CN105567699A - 白蛋白变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及亲本白蛋白的变体，其与亲本白蛋白相比具有改变的血浆半寿期。本发明亦涉及包含所述变体白蛋白的融合多肽和缀合物。
Description
本申请是2010年11月1日提交的发明名称为“白蛋白变体”、申请号为“201080060322.5”的发明专利申请的分案申请。
涉及序列表
本申请含有计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及相较于白蛋白、其片段或者包含白蛋白或其片段的融合多肽，具有半寿期改变的白蛋白变体或其片段，或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽。
背景技术
白蛋白是天然见于哺乳动物血浆中的蛋白，在血浆中，其为最丰富的蛋白。其在维持血液理想的渗透压方面，以及在血流中转运多种物质方面发挥重要作用。
已从多种物种包括人、猪、小鼠、大鼠、兔和山羊表征了白蛋白，且它们共享高度序列和结构同源性。
白蛋白在体内与其受体，即新生儿Fc受体(FcRn)“Brambell”结合，且已知该相互作用对于白蛋白的血浆半寿期是重要的。FcRn是膜结合蛋白，在多种细胞和组织类型中表达。已发现FcRn拯救白蛋白免受胞内降解(RoopenianD.C.和Akilesh,S.(2007),Nat.Rev.Immunol7,715-725.)。FcRn是参与在哺乳动物如人类血清中维持高水平的IgG和白蛋白的双功能性分子。
尽管现有技术中已表征了FcRn免疫球蛋白(IgG)相互作用，对FcRn-白蛋白相互作用的表征尚不充分。主要FcRn结合位点位于DIII内(381-585)。Andersen等(2010).ClinicalBiochemistry43,367–372。数据表明IgG和白蛋白非协同性结合于FcRn上的不同位点(Andersen等(2006),Eur.J.Immunol36,3044-3051；Chaudhury等(2006),Biochemistry45,4983-4990)。
已知小鼠FcRn结合来自小鼠和人类的IgG，而人FcRn表现得更加挑剔(Ober等(2001)Int.Immunol13,1551-1559)。Andersen等(2010).JournalofBiologicalChemistry285(7):4826-36描述了人和小鼠FcRn分别对小鼠和人白蛋白(所有可能的组合)的亲和力。未在生理pH观察到来自任一物种的白蛋白对任一受体的任何结合。在酸性pH，观察到结合亲和力存在100倍差异。在所有情况下，来自任一物种的白蛋白和IgG对两种受体的结合是加合性的。
人类血清白蛋白(HSA)已充分表征为585个氨基酸的多肽，其序列可见于Peters,T.,Jr.(1996)AllaboutAlbumin:Biohemistry,GeneticsandMedical,Applicationspp10,AcademicPress,Inc.,Orlando(ISBN0-12-552110-3)。其具有对其受体FcRn的特征性结合，其中其在pH6.0结合，但不在pH7.4结合。
已发现HSA的血浆半寿期为大约19日。已鉴定出了具有较低血浆半寿期的天然变体(Peach,R.J.和Brennan,S.0.,(1991)BiochimBiophysActa.1097:49-54)，其具有取代D494N。该取代在此变体中生成N-糖基化位点，该位点不存在于野生型白蛋白中。不知道该糖基化或氨基酸变化是否导致血浆半寿期的变化。
白蛋白具有长血浆半寿期，且因为该特性，已提出将其用于药物递送。已将白蛋白缀合于药学上有益的化合物(WO2000/69902A)，并已发现该缀合物保持白蛋白的长血浆半寿期。所得的缀合物血浆半寿期一般显著长于有益的治疗化合物本身的血浆半寿期。
此外，已将白蛋白融合于治疗上有益的肽(WO2001/79271A和WO2003/59934A)，这通常导致融合物具有所述治疗上有益的肽的活性和相对于所述治疗上有益的肽本身的血浆半寿期显著较长的血浆半寿期。
Otagiri等(2009),Biol.Pharm,Bull.32(4),527-534公开了已知77个白蛋白变体，其中25个见于域III。已显示缺乏羧基端最后175个氨基酸的天然变体具有减少的半寿期(Andersen等(2010),ClinicalBiohemistry43,367-372)。Iwao等(2007)使用小鼠模型研究了天然出现的人白蛋白变体的半寿期，并发现K541E和K560E具有减少的半寿期，E501K和E570K具有增加的半寿期，而K573E对半寿期几乎无作用(Iwao等(2007)B.B.A.ProteinsandProteomics1774,1582-1590)。
Galliano等(1993)Biochim.Biophys.Acta1225,27-32公开了天然变体E505K。Minchiotti等(1990)公开了天然变体K536E。Minchiotti等(1987)Biochim.Biophys.Acta916,411-418公开了天然变体K574N。Takahashi等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84,4413-4417公开了天然变体D550G。Carlson等(1992).Proc.Nat.Acad.Sci.USA89,8225-8229公开了天然变体D550A。
白蛋白具有结合多种配体的能力，这些配体与白蛋白相缔合(缔合物)。已利用该特性以延长具有非共价结合于白蛋白的能力的药物的血浆半寿期。这亦可通过将几乎不具或不具白蛋白结合特性的药学上有益的化合物与具有白蛋白结合特性的模块相结合来实现。参见综述文献Kratz(2008).JournalofControlledRelease132,171-183及其中的参考文献。
白蛋白用于制备药学上有益的化合物，其中此种制备物可例如但不限于白蛋白的纳米颗粒或微米颗粒。在这些实例中，药学上有益的化合物或化合物的混合物的递送可受益于白蛋白对其受体亲和力的改变，其中对于递送手段而言，已显示所述有益化合物与白蛋白相缔合。
尚不清楚形成的缔合物(例如，但不限于KurtzhalsP等Biochem.J.1995；312:725-731)、缀合物或融合多肽的血浆半寿期由何决定，但其似为白蛋白与选定的药学上有益的化合物/多肽之组合的结果。为了能够根据意图治疗的适应症的特点而设计特定药物，期望能够控制给定白蛋白缀合物、缔合物或白蛋白融合多肽的血浆半寿期，从而使得可获得与所述缔合物、缀合物或融合物的组分所给出的血浆半寿期相比更长或更短的血浆半寿期。
已知白蛋白在肿瘤中蓄积并发生分解代谢，亦显示其在类风湿性关节炎患者的发炎的关节中蓄积。参见Kratz(2008)JournalofControlledRelease132,171-183的综述文献和其中的参考文献。预计针对FcRn亲和力增加的HSA变体对于药学上有益的化合物的递送会是有利的。
甚至可期望获得对FcRn几乎无或无结合的白蛋白变体，以供提供较短的半寿期或受控的血清药代动力学，如Kenanova等(2009)J.Nucl.Med.；50(Supplement2):1582)所述。
发明内容
本发明提供了与其亲本相比具有改善的特性的亲本白蛋白的变体。具体而言，本发明提供了与其亲本相比具有改变的血浆半寿期的亲本白蛋白的变体。
本发明涉及亲本白蛋白的分离的白蛋白变体或其片段，或者包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，其在对应于SEQIDNO:2的成熟多肽的位置417、440、464、490、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582和584的一个或多个(几个)位置处包含改变，其中所述变体并非由具有取代D494N、E501K、K541E、D550G,A、K573E或K574N的SEQIDNO:2组成的变体。
在一个或多个位置处的变化可独立地选自取代、插入和缺失，其中优选取代。
本发明还涉及编码所述变体的分离的多核苷酸；涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及涉及产生所述变体的方法。
本发明还涉及包含本发明的变体白蛋白或其片段的缀合物或缔合物，以及有益的治疗模块，或者涉及包含本发明的变体白蛋白或其片段和融合伴侣多肽(fusionpartnerpolypeptide)的融合多肽。
本发明进一步涉及组合物，其包含变体白蛋白，其片段，包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，或包含本发明的变体白蛋白或其片段的缀合物，或包含本发明的变体白蛋白或其片段的缔合物。所述组合物优选为药学组合物。
本发明进一步涉及药学组合物，其包含变体白蛋白，其片段，包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，或包含所述变体白蛋白或其片段的缀合物，或包含所述变体白蛋白或其片段的缔合物，其中所述变体白蛋白，其片段，包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，或包含所述变体白蛋白或其片段的缀合物，或包含变体白蛋白或其片段的缔合物与HSA或其片段，包含HSA或其片段的融合多肽，或包含HSA或其片段的HSA或其片段的缀合物或缔合物的相应的血浆半寿期相比，具有改变的血浆半寿期。
附图简述
图1显示表达质粒pDB4082的限制图。
图2显示表达质粒pDB2305的限制图。
图3显示表达质粒pDB4005的限制图。
图4显示将10μM白蛋白针对shFcRn注入所得的SPR感应谱(sensorgram)，HSA(JTA)＝从Sigma-Aldrich获得的不含脂肪酸的HSA(A3782),HSA(Novozymes)＝商业性重组人血清白蛋白(RECOMBUMIN)。
图5显示shFcRn-GST对人血清白蛋白(HSA)变体的ELISA结合(100-0.045μg/ml)。WT、D494N、D494Q和D494A的结合在pH6.0和pH7.4进行。WT、D494N、D494N/T496A和T496A的结合在pH6.0和pH7.4进行。WT、E495Q和E495A的结合在pH6.0和pH7.4进行。
图6显示0.2μM的HSA变体对固定化的shFcRn(～4600RU)的结合的代表性感应谱。WT、D494N、D494Q、D494A、D494N/T496A和T496A。
图7显示1μM的HSA变体对固定化的shFcRn(～1400RU)的结合的代表性感应谱。WT、D494N、D494Q、D494A、D494N/T496A和T496A。
图8显示基于如示于(A)图6和(B)图7的两次独立的SPR实验，HSA变体与WT相比较的相对结合。
图9显示ELISA：(A)在pH6.0，shFcRn对来自人、驴、牛、绵羊、山羊和兔的白蛋白的结合。(B)在pH6.0，shFcRn对来自豚鼠、仓鼠、大鼠和鸡的白蛋白的结合。(C)在pH7.4，shFcRn对来自人、驴、牛、绵羊、山羊和兔的白蛋白的结合。(D)在pH7.4，shFcRn对来自豚鼠、仓鼠、大鼠和鸡的白蛋白的结合。(E)不同白蛋白的相对结合。人白蛋白对shFcRn的相对结合定义为1.0。ELISA值代表重复实验的平均值。
图10显示SPR：在pH6.0和pH7.4，shFcRn-GST对来自几种物种的白蛋白的结合。代表性感应谱显示对5.0μM来自不同物种的白蛋白的结合：(A)人，(B)驴，(C)牛，(D)山羊，(E)绵羊，(F)兔，(G)犬，(H)豚鼠，(I)仓鼠，(J)大鼠，(K)小鼠和(L)鸡。所述白蛋白变体针对固定化的GST标记的shFcRn(～2100RU)注入。注入在25℃以40μl/min的速率进行。
图11显示选定的HSA突变体的SPR感应谱与野生型HSA的比较。将20μM的(A)WT和P499A，(B)WT和K500A，(C)WT和K536A，(D)WT和P537A，以及(E)WT和K538A，以及(F)WT和K537A针对固定化的shFcRn在pH6.0(～1500RU)注入。
图12显示HSA突变体的SPR感应谱与WTHSA的比较。将10μM的(A)WT和K573A，(B)WT和K573C，(C)WT和K573F，(D)WT和K573G，以及(E)WT和K573L，以及(F)WT和K573M，(G)WT和K573Q，(H)WT和K573R，以及(I)WT和K573T，以及(J)WT和K573V针对固定化的shFcRn在pH5.5和pH7.4注入。注入在25℃以80μl/min的流速进行。
图13显示HSA突变体的SPR感应谱与野生型HSA的比较。将10μM的(A)WT和K573D，(B)WT和K573E，(C)WT和K573H，(D)WT和K573I，以及(E)WT和K573N，以及(F)WT和K573P，(G)WT和K573S，(H)WT和K573*，以及(I)WT和K573W，以及(J)WT和K573Y针对固定化的shFcRn在pH5.5和pH7.4注入。注入在25℃以80μl/min的流速进行。
图14显示HSA突变体的SPR感应谱与野生型HSA的比较。将20μM的(A)WT和E492G+K538H+K541N+E542D，(B)WT和E492T+N503K+K541A，(C)WT和E492P+N503K+K541G+E542P，(D)WT和E492H+E501P+N503H+E505D+T506S+T540S+K541E，以及(E)WT和A490D+E492T+V493L+E501P+N503D+A504E+E505K+T506F+K541D，以及(F)WT和E492G+V493P+K538H+K541N+E542D在pH6.0针对固定化的shFcRn注入。注入在25℃以80μl/min的流速进行。
图15显示HSA突变体的SPR感应谱与野生型HSA的比较。将20μM的(A)WT，(B)H440Q，(C)H464Q，(D)H510Q和(E)H535Q针对固定化的shFcRn在pH6.0注入。注入在25℃以80μl/min的流速进行。
图16显示HSA突变体K500E的SPR感应谱与野生型HSA的比较。将10μM的HSA突变体K500E针对固定化的shFcRn在pH5.75注入。注入在25℃以30μl/min的流速进行。
图17显示表达质粒pDB3017的限制图。
图18显示表达质粒pDB3021的限制图。
图19显示表达质粒pDB3056的限制图。
图20显示表达质粒pDB3165的限制图。
图21显示表达质粒pDB4172的限制图。
图22显示表达质粒pDB4267的限制图。
图23显示表达质粒pDB4285的限制图。
图24显示WTHSA和突变体K573PHRP缀合物对于shFcRn分析的GP-HPLC色谱。如材料和方法中所述向TSKG3000SWXL柱(TosohBioscience)上进行25μL的注入。
图25显示SDSPAGE分离继以荧光素缀合白蛋白的肉眼(A)和紫外(B)检测。HSA::F5M(泳道1)，K573P::F5M(泳道2)和rHA标准(泳道3)。
图26显示HSA变体的shFcRn结合特性。将10μM的WTrHA和E492T(A)，WTrHA和D494N/E495Q/T496A(B)，WTrHA和N503D(C)，WTrHA和N503K(D)，WTrHA和E492T/N503D(E)，WTrHA和E495Q/T496A(F)，WTrHA和K538H(G)，WTrHA和E492D(H)在pH5.5针对固定化的shFcRn注入。
图27显示HSA变体的shFcRn结合特性。将10μM的WTrHA和K541A(I)以及WTrHA和K541N(J)在pH5.5针对固定化的shFcRn注入。
图28显示K573A和K573P的竞争性结合，通过在pH6.0针对固定化的HSA(～2500RU)将shFcRn(100nM)单独注入或用不同量的HSAK573A和K573P预温育后注入来测量。
图29显示HSA-FLAG变体的竞争性结合，通过在pH6.0针对固定化的HSA(～2500RU)将shFcRn(100nM)单独注入或与不同量的HSA-FLAG变体一同注入来测量。
图30显示HSA-IL1Ra变体的竞争性结合，通过在pH6.0针对固定化的HSA(～2500RU)将shFcRn(100nM)单独注入或与不同量的HSA-IL1Ra变体一同注入来测量。
图31显示scFv融合的HSA变体的竞争性结合，通过在pH6.0针对固定化的HSA(～2500RU)将shFcRn(100nM)单独注入或与不同量的(A)scFv-HSA-FLAG变体或(B)HSA-scFv-FLAG变体一同注入来测量。
图32显示HSA，单个、双重和三重突变变体对shFcRn的结合。将每种HSA变体的10μM样品在pH5.5或pH7.4针对固定化的shFcRn注入。
发明详述
本发明涉及亲本白蛋白的分离的白蛋白变体或其片段，或者包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，其在对应于SEQIDNO:2的成熟多肽的位置417、440、464、490、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582和584的一个或多个(几个)位置处包含改变，其中所述变体并非由具有取代D494N、E501K、K541E、D550G,A、K573E或K574N的SEQIDNO:2组成的变体。
在一个或多个位置的变化可独立地选自取代、插入和缺失，其中优选取代。
定义
变体：术语“变体”意指通过在一个或多个(几个)位置的一个或多个改变，即取代、插入和/或缺失而从亲本白蛋白衍生的多肽。取代意指用不同氨基酸替代占据某位置的氨基酸；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指紧接着占据某位置的氨基酸添加一个或多个，优选1-3个氨基酸。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
野生型白蛋白：术语“野生型”(WT)白蛋白意指具有与天然见于动物或人中的相同的氨基酸序列的白蛋白。
亲本或亲本白蛋白：术语“亲本”或“亲本白蛋白”意指经人力造成改变以产生本发明的白蛋白变体的白蛋白。所述亲本可为天然出现的(野生型)多肽或其等位基因(allele)，或甚至其变体。
FcRn和shFcRn：术语“FcRn”意指人新生儿Fc受体(FcRn)。shFcRn是FcRn的可溶性重组形式。
smFcRn：术语“smFcRn”是小鼠新生儿Fc受体的可溶性重组形式。
分离的变体：术语“分离的变体”意指经人力修饰并完全或部分从与其天然出现的至少一种成分分离的变体。在一个方面，根据SDS-PAGE或GP-HPLC确定该变体至少是1％纯的，例如至少是5％纯的，至少是10％纯的，至少是20％纯的，至少是40％纯的，至少是60％纯的，至少是80％纯的，和至少是90％纯的。
基本上(substantially)纯的变体：术语“基本上纯的变体”意指一种制备物，其包含至多10％，至多8％，至多6％，至多5％，至多4％，至多3％，至多2％，至多1％，和至多0.5％以重量计的与其天然或重组结合的其他多肽物质。优选地，所述变体是以存在于该制备物中的总多肽物质重量计至少92％纯的，例如至少94％纯的，至少95％纯的，至少96％纯的，至少97％纯的，至少98％纯的，至少99％纯的，至少99.5％纯的，和100％纯的。本发明的变体优选为基本上纯的形式。其可通过，例如，以公知的重组方法和纯化方法制备该变体而达成。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指经翻译和任何翻译后修饰，如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等之后的最终形式的多肽。在一个方面，所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸1至585，包含任何翻译后修饰。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟白蛋白多肽的多核苷酸。在一个方面，所述成熟多肽编码序列是SEQIDNO:1的核苷酸1至1758。
序列同一性：两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性由参数”序列同一性”所描述。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定，如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件组(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，Rice等，2000，TrendsGenet.16:276-277)的Needle程序，优选为3.0.0版或之后的版本中执行的。所用的可选参数为缺口开放罚分(gapopenpenalty)10，缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算：
(相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口总数)
就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)确定，如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件组(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，Rice等，2000，见上)的Needle程序，优选为3.0.0版或之后的版本中执行的。所用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为”最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算：
(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度–比对中缺口总数)
片段：术语“片段”意指从白蛋白的氨基和/或羧基端，和/或白蛋白的内部区具有一个或多个(几个)氨基酸缺失，并保留结合于FcRn的能力的多肽。片段可由来源于HSA的一个未中断的序列组成，或其可包含两个或更多个来源于HSA的序列。本发明的片段具有超过大约20个氨基酸残基的大小，优选超过30个氨基酸残基，更优选超过40个氨基酸残基，更优选超过50个氨基酸残基，更优选超过75个氨基酸残基，更优选超过100个氨基酸残基，更优选超过200个氨基酸残基，更优选超过300个氨基酸残基，甚至更优选超过400个氨基酸残基，且最优选超过500个氨基酸残基的大小。
等位变体(allelicvariant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定其翻译得到的多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。
cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工(包括剪接)然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
调控序列(controlsequence)：术语“调控序列”意指编码本发明变体的多核苷酸表达所必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述变体的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列在编码变体的多核苷酸编码区内的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码变体的多核苷酸，并与供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不完全相同的亲本细胞的任何后代。
血浆半寿期：理想地，血浆半寿期应在合适个体中在体内确定。然而，由于这样消耗时间，成本昂贵，并不可避免地存在对动物和人进行实验带来的伦理问题，因此期望使用体外测定以确定血浆半寿期是否延长或缩短。已知白蛋白对其受体FcRn的结合对于血浆半寿期是重要的，且受体结合和血浆半寿期之间的关联是白蛋白对其受体的更高亲和力导致更长的血浆半寿期。因此对于本发明，白蛋白对FcRn的较高的亲和力被视为指示增加的血浆半寿期，而白蛋白对其受体的较低亲和力被视为指示减少的血浆半寿期。
在本申请和权利要求书中，白蛋白对其受体FcRn的结合使用术语亲和力和表述“较强”或“较弱”来描述。因此，应理解的是与HSA相比具有对FcRn较高亲和力的分子被视作与HSA相比较强地结合于FcRn，而与HSA相比具有对FcRn较低亲和力的分子被视作与HSA相比较弱地结合于FcRn。
术语“较长的血浆半寿期”或“较短的血浆半寿期”以及类似的表述应理解为相对于相应的亲本白蛋白分子。因此，对于本发明的白蛋白变体，较长的血浆半寿期意指所述变体与具有相同序列但不含在对应于SEQIDNO:2中417、440、464、490、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582和584的位置的改变的对应白蛋白相比具有较长的血浆半寿期。
变体命名规则：
就本发明而言，将公开于SEQIDNO:2中的成熟多肽用于确定在其他白蛋白中对应的氨基酸残基。将其他白蛋白的氨基酸序列与公开于SEQIDNO:2中的成熟多肽进行比对，并基于该比对，使用如EMBOSS包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277)的Needle程序(优选版本3.0.0或更新)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定了SEQIDNO:2所公开的成熟多肽中任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。
在其他白蛋白中鉴定对应的氨基酸残基可通过使用“ClustalW”(Larkin等,2007,Bioinformatics23:2947-2948)比对多个多肽序列来确认。
当其他多肽(或蛋白)从SEQIDNO:2的成熟多肽分歧到传统的基于序列的比较无法检测出其关系的程度时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)，可使用其他逐对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用采用多肽家族的概率表现(probabilisticrepresentation)(序型)来搜索数据库的搜索程序获得。举例而言，PSI-BLAST程序通过迭代的(iterative)数据库搜索过程来产生序型，并能够检测出较远的同源物(Atschul等,1997,NucleicAcidsRes.25:3389-3402)。当多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表时，甚至可达成更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones1999,J.Mol.Biol.287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics19:874-881)使用来自多个来源(PSI-BLAST、二级结构预测(secondarystructureprediction)、结构比对序型(structuralalignmentprofile)以及溶解势(solvationpotential))的信息作为向预测查询序列(querysequence)的结构折叠(structuralfold)的神经网络的输入。类似地，Gough等,2000,J.Mol.Biol.313:903-919的方法可用于将未知结构的序列在存在于SCOP数据库中的超家族模型内进行比对。这些比对继而能够用于生成关于多肽的同源性模型，且上述模型可就准确度使用多种为此目的开发的工具加以评价。
对于已知结构的蛋白质，可用数种工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。举例而言，已将SCOP超家族的蛋白质进行了结构比对，且这些比对是可获取并可下载的。两个或更多蛋白质结构可使用多种算法，如距离比对矩阵(distancealignmentmatrix)(Holm和Sander,1998,Proteins33:88-96)或组合延伸(combinatorialextension)(Shindyalov和Bourne,1998,ProteinEngineering11:739-747)进行比对，且这些算法的执行可另外用于查询具有目标结构的结构数据库，以发现可能的结构同源物(例如Holm和Park,2000,Bioinformatics16:566-567)。
在描述本发明的白蛋白变体时，为了参照方便起见，采用了下述的命名法。使用通用的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用下述命名法：初始氨基酸，位置，取代氨基酸。相应地，例如在226位用丙氨酸取代苏氨酸命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多重突变用加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表在205和411位分别用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，以及用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。附图亦使用(“/”)，例如“E492T/N503D”，这应视作可与(“+”)互换。
缺失。对于氨基酸缺失，使用了如下命名法：初始氨基酸，位置*。相应地，在位置195缺失甘氨酸命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入。对于氨基酸插入，使用了如下的命名法：初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸。因此，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸命名为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入命名为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸#1，插入的氨基酸#2；等等]。例如，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸记为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此情况下，通过在插入的氨基酸残基前的氨基酸残基的位置号添加小写字母而对插入的氨基酸残基进行编号。因此，在上一例子中序列为：
| 亲本: | 变体: |
| 195 | 195 195a 195b |
| G | G- K- A |
多重改变。包含多重改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和195分别用酪氨酸和谷氨酸取代精氨酸和甘氨酸。
不同的取代。当可在一个位置导入不同取代时，不同的取代由逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170用酪氨酸或谷氨酸取代精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”指下述变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”，“Tyr167Gly+Arg170Ala”，“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
亲本白蛋白
白蛋白是蛋白，并构成哺乳动物中血浆中最丰富的蛋白，且来自多种哺乳动物的白蛋白已通过生物化学方法和/或通过序列信息表征。几种白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)，已通过晶体学方法表征，且其结构已确定。
HSA是本发明优选的白蛋白，并为由585个氨基酸残基组成并具有67kDa的分子量的蛋白。在其天然形式，其未经糖基化。HSA的氨基酸序列示于SEQIDNO:2。本领域技术人员会理解可能存在与HSA具有基本上相同特性，但与SEQIDNO:2相比具有一个或多个氨基酸变化的天然等位基因，且本发明人亦涵盖使用此类天然等位基因作为本发明的亲本白蛋白。
白蛋白一般具有大约20日或更久的长血浆半寿期，例如，HSA具有19日的血浆半寿期。已知HSA的长血浆半寿期是通过与其受体FcRn的相互作用来介导的，然而，对于HSA的长半寿期背后的确切机制的理解或知识对于本发明不是必需的。
根据本发明，术语“白蛋白”意指与HSA具有相同或非常类似的三维结构，并具有长血浆半寿期的蛋白。作为本发明的白蛋白的实例，可提及人血清白蛋白，灵长类血清白蛋白(如黑猩猩血清白蛋白，大猩猩血清白蛋白)，啮齿类血清白蛋白(如仓鼠血清白蛋白，豚鼠血清白蛋白，小鼠白蛋白和大鼠血清白蛋白)，牛血清白蛋白，马血清白蛋白，驴血清白蛋白，兔血清白蛋白，山羊血清白蛋白，绵羊血清白蛋白，犬血清白蛋白，鸡血清白蛋白和猪血清白蛋白。如SEQIDNO:2公开的HSA及其任意天然出现的等位基因，是本发明优选的白蛋白。
本发明的亲本白蛋白，其片段，或包含白蛋白或其片段的融合多肽的白蛋白部分一般与SEQIDNO:2中所示的HSA的序列具有至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少86％，优选至少87％，优选至少88％，优选至少89％，优选至少90％，优选至少91％，优选至少92％，优选至少93％，优选至少94％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％的序列同一性。
所述亲本优选包含或组成为SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一个方面所述亲本包含或组成为SEQIDNO:2的成熟多肽。
在另一个实施方案中，所述亲本是SEQIDNO:2的成熟多肽的等位变体。
在第二个方面，所述亲本由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列；(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列；或(iii)(i)或(ii)的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。
SEQIDNO:1的多核苷酸或其亚序列，以及SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码亲本的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，例如至少25，至少35，或至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针是至少100个核苷酸长度，例如，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个核苷酸，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸的长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以检测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。本发明涵盖此类探针。
可从由这些其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并编码亲本的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它生物体的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQIDNO:1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中。
就本发明而言，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核苷酸探针杂交，所述核苷酸探针对应于SEQIDNO:1中所示的多核苷酸，其互补链，或其亚序列。可使用例如X射线片(X-rayfilm)或任何其他本领域中已知的检测手段来检测与所述探针杂交的分子。
在一个方面，所述核酸探针是SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核酸探针是SEQIDNO:1的核苷酸1至1785。在另一个方面，所述核酸探针是编码SEQIDNO:2的多肽或其片段的多核苷酸。在另一个方面，所述核酸探针是SEQIDNO:1。
对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5XSSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35％的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用2XSSC、0.2％SDS在45℃(非常低严格性)，在50℃(低严格性)，在55℃(中严格性)，在60℃(中-高严格性)，在65℃(高严格性)，或70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy的计算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390)计算出的Tm低大约5℃至大约10℃，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodiumpyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodiummonobasicphosphate)，0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。将所述载体材料在6×SSC加0.1％SDS中最终洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的Tm低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。
在第三方面，所述亲本由具有与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的序列的多核苷酸编码，所述多核苷酸编码能够发挥白蛋白功能的多肽。在一个实施方案中，所述亲本由包含或组成为SEQIDNO:1的多核苷酸编码。
变体的制备
在进一步的方面，本发明涉及用于制备变体白蛋白，其片段，或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽的方法，其包含下述步骤：
a.在白蛋白或其片段，或包含白蛋白或其片段的融合多肽的白蛋白部分中，鉴定对于白蛋白结合FcRn重要的一个或多个氨基酸残基位置；
b.提供编码所述白蛋白，其片段，或包含白蛋白或其片段的融合多肽的白蛋白部分的核酸；
c.修饰b中提供的核酸，使得位于在a中鉴定出的位置处的一个或多个(几个)氨基酸残基缺失或用不同氨基酸取代或插入。
d.在合适的宿主细胞中表达修饰的核酸；和
e.回收所述变体白蛋白，其片段或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽。
在白蛋白，其片段，或融合多肽的白蛋白部分中鉴定对于白蛋白结合FcRn重要的一个或多个氨基酸残基位置可以以数种方式进行，包括但不限于随机诱变继以分析生成的突变体，并与未突变的亲本分子比较，以及基于结构考量的鉴定，任选地继以生成具有鉴定出的改变的变体，并与未突变的亲本分子相比较。
用于鉴定待改变的一个或多个氨基酸残基位置，以制备与天然HSA相比具有对FcRn的改变结合的变体HSA的优选方法包括下述步骤：
i)鉴定具有对FcRn不同的结合特性的非人白蛋白；
ii)鉴定人血清白蛋白与FcRn相互作用的氨基酸残基；
iii)针对步骤ii)中鉴定出的氨基酸残基比较鉴定出的非人白蛋白和人血清白蛋白的一级和/或三级结构，并将在所述非人白蛋白和人血清白蛋白之间不同的氨基酸残基鉴定为导致所观察到的结合差异；和
iv)任选地，制备HSA在步骤iii)中鉴定的位置处的变体，并确认制备的变体与HSA相比具有改变的对FcRn的结合。
上述步骤i)可使用下文中所述的SPR测定法实施。然而，本领域技术人员会理解其他方法可用于鉴定与HSA相比具有不同的对FcRn的结合特性的非人白蛋白，且所述方法并不依赖于所述具有不同的对FcRn的结合特性的非人白蛋白是如何鉴定出的。
在一个优选实施方案中，鉴定出的非人白蛋白与HSA相比，具有较强的对FcRn的结合。与HSA相比具有较强的对FcRn的结合的非人白蛋白的实例包括驴血清白蛋白，兔血清白蛋白，犬血清白蛋白，仓鼠血清白蛋白，豚鼠血清白蛋白，小鼠血清白蛋白和大鼠血清白蛋白。步骤ii)可通过考虑FcRn，HSA和两者之间的结合复合物的结构来实现。在缺乏可获得的结合复合物结构的情况下，可使用HSA结构锚定在FcRn结构的结构中的模型，并由此鉴定出HSA中与FcRn相互作用的氨基酸残基。
在另一个优选实施方案中，鉴定出的非人白蛋白与HSA相比具有较弱的对FcRn的结合。与HSA相比具有较弱的对FcRn的结合的非人白蛋白的实例包括牛血清白蛋白，山羊血清白蛋白，绵羊血清白蛋白和鸡血清白蛋白。步骤ii)可通过考虑FcRn，HSA和两者之间的结合复合物的结构来实现。在缺乏可获得的结合复合物结构的情况下，可使用HSA结构锚定在FcRn结构的结构中的模型，并由此鉴定出HSA中与FcRn相互作用的氨基酸残基。
在本发明和权利要求书中，HSA中与FcRn相互作用的氨基酸残基视为HSA中任何位于FcRn中的某氨基酸以内的氨基酸残基，或任何涉及与位于FcRn中的某氨基酸以内的氨基酸残基的氢键、盐桥或极性或非极性相互作用的氨基酸残基。优选地，HSA残基中的氨基酸位于FcRn中的氨基酸的以内，更优选FcRn中的氨基酸的以内，且最优选FcRn中的氨基酸的以内。
步骤iii)和iv)可使用本领域技术人员公知的技术实施。
本发明还涉及获得变体白蛋白或其片段，或包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，或变体白蛋白或其片段的缔合物的方法，包括：(a)将在对应于SEQIDNO:2的成熟多肽的位置417、440、464、490、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582和584的一个或多个(几个)位置处的改变导入亲本白蛋白或其片段，或包含所述亲本白蛋白或其片段的融合多肽；和(b)回收所述变体白蛋白或其片段，或包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽。
所述变体可由本领域技术人员使用本领域中任何已知的诱变步骤，如定点诱变，合成基因构建，半合成基因构建，随机诱变，改组等来制备。
定点诱变是在编码亲本的多核苷酸中的一个或多个确定位点创建一个或多个(几个)突变的技术。
定点诱变可在体外通过PCR达成，涉及使用含有所期望突变的寡核苷酸引物。定点诱变亦可在体外通过表达盒诱变进行，涉及用限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点进行切割，然后将含有突变的寡核苷酸连接于所述多核苷酸中。通常在质粒上和在寡核苷酸上进行消化的限制酶是相同的，使所述质粒和插入物能够彼此连接。参见，例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:4949-4955；以及Barton等,1990,NucleicAcidsResearch18:7349-4966。
定点诱变亦可在体内通过本领域已知方法达成。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；Storici等,2001,NatureBiotechnol.19:773-776；Kren等,1998,Nat.Med.4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,FungalGenet.Newslett.43:15-16。
任何定点诱变方法均可用于本发明。有许多可用的商业试剂盒可用于制备变体。
合成基因构建涉及在体外合成设计为编码目标多肽的多核苷酸分子。基因合成可使用多种技术进行，如由Tian等(2004,Nature432:1050-1054)所述基于多路微芯片(multiplexmicrochip-based)的技术，以及类似的技术，其中合成寡核苷酸并在可用光编程(photo-programmable)的微流芯片(microfluidicchip)上组装。
可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413；或者WO95/22625所公开的那些，来进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等,1991,Biochemistry.30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)和区域定向诱变(region-directedmutagenesis)(Derbyshire等,1986,Gene46:145；Ner等,1988,DNA7:127)。
诱变/改组方法可与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的经克隆、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,NatureBiotechnology17:893-896)。编码活性多肽的经诱变的DNA分子可自宿主细胞回收并使用本领域标准方法迅速测序。这些方法使快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性成为可能。
半合成基因构建通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的特征来达成。半合成构建通常为使用合成的多核苷酸片段与PCR技术组合的方法。基因的确定区域可因而从头开始合成，而其他区域可使用定点诱变引物扩增，还可对另外的其他区域进行易错PCR或非易错PCR(non-errorpronePCR)扩增。然后多核苷酸亚片段可进行改组。
变体
本发明还提供了亲本白蛋白的变体白蛋白或其片段，或包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其在对应于SEQIDNO:2中位置417、440、464、490、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582和584的一个或多个(几个)位置包含改变，其中每个改变独立地为取代、插入或缺失，其前提为所述变体并非具有取代D494N、E501K、K541E、D550G,A、K573E或K574N的SEQIDNO:2。
本发明的变体白蛋白，其片段，或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽的白蛋白部分一般地与SEQIDNO:2中所示的HSA的序列具有至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％的序列同一性。
在一个方面，本发明变体中的改变数是1-20，例如1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
所述变体白蛋白，其片段，或包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽与对应的亲本白蛋白，其片段，或包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽相比具有改变的血浆半寿期。
在一个特别优选的实施方案中，所述亲本白蛋白是HSA，且所述变体白蛋白，其片段，或包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽与HSA，其对应的片段，或包含HSA或其片段的融合多肽相比具有改变的血浆半寿期。
基于天然出现的等位基因HSAD494N，本发明人意识到白蛋白对其受体的结合与血浆半寿期之间的关联。发明人分析了该等位基因，并发现其对其受体FcRn具有较低的亲和力。
此外，已公开了其天然小鼠FcRn用人FcRn替代的转基因小鼠与正常小鼠相比具有较高的血清白蛋白水平，参见JExpMed.(2003)197(3):315-22。本发明人发现人FcRn对小鼠血清白蛋白的亲和力与小鼠FcRn对小鼠血清白蛋白的亲和力相比更高，因此，在转基因小鼠中观察到的血清白蛋白的增加与血清白蛋白和其受体之间较高亲和力相一致，确证了白蛋白对FcRn的结合与血浆半寿期之间的关联。此外，已在小鼠模型中显示对FcRn几乎无或无结合的白蛋白的变体具有减少的半寿期，Kenanova等(2009)J.Nucl.Med.；50(Supplement2):1582)。
一种确定变体白蛋白对FcRn的亲和力是否高于或低于亲本白蛋白的方式是使用如下所述的表面等离子共振测定(SurfacePlasmonResonanceassay，SPR)。本领域技术人员应理解可使用其他方法确定变体白蛋白对FcRn的亲和力是否高于或低于亲本白蛋白对FcRn的亲和力，例如确定和比较结合常数KD。因此，根据本发明具有低于天然HSA的KD的KD的变体白蛋白视为具有与HSA相比更高的血浆半寿期，而具有高于天然HSA的KD的KD的变体白蛋白视为具有与HSA相比更低的血浆半寿期。
白蛋白的变体或其片段，或者包含白蛋白或其片段的融合多肽，在对应于HSA中选自下组的位置的一个或多个(几个)位置包含一个或多个改变，如取代、缺失或插入：417、440、464、490、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582和584。所述取代可为任何取代，其中天然白蛋白序列中的氨基酸由选自其他19中天然出现的氨基酸的不同氨基酸所取代。
在一个方面，变体在对应于SEQIDNO:2中的位置417、440、464、490、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582和584的一个或多个(几个)位置包含改变。在另一个方面，变体在对应于SEQIDNO:2中417、440、464、490、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582和584的两个位置包含改变。在另一个方面，变体在对应于SEQIDNO:2中的位置417、440、464、490、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582和584的三个位置包含改变。在另一个方面，变体在对应于SEQIDNO:2中的位置417、440、464、490、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582和584的每个位置包含改变。
在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代Q417A,H。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代H440Q。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代H464Q。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代A490D。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代E492G,T,P,H。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代V493P,L。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代D494N,Q,A,E,P。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代E495Q,A。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代T496A。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代P499A。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代K500E,G,D,A,S,C,P,H,F,N,W,T,M,Y,V,Q,L,I,R。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代E501A,P,Q。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代N503K,D,H。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代A504E。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代E505K,D。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代T506F,S。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代H510Q。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代H535Q。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代K536A。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代P537A。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代K538A,H。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代T540S。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代K541A,D,G,N,E。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代E542P,D。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代D550N。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代K573Y,W,P,H,F,V,I,T,N,S,G,M,C,A,E,Q,R,L,D。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代K574N。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代Q580K。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代L575F。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代A577T,E。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代A578R,S。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代S579C,T。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代Q580K。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代A581D。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代A582T。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代G584A。
在一个方面，所述变体在对应于位置417的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置417的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Ala或His。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代Q417A,H。
在另一个方面，所述变体在对应于位置440的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置440的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Ala。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代H440Q。
在另一个方面，所述变体在对应于位置464的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置464的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Ala。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代H464Q。
在另一个方面，所述变体在对应于位置490的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置490的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代A490G。
在另一个方面，所述变体在对应于位置492的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置492的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Gly。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代E492G。
在另一个方面，所述变体在对应于位置493的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置493的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Pro。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代V493P。
在另一个方面，所述变体在对应于位置494的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置494的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Asn，Gln或Ala。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代D494N,Q,A。
在另一个方面，所述变体在对应于位置495的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置495的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Gln或Ala。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代E495Q或A。
在另一个方面，所述变体在对应于位置496的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置496的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Ala。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代T496A。
在另一个方面，所述变体在对应于位置499的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置499的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Ala。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代P499A。
在另一个方面，所述变体在对应于位置500的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置500的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Ala。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代K500E,G,D,A,S,C,P,H,F,N,W,T,M,Y,V,Q,L,I,R。
在另一个方面，所述变体在对应于位置501的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置501的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Ala或Gln(以减少亲和力)和Pro(以增加亲和力)。在另一个方面，所述变体包含取代SEQIDNO:2的成熟多肽的E501A,Q,P。
在另一个方面，所述变体在对应于位置503的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置503的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Asp或Lys或His。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代N503D,K,H。
在另一个方面，所述变体在对应于位置504的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置504的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代A504。
在另一个方面，所述变体在对应于位置505的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置505的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代E505D。
在另一个方面，所述变体在对应于位置506的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置506的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代T506S,F。
在另一个方面，所述变体在对应于位置510的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置510的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Gln。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代H510Q。
在另一个方面，所述变体在对应于位置535的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置535的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Gln。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代H535Q。
在另一个方面，所述变体在对应于位置536的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置536的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Ala。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代K536A。
在另一个方面，所述变体在对应于位置537的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置537的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Ala。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代P537A。
在另一个方面，所述变体在对应于位置538的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置538的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Ala。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代K538H,A。
在另一个方面，所述变体在对应于位置540的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置540的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代T540S。
在另一个方面，所述变体在对应于位置541的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置541的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Gly，Asp或Ala。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代K541G,DA,N。
在另一个方面，所述变体在对应于位置542的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置542的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Asp或Pro。在另一个方面，所述变体包含取代SEQIDNO:2的成熟多肽的E542D,P。
在另一个方面，所述变体在对应于位置550的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置550的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Asn(以减少亲和力)，优选Glu(以增加亲和力)。
在另一个方面，所述变体在对应于位置573的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置573的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Tyr，Trp，Pro，His。Phe，Val，Ile，Thr，Asn，Ser，Gly，Met，Cys，Ala，Glu，Gln，Arg，Leu，Asp。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代K573Y,W,P,H,F,V,I,T,N,S,G,M,C,A,E,Q,R,L,D。
在另一个方面，所述变体在对应于位置574的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置574的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Asn。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代K574N。
在另一个方面，所述变体在对应于位置575的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置575的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Phe。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代L575F。
在另一个方面，所述变体在对应于位置577的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置577的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Thr或Glu。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代A577TE。
在另一个方面，所述变体在对应于位置578的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置578的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Arg或Ser。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代A578R,S。
在另一个方面，所述变体在对应于位置579的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置579的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Cys或Thr。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代S579C,T。
在另一个方面，所述变体在对应于位置580的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置580的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Lys。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代Q580K。
在另一个方面，所述变体在对应于位置581的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置581的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Asp。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代A581D。
在另一个方面，所述变体在对应于位置582的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置582的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Thr。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代A582T。
在另一个方面，所述变体在对应于位置584的位置包含改变。在另一个方面，在对应于位置584的位置的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选Ala。在另一个方面，所述变体包含SEQIDNO:2的成熟多肽的取代G584A。
在另一个方面，所述变体在对应于SEQIDNO:2中位置494和496的位置包含改变，如上述那些。
在另一个方面，所述变体在对应于SEQIDNO:2中位置492和493的位置包含改变，如上述那些。
在另一个方面，所述变体在对应于SEQIDNO:2中位置494和417的位置包含改变，如上述那些。
在另一个方面，所述变体在对应于SEQIDNO:2中位置492和503的位置包含改变，如上述那些。
在另一个方面，所述变体在对应于SEQIDNO:2中位置492和573的位置包含改变，如上述那些。
在另一个方面，所述变体在对应于SEQIDNO:2中位置492，503和573的位置包含改变，如上述那些。
在一个实施方案中，本发明的变体白蛋白或其片段，或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，在对应于HSA中选自下组的位置的位置含有一个取代：SEQIDNO:2中的417，440，464，490，492，493，494，495，496，499，500，501，503，504，505，506，510，535，536，537，538，540，541，542，550，573，574，575，577，578，579，580，581，582和584，前提为所述变体白蛋白并非由具有取代D494N，E501K，K541E，D550G,A，K573E或K574N的SEQIDNO:2组成的变体。本发明的变体白蛋白，其片段，或者包含变体白蛋白或其片段的融合多肽可在对应于HSA中其他位置的一个或多个(几个)位置包含其他取代、插入或缺失。
在另一个实施方案中，本发明的变体白蛋白或其片段，或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，在对应于HSA中选自下组的位置的位置含有两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或甚至更多个取代：SEQIDNO:2的417，440，464，490，492，493，494，495，496，499，500，501，503，504，505，506，510，535，536，537，538，540，541，542，550，573，574，575，577，578，579，580，581，582和584。本发明的变体白蛋白或其片段，或者包含变体白蛋白或其片段的融合多肽可在对应于HSA中其他位置的位置包含其他取代、插入或缺失。
在进一步的实施方案中，本发明的变体白蛋白或其片段，或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，与亲本白蛋白，其片段，或者包含所述亲本白蛋白或其片段的融合多肽的血浆半寿期相比，具有较长的血浆半寿期。根据该实施方案的实例包括在对应于SEQIDNO:2中的492，503，542，550，573，574，580，581，582或584的位置包含取代的变体白蛋白或其片段，或者包含变体白蛋白或其片段的融合多肽。根据本发明该实施方案的优选的取代包括在对应于SEQIDNO:2中492的位置的氨基酸残基的用G残基的取代，在对应于SEQIDNO:2中503的位置的氨基酸残基的用H或K残基的取代，在对应于SEQIDNO:2中550的位置的氨基酸残基的用E残基的取代，在对应于SEQIDNO:2中573的位置的氨基酸残基的用Y,W,P,H,F,V,I,T,N,S,G,M,C,A,E,Q,R,L或D的取代，在对应于SEQIDNO:2中574的位置的氨基酸残基的用N残基的取代，或在对应于SEQIDNO:2中580的位置的氨基酸残基的用K残基的取代。其他优选的变体具有在对应于SEQIDNO:2中492的位置用G残基的取代，和具有在对应于SEQIDNO:2中573的位置用A或P残基的取代。其他优选的变体具有在对应于SEQIDNO:2中位置492的位置多种取代，并在SEQIDNO:2中503的位置为H残基。
其他优选的变体具有在对应于SEQIDNO:2中492的位置用G残基的取代，和在对应于SEQIDNO:2中位置503的位置对应于H或K的取代，和在SEQIDNO:2中位置573用A或P残基的取代。
在进一步的实施方案中，本发明的变体白蛋白或其片段，或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，与亲本白蛋白，其片段，或者包含所述亲本白蛋白或其片段的融合多肽相比，具有较短的血浆半寿期。根据该实施方案的实例包括在对应于SEQIDNO:2中的417，440，494，495，496，499，500，501，536，537，538，541，494+496或492+493的位置包含取代的变体白蛋白或其片段，或者包含变体白蛋白或其片段的融合多肽。优选的取代包括对应于SEQIDNO:2中Q417A，H440Q，D494E+Q417H，D494N,Q,A，E495Q,A，T496A，D494N+T496A或P499A，K500A，E501A，E501Q，K536A，P537A，K538A，K541G，K541AK541D或D550N的取代。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的变体白蛋白或其片段，或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽丧失其结合FcRn的能力。在这种关联中，若在如下所述的SPR测定中对变体测得的共振单位少于对于对应的亲本白蛋白或其片段测得的共振单位的10％，则白蛋白变体或其片段，或者包含白蛋白变体或其片段的融合多肽被视为丧失结合FcRn的能力。根据该实施方案的实例包括在对应于SEQIDNO:2中464，500，510或535的位置包含取代的变体白蛋白或其片段，或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽。优选的取代包括对应于SEQIDNO:2中H464Q，K500A,P,C,S,A,D.GH510Q或H535Q的取代。
除了在对应于SEQIDNO:2中位置417，464，490，492，493，494，495，496，499，500，501，503，504，505，506，510，535，536，537，538，540，541，542，550，573，574，580，581，582和584的一个或多个位置的一个或多个取代之外，本发明的变体白蛋白或其片段，或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽可在分子的其他位置含有其他取代、缺失或插入。此类其他的取代、缺失或插入可用于改变分子的其他特性，如但不限于改变糖基化，导入表面反应基团如硫醇基团，去除/生成氨甲酰化位点等。
可改变以提供表面上的反应性残基，并可有利地应用于本发明的残基已公开于未公开的专利申请WO2010/092135(通过提述并入)中。特别优选的残基包括对应于SEQIDNO:2中的位置的位置。
作为可在SEQIDNO:2中或在其他白蛋白中对应位置进行以在表面提供反应性硫醇基团的改变的实例包括对应于下述SEQIDNO:2中改变的改变：L585C，D1C，A2C，D562C，A364C，A504C，E505C，T79C，E86C，D129C，D549C，A581C，D121C，E82C，S270C，A578C，L595LC，D1DC，A2AC，D562DC，A364AC，A504AC，E505EC，T79TC，E86EC，D129DC，D549DC，A581AC，A581AC，D121DC，E82EC，S270SC，A579AC，C360*，C316*，C75*，C168*，C558*，C361*，C91*，C124*，C169*和C567*。或者，可在白蛋白的N或C端添加半胱氨酸残基。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明任何变体的分离的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。
可以用许多方式操作多核苷酸以提供变体的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
调控序列可以是启动子序列，其由宿主细胞识别以供表达多核苷酸。启动子序列含有介导变体的表达的转录调控序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母蛋白酶A(PRA1)、酿酒酵母蛋白酶B(PRB1)、酿酒酵母翻译延伸因子(TEF1)、酿酒酵母翻译延伸因子(TEF2)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞有用的其它启动子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述变体的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、酿酒酵母醇脱氢酶(ADH1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞有用的其它终止子由Romanos等,1992,见上描述。
调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码变体的多核苷酸的5’末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与变体编码序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.15:5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的N端相连的信号肽，并且指导变体进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码区，该信号肽编码区与编码变体的编码区的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码区为外源的信号肽编码区。外源信号肽编码区在编码序列不天然地含有信号肽编码区时可为必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以增强变体的分泌。然而，可使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列描述于Romanos等，1992，见上。
当信号肽和前肽区二者均出现在变体的N端时，使前肽区的位置紧接着(nextto)变体N端，并且使信号肽区的位置紧接着前肽区的N端。
产生方法
本发明的变体可使用本领域技术人员公知的技术制备。一种方便的方法是通过克隆编码亲本白蛋白或其片段或者包含白蛋白或其片段的融合多肽的核酸，修饰所述核酸以在对应于SEQIDNO:2中位置417、464、490、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、550、573、574和580的一个或多个(几个)位置导入所需的取代，其中所述变体并非由具有取代D494N、E501K、K541E、D550G,A、K573E或K574N的SEQIDNO:2组成的变体，制备合适的基因构建体，其中经修饰的核酸与合适的调节遗传元件如启动子、终止子、激活位点、核糖体结合位点等可操作地连接，将所述基因构建体导入合适的宿主生物，在导致所述变体表达的条件下培养经转化的宿主生物，并回收所述变体。所有这些技术在本领域是公知的，且一般技术人员具有设计合适的方法以供制备本发明的具体变体的能力。
亦可将本发明的变体多肽连接于信号序列以使得所述变体多肽在经转化的宿主生物培养过程中分泌入生长培养基。使得变体多肽分泌入生长培养基以便回收和纯化一般是有利的。
用于制备变体多肽的技术亦公开于WO2009019314(通过提述并入)，且这些技术亦可适用于本发明。
白蛋白已成功地作为重组蛋白在多种宿主包括真菌(包括但不限于曲霉属(Aspergillus)(WO06066595)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(Fleer1991,Bio/technology9,968-975)，毕赤酵母属(Pichia)(Kobayashi1998TherapeuticApheresis2,257-262)和酵母属(Saccharomyces)(Sleep1990,Bio/technology8,42-46))，细菌(Pandjaitab2000,J.AllergyClin.Immunol.105,279-285))，动物(Barash1993,TransgenicResearch2,266-276)和植物(包括但不限于马铃薯和烟草(Sijmons1990,Bio/technology8,217andFarran2002,TransgenicResearch11,337-346)中得到表达。本发明的变体多肽优选在合适的宿主细胞中通过重组产生。原则上，任何能够以合适量产生多肽的宿主细胞均可使用，且一般技术人员具有根据本发明选择合适宿主细胞的能力。优选的宿主生物是酵母，优选选自酵母属(Saccharomycacae)，更优选为酿酒酵母。
可使用已知的分离技术如过滤、离心、层析和亲和分离技术等的组合从生长培养基回收和纯化本发明的变体多肽。一般技术人员有使用此类已知分离步骤的特定组合纯化所述变体的能力。作为可应用于本发明的变体的纯化技术的实例，可提及WO0044772的教导。
本发明的变体多肽可用于将治疗上有益的化合物递送至有此需要的动物或人类个体。此类治疗上有益的化合物包括但不限于用于诊断如多种显影技术的标记和容易检测的化合物；药学活性化合物如药物，或特异性结合模块如抗体。本发明的变体甚至可连接至两种或更多种不同的治疗上有益的化合物，例如一种抗体和一种药物，这赋予组合分子特异性结合于所需的靶的能力，并由此对于该特定靶提供高浓度的所连接的药物。
融合多肽
本发明的白蛋白变体及其片段亦可与非白蛋白多肽融合伴侣相融合。所述融合伴侣原则上可为任何多肽，但一般优选所述融合伴侣是具有治疗或诊断特性的多肽。包含白蛋白或其片段的融合多肽在本领域中是已知的。已发现此种包含白蛋白或其片段以及融合伴侣多肽的融合多肽与未融合的融合伴侣多肽相比具有较长的血浆半寿期。根据本发明，可改变本发明的融合多肽相对于现有技术的相应融合多肽的血浆半寿期。
可将一种或多种治疗多肽融合于白蛋白的N端，C端，插入白蛋白结构中的环(loop)，或其任意组合。其可包含或不包含将融合多肽多种组分分开的接头序列。
涉及白蛋白或其片段的融合的教导在本领域是已知的，且本领域技术人员会知道此类教导亦可适用于本发明。WO2001/79271A和WO2003/59934A亦包含可融合于白蛋白或其片段的治疗多肽的实例，且这些实例亦适用于本发明。
缀合物
本发明的白蛋白变体或其片段可使用本领域中已知的技术缀合于第二分子。所述第二分子可包含诊断模块，且在该实施方案中所述缀合可用作如在显影中的诊断工具，或所述第二分子可为治疗化合物，且在该实施方案中所述缀合物可用于治疗目的，其中所述缀合物具有所述治疗化合物的治疗特性以及白蛋白的长血浆半寿期。白蛋白和治疗分子的缀合物在本领域中是已知的，且已验证正如此，此类缀合物与未缀合的游离的治疗分子相比具有较长的血浆半寿期。所述缀合物可方便地通过HSA表面上存在的游离硫基团(成熟HSA的氨基酸残基34)使用公知的化学方法来连接。
在一个特别优选的方面，将所述变体白蛋白及其片段缀合于有益的治疗化合物，并将该缀合物用于治疗有此需要的患者中的病状，其中所述病状响应该特别选定的治疗化合物。用于将此种治疗化合物缀合于变体白蛋白或其片段的技术在本领域中是已知的。WO2009/019314公开了适于将治疗化合物缀合于多肽的技术的实例，且该技术亦可适用于本发明。此外，WO2009/019314公开了可缀合于取代的转铁蛋白的化合物和模块的实例，且这些实例亦可应用于本发明。WO2009/019314的教导通过提述并入本文。
HSA以其天然形式含有一个游离硫醇基团，其可方便地用于缀合。作为该方面中的具体实施方案，所述变体白蛋白或其片段可包含提供用于在其表面生成其他游离硫醇基团的进一步修饰。这具有下述益处：使得所述变体白蛋白或其片段的有效负载增加，从而可将超过一个分子的治疗化合物缀合于每分子的变体白蛋白或其片段，或可将两个或更多个不同的治疗化合物缀合于每分子的变体白蛋白或其片段，例如，将具有靶向特性的化合物如对例如肿瘤具特异性的抗体；以及细胞毒性药物缀合于变体白蛋白或其片段，由此构建针对肿瘤的高度特异性药物。对可修饰以在表面提供更多游离硫醇基团的特定残基的教导亦可见于共同待决的专利申请WO2010/092135，其通过提述并入本文。
缔合物
所述白蛋白的变体或其片段可进一步以“缔合物”的形式使用。在此情况下，术语“缔合物”旨在意指包含白蛋白变体或其片段以及另一种通过非共价结合连接或缔合于所述变体白蛋白或其片段的另一种化合物的化合物。作为此种缔合物的实例，可提及由变体白蛋白和通过疏水相互作用缔合于白蛋白的脂质的缔合物。此类缔合物在本领域是已知的，且其可使用公知技术制备。作为本发明优选的缔合物的实例，可提及包含变体白蛋白和紫杉醇的缔合物。
其他用途
本发明的变体白蛋白或其片段，或者包含变体白蛋白或其片段的融合多肽具有与亲本白蛋白或其片段，或者包含亲本白蛋白或其片段的融合多肽相比，其血浆半寿期改变的益处。其好处在于本发明的包含变体白蛋白或其片段的缀合物或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，或包含变体白蛋白或其片段的缔合物的血浆半寿期可依照具体治疗目的而加以选择。
举例而言，对于用于在动物或人类中显影目的的缀合物、缔合物或融合多肽，当显影模块具有非常短的半寿期，以及包含HSA的缀合物或融合多肽具有远较该显影目的所需的更长的血浆半寿期时，使用与亲本白蛋白或其片段相比具有较短血浆半寿期的本发明的变体白蛋白或其片段，以提供具有长至对于显影目的足够，但短至足够从其施用的特定患者体内清除的血浆半寿期的融合多肽的缀合物是有利的。
在关于包含有效治疗或缓解需要此种治疗的患者中的特定病状的治疗化合物的缀合物、缔合物或融合多肽的另一个实例中，使用与亲本白蛋白或其片段相比具有较长血浆半寿期的变体白蛋白或其片段以提供具有较长血浆半寿期的缔合物或缀合物或融合多肽会是有利的，这会具有下述益处：本发明的缔合物或缀合物或融合多肽的施用不需要频繁施用或仅需要减少的剂量，从而与当使用亲本白蛋白或其缔合物或其片段的情况相比具有较少的副作用。
在一个进一步的方面，本发明涉及包含本发明的变体白蛋白，其缔合物或其片段，变体白蛋白片段或其缔合物，或者包含变体白蛋白或其片段的融合多肽的组合物。所述组合物优选为药学组合物。所述组合物可使用本领域已知的技术制备，如药学领域内公认的手册中公开的技术。
在一个具体实施方案中，所述组合物包含本发明的变体白蛋白或其片段以及包含药学上有益的模块和白蛋白结合域(ABD)的化合物。根据本发明，ABD意指能够在体内结合于循环的白蛋白的位点、模块或域，并由此使得所述ABD和任何结合于所述ABD的化合物或模块在循环中转运。ABD在本领域中是已知的，并已显示其非常紧密地结合于白蛋白，因此包含结合于白蛋白的ABD的化合物会在一定程度上表现得像单个分子。本发明人已意识到通过将本发明的变体白蛋白或其片段与包含药学上有益的模块和ABD的化合物一同使用，可以与其中所述化合物就这样注入有此需要的患者，或在包含天然白蛋白或其片段的制剂中施用的情况相比，改变该包含药学上有益的模块和ABD的化合物的血浆半寿期。
本发明的变体白蛋白或其片段，包含变体白蛋白或其片段的缀合物，或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，或包含变体白蛋白或其片段的缔合物亦可使用本领域中公知的技术组入纳米或微米颗粒。用于制备可适用于本发明的变体白蛋白或其片段的纳米或微米颗粒的优选方法公开于WO2004/071536，其通过提述并入本文。
组合物
本发明亦涉及白蛋白变体或其片段或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，或包含白蛋白变体或其片段的缀合物，或包含白蛋白变体或其片段的缔合物在制备药学组合物中的用途，其中所述白蛋白变体或其片段或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，或包含白蛋白变体或其片段的缀合物，或包含白蛋白变体或其片段的缔合物与HSA或其相应片段，或包含HSA或其片段的融合多肽，或包含HSA的缀合物相比，具有改变的血浆半寿期。
在此情况下，所述HSA的相应片段旨在意指与其比较的变体白蛋白的片段对其并具有相同数量的氨基酸的HSA片段。类似地，相应的包含HSA的融合多肽或包含HSA的缀合物旨在意指与包含作为比较的变体白蛋白的缀合物的融合多肽具有相同大小和氨基酸序列的分子。
优选地，所述白蛋白变体或其片段，或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，其片段，或包含白蛋白变体或其片段的缀合物与HSA或其相应片段或包含HSA或其片段的融合多肽的血浆半寿期相比，具有更高的血浆半寿期。
或者，这可表述为：所述白蛋白变体或其片段，或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，其片段，或包含白蛋白变体或其片段的缀合物针对FcRn的KD低于与HSA或其相应片段或包含HSA或其片段的融合多肽的相应的KD。优选地，对于所述白蛋白变体或其片段，或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，其片段，或包含白蛋白变体或其片段的缀合物，其KD低于HSA的0.9XKD，更优选低于HSA的0.5XKD，更优选低于HSA的0.1XKD，甚至更优选低于HSA的0.05XKD，甚至更优选低于HSA的0.02XKD，并且最优选低于HSA的0.01XKD。
所述白蛋白变体或其片段，或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，其片段，或包含白蛋白变体或其片段的缀合物优选为本发明的白蛋白变体或其片段，或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，其片段，或包含白蛋白变体或其片段的缀合物。
本发明通过下述实施例进一步描述，其不应视为对本发明范围的限制。
实施例
材料和方法
ELISA:
将孔用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释至给定浓度的野生型HSA或变体包被，在4℃温育过夜，然后用4％脱脂乳(Acumedia)在室温封闭1小时。然后将孔用PBS/0.005％20(PBS/T)pH6.0洗涤四次，然后将用来自山羊的辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的多克隆抗GST抗体预温育并稀释于4％脱脂乳PBS/0.005％20(PBS/T)pH6.0的FEBSJ.2008Aug；275(16):4097-110中所述的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-融合的()shFcRn(0.5μg/ml)添加至每个孔，并在室温温育1.5h，接着用PBS/TpH6.0洗涤四次。将一百μl的底物四甲基联苯胺(TMB)(Calbiochem)添加至每个孔，并温育45分钟，然后添加100μl的0.25MHCl。使用SunriseTECAN分光光度计(TECAN,Maennedorf,Switzerland)在450nm测量吸光度。
用PBS/TpH7.4重复同样的ELISA。
表面等离振子共振(SPR)：
SPR实验使用Biacore3000装置(GEHealthcare)进行。将CM5传感芯片的流动室(flowcell)使用生产商提供的实验方案中描述的胺偶联化学与shFcRn-GST(～1400-5000RU)偶联。偶联通过将10μg/ml的蛋白注入10mM乙酸钠pH5.0(GEhealthcare)进行。使用pH6.0的磷酸盐缓冲液(67mM磷酸盐缓冲液，0.15MNaCl，0.005％20)作为运行缓冲液和稀释缓冲液。表面再生使用注入pH7.4的HBS-EP缓冲液(0.01MHEPES,0.15MNaCl,3mMEDTA,0.005％表面活性剂P20)进行。为了结合于固定化的shFcRn-GST，将1.0-0.5μM的每种HSA变体针对表面在25℃以恒定流速(40μl/ml)注入。在所有实验中，将数据通过调零校正(zeroadjust)，并减去参照室数据。数据衡量使用BIAevaluation4.1软件(BIAcoreAB)进行。
用HBS-EP缓冲液pH7.4重复同样的SPR测定。
就本专利的目的，除非另行声明，HSA、WTHSA、rHA指以注册商业名称RECOMBUMIN商业上可获得的重组人血清白蛋白(可从NovozymesBiopharmaUKLtd,NottinghamUK获得)，其用于实施例。
来自其他物种的血清白蛋白：这些白蛋白当提及时，是重组的，使用公众可获得的数据库提供的序列产生。或者，其为从商业供应商购得的。
FcRn：可溶性人(shFcRn)和小鼠(smFcRn)FcRn的表达和纯化：
用于生成shFcRn和smFcRn表达质粒，表达和纯化每个异二聚物的方法可见于Berntzen等(2005)J.Immunol.Methods298:93-104。或者，shFcRnFcRn异二聚物由GeneArtAG(Germany)产生。对于所述异二聚物的两个亚单元的序列可见于SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。可溶性受体表达于HEK293细胞，并从培养上清使用Ni-HiTrap层析柱纯化。
实施例1：变体的制备
特定HSA突变蛋白表达质粒的制备
用于表达HSA突变体变体和HSA融合变体的方法使用数种技术产生。整个过程中采用标准的分子生物学技术，如Sambrook,J.andD.W.Russell,2001.MolecularCloning:alaboratorymanual,3rded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y中所述的。
方法1：在表1中详述的HSA中的氨基酸取代
合成DNANcoI/SacI片段(859bp)通过基因拼装(GeneArtAG,Germany)生成，其在HSA编码基因(SEQIDNO:1)内含有点突变以在翻译的蛋白中导入所需的氨基酸取代。表2详述了用于将氨基酸取代导入HSA编码基因的密码子。编码未变化的氨基酸(即野生型)的合成片段的核苷酸序列与pDB2243中的相同(描述于WO00/44772)。将该合成核苷酸片段连接入NcoI/SacI消化的pDB2243以产生质粒pDB3876–pDB3886(表1)。对于表达质粒的产生，将pDB3876–pDB3886(参见表1)各自用NotI和PvuI消化，将DNA片段通过0.7％(w/v)TAE凝胶分离，并使用QiagenGelExtractionKit遵循生产商的指示从琼脂糖凝胶纯化2992bp片段(‘NotI盒’，包含PRB1启动子，编码融合前导(FL)序列(公开于WO2010/092135)的DNA，编码HSA的核苷酸序列，和ADH1终止子，参见图1)。将‘NotI盒’连接入NotI/ShrimpAlkalinePhosphatase(Roche)-处理的“解整合(disintegration)”质粒pSAC35(公开于EP-A-286424，并由Sleep,D.,等(1991)Bio/Technology9,183–187所述)。使用连接混合物转化化学感受态大肠杆菌DH5α。表达质粒pDB3887–pDB3897，含有“NotI盒”的pSAC35衍生物使用标准技术鉴定。使用解整合质粒pDB3887–pDB3897和pDB2244(用于表达野生型HSA，描述于WO00/44772)(表1)转化酿酒酵母BXP10cir0(如之前描述于WO/2001/079480，如下文所述)。
表1：质粒，导入HSA的氨基酸取代
n/a＝不适用。pDB3876-pDB3886为亚克隆质粒。
表2：用于将氨基酸取代导入HSA的密码子
方法2：HSA变体D494N+E495Q+T496A和E495Q+T496A的产生
采用基于PCR、使用QuickChangeLightening试剂盒(Statagene)的方法将点突变导入HSA。使用寡核苷酸对xAP094(SEQIDNO:5)/xAP095(SEQIDNO:6)和xAP096(SEQIDNO:7)/xAP097(SEQIDNO:8)生成两个HSA变体(分别为D494N+E495Q+T496A和E495Q+T496A)。使用质粒pDB3927(公开于WO2010/092135)作为模板DNA，并遵循试剂盒生产商推荐的方法。将所得的质粒命名为pDB3995和pDB3996(分别含有HSAD494N+E495Q+T496A和E495Q+T496A表达盒)。将pDB3995和pDB3996用BstEII/BsrBI消化，并将直链化的DNA分子使用标准技术纯化。将各一百ng的BstEII/BsrBI消化、使用QiagenPCR-Purification试剂盒遵循生产商的指示纯化的DNA，分别与100ngAcc65I/BamHI-消化的pDB3936(公开于WO2010/092135)混合，并用于使用下文所述的SigmaYeastTransformation试剂盒直接转化酿酒酵母BXP10cir0。
方法3：表3中详述的HSA中的氨基酸取代
对质粒pDB3927(公开于WO2010/092135)(含有与pDB2243相同的编码HSA的核苷酸序列)进行操作，使成熟HSA蛋白内发生氨基酸取代。生成合成的DNA片段(GeneArtAG,Germany或DNA2.0Inc,USA)(NcoI/Bsu36I、AvrII/SphI或SacI/SphI片段)，在HSA编码基因内含有点突变以将所需的氨基酸取代导入翻译的蛋白序列。表2详述了用于将氨基酸取代导入HSA编码基因的密码子。编码未变化的氨基酸(即野生型)的合成片段的核苷酸序列与pDB3927中的那些相同。将合成DNA片段亚克隆入NcoI/Bsu36I、AvrII/SphI-、SacI/Sph-消化的pDB3927(描述于PCT11527.204-WO)以生成pDB4006-pDB4010、pDB4083-pDB4101和pDB4103-pDB4111和pDB4194、pDB4200、pDB4202(参见表3)。
同样地，在编码HSA的核苷酸序列中含有点突变的BamHI/SalI片段通过基因拼装来合成(DNA2.0Inc,USA)，并将其连接入BamHI/SalI-消化的pDB3964(描述于WO2010/092135)以产生质粒pDB3986-pDB3989(表3)。
将HSA中C端位置573-585(KKLVAASQAALGL)(SEQIDNO:9)的一串氨基酸突变为恒河猴(PKFVAASQAALA)(SEQIDNO:10)、小鼠(PNLVTRCKDALA)(SEQIDNO:11)、兔(PKLVESSKATLG)(SEQIDNO:12)和绵羊(PKLVASTQAALA)(SEQIDNO:13)血清白蛋白中的那些。用于导入每个氨基酸取代的密码子在表2中给出。合成DNA片段(SacI/SphI)通过基因拼装合成(DNA2.0Inc,USA)(编码未变化的氨基酸(即野生型)的合成片段的核苷酸序列与pDB3927中的相同)，并亚克隆入SacI/SphI-消化的pDB3927以生成质粒pDB4114-4117(表3)。
将质粒pDB3883(表1)，pDB4094和pDB4095(表3)用NcoI/SacI消化，并将来自每个消化的857bp片段纯化，然后连接入NcoI/SacI-消化的pDB4006或pDB4110(8.688kb)(表3)以产生pDB4156-pDB4161。
在体内生成表达质粒(即在酿酒酵母中通过同源重组，该技术称作缺口修复或体内克隆，参见Orr-Weaver&Szostak.1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80:4417-4421)。将列于表3的修饰的质粒用BstEII/BsrBI消化，并使用标准技术纯化直链化的DNA分子。将各一百ng的BstEII/BsrBI消化的、使用QiagenPCR-Purification试剂盒遵循生产商的指示纯化的DNA分别与100ngAcc65I/BamHI-消化的pDB3936(公开于WO2010/092135)混合，并用于使用下文所述的SigmaYeastTransformation试剂盒直接转化酿酒酵母BXP10cir0。
表3.
表4：K500引物和质粒
表5：K573引物和质粒
方法4：HSAK500和K573排列文库
使用PCR产生两个排列文库，其中编码成熟HSA的氨基酸500或573的密码子变化(突变)为其他非野生型氨基酸和终止密码子(K5XXSTOP)。设计了诱变寡核苷酸(表4和表5)以扩增HSA编码DNA并组入所需变化。即，对于位置500处的变化，使用pDB4082(图1)作为模板DNA。pDB4082是pDB2305的衍生物(公开于EP1788084)，并如下所述产生。将pDB2305(图2)用NsiI/SpeI消化，并将产生的8.779kbNsiI片段自连接以产生pDB4005(图3)。合成DNA片段(BsaI/SphI)通过基因拼装生成(DNA2.0Inc,USA)(SEQIDNO:1)(含有PRB1启动子的3’区，修饰的融合先导序列，编码HSA的核苷酸序列，和修饰的ADH1终止子的5’区)，并连接入HindIII/SphI-消化的pDB4005(图3)以产生pDB4082。备注：已去除PRB1启动子位点中的HindIII位点并在编码HSA的核苷酸序列内导入了SacII位点。
对于HSA位置500的排列文库，使用NewEnglandBiolabsPhusion试剂盒(表6)和表4中列出的寡核苷酸生成对应于SalI/HindIII位点之间的编码HSA的核苷酸序列(参见质粒图谱pDB4082，图1)。表7描述了采用的PCR方法。
HSA中氨基酸位置573处的排列文库使用pDB3927作为模板DNA生成，并涉及使用表5中详述的寡核苷酸扩增对应于NcoI和Bsu36I位点之间的白蛋白编码DNA。
表6：PCR成分
表7：PCR条件
对于基于位置500和573的白蛋白变体，将每个PCR产物使用QiagenPCR-清除试剂盒(根据生产商的指示)纯化，用SalI/HindIII(位置500文库)或NcoI/Bsu36I(位置573文库)消化。然后将消化的DNA使用QiagenPCR-清除试剂盒纯化，并分别连接入SalI/HindIII-或NcoI/Bsu36I-消化的pDB4082或pDB3927，替代等价的天然序列。将连接物转化入大肠杆菌DH5α，接着将质粒从转化体使用Qiagen小量制备试剂盒(根据生产商的指示)分离，并通过限制性分析鉴定正确的构建体。这产生了质粒集合pDB4204–pDB4222(位置500文库)pDB4173至pDB4190(位置573文库)，含有仅在其对应于位置500或573处的氨基酸的密码子的序列存在差异的白蛋白基因(分别为表4和5)。每个质粒中的具体变化通过测序确认。
使用所得的质粒通过如上所述的体内克隆生成表达质粒和白蛋白融合物产生酵母。即，使用SigmaYeastTransformation试剂盒(如下所述)，使用100ng含有BstEII/BsrBI-消化的HSA变体的质粒和100ngAcc65I/BamHI消化的pDB3936的混合物转化酿酒酵母。
酿酒酵母的转化
将酿酒酵母BXP10cir0(如之前描述于WO/2001/079480)或菌株Acir0(描述于WO/2005/061718)划线于YEPD平板(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)Bactopeptone，2％(w/v)葡萄糖，1.5％琼脂)上，并允许在转化前在30℃生长4日。将一μg的全质粒(即环状质粒)，或对于缺口修复，100ng含有BstEII/BsrBI-或NsiI/PvuI-消化的HSA变体或HSA变体融合物的质粒，和100ngAcc65I/BamHI消化的pDB3936用于使用SigmaYeastTransformation试剂盒使用修改的乙酸锂方法(Sigmayeasttransformation试剂盒,YEAST-1,方案2；Ito等(1983)J.Bacteriol.,153,16；Elble,(1992)Biotechniques,13,18)转化酿酒酵母。所述方案略加改动，在热激之前，将转化物在室温温育4小时。在热激之后，将细胞短暂地离心，然后重悬于200μl1M山梨醇，然后铺板于BMMD琼脂平板，BMMD的组成描述于Sleep等,(2001),Yeast,18,403。将平板在30℃温育4日，然后将单个菌落补片至新鲜的BMMD平板。酵母菌株号详述于表1。
如下所述对于每个酵母菌株制备储备：将BMMD培养液用一大环每个酵母补片来接种，并在30℃生长24h，伴以200rpm的定规振荡。细胞通过在SorvalRT600离心机中以1900xg离心5分钟来收获，移除15mL上清，并用海藻糖40％(w/v)替代。将细胞重悬并转移至冷冻小瓶(1mL)以供在-80℃储藏。
酿酒酵母的摇瓶生长
将BMMD(配方：0.17％(w/v)不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮基(Difco)，37.8mM硫酸铵，29mM柠檬酸，142mM脱水正磷酸氢二钠pH6.5，2％(w/v)葡萄糖)培养基(10mL)用每种酵母菌株接种，并在30℃生长12h，伴以在200rpm定规振荡。将每个起始培养的等分试样(4mL)用于接种2x200mLBMMD培养基，并在30℃生长36h，伴以在200rpm定规振荡。细胞通过经由0.2μm真空过滤膜(Stericup,Millipore)(包括GF-D预滤器)过滤来收获，并保留上清以供纯化。
初级浓缩
将保留的培养上清使用TangentialFlowFiltration使用配置Omega10KD(0.093sq.m2)滤器(LVCentramateTMcassette,PallFiltron)的PallFiltronLV系统以20psi的跨膜压力和180mL.min-1的再循环率进行浓缩。
发酵
批次补料发酵在30℃的10LSartoriusBiostatC发酵器中进行；监视pH，并通过适当地添加氨或硫酸来调整pH。所述氨亦提供了培养物的氮源。监视溶解氧的水平，并将其与搅拌器速度缔合，以维持>20％饱和的水平。接种物在烧瓶中在缓冲的基本培养基(配方)中生长。对于分批阶段，将培养物接种入含有2％(w/v)蔗糖的发酵器介质(大约50％发酵器体积)。补料阶段由溶解氧水平的急剧上升自动触发。通过将补料速率控制至设定的名义生长速率来将蔗糖维持在生长限制浓度。补料由含有50％(w/v)蔗糖的发酵介质组成，均基本上如Collins所述(Collins,S.H.,(1990)Productionofsecretedproteinsinyeast,in:T.J.R.Harris(Ed.)Proteinproductionbybiotechnology,Elsevier,London,pp.61-77)。
GP-HPLC定量
通过GP-HPLC和如下所述的定量来分析纯化的白蛋白变体、融合物和缀合物。对于具有6.0mm内径(id)x40mm长TSKSW保护柱(TosohBioscience)的7.8mm内径(id)x300mm长TSKG3000SWXL柱(TosohBioscience)注入25μL。将样品在25mM磷酸钠，100mM磷酸钠，0.05％(w/v)叠氮化钠，pH7.0中以1mL/分钟进行层析。样品通过在280nm的UV检测以相对于已知浓度(10mg/mL)的重组人白蛋白标样通过峰面积来定量，并就其相对消光系数进行校正。
从摇瓶纯化白蛋白变体
白蛋白变体从摇瓶(培养上清或浓缩的培养上清)使用单次层析步骤使用白蛋白亲和基质(AlbuPureTM-ProMeticBioSciences,Inc.)纯化。自始自终层析以240cm/h的恒定线性速度进行。将培养上清施于用50mM乙酸钠pH5.3预平衡的6cm床高的2.0mL填充床。在加载之后，用10柱体积(CV)的平衡缓冲液，然后用50mM乙酸铵pH8.0(10CV)洗涤柱。产物用50mM乙酸铵10mM辛酸pH8.0，50mM乙酸铵30mM辛酸钠200mM氯化钠pH7.0或200mM硫氰酸钾洗脱。用0.5MNaOH(3cv)和20mMNaOH(3.5cv)清理柱。浓缩来自每个白蛋白变体的洗脱物级分，并针对10体积的50mM氯化钠进行渗滤(diafilter)(具有任选地渗滤杯(diafiltrationcup)的Vivaspin2010,000MWCOPES，Sartorius)。纯化的白蛋白变体通过如上所述的GP-HPLC定量。
从摇瓶纯化白蛋白融合物变体
白蛋白融合变体从摇瓶培养上清使用单次层析步骤使用白蛋白亲和基质(AlbuPureTM-ProMeticBioSciences,Inc.)纯化。层析自始至终以240cm/h的恒定线性速度进行。将培养上清或浓缩的培养上清施于用50mM乙酸钠pH5.3预平衡的6cm床高的2.0mL填充床。在加载之后，用10柱体积(cv)的平衡缓冲液，然后50mM乙酸铵pH8.0(10cv)洗涤柱。产物用50mM乙酸铵10mM辛酸pH8.0，50mM乙酸铵30mM辛酸钠200mM氯化钠pH7.0，50mM乙酸铵100mM辛酸钠pH9.0或200mM硫氰酸钾来洗脱。用0.5MNaOH(3cv)和20mMNaOH(3.5cv)清理柱。将来自每个白蛋白变体融合物的洗脱级分浓缩并针对10体积的25mMTris，150mMNaCl，2mMKCl，pH7.4渗滤(具有任选地渗滤杯的Vivaspin2010,000MWCOPES，Sartorius)。纯化的白蛋白融合物变体通过如上所述的GP-HPLC定量。
从发酵纯化白蛋白变体
在通过使用SorvallRC3C离心机(DuPont)的离心进行分离之后，从高细胞密度分批补料发酵上清纯化白蛋白变体。如上所述将培养上清经由用定制的合成白蛋白亲和基质(AlbuPureTM-ProMeticBioSciences,Inc.)填充的11cm床高柱8.6mL填充床层析。将产物使用如上所述的洗脱缓冲液以120cm/h的流速洗脱。通过GP-HPLC(见上)和还原SDS-PAGE就纯度分析洗脱级分，并若需要，进行浓缩(Vivaspin2010,000MWCOPES)并施于用Superdex75填充的2.4x96cm柱，并以39cm/h的流速在25mMTris，150mMNaCl，2mMKCl，pH7.4中运行。将峰分级，通过GP-HPLC测定，并汇集，以生成目标的单体蛋白。将汇集的级分浓缩(Vivaspin2010,000MWCOPES,Sartorius)。
所有待测定受体(FcRn)结合特性和/或其他分析的蛋白如上所述通过GP-HPLC定量，并就其相对消光系数校正。
实施例2：确定血液来源的HSA和重组人类白蛋白的受体(shFcRn)结合特性
将基本上不含脂肪酸的HSA(Sigma-Aldrich)进一步通过如Andersen等(2010).J.Biol.Chem.285,(7),4826–4836所述的大小排阻层析来纯化。如上所述使用SPR分析十μM的单体HSA和rHA，且数据示于图4。
将HSA(血液来源)与重组人类白蛋白(Recombumin)在相同浓度(10μM)(图4A和4B)的直接比较显示对于两种样品，对固定化的shFcRn(分别为pH6.0和pH7.4)的结合是可逆和pH依存性的。此外，Bosse等(2005)..J.Clin.Pharmacol.45；57-67将HSA与重组人类白蛋白的比较显示其在人类体内研究中具有相同的半寿期。
实施例3：确定白蛋白变体的受体(shFcRn)结合特性
使用两种公认的FcRn结合测定：ELISA和SPR。这些测定法之间具有明显区别：在ELISA系统中，HSA直接包被在孔上，而shFcRn-GST在溶液中添加，而在SPR测定中，shFcRn-GST固定化于CM5芯片，而HSA在溶液中注入。两种系统之间pH可存在差异。
使用ELISA在pH6.0和pH7.4分析变体。结果公开于图5。ELISA值代表重复测定的平均值。
使用SPR分析在pH6.0和pH7.4分析变体。对于代表性数量的变体，结果公开于图6(使用0.2μM的变体浓度)和图7(使用1μM的变体浓度)。
将公开于图6和图7的SPR数据归一化(normalize)，而变体在每个浓度的相对结合分别示于图8A和B。
该分析的结论为，所有测试的变体在pH6.0具有对受体的特征结合，但在pH7.4不具有结合。变体D494N,Q,A，E495Q,A，T496A和D494N+T496A与HSA相比显示对受体的减少的结合。
实施例4：白蛋白变体受体(shFcRn/smFcRn)结合特性的确定
使用下述SPR分析方法，对HSA和小鼠血清白蛋白(MSA)结合于人和小鼠FcRn计算缔合常数Ka、解离常数Kd和结合常数KD(表8)。
SPR分析-SPR分析在BIAcore3000装置(GEHealthcare)上使用CM5芯片进行，而smFcRn-GST和shFcRn-GST变体或smFcRn的固定化使用胺偶联试剂盒(GEHealthcare)进行。完全如生产商所述，将蛋白样品(10μg/ml)注入pH4.5的10mM乙酸钠(GEHealthcare)。将表面上的未反应的模块用1M乙醇胺封闭。对于所有实验，在pH6.0或pH7.4使用磷酸盐缓冲液(67mM磷酸盐缓冲液，0.15MNaCl，0.005％20)或在pH7.4使用HBS-P缓冲液(0.01MHEPES，0.15MNaCl，0.005％表面活性剂P20)作为运行缓冲液或稀释缓冲液。动力学测量使用低密度固定化表面(100-200共振单位(RU))进行。将hIgG1(2000.0-31.2nM)，mIgG1(1000.0-15.6nM)，MSA(20.0-0.3μM)和HSA(200.0-3.1μM)的系列稀释在pH6.0或pH7.4在25℃以50μl/分钟的流速注入。额外的结合通过在25℃在pH6.0以20μl/分钟针对固定化的shFcRn(～600RU)或smFcRn(～600RU)注入HSA(10μM)，MSA(5μM)，hIgG1(100nM)或mIgG1(100nM)之一或之二来记录。竞争性结合通过将shFcRn(50nM)或smFcRn(100nM)单独或与不同量的HSA或MSA(10.0-0.05μM)一同针对固定化的HSA(～2600RU)或MSA(～2000RU)来测量。在所有情况下，为了校正非特异性结合和大量缓冲作用(bulkbuffereffect)，将从对照表面和空白注入获得的应答从每个相互作用曲线减去。使用BIAevaluation4.1软件提供的预决的模型(Langmuir1:1配体模型，异源配体模型和稳态亲和力模型)计算动力学速率值。在所有亲和力估算中，由代表均方值的统计值χ2，描述的拟合的接近程度低于2.0。
表8：HSA和MSA对shFcRn和smFcRn的结合常数
KD使用BIAevaluation4.1软件生成。自始至终使用Langmuir1:1配体模型。动力学值代表三次重复的平均值。ND意指未确定。NA意指未获得。
实施例5：来自其他物种的白蛋白对人FcRn的结合
将商业上可获得的动物白蛋白(Sigma-Aldrich或Calbiochem)进一步如Andersen等(2010).J.Biol.Chem.285,(7),4826–4836所述进行纯化。驴血清白蛋白、牛血清白蛋白、山羊血清白蛋白、绵羊血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白、仓鼠血清白蛋白、豚鼠血清白蛋白、大鼠血清白蛋白和鸡血清白蛋白对shFcRn的结合使用材料和方法中所述的技术确定。ELISA结果公开于图9A-D，而相对结合总结于图9E。
SPR结果示于图10，其中显示了每种白蛋白物种在pH6.0和pH7.4的结合。图10显示了使用ELISA和SPR测得的相对结合应答的概略：
表10：物种间白蛋白-FcRn结合
相对结合应答归类为最强(++++)至最弱(+)和无结合。
a:未确定(ND)。
从最强至最弱结合的等级排序如下：豚鼠＝/>兔>仓鼠/犬>大鼠/小鼠>驴>人>牛>山羊/绵羊>鸡。该数据显示动物白蛋白对shFcRn具有不同的亲和力。
实施例6：HSA变体对shFcRn的动力学
本发明的变体的结合常数根据材料和方法中所述的方法确定。
表11：HSA变体对shFcRn的结合常数
KD使用BIAevaluation4.1软件生成。自始至终使用Langmuir1:1配体模型。动力学值代表三次重复的平均值。ND意指未确定。
结果对应于实施例3中基于SPR和ELISA数据得出的结论，但还显示E492G对其受体具有增加的亲和力。
实施例7：HSA变体的竞争性分析
实施例1中制备的HSA变体与WTHSA的竞争性分析使用实施例4中所述的方法进行。结果示于图15。
结果显示变体E492G与HSA相比对shFcRn具有更强的结合，不像E492H，E492P和E492G+V493P。
实施例8：Q417取代的分析
使用实施例1的方法，构建了具有取代Q417A和D494E+Q417H的HSA的变体。使用材料和方法中的方法测试了这些变体的动力学特性，并示于表12。
表12：HSA变体对shFcRn的结合常数
a：HSA变体的稀释针对固定化的shFcRn(～1500RU)注入。
b：动力学速率常数使用简单的一级(1:1)生物分子相互作用模型获得。
c：稳态亲和常数使用BIAevaluation4.1软件提供的平衡(Req)结合模型获得。动力学值代表三次重复的平均值。
d：未确定(ND)。
数据显示变体Q417A和D494E+Q417H与野生型HSA相比，与受体的结合较弱。
实施例9：在位置499、500、536、537、538和573处的HSA变体的分析
使用实施例1的方法，构建了具有取代P499A、K500A、K536A、P537A、K538A和K573A的HSA变体。如材料和方法中所述测试这些变体的受体结合特性。结果示于图11。
数据表明变体P499A、K536A、P537A和K538A相对于HSA对shFcRn具有减少的结合亲和力。相对于HSA，变体K500A几乎完全丧失其结合shFcRn的能力，而K573A对shFcRn具有增加的结合亲和力。
实施例10：HSA位置501的变体的分析
使用实施例1的方法，构建了具有取代E501A和E501Q的HSA变体。如材料和方法中所述测试了这些变体的动力学特性。
表13：HSA变体对shFcR的结合常数
a：将HSA变体的稀释针对固定化的shFcRn(～1500RU)注入。
b：动力学速率常数使用简单的一级(1:1)生物分子相互作用模型获得。
c：稳态亲和常数使用BIAevaluation4.1软件提供的平衡(Req)结合模型获得。动力学值代表三次重复的平均值。
d：未确定(ND)。
数据显示变体E501A和E501Q相对于HSA对shFcRn具有略微减少的结合亲和力。
实施例11：位置573的HSA变体的分析
使用实施例1的方法，构建了在位置573具有取代的HSA的变体。生成了所有在位置573处的变体，并如材料和方法中所述测试了这些变体的受体结合特性，但SPR分析在pH5.5进行。结果示于下表14和图12和13。
表14：HSAK573单点突变体的动力学
a：将HSA变体的稀释针对固定化的shFcRn(～1500RU)注入。
b：动力学速率常数使用简单的一级(1:1)生物分子相互作用模型获得。
c：稳态亲和常数使用BIAevaluation4.1软件提供的平衡(Req)结合模型获得。动力学值代表两次重复的平均值。
d：未确定(ND)。
结果显示所有在位置573具有取代的变体与WTHSA相比具有改善的结合。具体而言，变体K573F、K573H、K573P、K573W和K573Y与亲本HSA相比对shFcRn具有低至少于1/10的KD。变体K573STOP是在位置573具有终止密码子的截短的白蛋白。对K573STOP变体的感应谱与WTHSA相比显示显著减少的结合，并生成较高的KD。我们显示的变体K573E(由Otagiri(2009).Biol.Pharm.Bull.32(4)527-534表征的天然变体)增加的亲和力预计在体内增加了其半寿期。
实施例12：对进一步的HSA变体的分析
使用实施例1的方法，构建了具有取代E492G，E492G+N503H，N503H，D550E，E492G+N503K，E542P，H440Q，K541G，K541D，D550NE492G+K538H+K541N+E542D，E492T+N503K+K541A，E492P+N503K+K541G+E542P，E492H+E501P+N503H+E505D+T506S+T540S+K541E，A490D+E492T+V493L+E501P+N503D+A504E+E505K+T506F+K541D，E492G+V493P+K538H+K541N+E542D的HSA变体。如材料和方法中所述测试了这些变体的受体结合特性，并将结果示于表15和图14。
表15：HSA变体对shFcR的结合常数
a：将HSA变体的稀释针对固定化的shFcRn(～1500RU)注入。
b：动力学速率常数使用简单的一级(1:1)生物分子相互作用模型获得。
c：稳态亲和常数使用BIAevaluation4.1软件提供的平衡(Req)结合模型获得。动力学值代表三次重复的平均值。
d：未确定(ND)。
结果显示对于位置550，取代为E导致在pH6.0对shFcRn增加的亲和力，而取代为N减少了亲和力。然而，当在pH5.5对D550E取代重复该分析时，未发现可观察到的亲和力增加。取代为酸性氨基酸(E)保持并改善了结合。然而，取代为不荷电的酰胺氨基酸减少了在pH6.0的结合。基于该观察，我们对于该位置会预测取代为碱性氨基酸(H、K和R)会导致结合的进一步减少。
实施例13：His残基中的突变
使用实施例1中所述的方法生成了下述变体：H440Q、H464Q、H510Q和H535Q。图15显示了这些变体如材料和方法中所述与shFcRn相互作用的SPR感应谱。
发现变体H440Q以与HSA类似的亲和力结合。与之相对，H464Q、H510Q和H535Q对shFcRn具有显著减少的亲和力。这支持之前公开的观察，即这些组氨酸残基的诱变显著减少了HSA对shFcRn的结合(Wu等(2010).PEDS,23(10)789–798)。Wu等显示对于小鼠中双体抗体(diabody)融合蛋白(scFv-DIII)2的半寿期的减少，按照最慢到最快去除的顺序：Db-DIIIWT>H535A>H510A>H464A>Db。基于对shFcRn的亲和力，并当与smFcRn相比时(实施例5)，我们会预测到在人类中清除顺序为(对于谷氨酰胺(Q)取代)：WT>H440Q>H510Q>H464Q>H535Q。
实施例14：进一步的变体
使用实施例1中所述的方法生成了下述的变体：HSA中的K574N和Q580K。使用材料和方法中所述的SPR测定测试变体对FcRn的结合，且结果示于表16。
结果显示变体K574N和Q580K对shFcRn结合更强。
表16：对这些变体发现下述动力学数据：
| 白蛋白变体 | ka | kd | KD |
| (103/Ms) | (10-3/s) | (μM) | |
| WT | 9.7±0.0 | 30.0±0.1 | 3.1 |
| K574N | 4.9±01 | 8.4±0.1 | 1.7 |
| Q580K | 6.0±0.0 | 9.3±0.0 | 1.5 |
实施例15：在位置500的HSA变体的分析。
使用实施例1的方法构建了在位置500处具有取代的HSA。生成了所有在位置500处的变体，并测试了这些变体的受体结合特性。对于所有分析使用BiacoreX，BiacoreX100和SensorChipCM5，其均由GEHealthcare提供。将由GeneArtAG(Germany)产生的shFcRn(在10mM乙酸钠pH5.0(GEHealthcare)中稀释至10μg/mL)按照制造商的指示(GEhealthcare)经由标准胺偶联固定化于流动室1(FC1)上至1600-2200响应单位(RU)。在流动室1(FC1)上对其进行空白固定化以充当参照室。为了稳定测定，首先仅用运行缓冲液(67mM磷酸盐缓冲液,0.15MNaCl,0.005％Tween20，在pH5.75±0.25)运行3-5个起始循环，接着进行再生。在25℃以恒定流速(30μl/min)以多种浓度(1μM–150μM)注入WTrHA和K500文库变体90s，接着使用HBS-EP缓冲液pH7.4(GEHealthcare)再生表面，直至恢复了大致起始基线RU(通常12s脉冲即足够)。
结果示于表17和图16。
表17：HSAK500单点突变体的动力学
a：4个值的平均值。
b：动力学速率常数使用简单的一级(1:1)生物分子相互作用模型获得。
c：稳态亲和常数使用BIAevaluation4.1软件提供的平衡(Req)结合模型获得。
结果显示，变体K500R和K500I与WTHSA相比，对shFcRn分别具有增加的和类似的亲和力。变体K500E紧密结合于固定化的shFcRn，但仍显示FcRn相互作用的特征pH依存性。该复合物非常稳定，从而使得动力学分析无法进行(图16)。所有其他的变体与wtrHA相比对shFcRn具有减少的结合。
所有变体在pH5.5结合于shFcRn(一定程度上)。在pH7.4无法检测出K500文库变体对shFcRn的结合。
实施例16：融合多肽
含有白蛋白突变蛋白的白蛋白融合物的生成
修饰含有在N端或C端或两端基因融合于HSA的供产生scFv(vHvL)的表达盒的质粒(描述于Evans等,2010.ProteinExpressionandPurification.73,113–124)以允许使用体内克隆(如上文所述)产生白蛋白融合物。即将pDB3017(图17)，pDB3021(图18)，pDB3056(图19)用NsiI/SpeI消化，并使用标准技术纯化分别对应于9.511kb，9.569kb和8.795kb的NsiI片段。将纯化的NsiI片段自连接，并将其用于转化化学感受态大肠杆菌DH5α以分别产生pDB4168，pDB4169和pDB4170(表18)。
类似地，将pDB3165(含有二价融合物)(图20)用NotI消化，并纯化表达盒(4.506kb片段)，然后将其连接于NotI-消化的pDB3927以产生pDB4172(图21，表18)。
通过基因拼装(GeneArtAG,Germany)生成了合成的SalI/Bsu36IDNA片段(269bp)，其在白蛋白编码核苷酸序列内含有点突变以将对应于K500A或D550N或K573P的氨基酸取代导入翻译的白蛋白蛋白序列。将SalI/Bsu36I片段单独连接至SalI/Bsu36I-消化的pDB4168-pDB4170和pDB4172，并使用标准技术用其转化化学感受态大肠杆菌DH5α以生成质粒pDB4265-pDB4276(表18)。
表18：白蛋白变体融合物
类似地，通过PCR(使用标准技术)生成了DNA片段，以在翻译的白蛋白蛋白序列中导入K573A取代。PCR使用NewEnglandBiolabsPhusion试剂盒使用pDB4267(图22)作为模板DNA和寡核苷酸xAP238(SEQIDNO:53)和xAP239(SEQIDNO:54)进行：
表19描述了PCR循环。
表19：PCR循环
将PCR产物纯化，用SalI/Bsu36I消化，并将分离的片段(269bp)连接入SalI/Bsu36I-消化的pDB4168-pDB4170和pDB4172，并将其用于转化化学感受态大肠杆菌DH5α。所得的质粒(pDB4277-pDB4280)列于表18。
从质粒pDB4168和pDB4268-4270(分别用于表达N端融合于HSA和HSA突变蛋白K500A，D550N和K573P的scFv的质粒)去除编码FLAG标记的核苷酸序列。将pDB4168和pDB4268-4270(表18)用Bsu36I/SphI消化以去除包含HSA编码基因3’区的231bp的产物，编码FLAG标记的核苷酸序列和ADH1终止子的5’区。将包含来自pDB4181的HSA编码基因的3’区和mADH1终止子(SEQID1)的5'区的Bsu36I/SphI片段(207bp)使用标准技术连接于Bsu36I/SphI-消化的pDB4168和pDB4268-pDB4270。使用连接混合物使用标准技术转化化学感受态大肠杆菌DH5α以生成质粒pDB4281-pDB4284(表18)。
将pDB4265-pDB4284用BstEII/BsrBI消化，并使用标准技术纯化直链化的DNA分子。将一百ngBstEII/BsrBIDNA样品与100ngAcc65I/BamHI-消化的pDB3936混合，并使用下文中所述的SigmaYeastTransformation试剂盒用其转化酿酒酵母BXP10cir0。在每种情况下，通过在含有质粒(pDB4265-pDB4280)(表18)的白蛋白融合物和pDB3936之间的同源重组(体内克隆)在酵母中生成表达质粒。
将质粒pDB3017，pDB3021，pDB3056和pDB3165(由Evans等,2010.ProteinExpressionandPurification.73,113–124所述的野生型HSA融合物)用于使用如下所述的SigmaYeastTransformation试剂盒转化酿酒酵母菌株Acir0(描述于WO/2005/061718)。
可通过基因拼装合成地生成编码人IL-1RA(白介素-1受体拮抗剂)(登录号：CAA59087)的核苷酸序列。708bp合成片段的核苷酸序列(Bsu36I/SphI片段)在SEQIDNO:55中给出，并包含编码HSA的基因的3’区，编码GS接头的核苷酸序列，编码人IL-1RA的核苷酸序列(发生N84Q以消除N连接的糖基化基序)和ADH1终止子的5’区。可将合成DNA片段连接入Bsu36I/SphI-消化的pDB3927以产生pDB2588。
如下所述制备含有用于产生基因融合于HSA和HSA变体K500A，D550N，K573A和K573P的C端的IL-1RA的表达盒的质粒。将pDB2588用Bsu36I/SphI消化，并使用标准技术纯化含有HSA编码基因的3’区的705bp片段，编码GS接头的核苷酸序列，编码人IL1-RA(N84Q)的核苷酸序列，和修饰的酿酒酵母ADH1终止子(SEQID3)的5’区的705bp片段，然后将其连接入Bsu36I/SphI-消化的pDB4006(含有HSAK573A表达盒)，pDB4010(含有HSAD550N表达盒)，pDB4086(含有HSAK500A表达盒)，pDB4110(含有HSAK573P表达盒)以分别生成pDB4287，pDB4286，pDB4285和pDB4288(例如，参见图23)。将pDB4285-pDB4288用NsiI/PvuI消化，并使用标准技术纯化直链化的DNA分子。将一百ngNsiI/PvuI-消化的DNA样品与100ngAcc65I/BamHI-消化的pDB3936(9721bp)混合(即，体内克隆)，并用于使用如下所述的SigmaYeastTransformation试剂盒转化酿酒酵母(即，通过体内克隆)。
表达基因融合于GS接头和IL1-RA(N84Q)的野生型HSA(参见表18)的酿酒酵母菌株的制备亦可遵循如上所述的方法生成。
使用如上所述的SPR方法就其对FcRn的结合分析融合多肽，并获得下述结果：
表20：HSA融合变体的动力学
a：将HSA变体的稀释针对固定化的shFcRn(～1500RU)注入。
b：动力学速率常数使用简单的一级(1:1)生物分子相互作用模型获得。动力学值代表两次重复的平均值。
c：由于弱结合而未确定(ND)。
在实施例8中，显示K500A变体并不显著地结合shFcRn，在实施例10中，显示K573P和K573A变体与HSA相比更强地结合shFcRn，而在实施例11中，显示D550N变体与HSA相比更弱地结合FcRn。
在本实施例中，显示这些观察到的结合特性的差异亦反映在不同构型的融合多肽上：与小模块的C端融合物(HSA-FLAG)，与较大多肽的C端融合物(HSA-IL1RA)；与多肽的N端融合物(scFv-HSA)；N和C端融合物(scFv-HSA-FLAG和scFv-HSA-scFv-FLAG)。
实施例17：辣根过氧化物酶蛋白对白蛋白和K573P变体的缀合
对于缀合分析，使用商业上可获得的重组白蛋白(RecombuminTM)用作对照分子。对于该实施例，从分批补料发酵通过材料和方法中所述的手段纯化最终200mg/mL的本发明的白蛋白K573P变体。进行了两步纯化。
第一步使用用AlbuPureTM基质(ProMetic)填充的柱(床体积大约400mL，床高11cm)。将其用50mM乙酸钠，pH5.3平衡，并用干净的培养上清在大约pH5.5-6.5加载至大约20mg/mL基质。然后分别用大约各5柱体积的50mM乙酸钠pH5.3，50mM磷酸钠pH6.0，50mM磷酸钠pH7.0和50mM乙酸钠pH8.0洗涤柱。使用大约两柱体积的50mM乙酸钠，10mM辛酸pH7.0洗脱结合的蛋白。整个纯化的流速为154mL/分钟。
对于第二步，将来自第一步的洗脱物用水稀释大约两倍以在用乙酸调整至pH5.5±0.3之后获得2.5±0.5mS/cm的电导率。将其加载于用80mM乙酸钠，5mM辛酸，pH5.5平衡的DEAE-SepharoseFastFlow(GEHealthcare)柱(床体积大约400mL，床高11cm)。加载为大约30mg蛋白/mL基质。用大约5柱体积的80mM乙酸钠，5mM辛酸pH5.5洗涤柱。继以大约10柱体积的15.7mM四硼酸钾pH9.2。使用两个柱体积的大约pH9.0的110mM四硼酸钾，200mM氯化钠洗脱结合的蛋白。在加载和洗涤步骤过程中，流速为183mL/分钟，而在洗脱步骤过程中为169mL/分钟。
将洗脱物浓缩，并使用PallCentramateOmega10,000NominalMWCO膜针对145mMNaCl渗滤，以得到大约200mg/mL的最终蛋白浓度。
将rHA和K573P变体白蛋白的200mg/mL储液使用pH调整至pH6.5-6.7的磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释至5mg/mL。这确保MaleimideActivatedHorseradishPeroxidase(ThermoScientific)的马来酰亚胺反应基团处于有利的pH环境下，以与游离硫氢基反应，以形成稳定的硫醚键。将2mg的MaleimideActivatedHorseradishPeroxidase(HRP)与1mL的5mg/mLrHA或K573P变体白蛋白混合。该混合物确保白蛋白或K573P变体白蛋白的大约两倍摩尔过量。将该混合物在4℃温育至少24小时。然后使用GP-HPLC就缀合检查反应混合物。
为了从相应的缀合物种分离未缀合的物种(rHA，或白蛋白变体K573P和未反应的HRP)，首先将样品浓缩(Vivaspin20,10,000MWCOPES,Sartorius)，然后以PBS中45cm/hr的流速分别施于TricornSuperdexTM200,10/300GL柱(GEHealthcare)。将洗脱峰分级，并进行GP-HPLC分析。将含有缀合的物种的级分汇集，浓缩并针对50mMNaCl渗滤，并通过GP-HPLC分析进行呈现(图24)。
然后使用本文中所述的Biacore方法来测定这些样品(表21)。该实施例显示K573P保持与WTHSA相比其针对shFcRn增加的亲和力。
实施例18：将荧光素缀合于白蛋白和K573P变体
用于实施例17中的两个相同的白蛋白样品，亦同样为本实施例的起始材料。即，大约200mg/mLrHA或K573P白蛋白变体。
将荧光素-5-马来酰亚胺，ThermoScientific(F5M)溶解于二甲基甲酰胺，以得到25mg/mL的终浓度。然后将其进一步稀释入18ml的PBS，pH调整至大约pH6.5。向该溶液添加1ml的200mg/mLrHA或1mL的200mg/mLK573P变体。这提供了大约20倍最终摩尔过量的F5M。温育这些样品，并允许其在4℃避光缀合过夜，以允许F5M上的马来酰亚胺基团与存在于两种白蛋白物种中基本上为游离的硫氢基反应。
在过夜温育之后，将反应混合物的等分试样针对50mMNaCl彻底渗滤以去除未缀合的F5M(Vivaspin20,10,000MWCOPES,Sartorius)。缀合通过在标准的SDS-PAGE之后紫外显影缀合的荧光素::白蛋白来确认(图25)。
然后使用本文中所述的Biacore方法来测定这些经渗滤的样品(表21)。该实施例说明将小分子缀合于rHA或变体如K573P并不影响对shFcRn的结合亲和力的趋势。
表21：当结合于固定化的shFcRn时，缀合的rHA或变体(K573P)的代表性Biacore测定KD值。
| 分析物 | KD(μM) |
| rHA::HRP | 3.6 |
| K573P::HRP | 0.02 |
| rHA::F5M | 7.3 |
| K573P::F5M | 2.5 |
实施例19：进一步的白蛋白变体
使用实施例1中所述的方法生成了下述变体：E492T，N503D，E492T+N503D，K538H，E542D，D494N+E495Q+T496A，E495Q+T496A，N403K，K541A和K541N。SPR分析如实施例15中所述进行，且结果显示于图26和图27。
图30A和30B显示白蛋白变体对shFcRn结合的作用。
HSA内的取代N503D，D494N+E495Q+T496A，E492T+N503D，E495Q+T496A在pH5.5对与shFcRn的结合具有负面作用。
实施例20：在C端的白蛋白变体
使用实施例1中所述的方法生成了下述变体。对shFcRn的结合如材料和方法中所述来确定，且结果显示于表22。
表22：HSAC端互换的变体与shFcRn相互作用的动力学
a：将HSA变体的稀释针对固定化的shFcRn(～1500RU)注入。
b：动力学速率常数使用简单的一级(1:1)生物分子相互作用模型获得。
c：来自表2的数据
d：来自表3的数据
由于弱结合而未确定(ND)
该实施例表明对于所有测试的与人白蛋白的C端互换(swap)观察到相对于供体白蛋白的结合增加。所有含有K573P取代的供体序列显示显著增加的结合，但少于K573P本身(表20)。
实施例21：变体白蛋白融合物的竞争性结合分析
使用变体白蛋白融合物和选定的如实施例1中所述制备的变体白蛋白的竞争性结合研究如实施例4中所述进行。结果示于图28-31。
对于变体融合物HSA-FLAG和N+C端scFvHSA-FLAG的竞争性结合等级排序与单个HSA变体(未融合和融合的)亲和力数据的等级排序相同。对于IL1Ra变体K573P，K573A和K500A与预测相同，然而D550N似乎比WT融合更有效地抑制。
实施例22：进一步的HSA变体
使用实施例1中所述的方法生成下述变体：HSAE492G+K573A，HSAE492G+N503K+K573A，HSAE492G+N503H+K573A，HSAE492G+K573P，HSAE492G+N503K+K573P，HSAE492G+N503H+K573P。如材料和方法中所述进行SPR分析。结果(图32)显示在pH5.5所有HSA变体相对于野生型HSA对shFcRn的结合更强。未在pH7.4观察到结合。
HSAE492G+K573A，HSAE492G+N503K+K573A相对于HSAK573A几乎未改善结合(hadmarginallyimprovedbindingbeyondthatofHASK573A)，不像HSAE492G+N503H+K573A。含有K573P的组合变体相对于K573P单一变体并未显示改善的结合。
Claims (31)
1.一种用于制备白蛋白变体、其片段、或者包括所述变体白蛋白或其片段的融合多肽的方法，包括下述步骤：
a.提供编码与SEQIDNO:2具有至少80％序列同一性的亲本白蛋白的核酸；
b.修饰步骤a的序列以编码具有一个或多个取代的变体白蛋白、其片段、或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，所述取代对应于SEQIDNO:2中选自下述的取代：
Q417A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；
H440A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
A490C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；
E492A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
V493A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T.W,Y:
D494A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
E495A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
T496A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y；
P499A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y；
K500A,C,D,E,F,G,H,I,,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y；
E501A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
N503A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
A504C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
E505A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
T506A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y；
H510A,C,D,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
H535A,C,D,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
K536A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
P537A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y；
K538A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
T540A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,,V,W,Y；
K541A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
E542A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
D550A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
K574A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
Q580A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；
A581C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
A582C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
G584A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
H464A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
L575A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
A577C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
A578C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；或
S579A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y；
c.将步骤b中的修饰序列导入合适的宿主细胞；
d.让所述细胞在合适的生长培养基中在导致所述白蛋白变体、其片段、或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽表达的条件下生长；以及
e.从所述生长培养基回收所述白蛋白变体、其片段、或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，
其中所述白蛋白变体、其片段、或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽与所述亲本白蛋白、其片段、或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽相比具有改变的血浆半寿期。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽与所述亲本白蛋白相比具有较长的血浆半寿期。
3.根据权利要求2所述的方法，其中根据权利要求3所述的白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽包含对应于SEQIDNO:2中下述取代的一个或多个取代：
K573P+K574N+A577T+A578R+S579C+Q580K+A581D+G584A，K573P+A577E+A578S+Q580K+A582T，K573P+A578S+S579T+G584A，K573P+L575F+G584A，E492G，N503K，K500R，N503H，D550E，K574N，Q580K，E492G+N503K，E492G+N503H，E492H+E501P+N503H+E505D+T506S+T540S+K541E，E492G+K573A，E492G+N503K+K573A，E492G+N503H，E492G+K573P，E492G+N503K+K573P，E492G+N503H+K573P。
4.根据权利要求1所述的方法，其中根据权利要求2所述的白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽与所述亲本白蛋白相比具有较短的血浆半寿期。
5.根据权利要求4所述的方法，其中根据权利要求5所述的白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽包含对应于SEQIDNO:2中选自下述的取代的一个或多个取代：
K500E,G,D,A,S,C,P,H,F,N,W,T,M,Y,V,Q,L,I,R，D550N，H464Q，H510Q，H535Q，D494N,Q,A，E495Q,A，T496A，E492G+V493P，K541G,D，D494N+E495Q+T496A，E495Q+T496A，E492G+V493P+K538H+K541N+E542D，N503K,DP499A，K541A,N，D494E+Q417H，Q417A，E492T+N503D，A490D+E492T+V493L+E501P+N503D+A504E+E505K+T506F+K541D，K536A，P537A，K538A，E501A,Q，E492G+K538H+K541N+E542D。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中根据前述权利要求中任一项所述的白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽包含一个或多个在其表面生成硫基团的进一步的改变。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中根据前述权利要求所述的白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽与SEQIDNO:2的序列同一性大于80％，优选大于90％，更优选大于95％，更优选大于96％，甚至更优选大于97％，更优选大于98％且最优选大于99％。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中根据前述权利要求所述的白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽是白蛋白的变体片段或者包含白蛋白的变体片段的融合多肽，其中所述片段为至少20个氨基酸，优选至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，更优选至少300个氨基酸，更优选至少400个氨基酸且最优选至少500个氨基酸。
9.一种白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其与亲本白蛋白、其片段或者包含所述亲本白蛋白或其片段的融合多肽相比具有改变的血浆半寿期，其在对应于SEQIDNO:2中选自下述的位置的位置处包含一个或多个取代：500、550、492、580、574、417、440、464、490、493、494、495、496、499、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、575、577、578、579、581、582和584，其中所述变体并非由具有取代D494N、E501K、K541E、D550G,A或K574N的SEQIDNO:2组成的变体。
10.根据权利要求9所述的白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其与所述亲本白蛋白相比具有较长的血浆半寿期。
11.根据权利要求10所述的白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其包含对应于SEQIDNO:2中下述取代的一个或多个取代：K573P+K574N+A577T+A578R+S579C+Q580K+A581D+G584A，K573P+A577E+A578S+Q580K+A582T，K573P+A578S+S579T+G584A，K573P+L575F+G584A，E492G，N503K，K500R，N503H，D550E，K574N，Q580K，E492G+N503K，E492G+N503H，E492H+E501P+N503H+E505D+T506S+T540S+K541E，E492G+K573A，E492G+N503K+K573A，E492G+N503H，E492G+K573P，E492G+N503K+K573P，E492G+N503H+K573P。
12.根据权利要求9所述的白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其与所述亲本白蛋白相比具有较短的血浆半寿期。
13.根据权利要求12所述的白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其包含对应于SEQIDNO:2中选自下述的取代的一个或多个取代：K500E,G,D,A,S,C,P,H,F,N,W,T,M,Y,V,Q,L,I,R，D550N，H464Q，H510Q，H535Q，D494N,Q,A，E495Q,A，T496A，E492G+V493P，K541G,D，D494N+E495Q+T496A，E495Q+T496A，E492G+V493P+K538H+K541N+E542D，N503K,DP499A，K541A,N，D494E+Q417H，Q417A，E492T+N503D，A490D+E492T+V493L+E501P+N503D+A504E+E505K+T506F+K541D，K536A，P537A，K538A，E501A,Q，E492G+K538H+K541N+E542D。
14.根据权利要求9所述的白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其具有对应于SEQIDNO:2中选自下述的取代的一个或多个取代：
Q417A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；
H440A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
A490C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；
E492A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
V493A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y；
D494A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
E495A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
T496A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y；
P499A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y；
K500A,C,D,E,F,G,H,I,,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y；
E501A,C,D,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
N503A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
A504C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
E505A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
T506A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y；
H510A,C,D,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
H535A,C,D,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
K536A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
P537A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y；
K538A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
T540A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,,V,W,Y；
K541A,C,D,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
E542A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
D550C,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
K574A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
Q580A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；
A581C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
A582C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
G584A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
H464A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
L575A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
A577C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
A578C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；或
S579A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y；
15.根据权利要求9-14中任一项所述的白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其包含一个或多个在其表面生成硫基团的进一步的改变。
16.根据权利要求9-15中任一项所述的白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其中所述白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽与SEQIDNO:2的序列同一性大于80％，优选大于90％，更优选大于95％，更优选大于96％，甚至更优选大于97％，更优选大于98％且最优选大于99％。
17.根据权利要求9-16中任一项所述的白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其为白蛋白的变体片段或者包含白蛋白的变体片段的融合多肽，其中所述片段为至少20个氨基酸，优选至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，更优选至少300个氨基酸，更优选至少400个氨基酸且最优选至少500个氨基酸。
18.一种核酸，其编码权利要求9-17中任一项所述的白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽。
19.一种缀合物，其包含权利要求9-18中任一项所述的变体白蛋白或其片段以及有益的治疗模块。
20.一种缔合物，其包含权利要求9-19中任一项所述的变体白蛋白或其片段以及有益的治疗模块。
21.一种融合多肽，其包含权利要求9-10中任一项所述的变体白蛋白或其片段以及融合伴侣多肽。
22.一种组合物，其包含白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽、或者包含所述变体白蛋白的缀合物，其中与对应的白蛋白或其片段、或包含所述白蛋白或其片段的融合多肽、或者包含所述白蛋白的缀合物相比，对FcRn的结合较强。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中其对FcRn的结合与HSA对FcRn的结合相比较强。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述白蛋白变体、其片段或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽、或者包含所述变体白蛋白的缀合物对FcRn的结合系数少于HSA的0.9XKD，更优选少于HSA的0.5XKD，更优选少于HSA的0.1XKD，甚至更优选少于HSA的0.05XKD，甚至更优选少于HSA的0.02XKD且最优选少于HSA的0.01XKD。
25.一种组合物，其包含白蛋白变体、其片段、或者包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽、或者包含所述变体白蛋白的缀合物，其中与对应的白蛋白或其片段、或包含所述白蛋白或其片段的融合多肽、或者包含所述白蛋白的缀合物相比，对FcRn的结合较弱。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中其对FcRn的结合与HSA对FcRn的结合相比较弱。
27.根据权利要求22-26中任一项所述的组合物，其包含根据权利要求9-17中任一项所述的变体白蛋白或其片段、权利要求19所述的缀合物、权利要求20所述的缔合物或者权利要求21所述的融合多肽。
28.根据权利要求22-27中任一项所述的组合物，其包含根据权利要求9-17中任一项所述的变体白蛋白或其片段，还包含化合物，所述化合物包含白蛋白结合域(ABD)和治疗上有益的模块。
29.根据权利要求22-29中任一项所述的组合物，其为药学组合物。
30.根据权利要求9-30中任一项所述的变体白蛋白、片段、融合多肽、或者缀合物、缔合物、或者包含所述变体片段或者融合多肽的组合物用作药物的用途。
31.根据权利要求9-30中任一项所述的变体白蛋白、片段、融合多肽、或者缀合物、缔合物、或者包含所述变体片段或者融合多肽的组合物在制造药学组合物中的用途。
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