シリンジ、ポンプ、注入器、もしくは同様のものなどの、本発明の抗体構築物の投与手段、本発明の抗体構築物の再構成手段、及び／または本発明の抗体構築物の希釈手段を追加で含み得る。
本発明は、単一用量の投与ユニットのためのキットも提供する。本発明のキットは、乾燥／凍結乾燥抗体構築物を含む第１のレシピエント、及び水性製剤を含む第２のレシピエントも含み得る。本発明のある特定の実施形態では、単一チャンバー及び複数チャンバーを有する充填済シリンジ（例えば、液体シリンジ及び凍結乾燥シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが提供される。
（ａ）単量体ＦＬＴ３タンパク質の模式構造を示す。（ｂ）ＦＬＴ３ＬＧホモ二量体と相互作用しているＦＬＴ３ホモ二量体の結晶構造を示す。 エピトープクラスター結合体の特徴付けに使用したキメラヒト／マウスＦＬＴ３分子の模式構造を示す。 エピトープクラスター結合体の特徴付けに使用した切断型ＦＬＴ３構築物の模式構造を示す。 ＦＬＴ３への結合に対する、本発明のＦＬＴ３結合体とＦＬＴ３－リガンドとの競合を解析するためのアッセイを示す。１０μｇ／ｍｌのＦＬＴ３リガンド有りまたは無しで、ＣＨＯ－ヒトＦＬＴ３細胞を３０分間インキュベートした（洗浄段階無し）。ｓｃＦｖのペリプラズム調製物を添加し、３０分間インキュベートした。検出は、マウス抗ＦＬＡＧ＋ＰＥ複合化ヤギ抗マウス、及びＦＡＣＳによって検出した蛍光中央値（中央値（リガンド有り）／中央値（リガンド無し）＊１００％）を使用して実施した。 ヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株であるＨＰＢａＬＬ、カニクイザルＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞、及びマカクＣＤ３＋Ｔ細胞株であるＬｎＰｘ４１１９に対する指定の種間特異的二重特異性単鎖構築物の、ＦＡＣＳによる結合分析を示す。赤線は、２μｇ／ｍｌの精製単量体タンパク質と共にインキュベートした後、マウス抗Ｉ２Ｃ抗体、及びＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ検出抗体と共にインキュベートした細胞を示す。黒のヒストグラム線は、細胞を、抗Ｉ２Ｃ抗体ならびにＰＥ標識検出抗体のみと共にインキュベートした陰性対照を示す（実施例６を参照のこと）。 ＣＤ５６を枯渇させた無刺激のヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、及びヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞を標的細胞として使用して再指向させた指定の種間特異的単鎖構築物によって誘導された細胞傷害活性を示す（実施例９）。 ＣＤ３、ＦＬＴ３、及びそのアイソフォームに対する交差反応結合を示す。５μｇ／ｍｌのＢｉＴＥタンパク質：４℃で６０分、２μｇ／ｍｌの抗Ｉ２Ｃ－Ａｂ ３Ｅ５．Ａ５：４℃で３０分、ヤギ抗マウスＰＥ １：１００：４℃で３０分。 ＣＤ３、ＦＬＴ３、及びそのアイソフォームに対する交差反応結合を示す。５μｇ／ｍｌのＢｉＴＥタンパク質：４℃で６０分、２μｇ／ｍｌの抗Ｉ２Ｃ－Ａｂ ３Ｅ５．Ａ５：４℃で３０分、ヤギ抗マウスＰＥ １：１００：４℃で３０分。 パラログ及び遺伝子導入無しのＣＨＯに対する結合が存在しないことを示す。５μｇ／ｍｌのＢｉＴＥタンパク質：４℃で６０分、２μｇ／ｍｌの抗Ｉ２Ｃ－Ａｂ ３Ｅ５．Ａ５：４℃で３０分、ヤギ抗マウスＰＥ １：１００：４℃で３０分。 パラログ及び遺伝子導入無しのＣＨＯに対する結合が存在しないことを示す。５μｇ／ｍｌのＢｉＴＥタンパク質：４℃で６０分、２μｇ／ｍｌの抗Ｉ２Ｃ－Ａｂ ３Ｅ５．Ａ５：４℃で３０分、ヤギ抗マウスＰＥ １：１００：４℃で３０分。 エピトープクラスターのマッピングを示す－クラスターＥ１。 ＦＬＴ３ＬＧ（ＦＬＴ３リガンド）有りまたは無しで、ヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞に対して無刺激のヒトＰＢＭＣを使用すると、ＦＬＴ３ｓｃＦｃ抗体構築物が活性を有することを示す。
下記の実施例は、本発明の例示である。こうした実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
実施例１
野生型ＦＬＴ３発現ＣＨＯ細胞、及びキメラＦＬＴ３発現ＣＨＯ細胞の産生
ＦＬＴ３抗原は、実施例１及び実施例２の目的のために、定義された６つの異なるサブドメインまたは領域に細分類することができる。それらの５つのサブドメインのアミノ酸配列は、配列番号８１４～８１８に示される。
下記の分子を産生させた。図１も併せて参照のこと。
Figure 0007011574000006
ヒトＦＬＴ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）発現ＣＨＯ／ＨＥＫ細胞、マウスＦＬＴ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）発現ＣＨＯ／ＨＥＫ細胞、及びキメラＦＬＴ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）発現ＣＨＯ／ＨＥＫ細胞を産生させるために、ヒトＦＬＴ３、マウスＦＬＴ３、及び８つのキメラヒト／マウスＦＬＴ３バージョン（上記参照）のそれぞれをコードする配列を、ｐＥＦ－ＤＨＦＲと命名されたプラスミドにクローニングした（ｐＥＦ－ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０（２００１）１４１－１５０において説明されている）。ヒト及びマウスのＦＬＴ３の細胞表面発現には、元々のシグナルペプチドを使用した。クローニング手順はすべて、標準的なプロトコールに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１））。それぞれの構築物について、対応するプラスミドを真核生物で発現させるためにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。これについては、Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，５３７－５６６によって説明されている。
ヒト、キメラ、及びマウスのＦＬＴ３のＣＨＯ細胞での発現は、ＦＡＣＳアッセイにおいて検証した。
実施例２
抗ＦＬＴ３抗体構築物のエピトープマッピング
ヒトアルブミンに融合した二重特異性ＦＬＴ３ｘＣＤ３抗体構築物（Ｉ２Ｃと命名したＣＤ３結合ドメインを有する）（変異体１）を含む未精製の無希釈ペリプラズム抽出物を用いて、ヒトＦＬＴ３を遺伝子導入した細胞、マウスＦＬＴ３を遺伝子導入した細胞、及びキメラヒトＦＬＴ３分子（実施例１を参照のこと）を遺伝子導入した細胞をＰＢＳ／１，５％ＦＣＳにおいて染色した。結合した分子に、社内のマウスモノクローナル抗ＣＤ３結合ドメイン抗体（５０μｌ）を結合させた後、抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－ガンマ－ＰＥ（１：１００、５０μｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ 番号１１５－１１６－０７１）で検出した。抗体はすべて、ＰＢＳ／１．５％ＦＣＳにおいて希釈した。陰性対照として、ペリプラズム抽出物の代わりにＰＢＳ／２％ＦＣＳと共に細胞をインキュベートした。試料はフローサイトメトリーによって測定した。
それぞれのＦＬＴ３結合ドメインによって認識された領域は、配列表に示される（表２）。マウスのエピトープクラスターを含むそれぞれのキメラＦＬＴ３構築物におけるＦＡＣＳシグナルの減少から、結合に対するそれぞれのクラスターの関連性を読み取った。表２のそれぞれの結果は、実施例３による結果と一致している。
実施例３
野生型ＦＬＴ３発現ＣＨＯ細胞、及び切断型ＦＬＴ３発現ＣＨＯ細胞の産生
ＦＬＴ３抗原の細胞外ドメインは、異なるサブドメインまたは領域に細分類することができ、下記のアミノ酸位置によってそれぞれエピトープクラスターＥ１～Ｅ６と定義される。
Figure 0007011574000007
エピトープマッピングに使用する切断型ＦＬＴ３分子を構築（図３を参照のこと）するために、それぞれの７つのヒト領域の配列、ならびに２つの隣接ヒト領域の５つの組み合わせの配列（上記参照）を、マウスＦＬＴ３に由来する対応領域と交換した。さらに、「ＧＧＧＧＳ」リンカーを介してキメラ分子のＣ末端にＶ５タグ
Figure 0007011574000008
を融合させた。最終的なキメラ分子の配列は、配列番号８２７～８３４に示される。さらに、全長ヒトＦＬＴ３（配列番号８０１）及び全長カニクイザルＦＬＴ３（配列番号８０２）を構築し、両方共、そのＣ末端に、「ＧＧＧＧＳ」リンカーを介してＶ５タグ
Figure 0007011574000009
を融合させた。
上記構築物を発現するＣＨＯ ｄｈｆｒ－細胞を産生させるために、それぞれのコード配列をｐＥＦ－ＤＨＦＲと命名されたプラスミドにクローニングした（ｐＥＦ－ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０（２００１）１４１－１５０において説明されている）。Ｖ５タグを付加せずにヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞も産生させた。クローニング手順はすべて、標準的なプロトコールに従って実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１））。それぞれの構築物について、対応するプラスミドを真核生物で発現させるためにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。これについては、Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，５３７－５６６によって説明されている。ＣＨＯ細胞での構築物の発現は、モノクローナルマウスＩｇＧ２ａ抗ｖ５タグ抗体（１μｇ／ｍｌ、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、番号ＭＣＡ１３６０）を使用して検証した。結合したモノクローナル抗体は、抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－ガンマ－ＰＥで検出した。陰性対照として、一次抗体の代わりにアイソタイプ対照抗体と共に細胞をインキュベートした。試料は、フローサイトメトリーによって測定した。
この分析の結果は、開示のＦＬＴ３結合体について表２に示される。こうした結果は、実施例２によるエピトープマッピング解析と一致している。
（表２）エピトープのマッピング
Figure 0007011574000010
実施例４
ヒト及びカニクイザルのＦＬＴ３に対する抗体親和性の、Ｂｉａｃｏｒｅに基づく決定
本発明の抗体構築物の標的結合性を決定するために、組換えヒト／カニクイザルＦＬＴ３－ＥＣＤとアルブミンとの融合タンパク質を使用してＢｉａｃｏｒｅ解析実験を実施した。
詳細には、製造者の説明書に従ってｐＨ４．５の酢酸緩衝液を使用し、ＲＵが約６００～８００となるようにそれぞれの組換え抗原をＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化した。ＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の試料を下記の濃度の希釈系列で負荷した：ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において希釈した５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、及び３．１３ｎＭ。３分間、流速を３０μｌ／分とした後、再び流速３０μｌ／ｍｌで８分～２０分間、ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液を流した。チップの再生は、１０ｍＭのグリシン及び１０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ１．５の溶液を使用して実施した。データセットは、ＢｉａＥｖａｌソフトウェアを使用して解析した。一般に、２回の独立した実験を実施した。さらに、ヒトＣＤ３及びマカクＣＤ３に対する二重特異性抗体構築物の結合をＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて確認した。
実施例５
標的抗原陽性細胞に存在するヒトＦＬＴ３及びマカクＦＬＴ３に対するＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の親和性のスキャッチャードに基づく解析、ならびに種間親和性ギャップの決定
ヒトまたはマカクのＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞に対するＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の親和性は、ヒトＦＬＴ３とマカクＦＬＴ３との間の潜在的な親和性ギャップの測定に最も信頼できる方法として、スキャッチャード解析によっても決定した。スキャッチャード解析については、それぞれの細胞株に対するＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の１価の結合を正確に決定するための１価の検出システムを使用して飽和結合実験が実施される。
それぞれの細胞株（組換えでヒトＦＬＴ３を発現するＣＨＯ細胞株、組換えでマカクＦＬＴ３を発現するＣＨＯ細胞株）の２ｘ１０４個の細胞をそれぞれ、それぞれのＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の１０～２０ｎＭから開始した３連の希釈系列（１：２の希釈を１２回実施したもの）の５０μｌと共にインキュベートし（飽和に達するまで）、その後、４℃で１６時間撹拌し、残留物の洗浄段階を１回経た。その後、３０μｌのＣＤ３ｘＡＬＥＸＡ４８８複合体溶液と共に細胞をさらに１時間インキュベートした。１回の洗浄段階を経た後、３．５％のホルムアルデヒドを含む１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に細胞を再懸濁し、さらに１５分間インキュベートしてから遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した後、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩマシーン及びＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用して分析した。それぞれで３連のものを使用し、２回の独立したセットの実験からデータを得た。それぞれのスキャッチャード解析では、最大結合（Ｂｍａｘ）を外挿によって計算した。結合が最大結合の半分となるＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の濃度を決定し、それぞれのＫＤを示した。３連の測定の値を双曲線及びＳ時曲線としてプロットすることで、最小から最適な結合に至るまでの適切な濃度範囲を示した。
実施例６
二重特異性結合及び種間交差反応性
ヒトのＦＬＴ３及びＣＤ３、ならびにカニクイザルのＦＬＴ３及びＣＤ３に対する結合を確認するために、下記のものを使用し、フローサイトメトリーによって本発明の二重特異性抗体構築物を試験した。
・それぞれヒトＦＬＴ３（配列番号８０１）を遺伝子導入したＣＨＯ細胞、ヒトＦＬＴ３ アイソフォーム（ヒトＦＬＴ３（Ｔ２２７Ｍ）アイソフォーム（配列番号８０３を参照のこと）、及びヒトＦＬＴ３－ＩＴＤアイソフォーム（配列番号８０４を参照のこと））を遺伝子導入したＣＨＯ細胞、ならびにマカクＦＬＴ３（配列番号８０２）を遺伝子導入したＣＨＯ細胞、
・ＦＬＴ３陽性ヒトＡＭＬ細胞株であるＥＯＬ－１、ＭＯＬＭ－１３、及びＭＶ４－１１（しかし、他のＦＬＴ３陽性ヒト細胞株も想定される）、
・ＣＤ３発現ヒトＴ細胞白血病細胞株であるＨＰＢ－ａｌｌ（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＡＣＣ４８３）、ならびに
・カニクイザルＣＤ３発現Ｔ細胞株であるＬｎＰｘ４１１９。
フローサイトメトリーに向けて、濃度５μｇ／ｍｌの５０μｌの精製した二重特異性抗体構築物と共に、それぞれの細胞株の２００，０００個の細胞を４℃で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ／２％ＦＣＳにおいて細胞を２回洗浄した後、二重特異性抗体構築物のＣＤ３結合部分に特異的な社内のマウス抗体（２μｇ／ｍｌ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。洗浄した後、結合したマウス抗体を、ヤギ抗マウスＦｃγ－ＰＥ（１：１００）を４℃で３０分間使用して検出した。試料は、フローサイトメトリーによって測定した。遺伝子導入無しのＣＨＯ細胞を陰性対照として使用した。
（表３ａ）ＦＬＴ３結合ドメインの親和性
Figure 0007011574000011
（表３ｂ）ＣＤ３結合ドメインの親和性
Figure 0007011574000012
実施例７
ヒトのパラログに対する結合欠如の確認
ヒトＦＬＴ３のパラログであるＫＩＴ ｖ１（配列番号８０５）、ＣＳＦ１Ｒ ｖ１（配列番号８０６）、ＰＤＧＦＲＡ（配列番号８０７）、及びＮＴＭ ｖ３（配列番号８０８）をＣＨＯ細胞に安定的に遺伝子導入した。本実施例において使用したパラログの配列は、配列リストにおいて特定されるものである。
（表４ａ）パラログとＦＬＴ３との全長タンパク質配列にわたる同一性
Figure 0007011574000013
（表４ｂ）パラログとＦＬＴ３とのＥＣＤタンパク質配列にわたる同一性
Figure 0007011574000014
タンパク質発現は、特異的抗体を用いてＦＡＣＳ分析において確認した。フローサイトメトリーアッセイは、実施例６に記載したように実施した。
実施例８
ヒト生殖系列に対する同一性
ヒト抗体生殖系列遺伝子に対する抗体構築物の配列の同一性／類似性を解析するために、本発明のＦＬＴ３結合ドメインのアライメントを下記のように実施した：ヒト抗体生殖系列遺伝子（Ｖｂａｓｅ）に対して、すべてのＣＤＲを含む全ＶＬのアライメント、ならびにＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含むがＣＤＲ３は除外した全ＶＨのアライメントを実施。さらに詳細には、本出願の本明細書において知ることができる。
実施例９
細胞傷害活性
エフェクターＴ細胞をＦＬＴ３発現標的細胞に対して再指向させることにおける本発明のＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力を、５つのインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて分析した。
・刺激したヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を、ヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞に対して再指向させることにおけるＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力を、１８時間の５１－クロム放出アッセイにおいて測定した。
・刺激したヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を、ＦＬＴ３陽性ヒトＡＭＬ細胞株であるＥＯＬ－１、ＭＯＬＭ－１３、及びＭＶ４－１１（しかし、他のＦＬＴ３陽性ヒト細胞株も想定される）に対して再指向させることにおけるＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力を１８時間の５１－クロム放出アッセイにおいて測定した。
・無刺激のヒトＰＢＭＣにおけるＴ細胞を、ヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞に対して再指向させることにおけるＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力を、ＦＡＣＳに基づく４８時間の細胞傷害性アッセイにおいて測定した。
エフェクター細胞：無刺激のヒトＰＢＭＣ（ＣＤ１４－／ＣＤ５６－）。標的細胞：ＥＯＬ－１。エフェクターと標的細胞との比（Ｅ：Ｔ）：１０：１。記載のＢｉＴＥタンパク質。
Figure 0007011574000015
エフェクター細胞：無刺激のヒトＰＢＭＣ（ＣＤ１４－／ＣＤ５６－）。標的細胞：ＭＶ４－１１。エフェクターと標的細胞との比（Ｅ：Ｔ）：１０：１。記載のＢｉＴＥタンパク質。
Figure 0007011574000016
・無刺激のヒトＰＢＭＣにおけるＴ細胞を、ＦＬＴ３陽性ヒトＡＭＬ細胞株であるＥＯＬ－１、ＭＯＬＭ－１３、及びＭＶ４－１１（しかし、他のＦＬＴ３陽性ヒト細胞株も想定される）に対して再指向させることにおけるＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力を、ＦＡＣＳに基づく４８時間の細胞傷害性アッセイにおいて測定した。
・交差反応性のＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物が、マカクＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞に対してマカクＴ細胞を再指向させる能力を有するかということを確認するために、エフェクターＴ細胞としてマカクＴ細胞株を用いてＦＡＣＳに基づく４８時間の細胞傷害性アッセイを実施した。
エフェクター細胞：無刺激のヒトＰＢＭＣ（ＣＤ１４－／ＣＤ５６－）。標的細胞：マカクＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞。エフェクターと標的細胞との比（Ｅ：Ｔ）：１０：１。記載のＢｉＴＥタンパク質。
Figure 0007011574000017
・無刺激のヒトＰＢＭＣにおけるＴ細胞を、ＦＬＴ３リガンド無しまたは有りで、ヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞に対して再指向させることにおけるＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力を、ＦＡＣＳに基づく４８時間の細胞傷害性アッセイにおいて測定した。
エフェクター細胞：無刺激のヒトＰＢＭＣ（ＣＤ１４－／ＣＤ５６－）。標的細胞：ヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞。エフェクターと標的細胞との比（Ｅ：Ｔ）：１０：１。記載のＢｉＴＥタンパク質。
Figure 0007011574000018
実施例１０．１
刺激したヒトＴ細胞を用いたクロム放出アッセイ
ＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮した刺激Ｔ細胞は、以下に記載するように得た。市販の抗ＣＤ３特異的抗体（ＯＫＴ３、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ）を、最終濃度を１μｇ／ｍｌとして３７℃で１時間使用し、ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ ＧｍｂＨ，Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ）をコートした。未結合のタンパク質を、ＰＢＳによる１回の洗浄段階によって除去した。安定化グルタミン／１０％のＦＣＳ／２０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、Ｃｈｉｒｏｎ）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を入れたコート済ペトリ皿に３～５ｘ１０７個のヒトＰＢＭＣを添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を収集し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。ＩＬ－２を最終濃度２０Ｕ／ｍｌで添加し、上記と同一の細胞培養培地において再び１日間細胞を培養した。製造者のプロトコールに従ってＤｙｎａｌ－Ｂｅａｄｓを使用し、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞を枯渇させることによってＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を濃縮した。カニクイザルＦＬＴ３またはヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、最終体積１００μｌの５０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩにおいて３７℃で６０分間、１１．１ＭＢｑの５１Ｃｒで標識した。その後、標識した標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄した後、細胞傷害性アッセイにおいて使用した。アッセイは、Ｅ：Ｔの比を１０：１として添加した総体積２００μｌのＲＰＭＩにおいて９６ウェルプレートで実施した。精製した二重特異性抗体構築物の開始濃度を０．０１～１μｇ／ｍｌとして調製したその３倍希釈物を使用した。アッセイのインキュベート時間は１８時間とした。細胞傷害性は、最大溶解（トリトン－Ｘ（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）を添加）と自発性の溶解（エフェクター細胞無し）との差異に対する、上清に放出されたクロムの相対値として決定した。測定はすべて、４連で実施した。上清のクロム活性の測定は、Ｗｉｚａｒｄ ３’’ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ，Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。結果の解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＰｒｉｓｍ５（バージョン５．０、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で実施した。解析プログラムによってシグモイド用量反応曲線から計算したＥＣ５０値を細胞傷害活性の比較に使用した。
実施例１０．２
刺激したヒトエフェクターＴ細胞を、ヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞に対して再指向させる効力
ヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞を標的細胞として、及び刺激したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用し、５１－クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイにおいて、本発明によるＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を分析した。実験は、実施例１０．１に記載したように実施した。
実施例１０．３
刺激したヒトエフェクターＴ細胞を、ＦＬＴ３陽性ヒト細胞株に対して再指向させる効力
ＦＬＴ３陽性ヒトＡＭＬ細胞株であるＥＯＬ－１、ＭＯＬＭ－１３、及びＭＶ４－１１を標的細胞源として、ならびに刺激したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用し、５１－クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイにおいて、ＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を分析した。アッセイは、実施例１０．１に記載したように実施した。
実施例１０．４
無刺激のヒトＰＢＭＣを用いた、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ
エフェクター細胞の単離
輸血向けの血液を収集する血液バンクの副産物である濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）からＦｉｃｏｌｌを使用した密度勾配遠心分離によってヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を調製した。バフィーコートは、地域の血液バンクによって供給されたものであり、血液収集と同日にＰＢＭＣを調製した。Ｆｉｃｏｌｌを使用した密度勾配遠心分離の後、ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を大量に使用して洗浄してから、赤血球溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、１００μＭのＥＤＴＡ）と共にインキュベートすることによってＰＢＭＣから残存赤血球を除去した。血小板は、ＰＢＭＣを１００ｘ ｇで遠心分離した際の上清を介して除去した。残存リンパ球は、Ｂリンパ球及びＴリンパ球、ＮＫ細胞、ならびに単球を主に含むものである。ＰＢＭＣは、３７℃／５％ＣＯ２の条件で１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）含有ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養して保持した。
ＣＤ１４＋細胞及びＣＤ５６＋細胞の枯渇
ＣＤ１４＋細胞の枯渇には、ヒトＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ、ＭＡＣＳ、番号１３０－０５０－２０１）を使用し、ＮＫ細胞の枯渇には、ヒトＣＤ５６マイクロビーズ（ＭＡＣＳ、番号１３０－０５０－４０１）を使用した。ＰＢＭＣは、その計数を実施し、室温で１０分間、３００ｘ ｇで遠心分離した。上清を捨て、ＭＡＣＳ単離緩衝液［８０μｌ／１０７個細胞、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号２００１２－０４３）、０．５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、番号１０２７０－１０６）、２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、番号Ｅ－６５１１）］に細胞ペレットを再懸濁した。ＣＤ１４マイクロビーズ及びＣＤ５６マイクロビーズ（２０μｌ／１０７個細胞）を添加し、４～８℃で１５分間インキュベートした。ＭＡＣＳ単離緩衝液（１～２ｍＬ／１０７個細胞）で細胞を洗浄した。遠心分離（上記を参照のこと）の後、上清を捨て、ＭＡＣＳ単離緩衝液（５００μｌ／１０８個細胞）に細胞を再懸濁した。その後、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、番号１３０－０４２－４０１）を使用し、ＣＤ１４／ＣＤ５６陰性細胞を単離した。ＲＰＭＩ完全培地、すなわち、１０％のＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、番号Ｓ０１１５）、１ｘの非必須アミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、番号Ｋ０２９３）、１０ｍＭのヘペス緩衝液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、番号Ｌ１６１３）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、番号Ｌ０４７３）、及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、番号Ａ２２１３）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、番号ＦＧ１２１５）において、ＣＤ１４＋／ＣＤ５６＋細胞を含まないＰＢＭＣをインキュベーターで必要時まで３７℃で培養した。
標的細胞の標識化
フローサイトメトリーアッセイにおいて細胞溶解を分析するために、蛍光の膜用色素であるＤｉＯＣ１８（ＤｉＯ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、番号Ｖ２２８８６）を使用することで、ヒトＦＬＴ３またはマカクＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞を標的細胞として標識し、それらをエフェクター細胞と区別した。簡潔に記載すると、細胞を収集し、ＰＢＳで１回洗浄してから、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び膜用色素ＤｉＯ（５μＬ／１０６個細胞）を含むＰＢＳにおいて１０６個細胞／ｍＬに調整した。３７℃で３分間インキュベートした後、完全ＲＰＭＩ培地において細胞を２回洗浄し、細胞数を１．２５ｘ１０５個細胞／ｍＬに調整した。細胞の活力は、０．５％（ｖ／ｖ）の等張性エオシンＧ溶液（Ｒｏｔｈ、番号４５３８０）を使用して決定した。
フローサイトメトリーに基づく分析
ＦＬＴ３二重特異性抗体構築物の連続希釈物の存在下で生じる、カニクイザルまたはヒトのＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞の溶解を定量するためにこのアッセイを設計した。等体積のＤｉＯ標識標的細胞及びエフェクター細胞（すなわち、ＣＤ１４＋細胞を含まないＰＢＭＣ）を混合し、Ｅ：Ｔの細胞比を１０：１とした。この懸濁液の１６０μｌを９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに移した。４０μｌの連続希釈物としたＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物及び陰性対照の二重特異性体（無関係の標的抗原を認識する、ＣＤ３に基づく二重特異性抗体構築物）または追加の陰性対照としてＲＰＭＩ完全培地を添加した。７％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーターにおいて二重特異性抗体媒介性の細胞傷害反応を４８時間進行させた。その後、新しい９６ウェルプレートに細胞を移し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を最終濃度１μｇ／ｍＬで添加することによって標的細胞の膜の完全性の減少を監視した。ＰＩは、通常、生存細胞からは排除される膜不透過性の色素であるが、死細胞はＰＩを取り込み、蛍光発光による同定が可能になる。
試料は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ装置でフローサイトメトリーによって測定し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアによって解析した（共にＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎより入手）。標的細胞は、ＤｉＯ陽性細胞として同定した。ＰＩ陰性の標的細胞は、生存標的細胞として分類した。細胞傷害性の割合は、下記の式に従って計算した。
Figure 0007011574000019
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を使用し、二重特異性抗体構築物の対応濃度に対して細胞傷害性の割合をプロットした。シグモイド用量反応曲線の評価については、一定のヒル勾配（ｈｉｌｌ ｓｌｏｐｅ）を用いて、４つのパラメトリックなロジスティック回帰モデルで用量反応曲線を解析し、ＥＣ５０値を計算した。
実施例１０．５
無刺激のヒトＰＢＭＣを、ヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞に対して再指向させる効力
ヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞を標的細胞して、及び無刺激のヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいてＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を分析した。アッセイは、実施例８．４で上に記載したように実施した。
実施例１０．６
無刺激のヒトＰＢＭＣを、ＦＬＴ３陽性ヒト卵巣がん細胞株に対して再指向させる効力
ＦＬＴ３陽性ヒトＡＭＬ細胞株であるＥＯＬ－１、ＭＯＬＭ－１３、及びＭＶ４－１１を標的細胞源として、ならびに無刺激のヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいてＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性をさらに分析した。アッセイは、実施例８．４で上に記載したように実施した。
実施例１０．７
マカクＴ細胞を、マカクＦＬＴ３発現ＣＨＯ細胞に対して再指向させる効力
最後に、マカク（カニクイザル）ＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞を標的細胞として、及びマカクＴ細胞株である４１１９ＬｎＰｘ（Ｋｎａｐｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ９５：３２５６－６１（２０００））をエフェクター細胞源として使用し、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいてＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を分析した。マカクＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞の標的細胞標識化、及びフローサイトメトリーに基づく細胞傷害活性の分析は、上記のように実施した。
実施例１１
（ｉ）３回の凍結／解凍サイクル、及び（ｉｉ）２５０μｇ／ｍｌでの７日間のインキュベートを実施した後の、単量体から二量体への変換
初期には単量体であった抗体構築物が二量体抗体構築物へと変換された割合を決定するために、二重特異性ＦＬＴ３ｘＣＤ３抗体単量体構築物を異なるストレス条件に供した後、高速ＳＥＣを実施した。
（ｉ）単量体抗体構築物を２５μｇ使用し、一般的な製剤緩衝液で濃度を２５０μｇ／ｍｌに調整した後、－８０℃で３０分間凍結し、その後、室温で３０分間解凍した。３回の凍結／解凍サイクルを実施した後、ＨＰ－ＳＥＣによって二量体含量を決定した。
（ｉｉ）単量体抗体構築物を２５μｇ使用し、一般的な製剤緩衝液で濃度を２５０μｇ／ｍｌに調整した後、３７℃で７日間インキュベートした。ＨＰ－ＳＥＣによって二量体含量を決定した。
高分解能ＳＥＣカラムであるＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ、Ｔｏｋｙｏ－Ｊａｐａｎ）を、Ａ９０５オートサンプラーを備えたＡｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０ ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に連結した。カラムの平衡化及びランニング用の緩衝液は、１００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４－２００ｍＭのＮａ２ＳＯ４からなり、ｐＨ６．６に調整したものを使用した。平衡化したカラムに抗体溶液（タンパク質２５μｇ）を導入し、最大圧力７ＭＰａ、流速０．７５ｍｌ／分で溶出を実施した。実施中は常に、２８０ｎｍ、２５４ｎｍ、及び２１０ｎｍにおける光学吸収を監視した。Ａｋｔａ Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアの実施評価シートに記録された２１０ｎｍのシグナルのピークを積分することによって解析を実施した。二量体含量は、二量体ピークの面積を、単量体ピークと二量体ピークとを足した総面積で割ることによって計算した。
実施例１２
熱安定性
抗体の凝集温度は、下記のように決定した：２５０μｇ／ｍｌの抗体構築物溶液４０μｌを使い捨てキュベットに移し、Ｗｙａｔｔの動的光散乱装置であるＤｙｎａＰｒｏ Ｎａｎｏｓｔａｒ（Ｗｙａｔｔ）に設置した。加熱速度０．５℃／分で４０℃から７０℃に試料を加熱し、径を一定して測定取得した。ＤＬＳ装置に付属のソフトウェアパッケージによって、径の増加がタンパク質の融解及び凝集を示すことを利用することで抗体構築物の凝集温度を計算した。
実施例１３
ヒト血漿における２４時間のインキュベート後の安定性
精製した二重特異性抗体構築物を、最終濃度２～２０μｇ／ｍｌ、ヒト血漿プールにおける比を１：５として、３７℃で９６時間インキュベートした。血漿でインキュベートした後、刺激した濃縮ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞、及びヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞を使用し、エフェクターと標的細胞との比（Ｅ：Ｔ）を１０：１として開始濃度０．０１～０．１μｇ／ｍｌで５１－クロム放出アッセイ（実施例８．１に記載のアッセイ）において抗体構築物を比較した。インキュベート無しの新たに解凍した二重特異性抗体構築物を対照として含めた。
実施例１４
抗体濃度２５００μｇ／ｍｌにおける濁度
濃度２５０μｇ／ｍｌの精製した抗体構築物溶液１ｍｌを回転濃縮ユニットによって２５００μｇ／ｍｌに濃縮した。５℃で１６時間保存した後、ＯＤ３４０ｎｍの光学吸収を一般的な製剤緩衝液に対して測定することによって抗体溶液の濁度を決定した。
実施例１５
高分解能陽イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質均一性
高分解能陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＥＸ）によって本発明の抗体構築物のタンパク質均一性を分析した。
５０μｇの抗体構築物単量体を５０ｍｌの結合緩衝液Ａ（２０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、３０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のオクタン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）で希釈し、この溶液の４０ｍｌを、Ａｋｔａ Ｍｉｃｒｏ ＦＰＬＣ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に連結した１ｍｌのＢｉｏＰｒｏ ＳＰ－Ｆカラム（ＹＭＣ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に導入した。試料を結合させた後、追加の結合緩衝液で洗浄段階を実施した。タンパク質を溶出するために、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、１０００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のオクタン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）を使用し、緩衝液Ｂの含量を５０％まで直線的に増加させる塩濃度勾配をカラム体積の１０倍量にわたって適用した。実施中は常に、２８０ｎｍ、２５４ｎｍ、及び２１０ｎｍにおける光学吸収を監視した。Ａｋｔａ Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアの実施評価シートに記録された２８０ｎｍのシグナルのピークを積分することによって解析を実施した。
実施例１６
ＨＩＣブチルによって測定される表面疎水性
フロースルーモードの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）において、本発明の二重特異性抗体構築物の表面疎水性を試験した。
５０μｇの抗体構築物単量体を、一般的な製剤緩衝液で希釈して最終体積を５００μｌ（１０ｍＭのクエン酸、７５ｍＭのリジンＨＣｌ、４％のトレハロース、ｐＨ７．０）とし、Ａｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に連結した１ｍｌのＢｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に導入した。実施中は常に、２８０ｎｍ、２５４ｎｍ、及び２１０ｎｍにおける光学吸収を監視した。Ａｋｔａ Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアの実施評価シートに記録された２８０ｎｍのシグナルのピークを積分することによって解析を実施した。タンパク質シグナルが上昇及び下降した面積及び速度を比較することによって溶出挙動を評価し、それによってＢｉＴＥアルブミン融合体とマトリックスとの相互作用強度を示した。
実施例１７
二重特異性抗体構築物の単量体アイソフォームと二量体アイソフォームとの効力ギャップ
個々のＦＬＴ３ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物の単量体アイソフォームと二量体アイソフォームとの細胞傷害活性の差異（効力ギャップと称される）を決定するために、二重特異性抗体構築物の精製単量体及び精製二量体を用いて、本明細書で上に記載したように（実施例１０．１）、１８時間の５１－クロム放出細胞傷害性アッセイを実施した。刺激した濃縮ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞とした。ヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞を標的細胞とした。エフェクターと標的細胞との比（Ｅ：Ｔ）は、１０：１とした。効力ギャップは、ＥＣ５０間の比率として計算した。
Figure 0007011574000020
実施例１８
ＦＬＴ３結合体のその標的への結合に対するＦＬＴ３リガンドによる競合
可溶性ＦＬＴ３リガンドが、本発明による抗ＦＬＴ３結合ドメインのＦＬＴ３への結合を損なうことになるかどうかを試験するためにこのアッセイを実施した。
ヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞に対するヒトＦＬＴ３リガンドの結合を検証するために、ヒトＦＬＴ３リガンドと共に細胞を４℃で３０分間インキュベートした。結合したＦＬＴ３リガンドに、抗ＨＩＳ抗体（５μｇ／ｍｌ、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）を結合させた後、抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－ガンマ－ＰＥ（１：１００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ 番号１１５－１１６－０７１）で検出した。陰性対照の細胞は、ＣＤ２７の代わりにＰＢＳ／２％ＦＣＳと共にインキュベートした。
ＦＬＴ３リガンドによってＦＬＴ３結合体との競合／交換が生じるかを試験するために、ヒトＦＬＴ３を遺伝子導入したＣＨＯ細胞を、ＦＬＴ３リガンド有りまたは無しで、４℃で３０分間インキュベートした（１０μｇ／ＦＬＴ３リガンド）。その後、細胞を洗浄せずにＦＬＴ３結合体（ｓｃＦｖのもの）で直接染色した。結合したｓｃＦｖに、マウスモノクローナル抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｆ１８０４）を結合させた後、抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－ガンマ－ＰＥ（１：１００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ 番号１１５－１１６－０７１）で検出した。陰性対照として、ＦＬＴ３ｓｃＦｖの代わりに非特異的なｓｃＦｖと共に細胞をインキュベートした。ＦＬＴ３リガンド及びすべての抗体は、２％ＦＣＳ含有ＰＢＳにおいて希釈した。
データを評価するために、蛍光中央値をＦＡＣＳによって検出した。ＦＬＴ３リガンドとの競合の結果としてシグナルに２５％を超える減少が生じた場合は、結合に対する顕著な影響が生じたとものと見なした。このことは、ＦＬＴ３の同一ドメインに対する顕著な立体的相互作用が存在すると理解することができる。７５％基準値を上回る結合体はすべて、
（中央値［リガンド有り］／中央値［リガンド無し］＊１００≧７５％）
（このことは、ＦＬ－１～ＦＬ－６５に当てはまる）ＦＬＴ３リガンドによる競合に対して非感受性であると同定される。ＦＬＴ３リガンドとその受容体との相互作用は、エピトープクラスター３に対応する領域において生じると文献では説明されている。したがって、エピトープクラスター３に特異的であると我々の選別で同定された結合体のすべて、ならびに隣接するクラスター２及びクラスター４に特異的な結合体は、ＦＬＴ３リガンドとの競合によって蛍光中央値のシグナルが顕著に影響を受けるであろうと予測された。この予測は、概して正しいものであった。驚くべきことに、ＦＬ－５３、ＦＬ－５４、ＦＬ－６１、Ｆ－６２、ＦＬ－６３、及びＦＬ－６４（これらはすべて、ＦＬＴ３のエピトープクラスター３に結合する）は、依然として基準値を上回るシグナルを示した。
さらに、ＦＬＴ３リガンドと、エピトープクラスター３の領域との相互作用の観点から、クラスター１などの、ＦＬＴ３のさらに遠位のエピトープクラスターを標的とする結合体であれば、ＦＬＴ３リガンドによる競合によって影響を受けることはないであろうとも想定された。しかしながら、７５％基準値に到達しない結合体が相当数存在した。ＦＬＴ３リガンドによる競合に感受性を有さない群に属する結合体は、結合体ＦＬ－１～ＦＬ－５３、結合体ＦＬ－５５～ＦＬ－６０、及び結合体ＦＬ－６５であった。
（表５）配列リスト
Figure 0007011574000021
Figure 0007011574000022
Figure 0007011574000023
Figure 0007011574000024
Figure 0007011574000025
Figure 0007011574000026
Figure 0007011574000027
Figure 0007011574000028
Figure 0007011574000029
Figure 0007011574000030
Figure 0007011574000031
Figure 0007011574000032
Figure 0007011574000033
Figure 0007011574000034
Figure 0007011574000035
Figure 0007011574000036
Figure 0007011574000037
Figure 0007011574000038
Figure 0007011574000039
Figure 0007011574000040
Figure 0007011574000041
Figure 0007011574000042
Figure 0007011574000043
Figure 0007011574000044
Figure 0007011574000045
Figure 0007011574000046
Figure 0007011574000047
Figure 0007011574000048
Figure 0007011574000049
Figure 0007011574000050
Figure 0007011574000051
Figure 0007011574000052
Figure 0007011574000053
Figure 0007011574000054
Figure 0007011574000055
Figure 0007011574000056
Figure 0007011574000057
Figure 0007011574000058
Figure 0007011574000059
Figure 0007011574000060
Figure 0007011574000061
Figure 0007011574000062
Figure 0007011574000063
Figure 0007011574000064
Figure 0007011574000065
Figure 0007011574000066
Figure 0007011574000067
Figure 0007011574000068
Figure 0007011574000069
Figure 0007011574000070
Figure 0007011574000071
Figure 0007011574000072
Figure 0007011574000073
Figure 0007011574000074
Figure 0007011574000075
Figure 0007011574000076
Figure 0007011574000077
Figure 0007011574000078
Figure 0007011574000079
Figure 0007011574000080
Figure 0007011574000081
Figure 0007011574000082
Figure 0007011574000083
Figure 0007011574000084
Figure 0007011574000085
Figure 0007011574000086
Figure 0007011574000087
Figure 0007011574000088
Figure 0007011574000089
Figure 0007011574000090
Figure 0007011574000091
Figure 0007011574000092
Figure 0007011574000093
Figure 0007011574000094
Figure 0007011574000095

Claims (19)

  1. 標的細胞の表面に存在するヒトＦＬＴ３に結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面に存在するヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインと、を含む二重特異性抗体構築物であって、前記第１の結合ドメインが、配列番号８１９に示される領域内に含まれるＦＬＴ３のエピトープに結合する、前記二重特異性抗体構築物。
  2. 前記第１の結合ドメインが、ヒトＦＬＴ３及びマカクＦＬＴ３に結合する、請求項１に記載の抗体構築物。
  3. （ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ－単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ、及びそれらの形式のオリゴマーからなる群より選択される形式である、請求項１または２に記載の抗体構築物。
  4. 前記第１の結合ドメインが、配列番号１５１～１５６、配列番号１６１～１６６、配列番号１７１～１７６、配列番号１８１～１８６、配列番号１９１～１９６、配列番号２０１～２０６、配列番号２１１～２１６、配列番号２２１～２２６、配列番号２３１～２３６、配列番号２４１～２４６、配列番号２５１～２５６、配列番号２６１～２６６、配列番号２７１～２７６、配列番号２８１～２８６、配列番号２９１～２９６、配列番号３０１～３０６、配列番号３１１～３１６、配列番号３２１～３２６、配列番号３３１～３３６、配列番号３４１～３４６、配列番号３５１～３５６、配列番号３６１～３６６、配列番号３７１～３７６、配列番号３８１～３８６、配列番号３９１～３９６、配列番号４０１～４０６、配列番号４１１～４１６、配列番号４２１～４２６、配列番号４３１～４３６、配列番号４４１～４４６、配列番号４５１～４５６、配列番号４６１～４６６、配列番号４７１～４７６、配列番号４８１～４８６、配列番号４９１～４９６、配列番号５０１～５０６、配列番号５１１～５１６、配列番号５２１～５２６、配列番号５３１～５３６、配列番号５４１～５４６、配列番号５５１～５５６、配列番号５６１～５６６、配列番号５７１～５７６、配列番号５８１～５８６、配列番号５９１～５９６、配列番号６０１～６０６、配列番号６１１～６１６、配列番号６２１～６２６、配列番号６３１～６３６、配列番号６４１～６４６、配列番号６５１～６５６、配列番号６６１～６６６、配列番号６９１～６９６、配列番号７０１～７０６、配列番号７１１～７１６、配列番号７２１～７２６、配列番号７３１～７３６、配列番号７４１～７４６、及び配列番号７９１～７９６からなる群より選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域とＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域とを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  5. 前記第１の結合ドメインが、配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、配列番号２２７、配列番号２３７、配列番号２４７、配列番号２５７、配列番号２６７、配列番号２７７、配列番号２８７、配列番号２９７、配列番号３０７、配列番号３１７、配列番号３２７、配列番号３３７、配列番号３４７、配列番号３５７、配列番号３６７、配列番号３７７、配列番号３８７、配列番号３９７、配列番号４０７、配列番号４１７、配列番号４２７、配列番号４３７、配列番号４４７、配列番号４５７、配列番号４６７、配列番号４７７、配列番号４８７、配列番号４９７、配列番号５０７、配列番号５１７、配列番号５２７、配列番号５３７、配列番号５４７、配列番号５５７、配列番号５６７、配列番号５７７、配列番号５８７、配列番号５９７、配列番号６０７、配列番号６１７、配列番号６２７、配列番号６３７、配列番号６４７、配列番号６５７、配列番号６６７、配列番号６９７、配列番号７０７、配列番号７１７、配列番号７２７、配列番号７３７、配列番号７４７、及び配列番号７９７に示されるものからなる群より選択されるＶＨ領域を含む、請求項４に記載の抗体構築物。
  6. 前記第１の結合ドメインが、配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２３８、配列番号２４８、配列番号２５８、配列番号２６８、配列番号２７８、配列番号２８８、配列番号２９８、配列番号３０８、配列番号３１８、配列番号３２８、配列番号３３８、配列番号３４８、配列番号３５８、配列番号３６８、配列番号３７８、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４０８、配列番号４１８、配列番号４２８、配列番号４３８、配列番号４４８、配列番号４５８、配列番号４６８、配列番号４７８、配列番号４８８、配列番号４９８、配列番号５０８、配列番号５１８、配列番号５２８、配列番号５３８、配列番号５４８、配列番号５５８、配列番号５６８、配列番号５７８、配列番号５８８、配列番号５９８、配列番号６０８、配列番号６１８、配列番号６２８、配列番号６３８、配列番号６４８、配列番号６５８、配列番号６６８、配列番号６９８、配列番号７０８、配列番号７１８、配列番号７２８、配列番号７３８、配列番号７４８、及び配列番号７９８に示されるものからなる群より選択されるＶＬ領域を含む、請求項４または請求項５に記載の抗体構築物。
  7. 前記第１の結合ドメインが、配列番号１５７＋１５８、配列番号１６７＋１６８、配列番号１７７＋１７８、配列番号１８７＋１８８、配列番号１９７＋１９８、配列番号２０７＋２０８、配列番号２１７＋２１８、配列番号２２７＋２２８、配列番号２３７＋２３８、配列番号２４７＋２４８、配列番号２５７＋２５８、配列番号２６７＋２６８、配列番号２７７＋２７８、配列番号２８７＋２８８、配列番号２９７＋２９８、配列番号３０７＋３０８、配列番号３１７＋３１８、配列番号３２７＋３２８、配列番号３３７＋３３８、配列番号３４７＋３４８、配列番号３５７＋３５８、配列番号３６７＋３６８、配列番号３７７＋３７８、配列番号３８７＋３８８、配列番号３９７＋３９８、配列番号４０７＋４０８、配列番号４１７＋４１８、配列番号４２７＋４２８、配列番号４３７＋４３８、配列番号４４７＋４４８、配列番号４５７＋４５８、配列番号４６７＋４６８、配列番号４７７＋４７８、配列番号４８７＋４８８、配列番号４９７＋４９８、配列番号５０７＋５０８、配列番号５１７＋５１８、配列番号５２７＋５２８、配列番号５３７＋５３８、配列番号５４７＋５４８、配列番号５５７＋５５８、配列番号５６７＋５６８、配列番号５７７＋５７８、配列番号５８７＋５８８、配列番号５９７＋５９８、配列番号６０７＋６０８、配列番号６１７＋６１８、配列番号６２７＋６２８、配列番号６３７＋６３８、配列番号６４７＋６４８、配列番号６５７＋６５８、配列番号６６７＋６６８、配列番号６９７＋６９８、配列番号７０７＋７０８、配列番号７１７＋７１８、配列番号７２７＋７２８、配列番号７３７＋７３８、配列番号７４７＋７４８、及び配列番号７９７＋７９８に示されるＶＨ領域とＶＬ領域との対からなる群より選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、請求項４～６のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  8. 前記第１の結合ドメインが、配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９及び配列番号７９９に示されるものからなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項４～７のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  9. 前記第２の結合ドメインが、ヒトＣＤ３イプシロン、及びコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）、またはコモンリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＣＤ３イプシロンに結合する、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  10. （ａ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    ・配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （ｂ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    ・配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
    ・配列番号１０４～１３４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （ｃ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
    ・Ｘ１がＹまたはＨであるアミノ酸配列
    Figure 0007011574000096
    を有するポリペプチド；ならびに
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    ・配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
    ・アミノ酸配列
    Figure 0007011574000097
    を有するポリペプチド、
    （ｄ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
    ・配列番号１７、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、及び配列番号１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    ・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
    ・配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２３８、配列番号２４８、配列番号２５８、配列番号２６８、配列番号２７８、配列番号２８８、配列番号２９８、配列番号３０８、配列番号３１８、配列番号３２８、配列番号３３８、配列番号３４８、配列番号３５８、配列番号３６８、配列番号３７８、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４０８、配列番号４１８、配列番号４２８、配列番号４３８、配列番号４４８、配列番号４５８、配列番号４６８、配列番号４７８、配列番号４８８、配列番号４９８、配列番号５０８、配列番号５１８、配列番号５２８、配列番号５３８、配列番号５４８、配列番号５５８、配列番号５６８、配列番号５７８、配列番号５８８、配列番号５９８、配列番号６０８、配列番号６１８、配列番号６２８、配列番号６３８、配列番号６４８、配列番号６５８、配列番号６６８、配列番号６９８、配列番号７０８、配列番号７１８、配列番号７２８、配列番号７３８、配列番号７４８、及び配列番号７９８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつＣ末端にセリン残基を有するポリペプチド；
    ・配列番号１４０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
    Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
    ・配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、配列番号２２７、配列番号２３７、配列番号２４７、配列番号２５７、配列番号２６７、配列番号２７７、配列番号２８７、配列番号２９７、配列番号３０７、配列番号３１７、配列番号３２７、配列番号３３７、配列番号３４７、配列番号３５７、配列番号３６７、配列番号３７７、配列番号３８７、配列番号３９７、配列番号４０７、配列番号４１７、配列番号４２７、配列番号４３７、配列番号４４７、配列番号４５７、配列番号４６７、配列番号４７７、配列番号４８７、配列番号４９７、配列番号５０７、配列番号５１７、配列番号５２７、配列番号５３７、配列番号５４７、配列番号５５７、配列番号５６７、配列番号５７７、配列番号５８７、配列番号５９７、配列番号６０７、配列番号６１７、配列番号６２７、配列番号６３７、配列番号６４７、配列番号６５７、配列番号６６７、配列番号６９７、配列番号７０７、配列番号７１７、配列番号７２７、配列番号７３７、配列番号７４７、及び配列番号７９７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    ・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
    ・配列番号１８、配列番号２７、配列番号３６、配列番号４５、配列番号５４、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号９９、及び配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつＣ末端にセリン残基を有するポリペプチド；
    ・配列番号１４１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （ｅ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
    ・配列番号１７、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、及び配列番号１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    ・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
    ・配列番号１５８、配列番号１６８、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９８、配列番号２０８、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２３８、配列番号２４８、配列番号２５８、配列番号２６８、配列番号２７８、配列番号２８８、配列番号２９８、配列番号３０８、配列番号３１８、配列番号３２８、配列番号３３８、配列番号３４８、配列番号３５８、配列番号３６８、配列番号３７８、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４０８、配列番号４１８、配列番号４２８、配列番号４３８、配列番号４４８、配列番号４５８、配列番号４６８、配列番号４７８、配列番号４８８、配列番号４９８、配列番号５０８、配列番号５１８、配列番号５２８、配列番号５３８、配列番号５４８、配列番号５５８、配列番号５６８、配列番号５７８、配列番号５８８、配列番号５９８、配列番号６０８、配列番号６１８、配列番号６２８、配列番号６３８、配列番号６４８、配列番号６５８、配列番号６６８、配列番号６９８、配列番号７０８、配列番号７１８、配列番号７２８、配列番号７３８、配列番号７４８、及び配列番号７９８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    ・配列番号１４２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
    Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
    ・配列番号１５７、配列番号１６７、配列番号１７７、配列番号１８７、配列番号１９７、配列番号２０７、配列番号２１７、配列番号２２７、配列番号２３７、配列番号２４７、配列番号２５７、配列番号２６７、配列番号２７７、配列番号２８７、配列番号２９７、配列番号３０７、配列番号３１７、配列番号３２７、配列番号３３７、配列番号３４７、配列番号３５７、配列番号３６７、配列番号３７７、配列番号３８７、配列番号３９７、配列番号４０７、配列番号４１７、配列番号４２７、配列番号４３７、配列番号４４７、配列番号４５７、配列番号４６７、配列番号４７７、配列番号４８７、配列番号４９７、配列番号５０７、配列番号５１７、配列番号５２７、配列番号５３７、配列番号５４７、配列番号５５７、配列番号５６７、配列番号５７７、配列番号５８７、配列番号５９７、配列番号６０７、配列番号６１７、配列番号６２７、配列番号６３７、配列番号６４７、配列番号６５７、配列番号６６７、配列番号６９７、配列番号７０７、配列番号７１７、配列番号７２７、配列番号７３７、配列番号７４７、及び配列番号７９７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    ・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
    ・配列番号１８、配列番号２７、配列番号３６、配列番号４５、配列番号５４、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号９９、及び配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつＣ末端にセリン残基を有するポリペプチド；
    ・配列番号１４３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （ｆ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    ・配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
    ・配列番号１４４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列番号１４５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （ｇ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
    ・配列番号１４６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
    Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
    ・配列番号１４７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （ｈ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
    ・配列番号１４８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
    Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
    ・配列番号１４９に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （ｉ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    ・配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
    ・配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または
    （ｊ）Ｎ末端から下記の順序で下記のものを含むポリペプチド：
    ・配列番号１５９、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１８９、配列番号１９９、配列番号２０９、配列番号２１９、及び配列番号２２９、配列番号２３９、配列番号２４９、及び配列番号２５９、配列番号２６９、配列番号２７９、及び配列番号２８９、配列番号２９９、配列番号３０９、配列番号３１９、及び配列番号３２９、配列番号３３９、配列番号３４９、及び配列番号３５９、配列番号３６９、配列番号３７９、及び配列番号３８９、配列番号３９９、配列番号４０９、配列番号４１９、及び配列番号４２９、配列番号４３９、配列番号４４９、及び配列番号４５９、配列番号４６９、配列番号４７９、及び配列番号４８９、配列番号４９９、配列番号５０９、配列番号５１９、及び配列番号５２９、配列番号５３９、配列番号５４９、及び配列番号５５９、配列番号５６９、配列番号５７９、及び配列番号５８９、配列番号５９９、配列番号６０９、配列番号６１９、及び配列番号６２９、配列番号６３９、配列番号６４９、及び配列番号６５９、配列番号６６９、配列番号６９９、配列番号７０９、配列番号７１９、及び配列番号７２９、配列番号７３９、配列番号７４９、及び配列番号７９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    ・配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
    ・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    ・配列番号１～９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；ならびに
    ・配列番号８４３～８５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第３のドメイン
    を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  11. 配列番号８５６～８７１のいずれかに示されるポリペプチドを含むかまたはそれからなる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  12. 請求項１～１１のいずれか１項に定義される抗体構築物をコードする、ポリヌクレオチド。
  13. 請求項１２に定義されるポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  14. 請求項１２に定義されるポリヌクレオチドまたは請求項１３に定義されるベクターで形質転換されたかまたはそれを遺伝子導入された、宿主細胞。
  15. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体構築物の産生方法であって、
    請求項１～１１のいずれか１項に定義される抗体構築物の発現が可能になる条件下で請求項１４に定義される宿主細胞を培養することと、
    産生した抗体構築物を前記培養物から回収することと
    を含む、前記方法。
  16. ＦＬＴ３の発現と関連する血液学的疾患の処置のための、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体構築物を含む医薬組成物。
  17. 血液がん疾患または転移性がん疾患の予防、治療、または寛解において使用するための、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  18. 前記血液がん疾患がＡＭＬであるかまたは前述のもののいずれかに由来する転移性がん疾患である、請求項１７に記載の抗体構築物。
  19. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体構築物、請求項１２に定義されるポリヌクレオチド、請求項１３に定義されるベクター、及び／または請求項１４に定義される宿主細胞を含む、キット。
JP2018504926A 2015-07-31 2016-08-01 Ｆｌｔ３及びｃｄ３に対する抗体構築物 Active JP7011574B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022004318A JP2022062061A (ja) 2015-07-31 2022-01-14 Ｆｌｔ３及びｃｄ３に対する抗体構築物

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562199944P 2015-07-31 2015-07-31
US62/199,944 2015-07-31
US201662290861P 2016-02-03 2016-02-03
US62/290,861 2016-02-03
PCT/EP2016/068319 WO2017021362A1 (en) 2015-07-31 2016-08-01 Antibody constructs for flt3 and cd3

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022004318A Division JP2022062061A (ja) 2015-07-31 2022-01-14 Ｆｌｔ３及びｃｄ３に対する抗体構築物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2018527909A JP2018527909A (ja) 2018-09-27
JP7011574B2 true JP7011574B2 (ja) 2022-03-03

Family

ID=56800254

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018504926A Active JP7011574B2 (ja) 2015-07-31 2016-08-01 Ｆｌｔ３及びｃｄ３に対する抗体構築物
JP2022004318A Pending JP2022062061A (ja) 2015-07-31 2022-01-14 Ｆｌｔ３及びｃｄ３に対する抗体構築物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022004318A Pending JP2022062061A (ja) 2015-07-31 2022-01-14 Ｆｌｔ３及びｃｄ３に対する抗体構築物

Country Status (36)

Country Link
US (2) US11447567B2 (ja)
EP (2) EP4219562A3 (ja)
JP (2) JP7011574B2 (ja)
KR (1) KR20180030852A (ja)
CN (2) CN109476735B (ja)
AU (1) AU2016302580B2 (ja)
BR (1) BR112018001042A2 (ja)
CA (1) CA2991607A1 (ja)
CL (3) CL2018000269A1 (ja)
CO (1) CO2018000882A2 (ja)
CR (1) CR20180067A (ja)
CY (1) CY1126145T1 (ja)
DK (1) DK3328891T3 (ja)
EA (1) EA201890337A8 (ja)
ES (1) ES2943147T3 (ja)
FI (1) FI3328891T3 (ja)
HK (1) HK1248251A1 (ja)
HR (1) HRP20230401T1 (ja)
HU (1) HUE061579T2 (ja)
IL (2) IL289894B2 (ja)
JO (1) JO3792B1 (ja)
LT (1) LT3328891T (ja)
MD (1) MD3328891T2 (ja)
MX (1) MX2018001159A (ja)
MY (1) MY193235A (ja)
PE (1) PE20181082A1 (ja)
PH (1) PH12018500157A1 (ja)
PL (1) PL3328891T3 (ja)
PT (1) PT3328891T (ja)
RS (1) RS64184B1 (ja)
SG (1) SG10202000793XA (ja)
SI (1) SI3328891T1 (ja)
TN (1) TN2017000550A1 (ja)
TW (1) TWI829617B (ja)
UA (1) UA125717C2 (ja)
WO (1) WO2017021362A1 (ja)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109456410B (zh) * 2007-04-03 2022-01-28 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性CD3-ε结合结构域
AU2009299794B2 (en) 2008-10-01 2015-08-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
JO3519B1 (ar) 2013-01-25 2020-07-05 Amgen Inc تركيبات أجسام مضادة لأجل cdh19 و cd3
JP6749312B2 (ja) 2014-07-31 2020-09-02 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハーＡＭＧＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ）ＧｍｂＨ 最適化された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクト
TWI717375B (zh) 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI793062B (zh) * 2015-07-31 2023-02-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｄｌｌ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
EP3352784A4 (en) 2015-09-23 2019-06-26 Cytoimmune Therapeutics, LLC FLT3-FACED CAR CELLS FOR IMMUNOTHERAPY
EA039859B1 (ru) * 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
EP3411404B1 (en) 2016-02-03 2022-11-09 Amgen Research (Munich) GmbH Psma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs
KR20180103084A (ko) 2016-02-03 2018-09-18 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 Bcma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
US10100106B2 (en) 2016-05-20 2018-10-16 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
EP3589662A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN
KR102376863B1 (ko) 2017-05-12 2022-03-21 하푼 테라퓨틱스, 인크. 메소텔린 결합 단백질
EP3630841A1 (en) * 2017-06-02 2020-04-08 Pfizer Inc. Antibodies specific for flt3 and their uses
WO2019023097A1 (en) * 2017-07-26 2019-01-31 Smet Pharmaceutical Inc ASYMMETRIC BISPECIFIC ANTIBODIES AND THEIR USE
CR20200099A (es) 2017-08-03 2020-07-24 Amgen Inc Muteínas de interleucina 21 y métodos de tratamiento
SG11202001499WA (en) 2017-09-08 2020-03-30 Amgen Inc Inhibitors of kras g12c and methods of using the same
CR20200330A (es) 2018-01-12 2020-12-23 Amgen Inc Anticuerpos anti-pd-1 y métodos de tratamiento
JP7449041B2 (ja) * 2018-02-27 2024-03-13 ファイザー・インク 抗体精製
JP7425049B2 (ja) 2018-09-25 2024-01-30 ハープーン セラピューティクス，インク． Ｄｌｌ３結合タンパク質および使用方法
US20220259329A1 (en) * 2019-06-07 2022-08-18 Amgen Inc. Bispecific binding constructs
AU2021224851A1 (en) * 2020-02-21 2022-09-15 Harpoon Therapeutics, Inc. FLT3 binding proteins and methods of use
US20230146593A1 (en) 2020-03-12 2023-05-11 Amgen Inc. Method for treatment and prophylaxis of crs in patients comprising a combination of bispecific antibodies binding to cds x cancer cell and tnf alpha or il-6 inhibitor
AU2021255884A1 (en) * 2020-04-14 2022-11-17 Les Laboratoires Servier Anti-FLT3 antibodies and compositions
KR20230004680A (ko) 2020-04-17 2023-01-06 시티 오브 호프 Flt3-양성 악성 종양의 치료를 위한 flt3-표적화된 키메라 항원 수용체 변형 세포
WO2021242961A1 (en) * 2020-05-27 2021-12-02 Vanderbilt University Human monoclonal antibodies to venezuelan equine encephalitis virus and uses therefor
US20230398147A1 (en) 2020-09-16 2023-12-14 Amgen Inc. Methods for administering therapeutic doses of bispecific t-cell engaging molecules for the treatment of cancer
CN117136071A (zh) * 2021-02-10 2023-11-28 悟境股份有限公司 多肽及其在治疗疾病中的用途
AU2022328625A1 (en) * 2021-08-17 2024-03-21 Eli Lilly And Company Bispecific anti-flt3/cd3 antibodies and methods of use

Family Cites Families (250)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4447A (en) 1846-04-04 Car- wheel
US233A (en) 1837-06-14 Improvement in plows
US3180193A (en) 1963-02-25 1965-04-27 Benedict David Machines for cutting lengths of strip material
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4195128A (en) 1976-05-03 1980-03-25 Bayer Aktiengesellschaft Polymeric carrier bound ligands
US4330440A (en) 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
CA1093991A (en) 1977-02-17 1981-01-20 Hideo Hirohara Enzyme immobilization with pullulan gel
US4229537A (en) 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
ATE120761T1 (de) 1987-05-21 1995-04-15 Creative Biomolecules Inc Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
DE3850753T2 (de) 1987-12-09 1995-03-16 Omron Tateisi Electronics Co Induktives Datenübertragungssystem.
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5292658A (en) 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
FR2664073A1 (fr) 1990-06-29 1992-01-03 Thomson Csf Moyens de marquage d'objets, procede de realisation et dispositif de lecture.
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1992003917A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International Homologous recombination in mammalian cells
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0575319B1 (en) 1991-03-11 1999-11-10 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning and expression of renilla luciferase
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5470582A (en) 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
EP0648265A4 (en) 1992-06-18 1996-12-04 Genpharm Int PROCESS FOR THE PRODUCTION OF NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS HAVING AN ARTIFICIAL YEAST CHROMOSOME.
ATE381614T1 (de) 1992-07-24 2008-01-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
AU678787B2 (en) 1992-10-23 1997-06-12 Immunex Corporation Methods of preparing soluble, oligomeric proteins
US5981175A (en) 1993-01-07 1999-11-09 Genpharm Internation, Inc. Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CZ307995A3 (en) 1993-05-24 1996-10-16 Immunex Corp Ligands for flt3 receptors
US7045128B2 (en) 1993-05-24 2006-05-16 Immunex Corporation Antibodies against flt3-ligand
AU694745B2 (en) 1993-09-10 1998-07-30 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Uses of green fluorescent protein
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US5777079A (en) 1994-11-10 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
ES2304786T3 (es) 1995-04-27 2008-10-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos anti-il-8 humanos, derivados a partir de xenoratones inmunizados.
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
AU718138B2 (en) 1995-08-29 2000-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Chimeric animal and method for constructing the same
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5804387A (en) 1996-02-01 1998-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)
US5876995A (en) 1996-02-06 1999-03-02 Bryan; Bruce Bioluminescent novelty items
US5925558A (en) 1996-07-16 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
DK1500329T3 (da) 1996-12-03 2012-07-09 Amgen Fremont Inc Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa
WO1998026277A2 (en) 1996-12-12 1998-06-18 Prolume, Ltd. Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents
EP1724282B1 (en) 1997-05-21 2013-05-15 Merck Patent GmbH Method for the production of non-immunogenic proteins
EP1064360B1 (en) 1998-03-27 2008-03-05 Prolume, Ltd. Luciferases, gfp fluorescent proteins, their nucleic acids and the use thereof in diagnostics
PT1071752E (pt) 1998-04-21 2003-11-28 Micromet Ag Polipeptidos especificos para cd19xcd3 e suas utilizacoes
ATE251181T1 (de) 1998-07-28 2003-10-15 Micromet Ag Heterominikörper
US7254167B2 (en) 1998-10-30 2007-08-07 Broadcom Corporation Constellation-multiplexed transmitter and receiver
AU776910B2 (en) 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
US7230167B2 (en) 2001-08-31 2007-06-12 Syngenta Participations Ag Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor
JP2005510253A (ja) 2001-11-30 2005-04-21 アブジェニックス インコーポレイテッド ヒトＩｇλ軽鎖遺伝子を保有するトランスジェニック動物
US8486859B2 (en) 2002-05-15 2013-07-16 Bioenergy, Inc. Use of ribose to enhance plant growth
US7904068B2 (en) 2003-06-06 2011-03-08 At&T Intellectual Property I, L.P. System and method for providing integrated voice and data services utilizing wired cordless access with unlicensed spectrum and wired access with licensed spectrum
BRPI0411852A (pt) 2003-06-27 2006-05-23 Abgenix Inc anticorpos dirigidos aos mutantes de deleção de receptor de fator de crescimento epidérmico e seu usos
EP1678199B1 (en) * 2003-10-03 2013-03-20 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for mycoplasma pneumoniae exotoxins
KR101229731B1 (ko) 2003-10-16 2013-03-07 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 다중특이적 탈면역화된 ｃｄ3-바인더
WO2005077981A2 (en) 2003-12-22 2005-08-25 Xencor, Inc. Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES
DE602006017460D1 (de) 2005-03-14 2010-11-25 Omron Tateisi Electronics Co Programmierbares Steuersystem
ES2776657T3 (es) 2005-06-14 2020-07-31 Amgen Inc Formulaciones de proteínas autotamponantes
US8234145B2 (en) 2005-07-12 2012-07-31 International Business Machines Corporation Automatic computation of validation metrics for global logistics processes
BRPI0604215A (pt) 2005-08-17 2007-04-10 Biosigma Sa método para projetar oligonucleotìdeos para técnicas de biologia molecular
AU2006301492B2 (en) 2005-10-11 2011-06-09 Amgen Research (Munich) Gmbh Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
JP2007122396A (ja) 2005-10-27 2007-05-17 Hitachi Ltd ディスクアレイ装置及びその障害対応検証方法
TW200745163A (en) 2006-02-17 2007-12-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Peptides that block the binding of IgG to FcRn
US7919297B2 (en) 2006-02-21 2011-04-05 Cornell Research Foundation, Inc. Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase
US7574748B2 (en) 2006-03-07 2009-08-18 Nike, Inc. Glove with support system
US8430938B1 (en) 2006-07-13 2013-04-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Control algorithm for autothermal reformer
GB0614780D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
KR101146588B1 (ko) 2006-08-11 2012-05-16 삼성전자주식회사 Ｆｉｎ 구조체 및 이를 이용한 핀 트랜지스터의 제조방법
CN100589507C (zh) 2006-10-30 2010-02-10 华为技术有限公司 一种拨号提示系统及方法
US7466008B2 (en) 2007-03-13 2008-12-16 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. BiCMOS performance enhancement by mechanical uniaxial strain and methods of manufacture
LT2520590T (lt) 2007-04-03 2018-09-10 Amgen Research (Munich) Gmbh Susijusioms rūšims specifinis rišantis domenas
CN109456410B (zh) 2007-04-03 2022-01-28 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性CD3-ε结合结构域
MX2009010611A (es) * 2007-04-03 2010-03-26 Micromet Ag Enlazadores biespecificos, especificos para especies.
WO2008131242A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Zymogenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
NZ581395A (en) 2007-05-14 2012-08-31 Biogen Idec Inc Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
US8209741B2 (en) 2007-09-17 2012-06-26 Microsoft Corporation Human performance in human interactive proofs using partial credit
US8464584B2 (en) 2007-10-19 2013-06-18 Food Equipment Technologies Company, Inc. Beverage dispenser with level measuring apparatus and display
DE112008003168B4 (de) 2007-11-29 2022-01-05 Schaeffler Technologies AG & Co. KG Kraftübertragungsvorrichtung, insbesondere zur Leistungsübertragung zwischen einer Antriebsmaschine und einem Abtrieb
US8376279B2 (en) 2008-01-23 2013-02-19 Aurora Flight Sciences Corporation Inflatable folding wings for a very high altitude aircraft
WO2009127691A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
WO2009132058A2 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Zymogenetics, Inc. Levels of bcma protein expression on b cells and use in diagnostic methods
DK2356153T3 (en) 2008-10-01 2016-07-04 Amgen Res (Munich) Gmbh Bispecific single CHAIN ​​PSMAXCD3 ANTIBODY THAT ARE SPECIFICALLY TO ALL SPECIES
AU2009299794B2 (en) 2008-10-01 2015-08-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
WO2010045261A1 (en) 2008-10-13 2010-04-22 Zymogenetics, Llc Single chain fc type iii interferons and methods of using same
MY152352A (en) 2009-03-04 2014-09-15 Nissan Motor Exhaust gas purifying catalyst and method for manufacturing the same
CN104877026B (zh) 2009-03-10 2019-10-25 比奥根Ma公司 抗-bcma抗体
US8463191B2 (en) 2009-04-02 2013-06-11 Qualcomm Incorporated Beamforming options with partial channel knowledge
UY32560A (es) 2009-04-29 2010-11-30 Bayer Schering Pharma Ag Inmunoconjugados de antimesotelina y usos de los mismos
CN105567699A (zh) 2009-10-30 2016-05-11 诺维信生物制药丹麦公司 白蛋白变体
US9023996B2 (en) 2009-12-23 2015-05-05 Synimmune Gmbh Anti-FLT3 antibodies
US20130129723A1 (en) 2009-12-29 2013-05-23 Emergent Product Development Seattle, Llc Heterodimer Binding Proteins and Uses Thereof
TWI653333B (zh) 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
US9238080B2 (en) 2010-05-21 2016-01-19 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific fusion proteins
WO2012059486A1 (en) 2010-11-01 2012-05-10 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
CN103533943B (zh) 2010-11-10 2018-02-13 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 由cd3特异性结合结构域导致的不良作用的预防
EP3974453A3 (en) 2010-11-16 2022-08-03 Amgen Inc. Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
AR084053A1 (es) 2010-11-30 2013-04-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapeutico que induce citotoxicidad
MX345519B (es) 2010-12-20 2017-02-01 Genentech Inc Anticuerpos anti-mesotelina e inmunoconjugados.
WO2012088461A2 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Biogen Idec Inc. Linker peptides and polypeptides comprising same
WO2012089373A1 (de) 2010-12-30 2012-07-05 C. Rob. Hammerstein Gmbh & Co. Kg Längsverstellvorrichtung eines kraftfahrzeugsitzes mit zwei schienenpaaren
US8822417B2 (en) 2011-05-05 2014-09-02 Novozymes Biopharma DIC A/S Albumin variants
US20130078250A1 (en) 2011-08-23 2013-03-28 Oliver Ast Bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN103748114B (zh) 2011-08-23 2017-07-21 罗切格利卡特公司 T细胞活化性双特异性抗原结合分子
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
CL2014001263A1 (es) 2011-11-15 2014-10-10 Boehringer Ingelheim Int Molécula de unión biespecífica para bcma y cd3; secuencia de ácido nucleico que la codifica; vector ; célula; composición farmacéutica que comprende a la molécula de unión; uso para tratar enfermedades relacionadas a transtornos de células plasmáticas, trastornos de células b correlacionados con la expresión de bcma y enfermedades autoinmunes.
AU2012340174A1 (en) 2011-11-16 2014-05-29 Amgen Inc. Methods of treating epidermal growth factor deletion mutant VIII related disorders
WO2013075066A2 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Proteins with improved half-life and other properties
JP6441079B2 (ja) * 2011-12-19 2018-12-19 シンイミューン ゲーエムベーハー 二重特異性抗体分子
DK2817338T3 (en) 2012-02-24 2017-10-23 Abbvie Stemcentrx Llc DLL3 modulators and methods of use
JP6407726B2 (ja) 2012-03-01 2018-10-24 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハーＡＭＧＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ）ＧｍｂＨ 長寿命ポリペプチド結合分子
BR112014018679A2 (pt) 2012-03-16 2017-07-04 Novozymes Biopharma Dk As variantes de albumina
EP2861619A4 (en) 2012-06-07 2016-01-27 Univ Duke HUMAN BISPECIFIC ANTIBODY MOLECULAR EGFRVII
WO2014004549A2 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
JP2015528003A (ja) 2012-07-13 2015-09-24 ザイムワークス，インコーポレイテッド 抗ｃｄ３構築物を含む二重特異性の非対称ヘテロ二量体
EP3327037B1 (en) 2012-08-21 2019-10-09 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Mesothelin domain-specific monoclonal antibodies and use thereof
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
MX2015005363A (es) 2012-11-08 2015-11-06 Novozymes Biopharma Dk As Variantes de albumina.
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
US9243058B2 (en) 2012-12-07 2016-01-26 Amgen, Inc. BCMA antigen binding proteins
US20140377269A1 (en) 2012-12-19 2014-12-25 Adimab, Llc Multivalent antibody analogs, and methods of their preparation and use
AU2014205086B2 (en) * 2013-01-14 2019-04-18 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
JO3519B1 (ar) 2013-01-25 2020-07-05 Amgen Inc تركيبات أجسام مضادة لأجل cdh19 و cd3
JP6636803B2 (ja) 2013-02-05 2020-01-29 エンクマフ エスアーエールエル Ｂｃｍａに対する抗体の選択のための方法
GB201302447D0 (en) 2013-02-12 2013-03-27 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
MY192312A (en) 2013-02-26 2022-08-17 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
US9458245B2 (en) 2013-03-06 2016-10-04 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. ANTI-C-MET tandem Fc bispecific antibodies
US9580486B2 (en) 2013-03-14 2017-02-28 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
US20140308285A1 (en) 2013-03-15 2014-10-16 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
AR095596A1 (es) 2013-03-15 2015-10-28 Amgen Res (Munich) Gmbh Moléculas de unión de cadena única comprendiendo n-terminal abp
EP3424952A1 (en) 2013-03-15 2019-01-09 Amgen, Inc Heterodimeric bispecific antibodies
AR095374A1 (es) 2013-03-15 2015-10-14 Amgen Res (Munich) Gmbh Moléculas de unión para bcma y cd3
JP6071725B2 (ja) 2013-04-23 2017-02-01 カルソニックカンセイ株式会社 電気自動車の駆動力制御装置
WO2015006482A1 (en) 2013-07-09 2015-01-15 Duke University CERTAIN IMPROVED HUMAN BISPECIFIC EGFRvIII ANTIBODY ENGAGING MOLECULES
EP3030581B1 (en) 2013-08-07 2021-01-20 Affimed GmbH Antibody binding sites specific for egfrviii
EP2840091A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
AR097648A1 (es) 2013-09-13 2016-04-06 Amgen Inc Combinación de factores epigenéticos y compuestos biespecíficos que tienen como diana cd33 y cd3 en el tratamiento de leucemia mieloide
EP3733710A1 (en) 2013-09-25 2020-11-04 Amgen, Inc Hetrodimeric v-c-fc-v-c antibody
GB2519786A (en) 2013-10-30 2015-05-06 Sergej Michailovic Kiprijanov Multivalent antigen-binding protein molecules
DK3083689T3 (da) 2013-12-17 2020-08-03 Genentech Inc Anti-CD3-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse
EP3842455A1 (en) 2014-01-15 2021-06-30 F. Hoffmann-La Roche AG Fc-region variants with improved protein a-binding
EP3954713A3 (en) 2014-03-28 2022-03-30 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof
EA201692476A1 (ru) 2014-05-28 2017-07-31 Займворкс Инк. Модифицированные антигенсвязывающие полипептидные конструкции и их применение
JP6749312B2 (ja) 2014-07-31 2020-09-02 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハーＡＭＧＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ）ＧｍｂＨ 最適化された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクト
WO2016016415A1 (en) 2014-07-31 2016-02-04 Amgen Research (Munich) Gmbh Bispecific single chain antibody construct with enhanced tissue distribution
PE20170263A1 (es) 2014-08-04 2017-03-30 Hoffmann La Roche Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
US10105142B2 (en) 2014-09-18 2018-10-23 Ethicon Llc Surgical stapler with plurality of cutting elements
US20170247476A1 (en) 2014-09-25 2017-08-31 Amgen Inc. Protease-activatable bispecific proteins
MA40894A (fr) 2014-11-04 2017-09-12 Glenmark Pharmaceuticals Sa Immunoglobulines hétéro-dimères reciblant des lymphocytes t cd3/cd38 et leurs procédés de production
BR112017011166A2 (pt) 2014-11-26 2018-02-27 Xencor, Inc. anticorpos heterodiméricos que se ligam a cd3 e cd38
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
CA2967426A1 (en) 2014-11-26 2016-06-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
CN104829728B (zh) 2015-01-21 2019-03-12 武汉友芝友生物制药有限公司 一种双特异性抗体her2xcd3的构建及应用
CN104829726B (zh) 2015-01-21 2019-03-05 武汉友芝友生物制药有限公司 一种双特异性抗体cd19xcd3的构建及应用
ES2824167T3 (es) 2015-01-23 2021-05-11 Sanofi Sa Anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD123 y anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a CD3 y/o CD123
AU2016214978B2 (en) 2015-02-05 2021-12-09 The University Of Queensland Targeting constructs for delivery of payloads
EP4276116A3 (en) 2015-04-17 2024-01-17 Amgen Research (Munich) GmbH Bispecific antibody constructs for cdh3 and cd3
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI793062B (zh) 2015-07-31 2023-02-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｄｌｌ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI717375B (zh) 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
PE20180795A1 (es) 2015-08-17 2018-05-09 Janssen Pharmaceutica Nv Anticuerpos anti-bcma, moleculas de union a antigenos biespecificas que se unen a bcma y cd3, y uso de estos
CN108431042A (zh) 2015-11-02 2018-08-21 詹森药业有限公司 抗-il1rap抗体，结合il1rap和cd3的双特异性抗原结合分子及其用途
US9552854B1 (en) 2015-11-10 2017-01-24 Intel Corporation Register files including distributed capacitor circuit blocks
EP3411404B1 (en) 2016-02-03 2022-11-09 Amgen Research (Munich) GmbH Psma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
KR20180103084A (ko) 2016-02-03 2018-09-18 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 Bcma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
TWI790206B (zh) 2016-07-18 2023-01-21 法商賽諾菲公司 特異性結合至ｃｄ３和ｃｄ１２３的雙特異性抗體樣結合蛋白
TWI781108B (zh) 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
WO2018067331A1 (en) 2016-09-23 2018-04-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bi specific anti-muc16-cd3 antibodies and nti-muc16 drug conjugates
KR102520731B1 (ko) 2016-09-23 2023-04-14 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 항-steap2 항체, 항체-약물 컨쥬게이트, 및 steap2 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자, 및 이의 용도
BR112019008426A2 (pt) 2016-11-02 2019-09-03 Engmab Sarl anticorpo biespecífico contra bcma e cd3 e um fármaco imunológico para uso combinado no tratamento de mieloma múltiplo
US11284893B2 (en) 2019-04-02 2022-03-29 Covidien Lp Stapling device with articulating tool assembly

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Leukemia, 2012 (Epub 2012 Jan 6), vol. 26, no. 6, pp. 1228-1237
Mol Ther., 2015 Apr (Epub 2015 Feb 3), vol. 23, no. 4, pp. 648-655

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016302580A1 (en) 2017-12-21
PT3328891T (pt) 2023-05-04
CN109476735A (zh) 2019-03-15
CN115925964A (zh) 2023-04-07
CO2018000882A2 (es) 2018-04-19
EP4219562A2 (en) 2023-08-02
MD3328891T2 (ro) 2023-06-30
SG10202000793XA (en) 2020-03-30
MY193235A (en) 2022-09-27
CY1126145T1 (el) 2023-11-15
SI3328891T1 (sl) 2023-06-30
FI3328891T3 (fi) 2023-05-08
PE20181082A1 (es) 2018-07-05
IL289894A (en) 2022-03-01
TN2017000550A1 (en) 2019-04-12
CN109476735B (zh) 2022-10-04
IL289894B2 (en) 2023-04-01
CL2022002448A1 (es) 2023-04-28
TW201708257A (zh) 2017-03-01
ES2943147T3 (es) 2023-06-09
CA2991607A1 (en) 2017-02-09
KR20180030852A (ko) 2018-03-26
IL256821B (en) 2022-02-01
HK1248251A1 (zh) 2018-10-12
US20230272113A1 (en) 2023-08-31
JO3792B1 (ar) 2021-01-31
JP2018527909A (ja) 2018-09-27
AU2016302580B2 (en) 2022-11-10
RS64184B1 (sr) 2023-05-31
EP4219562A3 (en) 2023-09-06
CL2021000716A1 (es) 2021-08-20
IL289894B (en) 2022-12-01
US11447567B2 (en) 2022-09-20
HRP20230401T1 (hr) 2023-07-07
US20170037149A1 (en) 2017-02-09
EP3328891B1 (en) 2023-02-22
PL3328891T3 (pl) 2023-06-26
LT3328891T (lt) 2023-05-10
CL2018000269A1 (es) 2018-10-05
PH12018500157A1 (en) 2018-07-23
MX2018001159A (es) 2018-05-23
HUE061579T2 (hu) 2023-07-28
DK3328891T3 (da) 2023-05-01
CR20180067A (es) 2018-06-13
JP2022062061A (ja) 2022-04-19
EP3328891A1 (en) 2018-06-06
EA201890337A1 (ru) 2018-07-31
BR112018001042A2 (pt) 2018-09-11
EA201890337A8 (ru) 2019-09-30
WO2017021362A1 (en) 2017-02-09
TWI829617B (zh) 2024-01-21
UA125717C2 (uk) 2022-05-25
IL256821A (en) 2018-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7011574B2 (ja) Ｆｌｔ３及びｃｄ３に対する抗体構築物
JP7166368B2 (ja) Ｄｌｌ３及びｃｄ３に結合する二重特異性抗体構築物
JP6879998B2 (ja) Ｃｄ７０及びｃｄ３に対する抗体構築物
JP6880100B2 (ja) Ｃｄｈ１９およびｃｄ３に対する抗体構築物
JP6907124B2 (ja) Ｃｄｈ３及びｃｄ３に対する二重特異性抗体構築物
JP2018530996A6 (ja) Ｃｄ７０及びｃｄ３に対する抗体構築物
JP2018524997A (ja) Ｅｇｆｒｖｉｉｉ及びｃｄ３に結合する二重特異性抗体構築物
JP2023134497A (ja) Ｍｕｃ１７及びｃｄ３に向けられる二重特異性抗体コンストラクト
EA046123B1 (ru) Конструкция на основе биспецифического антитела, направленная на muc17 и cd3

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180409

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180216

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190731

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20191122

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20191122

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200715

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20201014

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20201029

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20210105

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210322

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20210621

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20210818

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210917

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20211206

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220104

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20220114

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7011574

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150