JP2020523987A - 半減期延長ポリペプチドを有する融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
i)生物学的に活性なポリペプチド;およびii)配列番号1:X1−X2−X3−X4−X5−X6−D−X8−X9−X10−X11(配列番号1)によるアミノ酸配列から独立に選択された2〜80ユニットを含む半減期延長ポリペプチド部分を含み、式中、独立に、X1はPであるか、または存在せず;X2はVであるか、または存在せず;X3はPまたはTであり;X4はPまたはTであり;X5はTまたはVであり;X6はD、GまたはTであり;X8はA、QまたはSであり;X9はE、GまたはKであり;X10はA、E、PまたはTであり;およびX11はA、PまたはT、である、融合タンパク質が提供される。半減期延長ポリペプチド部分は通常、アンフォールド構造を有し、腎クリアランスを回避し得る大きな流体力学半径を有する融合タンパク質を提供する。その結果、融合タンパク質の生物学的半減期は増大し、それにより、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的作用が延長され得る。【選択図】図5c
Description
発明の分野
本発明は、半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質、およびこのような半減期延長ポリペプチドおよび融合タンパク質の使用に関する。
本発明は、半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質、およびこのような半減期延長ポリペプチドおよび融合タンパク質の使用に関する。
治療用タンパク質およびペプチドは、多くの場合、短いインビボ半減期により妨害される。特に、より小さいタンパク質およびペプチドは、腎臓の濾過により循環から容易に排出される。生物製剤はほとんどの場合、静脈内(i.v.、iv)または皮下(s.c.、sc)注射により投与され、各投与の間の時間の長さが極めて重要である。一方、これらの投与経路、特に、静脈内注射は通常、医療専門家の手助けが必要であり、また、患者にとって不愉快でもあり、痛みを与える場合もあり、従って、高頻度の投与は患者の不快感および不自由さを増し、医療資源を必要とする。これは、手間や不愉快さがはるかに軽減される、経口、鼻腔内または局所などのより侵襲性の少ない経路により必要に応じて投与できる場合が多い小分子薬物の投与とは大きく対象をなすものである。
生物製剤またはバイオ医薬品の循環からの急速排出の問題への最も早期の対処の試みの1つは、タンパク質またはペプチドへポリエチレングリコール(PEG)ポリマー鎖を化学的に結合して、薬物の流体力学半径を増大させることであり、これは、溶液中の増大した見かけのサイズに変換され、それにより、その薬物は腎臓により容易には排出されないサイズに達する。ペグ化と命名されたこの技術は、うまくいくことを示し、現在、承認医薬品で使用されている。しかし、化学的結合のステップは、製造に対し追加の工程ステップを加え、製造された薬物のコストを高める。さらに、PEG部分の結合は、タンパク質またはペプチドの種々の部位で起こり得るので、PEG鎖の位置が個々の分子内で変動する不均質性の大きく増大した生成物が得られる。PEGポリマーそれ自体の性質はまた、そのポリマーが単分散ではなく、類似であるが同じでない長さのPEGポリマーの集合体であるため、ある程度の不均質性を付与する。
PEGは非免疫原性であり、結合した分子に対して免疫原性を低減さえできるという元々の考えとは逆に、PEGは、後で、免疫原性があることが判明した。一例では、PEGは、結合した薬物の排出を大きく増大させるに至った(PEG−uricase;Ganson NJ et al.,2005)。
追加の製造ステップを取り除き、単分散生成物を作製することを目的として、Amunix IncおよびXL−Protein GmbHなどの会社は、治療用タンパク質およびペプチドの生物学的半減期を延長する融合パートナーとして使用できる、無作為に非反復性のタンパク質配列をベースにした半減期延長技術を開発した(Podust et al.2016 J Control Release,Schlapschy et al.2013 Protein Eng Des Sel)。
生物製剤の生物学的半減期を延長する別の方法は、長い半減期を有する血清タンパク質の形態のパートナーへの融合である。最もよく使われる融合パートナーの内の2種は、ヒト血清アルブミン(HSA)およびヒト抗体のFc部分である。特に、Fcドメインは、半減期延長融合パートナーとして広範囲に使用されてきた。HSAおよびFcの両方は、腎クリアランスを回避するのに十分な大きさであり、また、新生児のFc受容体が関与する再循環経路の恩恵も受ける。新生児のFc受容に対し、これらのタンパク質が結合することにより、低減した腎クリアランスのみにより達成されるものを超えてそれらの半減期がさらに延長される(Kontermann RE.Half−life extended biotherapeutics.Expert Opin Biol Ther.2016)。ヒト起源のこのような融合パートナーはまた、ヒト患者中での低い免疫原性応答を意味する。
しかし、上記の進歩にもかかわらず、当該技術分野において、生物製剤の半減期を延長する新規手段に対する必要性がまだ残されている。
本発明の目的は、先行技術の問題点を少なくとも部分的に低減または回避し、タンパク質およびペプチドの生物学的半減期を延長する新規手段を提供することである。
当業者には本開示から明らかであると思われるこれらのおよび他の目的は、添付の特許請求の範囲で定められたおよび一般に本明細書で開示された本発明の種々の態様により実現される。
一態様では、本発明は、下記を含む融合タンパク質に関する:
i)生物学的に活性なポリペプチド;および
ii)2〜80ユニットを含む半減期延長ポリペプチド部分であって、それぞれのユニットが、配列番号1:
X1−X2−X3−X4−X5−X6−D−X8−X9−X10−X11(配列番号1)
による全てのアミノ酸配列からなる群より独立に選択され、式中、独立に、
X1はPであるか、または存在せず;
X2はVであるか、または存在せず;
X3はPまたはTであり;
X4はPまたはTであり;
X5はTまたはVであり;
X6はD、GまたはTであり;
X8はA、QまたはSであり;
X9はE、GまたはKであり;
X10はA、E、PまたはTであり;
X11はA、PまたはT、であるペプチド部分。
i)生物学的に活性なポリペプチド;および
ii)2〜80ユニットを含む半減期延長ポリペプチド部分であって、それぞれのユニットが、配列番号1:
X1−X2−X3−X4−X5−X6−D−X8−X9−X10−X11(配列番号1)
による全てのアミノ酸配列からなる群より独立に選択され、式中、独立に、
X1はPであるか、または存在せず;
X2はVであるか、または存在せず;
X3はPまたはTであり;
X4はPまたはTであり;
X5はTまたはVであり;
X6はD、GまたはTであり;
X8はA、QまたはSであり;
X9はE、GまたはKであり;
X10はA、E、PまたはTであり;
X11はA、PまたはT、であるペプチド部分。
上記の2〜80ユニットは、上述の配列番号1の定義の範囲内で同一でも異なっていてもよい。言い方を変えれば、半減期延長ポリペプチド部分は、2〜80ユニットを含み、各ユニットは、配列番号1の定義内に入る個々の配列からなる群より独立に選択されるアミノ酸配列である。好ましくは、各ユニットは、配列番号2〜11からなる群より独立に選択されるアミノ酸配列であり得る。
本発明者らは、意外にも、ヒト胆汁酸塩刺激リパーゼ(BSSL)のC末端ドメインに基づくまたはそれ由来の、上記で定義のポリペプチド部分が、治療薬として使用されるタンパク質またはペプチドに融合されると、優れた半減期延長部分を提供できることを発見した。半減期延長ポリペプチド部分は通常、生理的条件下ではアンフォールド構造を有し、大きな流体力学半径を有する融合タンパク質を提供し、従って、生物学的に活性なポリペプチドの腎クリアランスを回避するか、または少なくとも腎クリアランス速度を遅くする。従って、半減期延長ポリペプチド部分を含む融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチド単独の生物学的半減期に比べて、延長された生物学的半減期を有し得る。
本発明では、融合タンパク質は、全体的にみて、胆汁酸塩刺激リパーゼではなく、生物学的に活性なポリペプチドは、塩刺激リパーゼの触媒ドメインと一致しない。
本明細書で使用される場合、表現の「融合した」および「融合」は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸配列などの同じ種類の化学物質の2つ以上の部分の人為的結合を意味する。本明細書において参照される場合、融合タンパク質は通常、少なくとも2つの異なる起源のポリペプチド部分、例えば、BSSL由来であり得る、半減期延長ポリペプチド部分、およびBSSLではない、生物学的に活性なポリペプチドを含む。本発明の融合タンパク質は通常、非天然物質であり、ヒトBSSLに相当するものではない。本発明の融合タンパク質はまた、キメラタンパク質とも呼ばれ得る。「キメラタンパク質」は、元々別々のタンパク質のためにコードされた、同じまたは異なる種であり得る2つ以上の完全なまたは部分的遺伝子からなるヌクレオチド配列によりコードされるハイブリッドタンパク質を意味すると理解される。本発明の融合タンパク質、またはキメラタンパク質は、組換えDNA技術により生成される。
表現の「生物学的半減期」は、血液、血清または血漿中の当該物質の濃度が初期濃度の半分に低減するのに要する時間を意味する。生物学的半減期は、当業者に既知の従来の方法に従って決定し得る。例えば、生物学的半減期は、血清、血漿または全血中の濃度に基づいて決定できる。
本明細書で使用される場合、「生物学的に活性なポリペプチド」という用語は、インビボで所望の生物活性を働かせるポリペプチドを意味する。これに関して、「生物活性」は、インビボで治療効果につながり、結合活性として例示され得るポリペプチドのいずれかの活性を意味する。非限定的例には、酵素活性、アゴニスト活性、およびアンタゴニスト活性が挙げられる。通常、生物学的に活性なポリペプチドは、生物製剤とも呼ばれるバイオ医薬品である。生物学的に活性なポリペプチドは通常、部分的にまたは全体的にヒトBSSLでもまたいずれか他の種のBSSLでもなく、それらに相当するものでもない。
好ましくは、半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的半減期を、少なくとも1つの種、通常ヒトで、少なくとも1.5倍延長する。換言すれば、融合タンパク質は、好ましくは、生物学的に活性なポリペプチド単独の場合の少なくとも1.5倍の生物学的半減期を有する。例えば、融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的半減期を、少なくとも1.8倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、延長し得る。増大した生物学的半減期の結果、生物学的に活性なポリペプチドの効果は、延長され得る。
投与の観点からは、本明細書で開示の半減期延長ポリペプチド部分の使用は、より少ない頻度の投与を可能とし、これは、患者にとって有益であり、加えて、経済的な観点からも有益である。例えば、薬物の週2日の投与でなく、週1回のみの投与で、同じまたは類似の生物学的または治療的効果を達成し得る。このような違いは、患者にとって、特に、病院または医院に来診して治療を受けることが必要な患者、および/または投与で身体的に不快感があり、さらには痛みさえある患者の場合に大きな改善を意味する。さらに、より少ない投与および/またはより長い投与間の期間により、投与法により生ずる有害反応を回避し得、例えば、皮下注射の場合の痛み、湿疹および発疹などの注射部位の反応を低減または回避でき、および静脈内投与の場合では、例えば、発熱または悪心を伴う注入反応を低減または回避できる。
本発明で使用される半減期延長ポリペプチドの他の利益は、半減期延長ポリペプチド中の多数の親水性残基に起因する融合タンパク質の増大した親水性にある。増大した親水性は、融合タンパク質のバイオアベイラビリティを改善し(生物学的に活性なポリペプチドそのままのバイオアベイラビリティと比較して)、全身的な濃度を高め、より少量および/またはより少ない頻度の投与量を可能にし得る。本明細書で使用される場合、「バイオアベイラビリティ」は、静脈内投与とは異なる経路を介して投与後に、体循環に到達する物質の投与量分率を意味する。
増大した親水性の別の実用的な意味は、静脈内投与ではなく、皮下投与が現実的な選択肢であり得ることである。可能であれば、皮下注射は、静脈内投与に比べて、一般的により迅速で、不快感が少なく、また、実施するための医学的訓練が少なくてすむので、皮下投与は多くの場合、静脈内注入よりも好ましい。
さらに、本発明による融合タンパク質の増大した親水性はまた、粗製発現産物の精製中に有利な場合がある。本発明の実施形態による融合タンパク質は、勾配溶出を使って疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を用いることにより、生物学的に活性なポリペプチドそのままの場合より早期に溶出されることが明らかになった。これは、生物学的に活性なポリペプチドと同時に溶出される望ましくない宿主細胞タンパク質に関連する問題に対する解決策となり得る非常に有用な効果の可能性があると考えられる。従って、高純度の融合タンパク質を得るために必要なクロマトグラフィーの単位操作の数を減らすことが可能である。
本明細書で記載の半減期延長ポリペプチド使用の別の利点は、融合タンパク質の増大した生物学的半減期は、もっぱら、または少なくとも主としてそのポリペプチドのサイズ増大に依存し得ることから、そのポリペプチドが、溶液中の流体力学半径(または見かけのサイズ)の観点でのサイズに基づいて、得られる融合タンパク質の生物学的半減期のより正確な予測を可能とすることである。実際に、本発明の実施形態で使用される半減期延長ポリペプチド部分は、大部分の再利用受容体の新生児のFc受容体への結合を欠き、従って、タンパク質サイズと受容体相互作用による再利用との間の複雑な相互作用を回避し得る。この相互作用が回避できない場合には、生物学的半減期の予測および微調整を極めて不確実なものにする。
半減期延長ペプチド部分は、配列番号1で定義の1つまたは複数の配列の4〜80ユニットなどの2〜80ユニットのコンティグ配列を形成し得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、複数の半減期延長ポリペプチド部分を含み、それぞれのポリペプチド部分が上記で定義の2〜80ユニットを含み得る。このような複数の半減期延長ポリペプチドは、同じ長さ(同じ数のユニットを有する)であってもよく、または異なった長さであってもよい。あるいは、融合タンパク質は、1つの半減期延長ポリペプチドのみを含み、通常、上記で定義の4〜80ユニットを有し得る。
いくつかの実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、前記生物学的に活性なポリペプチドのアミノ末端(N末端)またはカルボキシ端末(C末端)に配置され得る。複数の半減期延長ポリペプチドの場合には、少なくとも1つの前記半減期延長ポリペプチド部分は、前記生物学的に活性なポリペプチドのN末端またはC末端に配置され得る。
代わりにまたは追加して、半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチドのアミノ酸配列中への挿入、またはその一部の置換を構成し得る。複数の半減期延長ポリペプチドの場合には、少なくとも1つの前記半減期延長ポリペプチド部分は、任意選択で、生物学的に活性なポリペプチドのアミノ酸配列中への挿入、またはその一部の置換として配置され得る。挿入または置換は、生物学的に活性なポリペプチドのアミノ酸配列中への挿入、またはその一部への置換を構成する半減期延長ポリペプチド部分が、融合タンパク質の表面上に露出されるように、生物学的に活性なポリペプチドの三次構造の表面露出ループ中でなされ得る。
本発明の実施形態では、配列番号1の残基X3およびX4の少なくとも1つがPであり得る。いくつかの実施形態では、配列番号1のX4およびX5の少なくとも1つがTであり得る。いくつかの実施形態では、配列番号1のX10およびX11の少なくとも1つがAまたはPであり得る。いくつかの実施形態では、X1はPであり、X2はVである。
本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号2〜11からなる群より独立に選択される1つまたは複数のアミノ酸配列の2〜80ユニットを含み得る。これらの配列は、配列番号1のヒトバリアントを表す。インビトロおよびインシリコで評価された配列番号2〜11から選択される反復ユニットに基づくアミノ酸配列は、低い免疫原性の可能性を有することが明らかになった。このようなユニットからなる半減期延長ポリペプチド部分は、免疫応答の観点から、ヒト対象で耐容性良好であることが予測される。
いくつかの実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、ヒト起源の天然配列が通常そうであるように、そのN末端に配列番号2を有し得る。例えば、半減期延長ポリペプチド部分は、次の順番で、少なくとも4つの近接ユニットを含み得る:任意選択で配列番号2が先行して、[配列番号3]−[配列番号4]−[配列番号5]−[配列番号5]。
本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号12〜21または57〜66から選択される少なくとも1つの配列を含み得る。例えば、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号12〜21および57〜66からなるアミノ酸配列の群から選択され得る。あるいは、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号12〜21および57〜66からなる群より選択される配列の複数のコピー、例えば、2個、または3個の、任意選択で、近接したコピーを含み得る。
いくつかの実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号100〜105からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなり得る。
本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号1による1つまたは複数のアミノ酸配列の少なくとも4、少なくとも6、少なくとも8、少なくとも10、または少なくとも17ユニットを含み得る。さらに、本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号1による1つまたは複数のアミノ酸配列の最大8、最大10、最大18、最大34、最大51、最大68、最大70ユニットを含み得る。従って、例えば、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号1による1つまたは複数のアミノ酸配列の7〜18ユニット、例えば、配列番号2〜11からなる群より独立に選択される7〜18ユニットを含み得る。
通常、半減期延長ポリペプチドは、または融合タンパク質が複数の半減期延長ポリペプチドを含む場合では、少なくとも1つの半減期延長ポリペプチドは、配列番号1による少なくとも2個の異なるアミノ酸配列を含む。
本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチドは、溶液中、単独で少なくとも5kDaの見かけのサイズを有する、生物学的に活性なポリペプチドに融合され得る。特に、小さい生物学的に活性なポリペプチドの場合には、存在する半減期延長ポリペプチドは、腎クリアランスを回避するのに十分なサイズに増大させ得るので、大きなメリットがあり得る。全体的にみて、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定して、融合タンパク質は通常、溶液中で少なくとも60kDaの見かけのサイズを有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の溶液中の見かけのサイズは、生物学的に活性なポリペプチド単独の溶液中の見かけのサイズより、少なくとも1.5倍、最大で300倍、大きい。流体力学半径に換算すると、融合タンパク質は、全体的にみて、少なくとも3.8nmの流体力学半径を示し得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の流体力学半径は生物学的に活性なポリペプチド単独の流体力学半径の、少なくとも1.25倍の大きさ、例えば、2倍の大きさであり得る。
半減期延長ポリペプチドにより提供される見かけのサイズの増大は、半減期延長ポリペプチドの不定形のまたはアンフォールド構造により、少なくとも一部は説明され得る。例えば、半減期延長ポリペプチドは、αヘリックスおよびβシートなどの二次構造要素を欠き、そのため、半減期延長ポリペプチドは、融合タンパク質のαヘリックスおよび/またはβシート含量に寄与しないとして特徴付けされ得る。
本発明の実施形態では、配列番号1によるアミノ酸配列は、ヒト起源であり得る。例えば、半減期延長ポリペプチド部分は、天然ヒトアミノ酸配列に一致し得る。ヒト対象でのより低い免疫原性の一因となることが予測されるので、ヒト起源の配列の使用は有利であり得る。実際に、下記の実施例14は、配列番号2〜11から選択される反復ユニットからなる半減期延長ポリペプチド部分は、ヒトにおける低い免疫原性の可能性を有することを確証する。それにもかかわらず、他の種の天然反復ユニットを含むまたはそれに相当する配列もまた、半減期延長ポリペプチドにおいて、単独またはヒト起源の反復ユニットと組み合わせた使用が意図されている。このような他の種には、特に、非ヒト霊長類、例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、ボノボおよびマカクが含まれる。
本発明の実施形態では、配列番号1による各反復ユニットは、1つの、または最大で1つの可能なO−グリコシル化部位を有する。さらに、半減期延長ポリペプチド部分が哺乳動物発現系で生成された場合、各ユニットは、最大で1つのO−グリコシル化を含み得、および通常、全部ではないが、大部分の前記ユニットが1つのO−グリコシル化をそれぞれ含む。例えば、前記ユニットの特定の数または部分は、グリコシル化を欠き得る。いくつかのグリコシル化は、それがサイズ増大にさらに寄与し得るので有益であり得るが、非特異的または未知のグリコシル化パターンは、タンパク質の特性評価中に実際的な問題を提起する場合がある。従って、本発明の実施形態による限られたおよび比較的明確な半減期延長ポリペプチド部分のグリコシル化パターンは、この点では有利である。しかし、いくつかの実施形態では、特に、融合タンパク質が非哺乳動物細胞中で産生される場合には、半減期延長ポリペプチド部分は、グリコシル化を完全に欠き得る。
融合タンパク質は、少なくとも1つの生物学的に活性なポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、複数の生物学的に活性なポリペプチド、例えば、2つの生物学的に活性なポリペプチドを含み得る。
半減期延長ポリペプチド部分との融合による半減期の延長が望ましい融合タンパク質の生物学的に活性なポリペプチドは、ホルモン、成長因子、サイトカイン、酵素、リガンド、結合剤、補助因子、抗体および抗原結合フラグメント(Fab)などの抗体フラグメントからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドは受容体アゴニストであり得る。他の実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドは、受容体アンタゴニストであり得る。
融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチド単独の生物学的半減期に比べて、少なくとも1.5倍延長される生物学的半減期を有し得る。
別の態様では、本発明は、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的半減期を延長する方法、または上記本発明の第1の態様による融合タンパク質を生成する方法を提供し、該方法は、
a)生物学的に活性なポリペプチドおよび半減期延長ポリペプチド部分を含む、上述の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、通常、DNA構築物を用意するステップ;
b)前記ポリヌクレオチドを細胞中に導入するステップ;
c)前記細胞を前記融合タンパク質の発現を可能とする条件下で維持するステップ;および
d)前記融合タンパク質を単離するステップ、を含む。
a)生物学的に活性なポリペプチドおよび半減期延長ポリペプチド部分を含む、上述の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、通常、DNA構築物を用意するステップ;
b)前記ポリヌクレオチドを細胞中に導入するステップ;
c)前記細胞を前記融合タンパク質の発現を可能とする条件下で維持するステップ;および
d)前記融合タンパク質を単離するステップ、を含む。
いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物発現系での発現は、融合タンパク質のグリコシル化を提供し得るので、有益であり得る。他の実施形態では、細胞は、酵母細胞、植物細胞または非哺乳動物細胞などの非哺乳動物真核細胞であり得る。さらに他の実施形態では、細胞は、大腸菌などの原核細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、α2,6−シアル酸転移酵素(EC:2.4.99.1;別名はB細胞抗原CD75である)と共発現され得る。このような方法は、
i)α2,6−シアル酸転移酵素をコードするポリヌクレオチド、通常DNA構築物を用意するステップまたは内因性α2,6−シアル酸転移酵素の発現を推進するステップ、
ii)本発明の実施形態による融合タンパク質の発現のために、前記ポリヌクレオチドを、上記ステップb)で使用したものと同じ細胞であってもよい細胞中に導入するステップ、および
iii)前記細胞を前記α2,6−シアル酸転移酵素の発現も可能とする条件下で維持するステップ、を含み得る。
i)α2,6−シアル酸転移酵素をコードするポリヌクレオチド、通常DNA構築物を用意するステップまたは内因性α2,6−シアル酸転移酵素の発現を推進するステップ、
ii)本発明の実施形態による融合タンパク質の発現のために、前記ポリヌクレオチドを、上記ステップb)で使用したものと同じ細胞であってもよい細胞中に導入するステップ、および
iii)前記細胞を前記α2,6−シアル酸転移酵素の発現も可能とする条件下で維持するステップ、を含み得る。
ポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードする上記ステップa)と同じ構築物であり得る。あるいは、それは、異なるDNA構築物であってもよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードし、およびそれぞれ、α2,6−シアル酸転移酵素をコードするか、またはその発現を推進する異なるDNA構築物を用いて、DNA構築物は、同時にまたは異なる時点で、同じ細胞中に導入され得る。あるいは、異なる細胞を用いてもよく、この場合には、細胞は一緒に培養され、従って、同時にまたは順次に、融合タンパク質およびα2,6−シアル酸転移酵素の発現を可能とする条件下で一緒に維持され得る。
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド含む発現ベクター、および哺乳動物細胞または非哺乳動物細胞であってよい、このような発現ベクターを含む細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の融合タンパク質および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮下投与、および/または静脈内投与用として処方され得る。
さらに別の態様では、本発明は、薬物として使用するための、特に、対象の皮下に投与することが意図される薬物として使用するための融合タンパク質を提供する。
さらなる態様では、本発明は、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的半減期を増大するための本明細書で定義の半減期延長ポリペプチドの使用、ならびに生物学的に活性なポリペプチドのバイオアベイラビリティを高めるための本明細書で定義の半減期延長ポリペプチドの使用に関する。前述のように、本明細書で記載の半減期延長ポリペプチド部分の別の利益は、半減期延長ポリペプチド中の多数の親水性残基に起因して得られた融合タンパク質の増大した親水性にある。増大した親水性は、バイオアベイラビリティを改善し得、また、全身的濃度(例えば、血清濃度)を高め、潜在的により少ない投与量またはより少ない頻度の投与量を可能とする。増大した親水性の別の実用的な意味は、特定の生物学的に活性なポリペプチドにとって、静脈内投与ではなく、皮下投与が現実的な選択肢であり得ることである。
本発明は、特許請求の範囲中に記述された特徴の全ての可能な組み合わせに関することに留意されたい。
ヒト授乳中乳腺および膵臓は、脂肪分解酵素の、胆汁酸塩活性化リパーゼ(BAL)またはカルボン酸エステルリパーゼ(CEL)とも呼ばれる胆汁酸塩刺激リパーゼ(BSSL)(EC3.1.1.13)を産生する。タンパク質は、2つのドメイン、大きな球状アミノ末端ドメインおよびより小さいが延長されたカルボキシ端末(C末端)ドメイン中に配置されている(概説は、例えば、Wang & Hartsuck(1993)Biochim.Biophys Acta 1166:1−19を参照)。本発明者らは、以下の実施例で示すように、意外にも、ヒトBSSLのC末端ドメインに基づくまたはそれから誘導された反復配列が、生物学的に活性なタンパク質またはペプチドにうまく融合でき、融合パートナーの増大した生物学的半減期を付与し、それにより、そのインビボでの生物学的または治療的効果を延長することを見出した。
ヒトBSSLのC末端ドメインは、式「PVPPTGDSGAP」の、またはそれに類似の、反復ユニットからなる。以下の実施例1の表2は、ヒトBSSLバリアント由来の反復ユニットを示す。最もよくある形態のC末端ドメインは、18反復ユニットを含む(UniProt entry P19835)。しかし、ヒト集団では、反復ユニットの数に関する変化、および個々の反復ユニットのアミノ酸配列の変化の両方の変化が存在する。さらに、各反復ユニットは、O−グリコシル化され得る1つの部位を有し、この領域の親水性およびサイズを増大する(Stromqvist et al.Arch.Biochem.Biophys.1997)。しかし、ドメインのC末端は疎水性であり、BSSLの活性部位に結合して、酵素の自己抑制をもたらすことが示された。この疎水性の部分の最も高頻度のヒト配列は、「QMPAVIRF」である(Chen et al.Biochemistry 1998)。
以前に、C末端ドメインは、インビボでBSSLの安定性、例えば、酸による変性および生理的条件下の凝集に対する抵抗性、に関与し得ることが推測された(Loomes et al.,Eur.J.Biochem.1999,266,105−111)。対照的に、別のコレステロールエステラーゼ構造の研究では、Pro、Asp、Glu、SerおよびThr残基が富化されたC末端ドメインは、短寿命タンパク質中のPESTリッチ配列を想起させ、このタンパク質が、C末端ドメインの反復配列に起因して、インビボで短い半減期を有し得ることを示した(Kissel et al.,Biochimica et Biophysica Acta 1989,1006)。
本発明では、本明細書で定義のヒトBSSLのC末端ドメインに基づくまたはそれ由来の半減期延長ポリペプチド部分を含む融合タンパク質の延長された生物学的半減期は、主に、タンパク質の増大した流体力学半径に起因すると考えられている。しかし、その他の機序が増大した生物学的半減期に寄与し得ることも想定される。
本明細書で使用される場合、表現の「融合した」および「融合」は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸配列などの同じ種類の化学物質の2つ以上の部分の人為的結合を意味する。本明細書において参照される融合タンパク質は通常、少なくとも2つの異なる起源であり得るポリペプチド部分、例えば、BSSLではない生物学的に活性なポリペプチド、およびBSSL由来であり得る半減期延長ポリペプチド部分を含む。一般に、融合は、任意の順序、任意の位置での縮合部分を含み得るが、しかし、当業者なら理解するように、遺伝子の融合は通常、縮合遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)が維持されるように、インフレーム(インライン)で行われる。
図1は、本発明の実施形態による融合タンパク質をコードする核酸構築物を模式的に示し、該核酸構築物は、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子(白色バー)、および半減期延長ポリペプチド部分をコードする遺伝子(破線のバー)を含む。単純化のために、プロモーターまたはエンハンサー配列などの他の要素は表示していないが、当業者なら、このような要素が必要に応じて含まれ得ることを理解するであろう。例えば、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子は、哺乳動物細胞では、発現のためのシグナル伝達ペプチドが先行し得る、または大腸菌中では、発現のためのシグナルペプチドもしくはメチオニン残基が先行し得る。
図1に示すように、半減期延長ポリペプチド部分をコードする遺伝子は、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子に対し、C末端に(図1b)、N末端に(図1c)またはN末端およびC末端の両方に(図1d)配置され得る。あるいは、半減期延長ポリペプチド部分をコードする配列は、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子の境界内に配置され得る(インライン位置決め)。このような実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分をコードする配列は、挿入が生物学的に活性なポリペプチドの三次または折り畳み構造を破壊しない限り、複数の部位、例えば、図1fに示す3つの位置に、またはさらに多くの所望の部位に、任意選択で存在し得る。1つまたは複数の半減期延長部分のインライン位置決めは、N末端および/またはC末端融合と組み合わせ得る。
半減期延長ポリペプチド部分の融合パートナーを構成する生物学的に活性なポリペプチドは、生物学的機能が生物学的に活性なポリペプチドの特定の全身的濃度を必要とする、いずれかの状態または障害の治療または予防での使用に好適し得る、任意の生物学的に活性なポリペプチド、または生物学的に活性なポリペプチドの組み合わせであり得る。
通常、生物学的に活性なポリペプチドは、生物製剤とも呼ばれるバイオ医薬品である。好適な生物学的に活性なポリペプチドの例には、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、酵素、補助因子、リガンド、結合剤(天然および人口の結合剤を含む)、ならびに抗体および抗体フラグメントが挙げられる。本発明の実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドは、受容体アゴニストであり得る。他の実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドは、受容体アンタゴニストであり得る。
生物学的に活性なポリペプチドそれ自体は、天然ポリペプチドであってもよく、または非天然ポリペプチドであってもよい。しかし、半減期延長ポリペプチド部分に融合されると、得られた融合タンパク質は常に、非天然物質である。生物学的に活性なポリペプチドは、融合タンパク質が天然のBSSLタンパク質に相当するようなヒトBSSLの一部ではない。天然のまたは非天然のポリペプチドを含む融合タンパク質は、組換えで産生され得るか、または例えば、下記の実施例で示すように化学的に合成され得る。
図2は、本発明の実施形態による融合タンパク質(下記実施例のPSI0540、配列番号38で表される融合タンパク質)を示し、生物学的に活性なポリペプチドは、この実施例ではIL−1Raである、球状の折り畳みドメイン、および生物学的に活性なポリペプチドのC末端の位置で尾部を形成する半減期延長ポリペプチド部分により表され、この実施例の半減期延長ポリペプチドは、配列番号57による17反復ユニットにより表される。生物学的に活性なポリペプチドは、生物学的に活性なポリペプチドのC末端を半減期延長ポリペプチドのN末端に結合するペプチドリンカー、ここでは[G4S]3を介して、そのC末端部で半減期延長ポリペプチドに結合され、従って尾部の近位部分を形成する。
しかし、上記で図1に関連して説明したように、半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチドのC末端に配置されるとは限らない。本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチドのN末端(図1c)に配置され得るか、または半減期延長部分はN末端およびC末端にそれぞれ配置され得る(図1d)。他の実施形態では、1つまたは複数の半減期延長ポリペプチドが、生物学的に活性なポリペプチド内の位置(図1e)に、例えば、生物学的に活性なポリペプチドの表面露出ループ中の位置に、挿入され得る。
いくつかの実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチドの特異的配列セグメントを置換し得る。例えば、インサートとして配置される場合、半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチド上の表面露出ループの一部を置換し得る。あるいは、半減期延長ポリペプチドは、生物学的に活性なポリペプチドのN末端またはC末端ドメイン、または内部ドメインなどの全体ドメインを置換し得る。
さらに他の実施形態では、インライン挿入半減期延長ポリペプチド部分は、N末端部分、C末端部分、またはN末端およびC末端両方の半減期延長ポリペプチド部分の内のいずれかと組み合わせ得る(図1f)。特に、異なる位置に配置された、複数の半減期延長部分を含む本発明の実施形態では、それぞれのこのような半減期延長部分は本明細書に記載のように独立に定義され得る。別義が示されない限り、それぞれのこのような半減期延長部分は、配列番号1によるアミノ酸配列の4〜80ユニットを含み得る。
最後に、本発明は、融合パートナーとして、単一の生物学的に活性なポリペプチドの使用に限定されず、むしろ、図1gに示されるように、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、リンカーにより、および/または図1gの例におけるように、半減期延長ポリペプチドにより、分離された複数の生物学的に活性なポリペプチドを含み得ることが想定されている。代わりにまたは追加して、1つまたは複数の半減期延長ポリペプチド部分または複数部分は、融合タンパク質のN末端またはC末端の位置にも配置され得る。
複数の生物学的に活性なポリペプチドの場合には、これらは、同一でも異なっていてもよい。例えば、融合タンパク質は、任意選択で、リンカーまたはスペーサー配列および/または半減期延長ポリペプチド部分により分離された、2つの異なる生物学的に活性なポリペプチドを含み得る。あるいは、融合タンパク質は、3つの異なる生物学的に活性なポリペプチドを含み得る。複数の生物学的に活性なポリペプチドを含む融合タンパク質の実施形態では、これらの1つは、成長因子、サイトカイン、酵素およびリガンドからなる群から選択されてよく、および残りの生物学的に活性なポリペプチドは、抗体または抗体フラグメントから選択されてよい。一例として、半減期延長ポリペプチド部分は、異なる抗原結合領域の間のリンカーとして配置され得る。
本発明では、生物学的に活性なポリペプチドとの融合のために使用される半減期延長ポリペプチド部分は、2〜80反復ユニットを含むアミノ酸配列を含み、それぞれのユニットは、配列番号1:
X1−X2−X3−X4−X5−X6−D−X8−X9−X10−X11(配列番号1)
により定義されるアミノ酸配列の群から独立に選択され、式中、独立に、
X1はPであるか、または存在せず;
X2はVであるか、または存在せず;
X3はPまたはTであり;
X4はPまたはTであり;
X5はTまたはVであり;
X6はD、GまたはTであり;
X8はA、QまたはSであり;
X9はE、GまたはKであり;
X10はA、E、PまたはTであり;
X11はA、PまたはT、である。
X1−X2−X3−X4−X5−X6−D−X8−X9−X10−X11(配列番号1)
により定義されるアミノ酸配列の群から独立に選択され、式中、独立に、
X1はPであるか、または存在せず;
X2はVであるか、または存在せず;
X3はPまたはTであり;
X4はPまたはTであり;
X5はTまたはVであり;
X6はD、GまたはTであり;
X8はA、QまたはSであり;
X9はE、GまたはKであり;
X10はA、E、PまたはTであり;
X11はA、PまたはT、である。
本明細書で使用される場合、「ユニット」は、例えば、配列番号2〜11によるいずれかの配列を含む、上記で定義の配列番号1による一般式のアミノ酸配列の発生を意味する。半減期延長ポリペプチドは、このような2〜80ユニットを含み、これは、上述の定義の範囲内で、同一でも異なっていてもよい。半減期延長ポリペプチドのユニットはまた、「反復ユニット」とも呼ばれ得るが、個々のユニット間である程度のアミノ酸配列の変化が存在し、従って、「反復ユニット」は、1つの、同じ配列の反復のみとして理解されるべきではない。言い方を変えれば、半減期延長ポリペプチド部分は、2〜80ユニットを含み、各ユニットは、配列番号1の定義内に入る個々の配列からなる群より独立に選択されるアミノ酸配列である。
半減期延長ポリペプチド部分は、少なくとも18個のアミノ酸(配列番号1の両方とも9マー型である2ユニットに相当)、および通常、880個までのアミノ酸(配列番号1の全て11マー型である80ユニットに相当)のコンティグ配列を含み得る。反復ユニットは、相互に隣接し得るが、反復ユニットは、短いスペーシング配列(spacing sequence)により分離することも可能である。例えば、2反復ユニットは、配列番号1に一致しない最大10アミノ酸残基により分離され得、例えば、短いスペーシング配列が式(G4S)2のペプチドリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、スペーシング配列が最大5アミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸残基が、例えば、N−グリコシル化部位などの所望の機能を付与するために、または別のタイプの修飾のための部位を提供するために、例えば、単一Cys残基を用いて、2つの反復ユニット間に配置され得る。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のG4Sリンカーなどのリンカーを隣接する反復ユニット間のスペーシング配列として用い得る。従って、この可能性を考慮すると、最大80反復ユニットを含むコンティグ配列は、880アミノ酸、例えば、最大900アミノ酸または最大1000アミノ酸より長くなる場合もある。
半減期延長ポリペプチド部分の反復ユニットは、配列番号1により定義され、これは、BSSL C末端ドメインのヒトバリアントの反復ユニットをベースにしており、また、位置X3、X4、X5、X6、X8、X9、X10およびX11のアミノ酸残基のいくつかの変化を可能とする。その一方で、位置X1、X2およびX7の残基は固定されるが、位置X1およびX2は存在しなくてもよい。いくつかの実施形態では、X1およびX2の両方が存在せず、このような実施形態では、反復ユニットは9アミノ酸のみからなる。
2〜80ユニット(反復ユニット)を含む半減期延長ポリペプチド部分は通常、いくつかの配列番号1により通常定義されるアミノ酸配列モチーフの、配列番号1による少なくとも2つの異なるバリアントなどのバリアントを含む。例えば、半減期延長ポリペプチド部分が少なくとも4ユニットを含む、本発明の実施形態では、それは、配列番号3、配列番号4および配列番号5のそれぞれの少なくとも1つのユニットを含み得る。半減期延長ポリペプチド部分が少なくとも2ユニットを含む、本発明の実施形態では、これらは、配列番号3、配列番号4および配列番号5からなる群より独立に選択され得る。好都合にも、半減期延長ポリペプチド部分は、任意選択で、配列番号2により先行されて、配列番号3〜5をこの順に含み得る。配列番号2によるユニットは、特に、半減期延長ポリペプチド部分のN末端に配置され得、半減期延長ポリペプチド部分の第1のユニットとなる。反復ユニットの他の特異的変化(例えば、配列番号3〜11によるユニット)は、繰り返して出現し得るが、配列番号2は、存在する場合、通常、半減期延長ポリペプチド部分の第1の反復ユニットとして、1回のみ出現する。
半減期延長ポリペプチド部分の構造は通常、不定形である。例えば、本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチドは、円偏光二色性またはFTIR(フーリエ変換赤外分光法)で測定して、融合タンパク質のαヘリックスおよび/またはβシート含量に寄与しない。
本発明の実施形態では、配列番号1により規定される反復ユニットは、ヒト起源であり、好ましくは、半減期延長ポリペプチド部分の全ての反復ユニットは、ヒトBSSLのC末端ドメインの天然の反復ユニットのバリアントに相当する。このような反復ユニットは、配列番号2〜11で表される(実施例中の表2も参照)。本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分の全ての反復ユニットは、配列番号2〜11、例えば、配列番号3〜11からなる群より選択される。すなわち、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号2〜11、例えば、配列番号3〜11からなる群よりそれぞれ独立に選択される2〜80ユニットを含み得る。先行技術で使用されたように、ポリペプチドベースであるか、その他であるかにかかわらず、非ヒトまたは部分的ヒト起源の反復ユニットを有する半減期延長部分に比べて、ヒト対象でのより低い免疫原性の一因となることが予測されるので、ヒト起源の配列の使用は有利であり得る。下記の実施例14でより詳細に記載のように、代表的なヒト起源の半減期延長ポリペプチド由来のどのペプチドも、ヒト健康ドナー由来の抗原提示細胞上に提示されなかった。これは、配列番号2〜11から選択される反復ユニットからなる半減期延長ポリペプチド部分は、ヒトにおける低い免疫原性の可能性を有することを示す。
さらに、本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、天然のヒト配列の反復ユニットに相当する反復ユニットの配列を含む、またはそれからなる。このような天然のヒト配列の反復ユニットの例は、配列番号12〜21および57〜66に提供されている。通常、このような配列は、第1の5反復ユニットとして、この順に:[配列番号2]−[配列番号3]−[配列番号4]−[配列番号5]−[配列番号5]を含む、あるいは、第1の4反復ユニットとして、この順に:[配列番号3]−[配列番号4]−[配列番号5]−[配列番号5]を含む。
従って、本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号12〜21または57〜66中のいずれか1つによるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号12〜21または57〜66のいずれか1つの反復からなる。例えば、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号12〜21または57〜66のいずれか1つ、例えば、配列番号57によるアミノ酸配列の、3つの連続反復、またはコピーからなり得る。配列番号57は、配列番号1による17ユニットのアミノ酸配列を含み、従って、配列番号1の3コピーの反復は、少なくとも51ユニットを含む。しかし、半減期延長ポリペプチド部分の反復ユニットは、配列番号1による全てのユニットから独立して選択することができ、本発明は従って、反復されるユニットの特定の配列に限定されないことに留意されたい。したがって、例えば、51ユニットの半減期延長ポリペプチド部分は、3コピーの17ユニット配列から形成されるとは限らず、配列番号1によるユニットの任意の組み合わせ、特に、配列番号2〜11から選択される反復ユニットの任意の組み合わせから形成され得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも34ユニットを有する半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号100〜105からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなり得る。例えば、34ユニットの半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号100または配列番号101による配列からなり得;51ユニットの半減期延長ポリペプチドは、配列番号102または配列番号103による配列からなり得;および68ユニットの半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号104または配列番号105による配列からなり得る。
上記で定義の各反復ユニットは、1つの可能なO−グリコシル化部位を保持することが見出された。すなわち、グリコシル化を可能とする哺乳動物環境中での発現時に、各反復ユニットは、最大で1つの所定の位置、通常は、トレオニン(T、Thr)残基の位置でグリコシル化され得る。配列番号2〜11の反復ユニットに関しては、O−グリコシル化の可能な位置は、表2に示されている(実施例1参照)。グリカンの数に上限値が存在し得、これは、ユニットの総数より小さい。すなわち、通常、半減期延長ポリペプチド部分のユニットの全てより少ない数がグリコシル化される。例えば、17ユニットの配列(例えば、配列番号14、配列番号15、配列番号19)から、通常、10ユニットのみがグリコシル化される。従って、いくつかの実施形態では、ユニットの大部分はグリコシル化されるが、一方、少量のユニットがグリコシル化され得ない。さらに、グリコシル化の程度(例えば、非グリコシル化ユニットに対するグリコシル化ユニットの比率、など)は、既知の手段により、例えば、発現系を適切に選択することにより、および/または産生細胞の培養または発現状態を制御することにより、調節可能である。
前述のように、本発明による半減期延長ポリペプチド部分を含む融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチド単独に比べて、増大した生物学的半減期から利益が得られる。増大した生物学的半減期は、主に、生物学的に活性なポリペプチド単独に対して、融合タンパク質の増大したサイズに起因する。本発明による融合タンパク質のサイズは、腎臓による循環からの排出(腎クリアランス)を低減するのに十分に大きい。
糸球体の膜の大部分細孔の半径は、4.5〜5nmである。膜は負に帯電しており、従って、負に帯電しているタンパク質は腎臓により排出される傾向が少ない。例えば、負に帯電している分子は、2.5nmの流体力学半径で既に、腎クリアランスから顕著に保護され得るが、一方で、中性の分子は、腎クリアランスから類似の保護を得るために、3.5nmのサイズが必要である(Haraldsson et al Physiological Reviews 88(2)451−487)。非荷電球状タンパク質に対しては、腎クリアランスのサイズ限界(これより小さいとタンパク質が分泌される)は、分子量約60kDaである。
例えば、多角度光散乱検出器(MALS)により測定して、実際のタンパク質の分子量は、アミノ酸組成、および任意のグリカン結合に基づく理論分子量と一致する。その一方で、タンパク質の溶液中の見かけのサイズ(または見掛けの分子量)は、例えば、下記の実施例4に記載されているように、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により測定して、球状タンパク質の実際の分子量に相当するタンパク質の見掛けの分子量、または見かけのサイズが得られる。球状構造を持たないタンパク質およびペプチドに対しては、実際の分子量は、溶液の見掛けの分子量、または見かけのサイズとは異なり得る。
通常、非球状タンパク質またはポリペプチドは、その実際の分子量よりも大きい溶液中の見かけのサイズを示し得る。通常、不定形のアンフォールド構造を有する、本発明の半減期延長ポリペプチド部分の場合には、発明者らは、SECにより測定して、実際の分子量が約1kDaに過ぎない場合であっても、各反復ユニットは約9kDaを示すことを見出した(図3a、以降でさらに詳細に記載する)。従って、溶液中での融合タンパク質の見かけのサイズは、本発明の実施形態による融合タンパク質で得られる各ユニットに対して、約9kDだけ増加され得る。
全体として、融合タンパク質は、SECにより測定して、生物学的に活性なポリペプチド単独のサイズより、少なくとも1.5、少なくとも1.8、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、または少なくとも50、および最大で10、最大で20、最大で40、最大で60、最大で80、最大で100、最大で200、最大で250、最大で270倍、およびさらには最大で、300倍大きい、溶液中の見かけのサイズを有し得る。増大因子は、本来、当該の生物学的に活性なポリペプチドのサイズに依存するであろう。しかし、6kDa〜60kDaの範囲の見かけのサイズの生物学的に活性なポリペプチドに対して、融合タンパク質は、少なくとも1.5倍、および最大で約250倍だけ大きい見かけのサイズを有し得る。より小さい、例えば、約3kDaの生物学的に活性なペプチドに対して、それでも、250倍を超えないサイズの増加、例えば、約240倍のサイズの増加を目標にするのが好ましいであろう。
半減期延長ポリペプチド部分および融合タンパク質のサイズはそれぞれ、流体力学半径によっても決定され得、ストークス半径とも呼ばれ、ナノメートル(nm)で測定される。溶液中の見かけのサイズおよび流体力学半径の両方は、例えば、下記の実施例4に記載されているように、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により測定される。
溶液中の見かけのサイズに関して上記で述べたことと一致して、融合タンパク質の流体力学半径は通常、腎クリアランスを回避するのに十分な大きさである。比較のために、腎クリアランスの限界を超えるサイズを有するヒト血清アルブミンは、3.8nmの流体力学半径を有する。融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチド単独の流体力学半径の少なくとも1.25倍の大きさ、または少なくとも1.5倍の大きさである流体力学半径を有し得る。例えば、融合タンパク質の流体力学半径は、生物学的に活性なポリペプチド単独の流体力学半径の、少なくとも2、3、5、10、20または50倍の増加を示し得る。融合タンパク質の流体力学半径は、生物学的に活性なポリペプチドの流体力学半径より、最大で8、最大で10、最大で12、または最大で30、またはさらに最大で100倍増大し得る。半減期延長ポリペプチド部分の各反復ユニットは、一般に、0.11nmの流体力学半径の増加に寄与することが明らかになった。
半減期延長ポリペプチド部分中の反復ユニットの数に加えて、融合タンパク質内のポリペプチド部分の位置もサイズ増大に影響し得る。例えば、半減期延長ポリペプチド部分のN末端またはC末端の位置は、生物学的に活性なポリペプチド(例えば、表面ループを形成する)のアミノ酸配列内のインサートとして配置された半減期延長部分に比べて、より大きな流体力学半径を与えることが予測される。
さらに、半減期延長部分のアンフォールド構造は、そのままで大きな流体力学半径を与えるのみではなく、反復ユニットの多くのアミノ酸の親水性特性のために、水分子の半減期延長ポリペプチド部分へ結合して、流体力学半径をさらに増大させることにより、サイズ増大にも寄与し得る。
最後に、下記の実施例4で示すように、いくつかの反復ユニットのグリコシル化が、より大きなサイズにさらに寄与し得る。17反復ユニットの半減期延長ポリペプチド部分が、グリコシル化のない反復ユニットの同じ配列に比べて、さらに、60〜70kDaの見かけのサイズを示すことを見出した。
図3は、本発明の種々の実施形態による反復ユニットの数と、溶液中の見かけのサイズとの間の関係を示す。本明細書の以降の実施例中に記載されるこれらの実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドが種々の長さの半減期延長ポリペプチド部分に融合された(異なる数のユニット:それぞれ、17、34、および51)。発明者らは、溶液中のサイズと、反復ユニットの数との間の相関は、調査した領域では、直線であることを見出した。1つのユニットの溶液中のサイズは、9kDaの分子量を有する球状タンパク質に相当することも明らかになった。従って、一定数のユニットの付加により達成されるサイズ増大を予測できる。例えば、80反復ユニットを有するポリペプチド部分は、約720kDaの分子量の球状タンパク質に相当する溶液中の見かけのサイズを有する。さらに、融合タンパク質の終末相半減期が溶液中の見かけのサイズに対してプロットされている図5a〜cに示すように、直線関係はまた、融合タンパク質の薬物動態学的特性に変換されることが明らかになった(実施例8参照)。これらの洞察は、ポリペプチド部分が、所望のインビボ半減期を与えるようにデザインされた、本明細書に記載の半減期延長ポリペプチド部分と融合することにより、生物製剤の薬物動態学的特性、特に半減期および平均滞留時間の微調整に使用することができる。各生物学的に活性なポリペプチドに対して、反復ユニットの数に換算した半減期延長ポリペプチドのサイズを、生物学的に活性なポリペプチドそのままのサイズおよび半減期、投与経路、投与量および所望の投与間隔に関して選択し得る;それにもかかわらず、サイズ(図5a、5b)と、ユニットの数(図5c)との間の直線関係は、目的の特定の融合タンパク質のための所望の半減期延長ポリペプチドの合理的なデザインを可能にする。
特に、腎クリアランスに対するサイズ限界(非荷電球状タンパク質で約60kDa)を超えても、融合タンパク質の溶液中の見かけのサイズの増加は、依然として、生物学的半減期の増加に寄与するという点で、有用であり得る(実施例8参照)。しかし、そのままで既に60kDaの溶液中の見かけのサイズを有する生物学的に活性なポリペプチドに対しては、融合タンパク質が生物学的に活性なポリペプチド単独のサイズの少なくとも2倍の見かけのサイズを有するように、見かけのサイズを少なくとも2倍だけ増加することが望ましい場合があり得る。
市場承認治療薬に対しては、正確な特性評価が必要な規制要件であり、グリコシル化タンパク質に対しては、任意のグリカンの正確な位置を知る必要がある。本発明の半減期延長ポリペプチド部分の各ユニットが、最大で1つのO−グリコシル化部位を有するという事実は、哺乳動物系中で発現した融合タンパク質の特性評価を容易にし得る。
本発明による半減期延長ポリペプチドの特性評価のために好適するプロテアーゼは、酸性の残基:グルタミン酸(Glu、E)およびアスパラギン酸(Asp、D)の後ろで切断するペプシンである。しかし、ペプシンは通常、グリカンのプロテアーゼとの立体障害のために、グリコシル化された残基の近位で切断しないので、O−グリコシル化を有する反復ユニットは、非グリコシル化されたユニットと比べて、異なる切断パターンを有することになる。この知識に基づいて、また、限られたおよび比較的予測可能なグリコシル化パターンを考慮して、クロマトグラフ法および質量分析法などの確立された方法を用いた、存在する融合タンパク質の特性評価は、大量にまたは未知の程度にグリコシル化される可能性のある半減期延長部分に比べて、大きく単純化され、本発明の融合タンパク質の哺乳動物系中での発現をさらに現実的に実現可能にする。
半減期延長ポリペプチド部分のグリコシル化の別の潜在的利点は、グリコシル化が融合タンパク質に対する免疫寛容を高める手段を提供し得ることである。α2,6−結合末端シアル酸で終わるO−グリカンは、CD22またはシグレック−10に結合でき、これは、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン(シグレック)ファミリーの2つの抑制性受容体である。これらの受容体は、B細胞受容体(BCR)からのシグナルを減衰させることにより作用し、これは、融合タンパク質に対するB細胞寛容の発生をもたらし得る。ヒトタンパク質のグリカンは、α2,6−およびα2,3−結合末端シアル酸の両方を有する。ヒト起源の細胞中で発現された融合タンパク質中のα2,6−結合末端シアル酸のシアル酸含量を増やすために、目的の融合タンパク質は、α2,6−シアル酸転移酵素と共発現され得る。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で産生された融合タンパク質は、α2,6−シアル酸転移酵素発現の非存在のために、α2,3−結合のみを有する。CHO細胞中で産生された融合タンパク質のO−グリカン中でα2,6−結合末端シアル酸を導入するために、目的の融合タンパク質は、α2,6−シアル酸転移酵素と共発現され得る。
図2に関して上記に示したように、融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチドを、本明細書に記載の1つまたは複数の半減期延長ポリペプチド部分に結合したリンカー、通常はペプチドリンカーを含み得る。従って、本発明の実施形態では、融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチドのアミノ酸配列と、半減期延長ポリペプチド部分のアミノ酸配列との間に配置されたペプチドリンカーをさらに含む。例えば、ペプチドリンカーは、−GS−および−(G4S)n−から選択してよく、ここで、nは、1〜5の整数であり、通常、1〜3、または2〜3である。リンカーの使用は、それが、ネオエピトープの発生を低減し得る、またはnが少なくとも2の場合には、ネオエピトープの形成およびその後のこのようなネオエピトープの免疫系の抗原提示細胞による結合を防ぐという点で好都合であり得る。
本明細書で記載の融合タンパク質は、哺乳動物などの原核生物または真核生物発現系を用いて、当業者に既知の従来の方法を使って、組換え技術により作製できる。下記の実施例2は、半減期延長ポリペプチド部分が生物学的に活性なポリペプチドに融合される、融合タンパク質のクローニングおよび作製について記載する。本発明は、実施例2の株および細胞型の使用に全く限定されるものではなく、むしろ、融合タンパク質の作製のための好適な細胞株は、当業者に既知であり、例には、大腸菌、ピキアパストリス、出芽酵母、藻類、蘚類細胞、ニンジン細胞などの植物細胞、およびCHO、HEK−293、およびHT1080などの哺乳動物細胞が挙げられることに留意されたい。
半減期延長ポリペプチド部分をコードするDNA構築物のデザインに関しては、異なる、または全てのコドンバリアントを含むことによる、コードされる各アミノ酸に対する遺伝子コードの重複性を利用する合成遺伝子の使用は有利であり得る。より可変性のDNA配列の使用は、核酸成分の特性評価を容易にし得る。理由は、高度に反復性の配列の特性解析は、問題がある場合があるためである。
本発明による融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチド単独のサイズに比較して、溶液中で増大した流体力学半径および見かけのサイズを有する。サイズ増大により低減した腎クリアランスの少なくとも一部の結果として、融合タンパク質の薬物動態学的特性が変化する。下記の実施例8〜10および15で示されるように、最も顕著には、生物学的半減期が延長される。これらの実施例はまた、半減期延長ポリペプチド部分の半減期延長効果は、その部分の長さ(ユニットの数、特に図5cを参照)の関数であることも示す。
好ましくは、半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的半減期を、少なくとも1つの種、通常ヒトで、少なくとも1.5倍延長する。換言すれば、融合タンパク質は、好ましくは、生物学的に活性なポリペプチド単独の場合の少なくとも1.5倍の生物学的半減期を有する。例えば、融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的半減期を、少なくとも1.8倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、および最大で500倍未満、例えば、60倍、延長し得る。例えば、1時間未満の生物学的半減期を有する生物学的に活性なポリペプチドに対し、生物学的半減期を、最大で500倍延長し得、一方、1時間以上の生物学的半減期を有する生物学的に活性なポリペプチドに対しては、生物学的半減期が最大で60倍まで延長される場合、それで十分であり得る。
薬物動態学的観点から、生物学的半減期を可能な限り延長するのが望ましい場合もあり得る。しかし、半減期延長効果は、半減期延長部分のサイズに比例することが示され、非常に大きな半減期延長ポリペプチド部分は、作製の実現性または生物学的に活性なポリペプチドの生物活性の障害などの種々の理由から望ましくなく、所与の生物学的に活性なポリペプチドの半減期延長は、その他の要件に対してバランスを取る必要性があり得、従って、最適条件半減期延長は、本発明により達成され得る理論的最大半減期延長より少ない場合があり得る。例えば、わずか3つ以下のそれぞれ80ユニット半減期延長ポリペプチド部分(すなわち、3つの部分に分配される合計240ユニット)またはわずか2つ以下のそれぞれ80ユニットの半減期延長ポリペプチド部分(すなわち、2つの部分に分配される合計160ユニット)を使用するのが望ましい場合がある。別の想定できる半減期延長ポリペプチド部分に対する上限値は、それぞれ68ユニットの2つの部分(例えば、1つはN末端に、残りはC末端に)であり得る。
さらに、半減期延長ポリペプチド部分は、融合タンパク質に対し増大した溶解度を与え得る。特に、半減期延長ポリペプチド部分の親水性は、それが、生物学的に活性なポリペプチド単独のバイオアベイラビリティに比べて、皮下に投与される融合タンパク質のバイオアベイラビリティを高め得るという点で有益であり得る。このような場合には、融合タンパク質の増大した溶解度により、注射後、組織細胞外マトリックス中に残るのではなく、血流への移行が促進され得る。これは、こうならない場合には、限られたバイオアベイラビリティのために、静脈内投与が必要であるいくつかの生物学的に活性なポリペプチドにとって、生物学的に活性なポリペプチドが本明細書に記載の半減期延長ポリペプチド部分に融合される場合に、皮下投与が現実的な選択肢となり得ることを意味し得る。
従って、本発明で使用される半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的半減期の延長の手段としておよびこれ以外の薬物動態学的特性を適応させる手段として使用され得る。
本発明の融合タンパク質は、状態、障害または疾患の治療および/または予防に使用するための医薬組成物として処方され得る。本明細書で使用される場合、用語の「組成物」は、固体および液体形態を包含すると理解されたい。組成物は、好ましくは、患者(例えば、哺乳動物)への、例えば、注射または経口による投与に好適する医薬組成物であり得る。医薬組成物は通常、本発明による融合タンパク質および少なくとも1種の薬学的に許容可能な担体または置換基を含む。医薬組成物は、例えば、塩、pH調節剤、油、保存剤、浸透圧的に活性な薬剤のいずれか1種、およびこれらの任意の組み合わせを含み得る。
医薬組成物は、静脈内、皮下、経鼻、経口、および局所投与を含む任意の投与経路用として処方され得る。例えば、組成物は、静脈内または皮下投与用として処方し得る。
治療される状態、障害または疾患は、半減期延長ポリペプチドにより制限されるものではなく、むしろ、特定の状態、障害または疾患の治療用の融合タンパク質の適合性は、既存のバイオ医薬品であってもよい生物学的に活性なポリペプチドによってのみ決定され得る。本明細書で記載の半減期延長ポリペプチド部分との融合から恩恵を受け得る好適な生物学的に活性なポリペプチドの例には、サイトカイン、酵素、リガンド、結合剤、および抗体フラグメントが挙げられる。
本発明の融合タンパク質は、状態、障害または疾患の治療方法で使用され得、該方法は、前記状態、障害または疾患を罹患している患者に、前記状態、障害または疾患の治療に有用な、本明細書に記載の半減期延長ポリペプチド部分に融合された生物学的に活性なポリペプチドを含む融合タンパク質を投与するステップを含む。患者は通常、ヒトなどの哺乳動物である。この方法では、生物学的に活性なポリペプチド単独の投与を含む治療計画に比べて、より少ない頻度で投与を行い得る。例えば、生物学的に活性なポリペプチドのアナキンラ(Met−huIL−1Ra)を含むKineret(登録商標)は通常、皮下注射により毎日投与される。しかし、IL−1Raおよび本明細書に記載の半減期延長ポリペプチド部分の融合タンパク質は、生物学的半減期を少なくとも2倍増大させ得、それにより、融合タンパク質は1日おきに投与し得、または少なくとも3倍、または少なくとも7倍増大させ得、それにより、融合タンパク質は週2回またはさらに週1回投与になり得る。成長ホルモンなどのいくつかの生物学的に活性なポリペプチドに対しては、各投与間の期間をさらに延長するのが望ましい場合があり、例えば、月1回の投与が想定される。
以下の実施例により、本発明をさらに説明する。
実施例
実施例1:ヒト起源の反復ユニットの特定
米国国立衛生研究所(NIH)の非冗長性タンパク質配列データベースに対し、胆汁酸塩刺激リパーゼ(BSSL)の触媒ドメインでblast検索を実施し、10種の報告されたC末端反復不定形ドメインの全体または一部を含むヒト起源のタンパク質のタンパク質配列を特定した。
実施例1:ヒト起源の反復ユニットの特定
米国国立衛生研究所(NIH)の非冗長性タンパク質配列データベースに対し、胆汁酸塩刺激リパーゼ(BSSL)の触媒ドメインでblast検索を実施し、10種の報告されたC末端反復不定形ドメインの全体または一部を含むヒト起源のタンパク質のタンパク質配列を特定した。
材料および方法
NIHにあるblastを用いて、ユニプロットID P19835(受入番号 CEL_HUMAN)の胆汁酸塩刺激リパーゼの触媒ドメインに一致するヒト起源タンパク質を検索した。
NIHにあるblastを用いて、ユニプロットID P19835(受入番号 CEL_HUMAN)の胆汁酸塩刺激リパーゼの触媒ドメインに一致するヒト起源タンパク質を検索した。
結果
BLAST検索により、触媒ドメインの重要な部分およびC末端反復不定形ドメインの両方を含む10エントリー結果を得た。ドメイン中の反復ユニットの数は異なり、反復ユニットの配列間のある程度の変動が確認された。異なるヒットについては、表1を参照されたい。各反復ドメインは、9残基の短縮された配列により開始され、最も多い反復ユニットは11残基の長さである。下表では、反復ユニットは、分かりやすくするために、「〜」記号により分離されている。不定形ドメインの最終配列ストレッチは、反復ユニットと配列類似性を共有せず、表1で下線処理されている。同封の配列表では、反復部分(すなわち、下線を引いた疎水性のモチーフを除いて)は、配列番号12〜21で表されている。
BLAST検索により、触媒ドメインの重要な部分およびC末端反復不定形ドメインの両方を含む10エントリー結果を得た。ドメイン中の反復ユニットの数は異なり、反復ユニットの配列間のある程度の変動が確認された。異なるヒットについては、表1を参照されたい。各反復ドメインは、9残基の短縮された配列により開始され、最も多い反復ユニットは11残基の長さである。下表では、反復ユニットは、分かりやすくするために、「〜」記号により分離されている。不定形ドメインの最終配列ストレッチは、反復ユニットと配列類似性を共有せず、表1で下線処理されている。同封の配列表では、反復部分(すなわち、下線を引いた疎水性のモチーフを除いて)は、配列番号12〜21で表されている。
下表2は、同封配列表中の配列識別番号を基準にして、ヒト起源の反復ユニットのユニーク配列を記載する。第1の配列の非存在残基はダッシュで標識されている。O−グリコシル化の可能性のある部位は、下線を引いている。
従って、ヒト集団中には、種々の長さのC末端ドメインが存在する。さらに、反復ユニットの順番は、ヒト集団では変えることができる。これは、反復ユニットの順番および全体ドメインモチーフの長さの変化が許容されることを意味するのであろう。各ユニットは、O−グリコシル化され得る1つの部位を有する。
最も多いヒト型は、次の反復ユニット配列の組み合わせから構成される:
[配列番号2]−[配列番号3]−[配列番号4]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号6]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号7]−[配列番号5]−[配列番号8]−[配列番号9]。
[配列番号2]−[配列番号3]−[配列番号4]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号6]−[配列番号5]−[配列番号5]−[配列番号7]−[配列番号5]−[配列番号8]−[配列番号9]。
言い方を変えれば:
[配列番号2]−[配列番号3]−[配列番号4]−[配列番号5]x8−[配列番号6]−[配列番号5]x2−[配列番号7]−[配列番号5]−[配列番号8]−[配列番号9]。
[配列番号2]−[配列番号3]−[配列番号4]−[配列番号5]x8−[配列番号6]−[配列番号5]x2−[配列番号7]−[配列番号5]−[配列番号8]−[配列番号9]。
実施例2:融合タンパク質のクローニングおよび作製
本実施例は、以降の実施例で使用される、異なるフォーマットの融合タンパク質のクローニングおよび作製のための一般的戦略を記載する。
本実施例は、以降の実施例で使用される、異なるフォーマットの融合タンパク質のクローニングおよび作製のための一般的戦略を記載する。
材料および方法
DNA構築物:半減期延長ポリペプチドを含む一連の融合タンパク質をコードするDNA配列(下表3参照)を、大腸菌中での発現またはヒト(Expi293)細胞中での発現のために、コドン最適化し、Thermo Fisher ScientificでのInvitrogen GeneArt Gene Synthesisサービスにより合成した。遺伝子は、その後の大腸菌またはExpi293細胞中での発現のために、発現ベクター中でクローン化された。
DNA構築物:半減期延長ポリペプチドを含む一連の融合タンパク質をコードするDNA配列(下表3参照)を、大腸菌中での発現またはヒト(Expi293)細胞中での発現のために、コドン最適化し、Thermo Fisher ScientificでのInvitrogen GeneArt Gene Synthesisサービスにより合成した。遺伝子は、その後の大腸菌またはExpi293細胞中での発現のために、発現ベクター中でクローン化された。
培養および精製:組換え融合タンパク質をコードする遺伝子フラグメントを含む発現ベクターで大腸菌細胞を形質転換した後、流加バッチ技術を用いてバイオリアクター中で、または振盪フラスコ中で培養し、続けて、タンパク質発現および遠心分離による細胞の採取を行った。細胞ペレットを−20℃で貯蔵するか、または浸透圧ショックに直接供し、放出されたタンパク質を遠心分離により清澄化し、−20℃で貯蔵した。Expi293発現系(Thermo Fisher Scientific)を用いて、基本的に製造業者のプロトコルに従って、組換え融合タンパク質の発現を同様に実施した。発現ベクターの遺伝子導入の6日後、上清を遠心分離により採取し、−70℃で貯蔵した。表4にコード化タンパク質配列を示す。
凍結大腸菌細胞ペレットを再懸濁した後、超音波処理により粉砕し、その後、細胞デブリを遠心分離と、その後の濾過(0.22μm)により除去した。Expi293培養物由来の浸透圧ショック試料および上清を解凍し、濾過した(0.22μm)後、精製した。組換え融合タンパク質を含む各上清を、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーなどの従来のクロマトグラフィー法を用いて精製した。動物試験に使用するための組換え融合タンパク質も、Detoxi−Gel Endotoxin Removing Columns(Pierce、カタログ番号20344)を用いて、エンドトキシン除去精製に供した。精製した融合タンパク質をPBSに緩衝液交換し、別に定める場合を除き、PBSをその後の実験の処方緩衝液としても使用した。融合タンパク質の純度をクーマシーブルーで染色してSDS−PAGEにより分析し、各タンパク質の分子量を質量分析法(HPLC/MSまたはMALDI−TOF/MS)により分析した。
結果
全ての融合タンパク質は、大腸菌またはExpi293細胞中で可溶性タンパク質として発現された。図4は、51および68反復ユニット含有Met−huIL−1Raの大腸菌中の発現結果を示す。レーンI:SeeBlue Plus 2マーカー,10ul。レーンII:M−IL1RA 51反復ユニット、採取細胞、Bugbuster/rLysozyme/Bensonase処理、7ul。レーンIII:M−IL1RA 51反復ユニット、浸透圧ショック物質、1.5ul。レーンIV:M−IL1RA 51反復ユニット、浸透圧ショック物質、3ul。レーンV:M−IL1RA 68反復ユニット、採取細胞、Bugbuster/rLysozyme/Bensonase処理、7ul。レーンVI:M−Il1RA 68反復ユニット、浸透圧ショック物質、1.5ul。レーンVII:M−IL1RA 68反復ユニット、浸透圧ショック物質、3ul。融合タンパク質の位置は、2つの短い線で標識されている。
全ての融合タンパク質は、大腸菌またはExpi293細胞中で可溶性タンパク質として発現された。図4は、51および68反復ユニット含有Met−huIL−1Raの大腸菌中の発現結果を示す。レーンI:SeeBlue Plus 2マーカー,10ul。レーンII:M−IL1RA 51反復ユニット、採取細胞、Bugbuster/rLysozyme/Bensonase処理、7ul。レーンIII:M−IL1RA 51反復ユニット、浸透圧ショック物質、1.5ul。レーンIV:M−IL1RA 51反復ユニット、浸透圧ショック物質、3ul。レーンV:M−IL1RA 68反復ユニット、採取細胞、Bugbuster/rLysozyme/Bensonase処理、7ul。レーンVI:M−Il1RA 68反復ユニット、浸透圧ショック物質、1.5ul。レーンVII:M−IL1RA 68反復ユニット、浸透圧ショック物質、3ul。融合タンパク質の位置は、2つの短い線で標識されている。
結論
合成遺伝子を構築し、続けて大腸菌または哺乳動物系中で発現させ、従来技術を使用して高純度に精製することにより、種々の長さの半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質を作製できる。
合成遺伝子を構築し、続けて大腸菌または哺乳動物系中で発現させ、従来技術を使用して高純度に精製することにより、種々の長さの半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質を作製できる。
実施例3:融合タンパク質の化学合成
この実施例は、以降の実施例でさらに使用される、化学合成による異なるフォーマットのポリペプチドを作製するための一般的戦略を説明する。
この実施例は、以降の実施例でさらに使用される、化学合成による異なるフォーマットのポリペプチドを作製するための一般的戦略を説明する。
材料および方法
化学合成バージョンのGLP−1(7−37)(Bachem AG,catalogue number H5102)、GLP−2(1−33)(Bachem AG,catalogue number H−7742)、GLP−1(7−37)−半減期延長ポリペプチド(各11残基の2ユニット)、GLP−2(1−33)−半減期延長ポリペプチド(1ユニット)、GLP−2(1−33)−半減期延長ポリペプチド(2ユニット)をBACHEM AGに注文した。凍結乾燥タンパク質を25mMのNaPおよび125mMのNaClを含む緩衝液中に10mg/mLの目標濃度で溶解した。C5結合化合物PSI0400およびそのペグ化バージョンPSI0489もBACHEM AGに注文し、PSI0489を上述の緩衝液に35mg/mlの濃度で溶解し、PSI0400を29mg/mlの濃度で溶解した。タンパク質の詳細は、表5にまとめられている。
化学合成バージョンのGLP−1(7−37)(Bachem AG,catalogue number H5102)、GLP−2(1−33)(Bachem AG,catalogue number H−7742)、GLP−1(7−37)−半減期延長ポリペプチド(各11残基の2ユニット)、GLP−2(1−33)−半減期延長ポリペプチド(1ユニット)、GLP−2(1−33)−半減期延長ポリペプチド(2ユニット)をBACHEM AGに注文した。凍結乾燥タンパク質を25mMのNaPおよび125mMのNaClを含む緩衝液中に10mg/mLの目標濃度で溶解した。C5結合化合物PSI0400およびそのペグ化バージョンPSI0489もBACHEM AGに注文し、PSI0489を上述の緩衝液に35mg/mlの濃度で溶解し、PSI0400を29mg/mlの濃度で溶解した。タンパク質の詳細は、表5にまとめられている。
化学的に合成したタンパク質の完全性および素性を質量分析法(HPLC/MSまたはMALDI−TOF/MS)を用いて確認した。
結果
半減期延長ポリペプチドを含む化学的に合成したタンパク質は、全ての所望の濃度で溶解可能であり、一方、GLP−1は、10mg/mLで少々の沈殿を示し、GLP−2は、半分の濃度の5mg/mLのみで溶解可能であった。これは、半減期延長ポリペプチド反復ユニットの親水性および反復ユニットの配列をそれらに融合することによりタンパク質溶解度を増大させることの有用性を示した。PSI0400およびPSI0489は、両方とも、20mg/mlを超える濃度で容易に溶解し得た。各バリアントの正確な素性および分子量を質量分析により確認した。
半減期延長ポリペプチドを含む化学的に合成したタンパク質は、全ての所望の濃度で溶解可能であり、一方、GLP−1は、10mg/mLで少々の沈殿を示し、GLP−2は、半分の濃度の5mg/mLのみで溶解可能であった。これは、半減期延長ポリペプチド反復ユニットの親水性および反復ユニットの配列をそれらに融合することによりタンパク質溶解度を増大させることの有用性を示した。PSI0400およびPSI0489は、両方とも、20mg/mlを超える濃度で容易に溶解し得た。各バリアントの正確な素性および分子量を質量分析により確認した。
結論
ペプチドおよび半減期延長ポリペプチドの融合は、化学合成により行うことができる。半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質は、より高い濃度の溶液を生成可能であることにより明白なように増大した溶解度を示す。
ペプチドおよび半減期延長ポリペプチドの融合は、化学合成により行うことができる。半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質は、より高い濃度の溶液を生成可能であることにより明白なように増大した溶解度を示す。
実施例4:融合タンパク質の生物物理学的特性評価
この実施例は、溶液中の見かけのサイズおよび分子量などの生物物理学的特性およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)ならびにカラム較正および多角度光散乱検出器(MALS)による溶液中の流体力学半径の測定に関して、非融合タンパク質またはペプチドならびにペグ化タンパク質を基準として用いて、半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質の特性評価について記載する。
この実施例は、溶液中の見かけのサイズおよび分子量などの生物物理学的特性およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)ならびにカラム較正および多角度光散乱検出器(MALS)による溶液中の流体力学半径の測定に関して、非融合タンパク質またはペプチドならびにペグ化タンパク質を基準として用いて、半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質の特性評価について記載する。
材料および方法
融合タンパク質、非融合タンパク質およびペグ化タンパク質の溶液中のサイズを、AKTA Micro(GE Healthcare Life Sciences)で、較正カラムSuperdex200 Increase 3.2/300(GE Healthcare Life Sciences)を用いて、分析用ゲル濾過により評価した。カラムを、6〜669kDaのサイズ範囲の8つの球状タンパク質およびブルーデキストラン2000を含む、Gel Filtration Calibration Kit LMW(コード番号28−4038−41、GE Healthcare Life Sciences)およびCalibration Kit LMW(コード番号28−4038−42、GE Healthcare Life Sciences)で、25mMのNaPおよび125mMのNaClのランニングバッファーpH7.0を用いて、75μl/分の流量、25℃の温度で較正した。溶液中の対応するサイズおよび流体力学半径は、較正カラム上のタンパク質の溶出体積から、Handbook of Size Exclusion Chromatography Principles and Methods(注文番号18−1022−18、GE Healthcare Life Sciences)の補足資料10に記載の方法により、計算できる。
融合タンパク質、非融合タンパク質およびペグ化タンパク質の溶液中のサイズを、AKTA Micro(GE Healthcare Life Sciences)で、較正カラムSuperdex200 Increase 3.2/300(GE Healthcare Life Sciences)を用いて、分析用ゲル濾過により評価した。カラムを、6〜669kDaのサイズ範囲の8つの球状タンパク質およびブルーデキストラン2000を含む、Gel Filtration Calibration Kit LMW(コード番号28−4038−41、GE Healthcare Life Sciences)およびCalibration Kit LMW(コード番号28−4038−42、GE Healthcare Life Sciences)で、25mMのNaPおよび125mMのNaClのランニングバッファーpH7.0を用いて、75μl/分の流量、25℃の温度で較正した。溶液中の対応するサイズおよび流体力学半径は、較正カラム上のタンパク質の溶出体積から、Handbook of Size Exclusion Chromatography Principles and Methods(注文番号18−1022−18、GE Healthcare Life Sciences)の補足資料10に記載の方法により、計算できる。
目的のタンパク質を較正中と同じ条件下で分析した。タンパク質の分子量は、AdvanceBio SEC 300A 2.7um 7.8x300mmカラム(Agilent部品番号:PL1180−5301、Agilent Technologies)を用いて、Agilent 1100 HPLC(Agilent Technologies)に連結されたMALS−RIシステム:静的光散乱検出器DAWN HELEOS 8+および示差屈折計Optilab T−rEX、およびAstra 6ソフトウェア(Wyatt Technology Europe,Germany)により決定した。カラム温度は30℃で、ランニングバッファーは、PBS pH7.0で流量0.7mL/分であった。
さらに、図3aおよび図3bは、異なる分子の、サイズと、半減期延長部分中のユニットの数との間の関係を示し:ダイヤモンドは、Met−huIL−1Ra(値「0」は、半減期延長ポリペプチド部分の非存在を表す)および単一のIL−1Raと半減期延長ポリペプチド部分の融合体の半径を示し、正方形は、PSI0400およびそれと半減期延長ポリペプチド部分との融合体の半径を示し、三角形は、GLP−1およびそれと半減期延長ポリペプチド部分との融合体の半径を示し、およびx印は、GLP−2およびそれと半減期延長ポリペプチド部分との融合体の半径を示す。
図3aは、見掛けの分子量、すなわち、半減期延長ポリペプチド部分のユニットの数の関数として、溶出体積(SEC)により決定された溶液中の見かけのサイズ(グラフ中では単に「MW」と表記)を示す。図3bは、図3aと同じ試料の半減期延長ポリペプチド部分のユニットの数の関数として、流体力学半径を示す。
結論
溶液中の半減期延長ポリペプチド融合の長さとサイズの相関を観察した:11残基のそれぞれのユニットは、平均1kDaの実際の分子量を有し、そのアンフォールド特性のために、溶液中のMW 9kDaの球状タンパク質のサイズに相当する。
溶液中の半減期延長ポリペプチド融合の長さとサイズの相関を観察した:11残基のそれぞれのユニットは、平均1kDaの実際の分子量を有し、そのアンフォールド特性のために、溶液中のMW 9kDaの球状タンパク質のサイズに相当する。
補足すると、アルブミンの流体力学半径またはストークス半径は、3.8nmであり、これは、アルブミンがそのままで腎クリアランスの限界サイズを超えるという事実を考慮すると、腎クリアランスを回避するために必要な最小限のサイズのマーカーとして機能し得る。
同じアミノ酸配列を有する非グリコシル化PSI0540:BB1595と比較して、グリコシル化されたPSI0540:BB1596の増大したサイズにより明らかなように、融合タンパク質が哺乳動物系で受けるグリコシル化は、融合タンパク質のサイズをさらに増大させる。
実施例5:細胞ベースアッセイを用いたインビトロ薬理活性分析。
正常なヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)は、IL−6の産生によりIL−1βに応答し、これは、インビトロでの阻害調査に活用できる特徴である。この実験では、IL−1Raと半減期延長ポリペプチドとの組換え融合タンパク質のIL−1βの阻止能力をNHDFアッセイにより試験した。
正常なヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)は、IL−6の産生によりIL−1βに応答し、これは、インビトロでの阻害調査に活用できる特徴である。この実験では、IL−1Raと半減期延長ポリペプチドとの組換え融合タンパク質のIL−1βの阻止能力をNHDFアッセイにより試験した。
材料および方法
細胞を3日間播種後、タンパク質で処理した。タンパク質(本発明の実施形態による組換えIL−1Ra融合タンパク質、ペグ化Met−huIL−1Raまたはアナキンラ/Met−huIL−1Ra)を100nMの開始濃度に希釈し、その後、1:4の系列希釈を9回行い、9uMの組換えヒト血清アルブミン(rHSA)の存在下の無血清増殖培地中で100nM〜0.38pMの濃度範囲を得た。半減期延長ポリペプチドを有する組換えIL−1Ra融合タンパク質およびMet−huIL−1Raを、3.4pMの誘導投与量のIL−1βの存在下で試験し、細胞を37℃でタンパク質と共に22時間インキュベートし、その後、培地を回収した。回収した培地を41倍に希釈した後、IL−6含量をヒトIL−6 ELISAキット(R&D Systems)を用いて、製造業者の推奨条件に従って分析した。データを、XLfitを用いて分析し、IC50値を濃度反応曲線から計算した。
細胞を3日間播種後、タンパク質で処理した。タンパク質(本発明の実施形態による組換えIL−1Ra融合タンパク質、ペグ化Met−huIL−1Raまたはアナキンラ/Met−huIL−1Ra)を100nMの開始濃度に希釈し、その後、1:4の系列希釈を9回行い、9uMの組換えヒト血清アルブミン(rHSA)の存在下の無血清増殖培地中で100nM〜0.38pMの濃度範囲を得た。半減期延長ポリペプチドを有する組換えIL−1Ra融合タンパク質およびMet−huIL−1Raを、3.4pMの誘導投与量のIL−1βの存在下で試験し、細胞を37℃でタンパク質と共に22時間インキュベートし、その後、培地を回収した。回収した培地を41倍に希釈した後、IL−6含量をヒトIL−6 ELISAキット(R&D Systems)を用いて、製造業者の推奨条件に従って分析した。データを、XLfitを用いて分析し、IC50値を濃度反応曲線から計算した。
結果
NHDF細胞からのIL−1β誘導IL−6放出は、IL−1Ra融合タンパク質、ペグ化Met−huIL−1Raにより、ならびにアナキンラ/Met−huIL−1Raにより濃度依存的に低減した。実験により得られたデータを表9に示す。
NHDF細胞からのIL−1β誘導IL−6放出は、IL−1Ra融合タンパク質、ペグ化Met−huIL−1Raにより、ならびにアナキンラ/Met−huIL−1Raにより濃度依存的に低減した。実験により得られたデータを表9に示す。
結果は、IL−1βによる誘導されたサイトカイン分泌応答は、半減期延長ポリペプチドを有する組換えIL−1Ra融合体のアンタゴニスト効果により濃度依存的に低減し、NHDFからの低減したIL−6放出をもたらすことを示した。
結論
半減期延長ポリペプチドへの融合は、IL−1Raの活性をサイズ依存的に低減させたが、生物学的機能を消滅させることはなかった。
半減期延長ポリペプチドへの融合は、IL−1Raの活性をサイズ依存的に低減させたが、生物学的機能を消滅させることはなかった。
実施例6:C5欠乏血清における溶血性活性の阻害
古典的な補体経路機能およびPSI0493(配列番号37)、PSI0489([配列番号51]−PEG30K)、およびPSI0400(配列番号50)によるそれの阻害の調査のために、ヒツジ赤血球を、オルシーバー液(Swedish National Veterinary Institute)中で新しいヒツジ全血から作製し、その後ウサギ抗ヒツジ赤血球抗血清(Sigma)で処理して抗体感作ヒツジ赤血球(EA)とした。全工程を無菌条件下で行った。その他の全ての試薬は市販品入手源から購入した。
古典的な補体経路機能およびPSI0493(配列番号37)、PSI0489([配列番号51]−PEG30K)、およびPSI0400(配列番号50)によるそれの阻害の調査のために、ヒツジ赤血球を、オルシーバー液(Swedish National Veterinary Institute)中で新しいヒツジ全血から作製し、その後ウサギ抗ヒツジ赤血球抗血清(Sigma)で処理して抗体感作ヒツジ赤血球(EA)とした。全工程を無菌条件下で行った。その他の全ての試薬は市販品入手源から購入した。
インビトロアッセイを、96ウェルU型マイクロタイタープレート中で、試験タンパク質、補体血清およびEA懸濁剤を順次添加して実施した。pH7.3〜7.4でのウェル当たり50μL中の総反応量中の全ての試薬の最終濃度は以下の通りであった:0.15mMのCaCl2;0.5mMのMgCl2;3mMのNaN3;138mMのNaCl;0.1%のゼラチン;1.8mMのナトリウムバルビタール;3.1mMのバルビツル酸;5百万のEA;好適希釈の補体タンパク質C5血清、および所望の濃度のC5結合ポリペプチド。
EA懸濁剤の添加による反応開始の前に、調査タンパク質を上記の補体血清と共に氷上で20分間プレインキュベートした。溶血反応を撹拌しながら37℃で45分間進行させた後、0.02%のツイーン20含有100μLの氷冷生理食塩水により終了させた。細胞を底部に遠心分離し、100μLの上清に相当する上部を、ハーフエリアの平底ウェルを有する透明マイクロプレートに移した。反応物結果を、マイクロタイタープレートリーダーを用いて415nmの波長での光学密度として分析した。
試験したC5結合ポリペプチドの阻害効力(IC50値)を、制御された濃度のC5枯渇血清に加えたヒトC5の存在下で、同じアッセイを適用することにより特定した。極めて効力の高い阻害剤(低ナノモル〜ナノモル以下)に対しては、反応混合物の最終C5濃度を0.1nMに制御した。結果を表10に示す。
結論
半減期延長ポリペプチドへの融合は、C5欠乏血清における溶血活性の阻害に影響を与えなかった。
半減期延長ポリペプチドへの融合は、C5欠乏血清における溶血活性の阻害に影響を与えなかった。
実施例7:ヒトC5への結合
材料および方法
ヒトC5に対するC5結合ポリペプチドの結合親和性をBiacore T200装置(GE Healthcare)を用いて分析した。アミン結合化学を用いて、製造業者のプロトコルに従って、ヒトC5(A403、Quidel Corporation)をCM5センサーチップ(900RU)に取り付けた。取付は、10mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH=5)(GE Healthcare)中の7.5μg/mLの濃度のhC5を注入することにより実施した。基準セルをヒトC5の注入を含まない同じ試薬で処理した。C5結合ポリペプチドの固定hC5に対する結合を、シングルサイクルカイネティクス(single cycle kinetics)法で調査した。この方法では、5種の濃度の試料、通常、HBS−EP緩衝液(10mMのHEPES pH7.4、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.005%のサーファクタントP20、GE Healthcare)中の、25、12.5、6.25、3.12および1.56nMの試料を、30μL/分の流量を用いて、注入間での再生なしで、同じサイクルを使用して、25℃の温度で、順次注入した。基準セルからのデータを差し引いて、バルク屈折率変化を補償した。ほとんどの場合、HBS−EPの注入も、センサーグラムが二重ブランクとなるように、対照として含めた。表面をHBS−EP緩衝液中で再生した。Biacore T200 Evaluation Softwareバージョン1.0のラングミュア1:1分析物モデルを用いて、反応速度定数をセンサーグラムから計算した。
材料および方法
ヒトC5に対するC5結合ポリペプチドの結合親和性をBiacore T200装置(GE Healthcare)を用いて分析した。アミン結合化学を用いて、製造業者のプロトコルに従って、ヒトC5(A403、Quidel Corporation)をCM5センサーチップ(900RU)に取り付けた。取付は、10mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH=5)(GE Healthcare)中の7.5μg/mLの濃度のhC5を注入することにより実施した。基準セルをヒトC5の注入を含まない同じ試薬で処理した。C5結合ポリペプチドの固定hC5に対する結合を、シングルサイクルカイネティクス(single cycle kinetics)法で調査した。この方法では、5種の濃度の試料、通常、HBS−EP緩衝液(10mMのHEPES pH7.4、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.005%のサーファクタントP20、GE Healthcare)中の、25、12.5、6.25、3.12および1.56nMの試料を、30μL/分の流量を用いて、注入間での再生なしで、同じサイクルを使用して、25℃の温度で、順次注入した。基準セルからのデータを差し引いて、バルク屈折率変化を補償した。ほとんどの場合、HBS−EPの注入も、センサーグラムが二重ブランクとなるように、対照として含めた。表面をHBS−EP緩衝液中で再生した。Biacore T200 Evaluation Softwareバージョン1.0のラングミュア1:1分析物モデルを用いて、反応速度定数をセンサーグラムから計算した。
結論
実施例6では、溶血活性の差異は観察されなかったが、この実験で、C5への結合は、Biacore装置で測定して、融合タンパク質によりわずかに影響されたペグ化分子は、結合親和性を溶血阻害に整合させることを示す。
実施例6では、溶血活性の差異は観察されなかったが、この実験で、C5への結合は、Biacore装置で測定して、融合タンパク質によりわずかに影響されたペグ化分子は、結合親和性を溶血阻害に整合させることを示す。
実施例8:インビボ薬物動態学
この実施例では、雄ラットでの単回投与調査により、IL−1Ra融合タンパク質PSI0540(配列番号38)、PSI0541(配列番号39)、PSI0542(配列番号40)、PSI0545(配列番号43)、PSI0547(配列番号45)およびPSI0551(配列番号49)の薬物動態学を評価した。
この実施例では、雄ラットでの単回投与調査により、IL−1Ra融合タンパク質PSI0540(配列番号38)、PSI0541(配列番号39)、PSI0542(配列番号40)、PSI0545(配列番号43)、PSI0547(配列番号45)およびPSI0551(配列番号49)の薬物動態学を評価した。
材料および方法
供試品:PSI0540、PSI0541、PSI0542、PSI0545、PSI0547およびPSI0551。6種全ての供試品を、25mMのリン酸ナトリウムおよび250mMの塩化ナトリウム、pH7.0中の溶液として構成した。
供試品:PSI0540、PSI0541、PSI0542、PSI0545、PSI0547およびPSI0551。6種全ての供試品を、25mMのリン酸ナトリウムおよび250mMの塩化ナトリウム、pH7.0中の溶液として構成した。
皮下投与は、5ml/kgの投与体積で頸部に注入された。静脈内投与は、2.5ml/kgの投与体積で外側(lateral)尾静脈に注入された。標準的バイアルを用いて、血清凝血活性化薬なしで血液試料を舌下神経叢から収集した。s.c.投与後、24mg/kgの投与レベルのPSI0545および30mg/kgの投与レベルのPSI0547を除いて、血清調製用の血液試料を、投与前、および投与の20分、および1、4、8、24、30、48、72および96時間後に収集した。前述のPSI0545およびPSI0547については、投与前、および投与の20分、および1、4、8、24、48、72、96および120時間後に収集した。静脈内投与後、12mg/kgの投与レベルのPSI0545および15mg/kgの投与レベルのPSI0547を除いて、血清調製用の血液試料を、投与前、ならびに投与の5および20分、および1、4、8、24、30、48および72時間後に収集した。前述のPSI0545およびPSI0547については、投与前、ならびに投与の5および20分、および1、4、8、24、48、72、および96時間後に収集した。
定量ELISA:ラット血清試料中の修飾アナキンラレベルの測定を酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により実施した。PBS(Medicago)中の0.25μg/mlの濃度のウェル当たり50μlのポリクローナルヤギ抗ヒトIL−1Ra抗体(AF280、R&D Systems)を、マイクロプレート(96ウェル高結合ハーフエリアプレート、Corning 3690)上に2時間コートした。非結合ポリクローナル抗体を、マイクロプレート洗浄機(MultiWash+、Molecular Devices)を用いて2x150μlのPBS−ツイーン(Medicago)で洗い流し、150μlのPBS中の1%Casein Blocker(Thermo Scientific)をウェルに室温で2時間加えた。
血清試料を0.5%カゼインおよび1%ラット正常血清を補充したPBS中の標準希釈に対して、100倍希釈からそれ以上の希釈で分析した。各構築物に対し、40ng/ml〜20pg/mlの2倍希釈系列により標準を作製した。最初に、血清試料を、0.5%カゼインを補充したPBS中で100倍希釈し、続けて、0.5%カゼインおよび1%ラット正常血清(Adlego)を補充したPBS中で系列希釈を行った。液体取り扱いロボット(Biomek 4000、Beckman Coulter)を用いて、ポリプロピレンプレート(Corning 3365)中で試料の1/5ステップの系列希釈を作製した。
2x150μlのPBS−ツイーンで非結合ブロッキングタンパク質を除去し、25μlの試料および標準をピペットでウェルに採取し、600rpmで振盪を加えながら、室温で1時間インキュベートし、続けて、+4℃で一晩インキュベートした。全ての非結合物質を3x150μlのPBS−ツイーンで洗い流した後、50μlの、ヒトIL−1Ra(BAF280、R&D Systems)特異的ビオチン結合ポリクローナル検出抗体をウェルに加え、室温で2時間インキュベートした。検出抗体を、0.5%カゼインを補充したPBS中で0.4μg/mlに希釈した。非結合検出抗体を、3x150μlのPBS−ツイーンで洗い流し、50μlのHRP標識ストレプトアビジン(MabTech)をウェルに加え、400rpmで振盪を加えながら、室温で1時間インキュベートした。SA−HRP複合体を、0.5%カゼインを補充したPBS中で1/10000に希釈した。3x150μlのPBS−ツイーンで洗浄して全ての非結合SA−HRP複合体を除去した後、50μlの基質溶液(Easy Blue Enhanced TMB Substrate、Medicago)をウェルに加え、結合アナキンラ構築物の量に比例して、発色した。25μlの2MのHClをウェルに加えることにより、約30分後に発色を停止させ、540nmをプレートバックグラウンドの基準波長として用いて、450nmで色の強度をマイクロプレートリーダー(SpectraMax i3、Molecular Devices)により測定した。
4パラメーターロジスティック関数(MSエクセル用のXLfitを使ったequation 200)で検量線を作製した。読み取り濃度に試料の希釈因子を乗じて、未希釈血清の濃度を得た。
薬物動態解析:薬物動態解析は、平均血清濃度vs各投与群由来の時間データをベースにした。観察した最大濃度(Cmax)および最大血清濃度までの時間(Tmax)を、生体分析濃度vs時間データから直接取得した。その他の薬物動態学的パラメーター:用量正規化Cmax(Cmax/投与量)、濃度vs時間曲線下面積(AUC)、クリアランス(CL)、皮下投与後の見かけのクリアランス(CL/F)、定常状態での見かけの分布容積(VSS)、平均滞留時間(MRT)および終末相半減期(t1/2z)は、Phoenix WinNonlinソフトウェアバージョン6.3(Pharsight Corp.,USA)を用いて、ノンコンパートメント解析により推定した。皮下バイオアベイラビリティ(F)の計算は、マイクロソフトエクセルを用いて実施した。
結果
ラット中の、PSI0540、PSI0541、PSI0542、PSI0545、PSI0547およびPSI0551の単回投与薬物動態学的パラメーター推定値は、表13および14に示されている。
PSI0551のクリアランスおよび他の薬物動態学的パラメーターは、生体分析異常により決定しなかった。その他の5種の供試品に対しては、静脈内投与後の結果は、クリアランス(ml/h・kg)が、PSI0547(配列番号45)(3.73)<PSI0545(配列番号43)(9.25)<PSI0542(配列番号40)(12.9)<PSI0540(配列番号38)(21.2)<PSI0541(配列番号39)(30.5)のランク順に増大することを示した。見かけの分布容積(VSS)は小さく、41.2ml/kg(PSI0547(配列番号45))および98.9ml/kg(PSI0541(配列番号39))であった。平均滞留時間(時間)、すなわち、CLに対するVSSの比、は、PSI0540(配列番号38)(3.03)≒PSI0541(配列番号39)(3.24)<PSI0545(配列番号43)(5.59)≒PSI0542(配列番号40)(6.72)<PSI0547(配列番号45)(11.0)のランク順に増大した。
ラット中の、PSI0540、PSI0541、PSI0542、PSI0545、PSI0547およびPSI0551の単回投与薬物動態学的パラメーター推定値は、表13および14に示されている。
PSI0551のクリアランスおよび他の薬物動態学的パラメーターは、生体分析異常により決定しなかった。その他の5種の供試品に対しては、静脈内投与後の結果は、クリアランス(ml/h・kg)が、PSI0547(配列番号45)(3.73)<PSI0545(配列番号43)(9.25)<PSI0542(配列番号40)(12.9)<PSI0540(配列番号38)(21.2)<PSI0541(配列番号39)(30.5)のランク順に増大することを示した。見かけの分布容積(VSS)は小さく、41.2ml/kg(PSI0547(配列番号45))および98.9ml/kg(PSI0541(配列番号39))であった。平均滞留時間(時間)、すなわち、CLに対するVSSの比、は、PSI0540(配列番号38)(3.03)≒PSI0541(配列番号39)(3.24)<PSI0545(配列番号43)(5.59)≒PSI0542(配列番号40)(6.72)<PSI0547(配列番号45)(11.0)のランク順に増大した。
皮下投与後の結果は、6種の供試品の内で、PSI0547が最低クリアランス、最高用量正規化Cmax、および最長平均滞留時間を示した。AUCに反比例するクリアランスCL/F(ml/h・kg)は、PSI0547(配列番号45)(12)<PSI0545(配列番号43)(34)<PSI0551(配列番号49)(50)<PSI0542(配列番号40)(87)<PSI0540(配列番号38)(128)<PSI0541(配列番号39)(439)のランク順に増大する。
17、34、34および51ユニットの半減期延長ポリペプチド部分をそれぞれ有するIL−1Raを含む、融合タンパク質PSI0540、PSI0542、PSI0545、およびPSI0547の静脈内注入後の推定終末相半減期、t1/2z(時間)を、それぞれ、球状タンパク質に対して較正した溶出体積による見かけのサイズ(図5a)、溶液中の流体力学半径(図5b)および半減期延長ポリペプチド部分の反復ユニットの数(図5c)に対してプロットした。PSI0162(Met−huIL−1Ra)を基準として含めた。
結論
半減期延長ポリペプチドの半減期延長特性は、ドメインの長さの関数であることを示し、51ユニットを有するPSI0547が、一貫して、最良の特性を示した。一般に、2つのIL−1Ra分子を含む融合タンパク質は、対応する単一融合タンパク質より短い半減期を示す。さらに、化合物のバイオアベイラビリティは、添加した半減期延長ポリペプチドの長さと共に低減することはないことも明らかになった。むしろ、それぞれ、PSI0540、PSI0542、PSI0545、PSI0547、ならびにPSI0541およびPSI0551のシリーズ中で、同じ構造を有するより小さい融合タンパク質と比較して、より大きな融合タンパク質において増大したバイオアベイラビリティの傾向が確認された。
半減期延長ポリペプチドの半減期延長特性は、ドメインの長さの関数であることを示し、51ユニットを有するPSI0547が、一貫して、最良の特性を示した。一般に、2つのIL−1Ra分子を含む融合タンパク質は、対応する単一融合タンパク質より短い半減期を示す。さらに、化合物のバイオアベイラビリティは、添加した半減期延長ポリペプチドの長さと共に低減することはないことも明らかになった。むしろ、それぞれ、PSI0540、PSI0542、PSI0545、PSI0547、ならびにPSI0541およびPSI0551のシリーズ中で、同じ構造を有するより小さい融合タンパク質と比較して、より大きな融合タンパク質において増大したバイオアベイラビリティの傾向が確認された。
実施例9:Met−huIL−1Raおよびそのペグ化バリアントのインビボ薬物動態学
この比較例は、Met−huIL−1Raおよび直鎖10kDaのPEG、直鎖20kDaのPEGおよび直鎖30kDaのPEGでそれぞれ、N−末端でペグ化したMet−huIL−1Raの、雄ラットを用いた2種の別々の試験の調査について記載する。
この比較例は、Met−huIL−1Raおよび直鎖10kDaのPEG、直鎖20kDaのPEGおよび直鎖30kDaのPEGでそれぞれ、N−末端でペグ化したMet−huIL−1Raの、雄ラットを用いた2種の別々の試験の調査について記載する。
材料および方法
2種の別々の試験は、実施例8の場合と同じ一般デザインに従った。PEG含有または非含有のMet−huIL−1Raタンパク質を雄スプラーグドーリーラットで、皮下パートに対しn=3、静脈内パートに対しn=1で投与した。サンプリング時点は次の通り:皮下サンプリング−0(投与前)、15分、30分、1、2、4、6、8、24、48、72、96、120および144時間;静脈内サンプリング−0(投与前)、5分、20分、1、2、4、6、8、24、48、72、96、120および144時間。血清試料中のタンパク質の濃度を、標準試薬および標準的プロトコルを用いて、サンドイッチELISAにより測定した。
2種の別々の試験は、実施例8の場合と同じ一般デザインに従った。PEG含有または非含有のMet−huIL−1Raタンパク質を雄スプラーグドーリーラットで、皮下パートに対しn=3、静脈内パートに対しn=1で投与した。サンプリング時点は次の通り:皮下サンプリング−0(投与前)、15分、30分、1、2、4、6、8、24、48、72、96、120および144時間;静脈内サンプリング−0(投与前)、5分、20分、1、2、4、6、8、24、48、72、96、120および144時間。血清試料中のタンパク質の濃度を、標準試薬および標準的プロトコルを用いて、サンドイッチELISAにより測定した。
結論
クリアランス(CL)は、PEGの次第に増加するサイズと共に減少する(442(Met−huIL−1Ra)>22.2(L10k)>9.43(L20k)>6.93(L30k))。平均滞留時間は、PEGの次第に増加するサイズと共に増加する(IV:0.20(Met−huIL−1Ra)<4.9(L10k)〜5.3(L20k)<11(L30k);SC:2.2(Met−huIL−1Ra)<26(L10k)=26(L20k)<37(L30k))。皮下投与後のバイオアベイラビリティ(F)は、PEGの次第に増加するサイズと共に低下する;このPEG複合体の性質は、より長い半減期延長ポリペプチドを有する融合タンパク質が、実際に、より高いバイオアベイラビリティを示す半減期延長ポリペプチドの効果とは対照的である。全てのPEGに対し、最大血漿中濃度は24時間で観察された。
クリアランス(CL)は、PEGの次第に増加するサイズと共に減少する(442(Met−huIL−1Ra)>22.2(L10k)>9.43(L20k)>6.93(L30k))。平均滞留時間は、PEGの次第に増加するサイズと共に増加する(IV:0.20(Met−huIL−1Ra)<4.9(L10k)〜5.3(L20k)<11(L30k);SC:2.2(Met−huIL−1Ra)<26(L10k)=26(L20k)<37(L30k))。皮下投与後のバイオアベイラビリティ(F)は、PEGの次第に増加するサイズと共に低下する;このPEG複合体の性質は、より長い半減期延長ポリペプチドを有する融合タンパク質が、実際に、より高いバイオアベイラビリティを示す半減期延長ポリペプチドの効果とは対照的である。全てのPEGに対し、最大血漿中濃度は24時間で観察された。
実施例10:C5結合ポリペプチドのバリアントの薬物動態学的特性の比較調査
この比較例では、本発明の実施形態による融合タンパク質、C5結合タンパク質およびペグ化C5結合タンパク質(PSI0493、PSI0489およびPSI0257)、の薬物動態学を、雄ラットを用いた3種の単回投与試験で評価した。
この比較例では、本発明の実施形態による融合タンパク質、C5結合タンパク質およびペグ化C5結合タンパク質(PSI0493、PSI0489およびPSI0257)、の薬物動態学を、雄ラットを用いた3種の単回投与試験で評価した。
材料および方法
この3種の試験では、雄スプラーグドーリーラット(投与経路およびタンパク質当たりN=3)による単回静脈内(iv)または皮下(sc)投与と同じ一般デザインを採用した。PSI0257の濃度を測定するための血清の作製のための血液試料を、次の名目時点:0(投与前)、5分、20分、1、2、4、8、12、24、48、96および168時間、で採取した。PSI0489およびPSI0493に対しては、血液試料を、0(投与前)、および投与の5分(IVのみ)、15分(SCのみ)、1、4、8、24、48、72、120および192時間後に採取した。PSI0257、PSI0489およびPSI0493の血清濃度を、3種全ての融合タンパク質に共通の合成放射性同位元素標識ペプチドを用いて、ペプシン消化とそれに続くLC/LC/MS/MS分析により測定した。個々の濃度vs時間のプロファイルを実際の測定値および名目時点から収集した。最大のPSI0257、PSI0489またはPSI0493の血清中濃度Cmax、および投与後にこの最大血清濃度に達する時間,tmax、を個々のデータから決定した。個々の薬物動態プロファイルをノンコンパートメント解析に供して、終末相半減期、t1/2z、平均滞留時間(MRT)、時間ゼロから無限大までの血漿中濃度−時間曲線下面積、AUC∞、およびクリアランス、CLを計算した。
この3種の試験では、雄スプラーグドーリーラット(投与経路およびタンパク質当たりN=3)による単回静脈内(iv)または皮下(sc)投与と同じ一般デザインを採用した。PSI0257の濃度を測定するための血清の作製のための血液試料を、次の名目時点:0(投与前)、5分、20分、1、2、4、8、12、24、48、96および168時間、で採取した。PSI0489およびPSI0493に対しては、血液試料を、0(投与前)、および投与の5分(IVのみ)、15分(SCのみ)、1、4、8、24、48、72、120および192時間後に採取した。PSI0257、PSI0489およびPSI0493の血清濃度を、3種全ての融合タンパク質に共通の合成放射性同位元素標識ペプチドを用いて、ペプシン消化とそれに続くLC/LC/MS/MS分析により測定した。個々の濃度vs時間のプロファイルを実際の測定値および名目時点から収集した。最大のPSI0257、PSI0489またはPSI0493の血清中濃度Cmax、および投与後にこの最大血清濃度に達する時間,tmax、を個々のデータから決定した。個々の薬物動態プロファイルをノンコンパートメント解析に供して、終末相半減期、t1/2z、平均滞留時間(MRT)、時間ゼロから無限大までの血漿中濃度−時間曲線下面積、AUC∞、およびクリアランス、CLを計算した。
結論
本発明の実施形態による半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質のt1/2zは、親分子単独での6時間に比べて、20時間延長され、9倍大きいAUC∞および従って9倍のクリアランスの減少を示す。30kDa直鎖PEGにC末端のCys位置で化学的に結合された、同じ標的化分子であるPSI0489に比べて、終末相半減期は、45時間に比べて、20時間である。これは、半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質に対し標的のサイズ増大が10xであるがペグ化標的に対しては24xである、実施例4、表7で示したデータと一致する。
本発明の実施形態による半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質のt1/2zは、親分子単独での6時間に比べて、20時間延長され、9倍大きいAUC∞および従って9倍のクリアランスの減少を示す。30kDa直鎖PEGにC末端のCys位置で化学的に結合された、同じ標的化分子であるPSI0489に比べて、終末相半減期は、45時間に比べて、20時間である。これは、半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質に対し標的のサイズ増大が10xであるがペグ化標的に対しては24xである、実施例4、表7で示したデータと一致する。
実施例11:抗体フラグメントベース融合タンパク質のクローニングおよび作製
本実施例は、本明細書で開示の半減期延長ポリペプチドと、ルプリズマブ抗体フラグメント配列の融合タンパク質のクローニングおよび作製のための一般的戦略を記載する。半減期延長ポリペプチドを抗体フラグメントの軽鎖(LC)または重鎖(HC)に融合した。この実施例で作製された融合タンパク質を、下記実施例12〜15で使用した。
本実施例は、本明細書で開示の半減期延長ポリペプチドと、ルプリズマブ抗体フラグメント配列の融合タンパク質のクローニングおよび作製のための一般的戦略を記載する。半減期延長ポリペプチドを抗体フラグメントの軽鎖(LC)または重鎖(HC)に融合した。この実施例で作製された融合タンパク質を、下記実施例12〜15で使用した。
材料および方法
DNA構築物:半減期延長ポリペプチド含有または非含有の一連の抗体フラグメントをコードするDNA配列を、大腸菌またはCHO細胞中での発現のために、コドン最適化し、Thermo Fisher ScientificでのInvitrogen GeneArt Gene Synthesisサービスにより合成した(成熟タンパク質配列(シグナル伝達ペプチド不含)に対応する領域のヌクレオチド配列については、下表18を参照されたい)。遺伝子は、その後、大腸菌またはExpi293細胞またはExpiCHO細胞中での発現のために、発現ベクター中でクローン化された。PSI0716、PSI0717、PSI0762およびPSI0761に対し、bicistronic vectorを用いて、重鎖および軽鎖の両方のヌクレオチド配列を組み込んだ。
DNA構築物:半減期延長ポリペプチド含有または非含有の一連の抗体フラグメントをコードするDNA配列を、大腸菌またはCHO細胞中での発現のために、コドン最適化し、Thermo Fisher ScientificでのInvitrogen GeneArt Gene Synthesisサービスにより合成した(成熟タンパク質配列(シグナル伝達ペプチド不含)に対応する領域のヌクレオチド配列については、下表18を参照されたい)。遺伝子は、その後、大腸菌またはExpi293細胞またはExpiCHO細胞中での発現のために、発現ベクター中でクローン化された。PSI0716、PSI0717、PSI0762およびPSI0761に対し、bicistronic vectorを用いて、重鎖および軽鎖の両方のヌクレオチド配列を組み込んだ。
培養および精製:組換え抗体フラグメントまたは融合タンパク質をコードする遺伝子フラグメントを含む発現ベクターで大腸菌細胞を形質転換した後、流加バッチ技術を用いてバイオリアクター中で、または振盪フラスコ中で培養し、続けて、タンパク質発現および遠心分離による細胞の採取を行った。細胞ペレットを−20℃で貯蔵するか、または浸透圧ショックに直接供し、放出されたタンパク質を遠心分離により清澄化し、−20℃で貯蔵した。Expi293およびExpiCHO発現系(Thermo Fisher Scientific)を用いて、基本的に製造業者のプロトコルに従って、組換え抗体フラグメントまたは融合タンパク質の発現を実施した。発現ベクターの遺伝子導入の6日後、上清を遠心分離により採取し、−70℃で貯蔵した。表19は、コード化タンパク質配列を示す。
凍結大腸菌細胞ペレットを再懸濁した後、超音波処理により粉砕し、その後、細胞デブリを遠心分離と、その後の濾過(0.22μm)により除去した。ExpiCHOおよびExpi293培養物由来の浸透圧ショック試料および上清を解凍し、濾過した(0.22μm)後、精製した。組換え抗体フラグメントまたは融合タンパク質を含む各上清を、従来のクロマトグラフィー法を用いて精製した。動物試験に使用するための組換え融合タンパク質も、Detoxi−Gel Endotoxin Removing Columns(Pierce、方ログ番号20344)を用いて、エンドトキシン除去精製に供した。精製した抗体フラグメントまたは融合タンパク質をPBSに緩衝液交換し、別に定める場合を除き、PBSをその後の実験の処方緩衝液としても使用した。融合タンパク質の純度をクーマシーブルーで染色してSDS−PAGEにより分析し、各タンパク質の分子量を質量分析法(HPLC/MSまたはMALDI−TOF/MS)により分析した。
結果
精製により、高純度のタンパク質調製物を生じ、これは、クーマシーブルーで染色してSDS−PAGEにより分析した。各融合タンパク質の正確な素性および分子量を質量分析により確認した。
精製により、高純度のタンパク質調製物を生じ、これは、クーマシーブルーで染色してSDS−PAGEにより分析した。各融合タンパク質の正確な素性および分子量を質量分析により確認した。
下表19は、作製したタンパク質のアミノ酸配列を示す。半減期延長ポリペプチドをルプリズマブFabの軽鎖(下表中のLC)または重鎖(下表中のHC)、または軽鎖および重鎖の両方のC末端に融合した。
結論
合成遺伝子を構築し、続けて哺乳動物系または細菌系で発現させ、従来技術を使用して高純度に精製することにより、抗体フラグメントおよび種々の長さの半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質を作製できる。
合成遺伝子を構築し、続けて哺乳動物系または細菌系で発現させ、従来技術を使用して高純度に精製することにより、抗体フラグメントおよび種々の長さの半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質を作製できる。
実施例12:融合タンパク質の生物物理学的特性評価
この実施例は、溶液中の見かけのサイズおよび分子量(MW)などの生物物理学的特性およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)ならびにカラム較正および多角度光散乱検出器(MALS)による溶液中の流体力学半径の測定に関して、非融合タンパク質およびペグ化タンパク質を基準として用いて、ルプリズマブFabおよび半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質の特性評価について記載する。
この実施例は、溶液中の見かけのサイズおよび分子量(MW)などの生物物理学的特性およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)ならびにカラム較正および多角度光散乱検出器(MALS)による溶液中の流体力学半径の測定に関して、非融合タンパク質およびペグ化タンパク質を基準として用いて、ルプリズマブFabおよび半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質の特性評価について記載する。
材料および方法
融合タンパク質、非融合タンパク質およびペグ化タンパク質の溶液中のサイズを、AKTA Micro(GE Healthcare Life Sciences)で、較正カラムSuperdex200 Increase 3.2/300(GE Healthcare Life Sciences)を用いて、分析用ゲル濾過により評価した。カラムを、6〜669kDaのサイズ範囲の8つの球状タンパク質およびブルーデキストラン2000を含む、Gel Filtration Calibration Kit LMW(コード番号28−4038−41、GE Healthcare Life Sciences)およびCalibration Kit LMW(コード番号28−4038−42、GE Healthcare Life Sciences)で、25mMのNaPおよび125mMのNaClのランニングバッファーpH7.0を用いて、75μl/分の流量、25℃の温度で較正した。溶液中の対応するサイズおよび流体力学半径は、較正カラム上のタンパク質の溶出体積から、Handbook of Size Exclusion Chromatography Principles and Methods(注文番号18−1022−18、GE Healthcare Life Sciences)の補足資料10に記載の方法により、計算できる。タンパク質の分子量は、連結されたMALS−RIシステム:静的光散乱検出器miniDawn Tristarおよび示差屈折計Optilab rEX、およびAstra Vソフトウェア(Wyatt Technology Europe,Germany)により決定した。
融合タンパク質、非融合タンパク質およびペグ化タンパク質の溶液中のサイズを、AKTA Micro(GE Healthcare Life Sciences)で、較正カラムSuperdex200 Increase 3.2/300(GE Healthcare Life Sciences)を用いて、分析用ゲル濾過により評価した。カラムを、6〜669kDaのサイズ範囲の8つの球状タンパク質およびブルーデキストラン2000を含む、Gel Filtration Calibration Kit LMW(コード番号28−4038−41、GE Healthcare Life Sciences)およびCalibration Kit LMW(コード番号28−4038−42、GE Healthcare Life Sciences)で、25mMのNaPおよび125mMのNaClのランニングバッファーpH7.0を用いて、75μl/分の流量、25℃の温度で較正した。溶液中の対応するサイズおよび流体力学半径は、較正カラム上のタンパク質の溶出体積から、Handbook of Size Exclusion Chromatography Principles and Methods(注文番号18−1022−18、GE Healthcare Life Sciences)の補足資料10に記載の方法により、計算できる。タンパク質の分子量は、連結されたMALS−RIシステム:静的光散乱検出器miniDawn Tristarおよび示差屈折計Optilab rEX、およびAstra Vソフトウェア(Wyatt Technology Europe,Germany)により決定した。
目的のタンパク質を較正中と同じ条件下で分析した。
結論
融合タンパク質中に包含される半減期延長ポリペプチドの全体長さと、溶液中でのそのサイズとの相関を観察した:溶液中のサイズは、半減期延長ポリペプチドの位置には依存しなかったが、その理由は、全てのユニットの半減期延長ポリペプチドが重鎖(HC)、軽鎖(LC)に融合された場合、または同じ数のユニットがFabの重鎖および軽鎖の両方に分布された場合、異なる融合タンパク質のサイズが類似であったためである。
融合タンパク質中に包含される半減期延長ポリペプチドの全体長さと、溶液中でのそのサイズとの相関を観察した:溶液中のサイズは、半減期延長ポリペプチドの位置には依存しなかったが、その理由は、全てのユニットの半減期延長ポリペプチドが重鎖(HC)、軽鎖(LC)に融合された場合、または同じ数のユニットがFabの重鎖および軽鎖の両方に分布された場合、異なる融合タンパク質のサイズが類似であったためである。
アルブミンの流体力学半径またはストークス半径は、腎クリアランスの限界サイズを超える3.8nmであることがわかっている。これは、腎クリアランスを回避するのに必要な最小限のサイズの限界値として機能し得る。全ての上記で試験した融合タンパク質は、アルブミンの限界値を超えるサイズを有していた。
実施例13:ヒトCD40への結合
この実施例は、ルプリズマブFabおよび半減期延長ポリペプチドの融合タンパク質の結合特性について記載し、ルプリズマブ、非融合Fabタンパク質および別のFab標的化ヒトCD40Lを、基準タンパク質として使用した。
この実施例は、ルプリズマブFabおよび半減期延長ポリペプチドの融合タンパク質の結合特性について記載し、ルプリズマブ、非融合Fabタンパク質および別のFab標的化ヒトCD40Lを、基準タンパク質として使用した。
材料および方法
ヒトCD40リガンド(CD40LまたはCD154)に対するルプリズマブFabおよび半減期延長ポリペプチド含有融合タンパク質の結合親和性を、OctetRED96装置(Pall/ForteBio)を用いて分析した。抗ヒトFab−CH1第二世代(FAB2G、Pall/ForteBio)センサーを用いて固定したポリペプチドを、ヒトCD40L(aa 108〜261、大腸菌中で組換えにより作製)の細胞外部分への結合に関し、通常、1:2ステップ増分による2.5〜80nMの濃度範囲で試験した。
ヒトCD40リガンド(CD40LまたはCD154)に対するルプリズマブFabおよび半減期延長ポリペプチド含有融合タンパク質の結合親和性を、OctetRED96装置(Pall/ForteBio)を用いて分析した。抗ヒトFab−CH1第二世代(FAB2G、Pall/ForteBio)センサーを用いて固定したポリペプチドを、ヒトCD40L(aa 108〜261、大腸菌中で組換えにより作製)の細胞外部分への結合に関し、通常、1:2ステップ増分による2.5〜80nMの濃度範囲で試験した。
通常、各濃度のCD40Lの会合を180秒間、続けて解離を600秒間モニターした。センサーは、各サイクル間で、pH2で3x10秒パルスにより生成し、各センサーのデータを緩衝液曝露に対し参照した。ソフトウェア「Octet System Data Analysis、リリース10.0−カイネティクスモジュール(ForteBio、Pall Life Sciences)」のラングミュア1:1分析物モデル(Global fit)を用いて、反応速度定数をセンサーグラムから計算した。
結論
Fabの半減期延長ポリペプチドへの融合は、前記FabのヒトCD40Lの可溶性部分への親和性に対し測定できるほどの影響を与えない。全ての試験した融合タンパク質のヒトCD40Lに対する親和性は、対照タンパク質ルプリズマブおよびダピロリズマブFabと同等であった。
Fabの半減期延長ポリペプチドへの融合は、前記FabのヒトCD40Lの可溶性部分への親和性に対し測定できるほどの影響を与えない。全ての試験した融合タンパク質のヒトCD40Lに対する親和性は、対照タンパク質ルプリズマブおよびダピロリズマブFabと同等であった。
実施例14:インビトロおよびインシリコ免疫原性傾向調査
この実施例は、PSI0699(配列番号69/配列番号70)中に存在する潜在的免疫原性領域を特定することを目的とする。ProImmune ProPresent(登録商標)Antigen PresentationアッセイをProImmune(UK)により実施した。単球由来樹状細胞により自然に処理され、その結果、MHC抗原提示系により提示され得るペプチドを特定することにより、免疫原性領域を決定した。推定免疫原性ペプチドの検出は、質量分析法LC/MS/MSベース分析を利用して実施した。
この実施例は、PSI0699(配列番号69/配列番号70)中に存在する潜在的免疫原性領域を特定することを目的とする。ProImmune ProPresent(登録商標)Antigen PresentationアッセイをProImmune(UK)により実施した。単球由来樹状細胞により自然に処理され、その結果、MHC抗原提示系により提示され得るペプチドを特定することにより、免疫原性領域を決定した。推定免疫原性ペプチドの検出は、質量分析法LC/MS/MSベース分析を利用して実施した。
材料および方法
ProImmune ProPresent(登録商標)Antigen Presentationアッセイを用いて、PSI0699中に存在する潜在的免疫原性領域を特定した。それらは、単球由来樹状細胞により自然に処理され、その結果、クラスII MHC(HLA−DR)分子により提示されるペプチドを特定することにより決定された。このアッセイで用いられた樹状細胞は、ヒト集団中に存在するHLA型の適切な対象範囲を有する11人の健常な血液ドナーから単離された。推定免疫原性ペプチドは、LC/MS/MSベース分析塩基配列決定質量分析法により特定された。
ProImmune ProPresent(登録商標)Antigen Presentationアッセイを用いて、PSI0699中に存在する潜在的免疫原性領域を特定した。それらは、単球由来樹状細胞により自然に処理され、その結果、クラスII MHC(HLA−DR)分子により提示されるペプチドを特定することにより決定された。このアッセイで用いられた樹状細胞は、ヒト集団中に存在するHLA型の適切な対象範囲を有する11人の健常な血液ドナーから単離された。推定免疫原性ペプチドは、LC/MS/MSベース分析塩基配列決定質量分析法により特定された。
インシリコ免疫原性分析をソフトウェア、TEPredict(Antonets & Maksyutov TEpredict:Software for T−Cell Epitope Prediction Molecular Biology,2010,Vol.44,No.1,pp.119−127)を用いて実施した。
結果
全体として、4種の潜在的免疫原性ペプチドがこのアッセイで特定され、1つは、PSI0699のFabの重鎖から、および3つは、Fabの軽鎖からであった。これらの内、2つは、以前に、Treg134と命名された、潜在的Tregitope配列として発表され、これらのペプチドの両方を包含する。全てのペプチドは、分子の抗体由来部分の定常領域を起源に持つ。半減期延長ポリペプチド由来の免疫原性ペプチドはこのアッセイでは存在しなかった。
全体として、4種の潜在的免疫原性ペプチドがこのアッセイで特定され、1つは、PSI0699のFabの重鎖から、および3つは、Fabの軽鎖からであった。これらの内、2つは、以前に、Treg134と命名された、潜在的Tregitope配列として発表され、これらのペプチドの両方を包含する。全てのペプチドは、分子の抗体由来部分の定常領域を起源に持つ。半減期延長ポリペプチド由来の免疫原性ペプチドはこのアッセイでは存在しなかった。
さらに、インシリコ評価は、半減期延長ポリペプチド由来のどのペプチドもいずれかのMHCクラスの分子に結合する傾向を有するとは予測しなかった。しかし、インシリコ分析は、Fabの標的特異性を示す可変領域由来のペプチドを含むFab部分由来のさらなるペプチドは、種々のMHC分子に結合する可能性があることを予測した。
結論
現在のアッセイ設定では、半減期延長ポリペプチド由来のペプチドは提示されなかったので、半減期延長ポリペプチドの免疫原性の可能性は低いと判定される。このアッセイでは多くの抗体に共通の領域のみが提示されたので、全体の免疫原性の可能性も低いと判定される。以前に発表されたTregitopeペプチドの提示もまた、低い応答であることを示唆する。
現在のアッセイ設定では、半減期延長ポリペプチド由来のペプチドは提示されなかったので、半減期延長ポリペプチドの免疫原性の可能性は低いと判定される。このアッセイでは多くの抗体に共通の領域のみが提示されたので、全体の免疫原性の可能性も低いと判定される。以前に発表されたTregitopeペプチドの提示もまた、低い応答であることを示唆する。
実施例15:Fabベース融合タンパク質の薬物動態学的特性の比較調査
この実施例では、非融合CD40L Fabを対照(PSI0698、ルプリズマブFab、(配列番号67/配列番号68))として含む、PSI0699(配列番号69/配列番号70)およびPSI0701(配列番号73)の静脈内および皮下薬物動態学的特性を評価した。
この実施例では、非融合CD40L Fabを対照(PSI0698、ルプリズマブFab、(配列番号67/配列番号68))として含む、PSI0699(配列番号69/配列番号70)およびPSI0701(配列番号73)の静脈内および皮下薬物動態学的特性を評価した。
材料および方法
この試験では、PSI0699およびPSI0701の両方に対し、雄スプラーグドーリーラット(投与経路およびタンパク質当たりN=3)による単回静脈内(IV)または皮下(SC)投与と同じ一般デザインを採用した。PSI0698に対しては、実験のIV部分のみを実施した。
この試験では、PSI0699およびPSI0701の両方に対し、雄スプラーグドーリーラット(投与経路およびタンパク質当たりN=3)による単回静脈内(IV)または皮下(SC)投与と同じ一般デザインを採用した。PSI0698に対しては、実験のIV部分のみを実施した。
PSI0699およびPSI0701に対しては、IV実験の投与量および時点は、次の通り:2mg/kg:5および20分ならびに1、4、8、24、48、72、96および120時間。SC実験に対しては、4mg/kgの投与量を用い、血液試料を次の時点で採取した:20分および1、4、8、24、48、72、96、120および168時間。PSI0698のIV実験に対しては、13mg/kgの投与量を用い、血液を次の時点で採取した:5および20分ならびに1、2、4、8、24、30および48時間。PSI0698、PSI0699およびPSI0701の血清濃度を、Meso Scale Discoveryプラットフォーム(Meso Scale Diagnostics)で、サンドイッチ法により測定した。活性薬物をビオチン化CD40Lで捕捉し、ヤギ中で産生したルテニウム結合抗ヒトIgG(Fab特異的)抗体(I5260、Sigman−Aldrich)を用いて検出した。個々の濃度vs時間のプロファイルを実際の血清濃度測定値および名目時点から収集した。最大のPSI0698、PSI0699およびPSI0701の血清中濃度Cmax、および投与後にこの最大血清濃度に達する時間、tmax、を個々のデータから決定した。その他の曝露および薬物動態学的パラメーター推定値は、ノンコンパートメント解析(Phoenix WinNonlin 8.0を用いて)により決定した;すなわち、AUC(時間0〜無限大までの血漿血清濃度−時間曲線下面積)、CL(クリアランス)、CL/F(SC投与後クリアランス)、VSS(定常状態での見かけの分布容積)、MRT(平均滞留時間)およびt1/2z(終末相半減期)。皮下バイオアベイラビリティ、Fは、個々のAUC/投与量(SC)の中央値AUC/投与量(IV)での除算に基づいて計算した。
結論
PSI0699およびPSI0701のクリアランスは、CD40L FabのCLより100倍低かった。PSI0699およびPSI0701の静脈内PKはそれぞれ、低クリアランスおよび少容積分布を特徴とした。PSI0699およびPSI0701の両方は、投与の24または48時間後観察されたCmaxレベル、およびその後の、32〜55時間の順に、t1/2zと共に単層的減少を示して、比較的高いSCバイオアベイラビリティを示した。中央推定値に基づくと、PSI0699は、PSI0701に比べて、幾分高いバイオアベイラビリティ(68vs50%)、長い生物学的半減期(53vs40時間)および高いC168/投与レベル(1.6vs0.96)を示した。
PSI0699およびPSI0701のクリアランスは、CD40L FabのCLより100倍低かった。PSI0699およびPSI0701の静脈内PKはそれぞれ、低クリアランスおよび少容積分布を特徴とした。PSI0699およびPSI0701の両方は、投与の24または48時間後観察されたCmaxレベル、およびその後の、32〜55時間の順に、t1/2zと共に単層的減少を示して、比較的高いSCバイオアベイラビリティを示した。中央推定値に基づくと、PSI0699は、PSI0701に比べて、幾分高いバイオアベイラビリティ(68vs50%)、長い生物学的半減期(53vs40時間)および高いC168/投与レベル(1.6vs0.96)を示した。
Claims (24)
- 融合タンパク質であって、
i)生物学的に活性なポリペプチド;および
ii)2〜80ユニットを含む半減期延長ポリペプチド部分であって、それぞれのユニットが、配列番号1:
X1−X2−X3−X4−X5−X6−D−X8−X9−X10−X11(配列番号1)
による全てのアミノ酸配列からなる群より独立に選択され、式中、独立に、
X1はPであるか、または存在せず;
X2はVであるか、または存在せず;
X3はPまたはTであり;
X4はPまたはTであり;
X5はTまたはVであり;
X6はD、GまたはTであり;
X8はA、QまたはSであり;
X9はE、GまたはKであり;
X10はA、E、PまたはTであり;
X11はA、PまたはTであり;
全体的にみて、胆汁酸塩刺激リパーゼと一致しない、融合タンパク質。 - 前記半減期延長ペプチド部分が、2〜80ユニット、例えば、4〜80ユニットのコンティグ配列を形成する、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 複数の半減期延長ポリペプチド部分を含み、それぞれのポリペプチド部分が2〜80ユニットを含む、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 前記半減期延長ポリペプチド部分、または少なくとも1つの前記複数の半減期延長部分が、前記生物学的に活性なポリペプチドのN末端またはC末端に配置される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記半減期延長ポリペプチド部分、または少なくとも1つの前記複数の半減期延長ポリペプチド部分が、前記生物学的に活性なポリペプチドのアミノ酸配列中への挿入、またはそのアミノ酸配列の一部の置換を構成する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記半減期延長ポリペプチド部分が、配列番号2〜11からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸配列の2〜80ユニットを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記半減期延長ポリペプチド部分が、配列番号12〜21および57〜66からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 前記半減期延長ポリペプチド部分が、配列番号12〜21および57〜66からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 前記半減期延長ポリペプチド部分が、配列番号100〜105からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 前記半減期延長ポリペプチド部分が、配列番号100〜105からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項9に記載の融合タンパク質。
- 前記半減期延長ポリペプチド部分が、10〜51ユニットなどの6〜70ユニット、例えば、7〜18ユニットを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 少なくとも3.8nmの流体力学半径を有する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- サイズ排除クロマトグラフィーにより測定して、少なくとも60kDaの溶液中の見かけのサイズを有する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 配列番号1による前記アミノ酸配列がヒト起源である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記半減期延長ポリペプチド部分が、天然ヒトアミノ酸配列に一致する、請求項14に記載の融合タンパク質。
- 各ユニットが、最大で1つのO−グリコシル化を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 複数の生物学的に活性なポリペプチドを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 生物学的に活性なポリペプチドの前記生物学的半減期を延長する方法であって、
a)請求項1〜17のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用意するステップ;
b)前記ポリヌクレオチドを細胞中に導入するステップ;
c)前記細胞を前記融合タンパク質の発現を可能とする条件下で維持するステップ;および
d)前記融合タンパク質を単離するステップ、を含む方法。 - 請求項1〜17のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項19に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項20に記載の発現ベクターを含む細胞。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載の融合タンパク質および薬学的に許容可能な担体を含み、任意選択で、皮下または静脈内投与用に処方された医薬組成物。
- 薬物としての使用のための、任意選択で、対象の皮下または静脈内に投与される、請求項1〜17のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 生物学的に活性なポリペプチドのバイオアベイラビリティを高めるための、請求項1〜17のいずれか1項で定義の半減期延長ポリペプチドの使用。
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