JP5876034B2 - Pcsk9に結合するフィブロネクチンベースのスカフォールドドメインタンパク質 - Google Patents
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Description
本出願は、ASCIIフォーマットにおいてEFS−Webを介して提出されており、その全体において出典明示により本明細書に包含させる配列表を含む。2011年4月13日に作成された該ASCIIのコピーは、11594 PCT.ST25.txtという名であり、1,382KBのサイズである。
本発明は、前駆タンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9型(PCSK9)に結合するフィブロネクチンベースのスカフォールドドメインタンパク質に関する。本発明はまた、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症および他のコレステロール関連疾患を処置するための治療的適応における革新的なタンパク質の使用に関する。本発明は、さらに、このようなタンパク質、このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはそれらのフラグメントを含む細胞、および革新的なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
アテローム性動脈硬化症は、先進工業国において多数の死の根底にある冠動脈性心臓疾患(CHD)に関与する動脈疾患である(Lusis (2000))。現在、CHDに関するいくつかの危険因子:脂質異常症、高血圧、糖尿病、喫煙、質の悪い食生活、運動不足およびストレスは、よく確立されている。多数の臨床的に関連した、および一般的な脂質異常症は、高トリグリセリド血症の非存在および存在下で、高コレステロール血症での低比重リポタンパク質および超低密度リポタンパク質(LDLおよびVLDL)の増加により特徴付けられる(Fredricksonら (1967))。単離されたLDLコレステロールの上昇は、CHDに対する最も一般的な危険因子の1つである。PCSK9(HCHOLA3、NARC−1またはFH3とも称される)は、分泌サブチラーゼファミリーのプロテイナーゼKサブファミリーに属するプロテアーゼである(Naureckieneら Arch. Biochem. Biophy., 420:55-57 (2003))。PCSK9は、コレステロールホメオスタシスおよび血中低比重リポタンパク質レベルの重要なレギュレーターであることが示されている。血中PCSK9タンパク質は、LDL受容体への直接結合および肝細胞における分解の促進により、LDL代謝をコントロールする。LDL受容体タンパク質および活性のPCSK9介在下方制御は、血中からのLDLのクリアランスの減少およびより高いLDLレベルをもたらす。常染色体優性高コレステロール血症(ADH)に関連しているS127R、F216LおよびD374Yを含むS127R、N157K、F216L、R218SおよびD374Yを含む、PCSK9のいくつかの変異体形態が知られている。野生型PCSK9が、より少ないLDLクリアランスを引き起こすLDL受容体の回転率を増加させるが(Maxwellら Proc. Natl. Acad. Sci., 102(6):2069-2074 (2005); Benjannetら and Lalanneら)、PCSK9機能喪失変異体が低比重リポタンパク質受容体(LDLR)のレベルの増加、血中LDLのクリアランスの増加、および血漿コレステロールレベルの対応する増加をもたらすことが考えられている(Rashidら Proc. Natl. Acad. Sci., 102(15):5374-5379 (2005))。そのため、PCSK9は、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症および他のコレステロール関連疾患の処置のための可能性のある標的である。
本出願は、ヒトPCSK9に対するアドネクチンを提供する。本発明の1つの局面は、1つ以上の溶媒接触可能ループがランダム化または変異化されているFn3ドメインを含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、Fn3ドメインは、ヒトフィブロネクチンIII型ドメインの野生型第10モジュール(10Fn3)由来のFn3ドメインである。いくつかの態様において、本発明の10Fn3ポリペプチドは、ヒト10Fn3ドメインと少なくとも40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%または90%同一である。
定義
「ポリペプチド」は、長さ、翻訳後修飾または機能にかかわらず、2つ以上のアミノ酸のあらゆる配列を意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用される。ポリペプチドは、米国特許第6,559,126号(出典明示により本明細書に包含させる)に記載されているもののような天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含むことができる。ポリペプチドはまた、種々の標準的な化学法のいずれかで修飾されていてもよい(例えば、アミノ酸は保護基で修飾されていてもよい;カルボキシ末端アミノ酸は、末端アミド基にされてもよい;アミノ末端残基は、例えば、親油性を増強するための基で修飾されてもよい;またはポリペプチドは、化学的にグリコシル化されていてもよく、あるいは、安定性もしくはインビボ半減期を増大するように修飾されていてもよい)。ポリペプチド修飾は、ポリペプチドへの別の構造、例えば、環状化合物または他の分子の結合を含み得、また、1つ以上のアミノ酸を改変された立体配置(すなわち、RもしくはS;またはLもしくはD)で含むポリペプチドを含み得る。本発明のペプチドは、PCSK9に特異的に結合するように修飾されているフィブロネクチンの第10III型ドメイン由来のタンパク質であり、「抗−PCSK9アドネクチン」または「PCSK9アドネクチン」として本明細書において称される。
本出願は、ヒトPCSK9に対するアドネクチンを提供する。PCSK9特異的アンタゴニストを同定するために、PCSK9を、アドネクチンの大型合成ライブラリーに提供した。PCSK9に結合したアドネクチンを、PCSK9結合、生物物理的特性およびPCSK9阻害活性についてスクリーニングした。抗−PCSK9アドネクチンを変異させ、標的濃度を低下させ、スローオフ速度(slow off-rate)で抗−PCSK9アドネクチンを選択することによるさらなる選択圧に付した。この最適化処理から、アドネクチンファミリーが好ましい生化学的および生物物理的特性を有するPCSK9特異的阻害剤として同定された。
本出願の1つの局面は、1つ以上の溶媒接触可能ループがランダム化または変異化されているFn3ドメインを含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、Fn3ドメインは、ヒトフィブロネクチンIII型ドメイン(10Fn3)の野生型第10モジュール由来のFn3ドメインである:VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(配列番号:1)。10Fn3配列において、BC、DEおよびFGループは下線を引かれている。
EVVAAT(X)aSLLI(X)xYYRITYGE(X)bQEFTV(X)yATI(X)cDYTITVYAV(X)zISINYRT(配列番号:328)
EVVAATPTSLLI(X)xYYRITYGETGGNSPVQEFTV(X)yATISGLKPGVDYTITVYAV(X)zISINYRT(配列番号:329)
1つの局面において、本出願は、薬物動態学(PK)部分をさらに含む抗−PCSK9アドネクチンを提供する。改善された薬物動態学は、認識される治療的必要性にしたがって評価され得る。しばしば、恐らくタンパク質が投与後の血清において利用可能なままである時間を増加させることにより、バイオアベイラビリティを増加させること、および/または投与間の時間を増加させることが望ましい。場合によっては、時間とともにタンパク質の血清濃度の連続性を改善すること(例えば、投与直後および次の投与直前の、タンパク質の血清濃度における違いを減少させること)が望ましい。抗−PCSK9アドネクチンは、哺乳動物(例えば、マウス、ラットまたはヒト)におけるポリペプチドのクリアランス速度を、非修飾抗−PCSK9アドネクチンと比較して3倍以上低減させる部分に結合させてもよい。改善された薬物動態学の他の尺度は、しばしば、アルファ相およびベータ相に分類される血清半減期を含み得る。いずれかの相または両方の相は、適当な部分の付加により有意に改善され得る。
表1
典型的な抗−PCSK9アドネクチン−Fc融合物タンパク質
表2
本出願は、PCSK9に結合するFn3ドメインを含むアドネクチンを提供する。標的分子へのポリペプチド結合は、平衡定数(例えば、解離、KD)および速度定数(例えば、結合の速度定数、Konおよび解離の速度定数、koff)について評価され得る。アドネクチンは、一般的に、500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pM、100pM未満のKDで標的分子に結合するが、より高いKD値は、Koffが十分に低いか、またはKonが十分に高いとき許容され得る。
表3
抗−PCSK9アドネクチン BC、DEおよびFGループ
表5
ペグ化を可能にする抗−PCSK9アドネクチンファミリーシステイン変異体
*注意:記載されているいくつかのタンパク質は、まだペグ化されていないが、システイン変異を介してペグ化可能である。ペグ化されているタンパク質は、アステリスクにより示される。
1つの局面において、本出願は、PCSK9に結合するフィブロネクチンIII型ドメインを含むアドネクチンを提供する。特異的結合特性を有するFn3ドメインを迅速に生成し、試験する1つの方法は、Adnexus, a Bristol-Myers Squibb R&D Companyの核酸−タンパク質融合技術である。本記載は、核酸−タンパク質融合物(RNA−およびDNA−タンパク質融合物)を利用して、タンパク質への結合のために重要である新規ポリペプチドおよびアミノ酸モチーフを同定する、PROfusionと称されるインビトロ発現およびタグ技術を利用する。核酸−タンパク質融合技術は、タンパク質をそのコーディング遺伝情報に共有的に連結する技術である。RNA−タンパク質融合技術およびフィブロネクチンベースのスカフォールドタンパク質ライブラリースクリーニング方法の詳細な説明のために、Szostakら、米国特許第6,258,558、6,261,804、6,214,553、6,281,344、6,207,446、6,518,018および6,818,418号;ならびにRobertsら Proc. Natl. Acad. Sci., 94:12297-12302 (1997)(出典明示により本明細書に包含させる)参照。
本明細書に記載されている種々のタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成され得る。コドン使用頻度は、細胞における発現を改善するよう選択され得る。このようなコドン使用頻度は、選択される細胞型に依存する。特定化されたコドン使用頻度パターンは、大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞に対して開発されている。例えば:Mayfieldら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (Jan. 21, 2003); Sinclairら Protein Expr. Purif., 26(I):96-105 (Oct. 2002); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (Oct. 2001); Makridesら Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (Sep. 1996);およびSharpら Yeast, 7(7):657-678 (Oct. 1991)参照。
宿主細胞は、タンパク質生産のために本明細書において記載されている発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に修飾された慣用の栄養培地中で培養される。本明細書に示される例において、ハイスループットタンパク質生産(HTPP)および中規模生産のために使用された宿主細胞は、HMS174−細菌株であった。本発明のタンパク質を生産するために使用される宿主細胞は、種々の培地で培養され得る。市販の培地、例えば、Ham’s F10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、(Sigma))、RPMI−1640(Sigma)およびダルベッコ改変イーグル培地((DMEM)、Sigma))は、宿主細胞を培養するために適当である。加えて、Hamら Meth. Enzymol., 58:44 (1979)、Baritesら Anal. Biochem., 102:255 (1980)、米国特許第4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655、5,122,469、6,048,728、5,672,502号、または米国特許第RE30,985号に記載されている培地が、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地はいずれも、必要なとき、ホルモンおよび/または他の増殖因子(例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮細胞増殖因子)、塩(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェート)、バッファー(例えば、HEPES)、ヌクレオチド(例えば、アデノシンおよびチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される)、およびグルコースまたは同等のエネルギー供給源を補給され得る。任意の他の必要な栄養補助剤がまた、当業者に知られている適当な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば、温度、pHなどは、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者に明らかである。
1つの局面において、本出願は、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症および他のコレステロール関連疾患の処置において有用な抗−PCSK9アドネクチンを提供する。本出願はまた、抗−PCSK9アドネクチンを対象に投与するための方法を提供する。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、抗−PCSK9アドネクチンは、哺乳動物、特にヒトに対して薬学的に許容される。「薬学的に許容される」ポリペプチドは、重大な有害な医学的結果なしで、例えば、本質的にエンドトキシンなしで、または非常に低いエンドトキシンレベルで動物に投与されるポリペプチドを示す。
本出願は、さらに、本明細書に記載されている抗−PCSK9アドネクチンまたはその融合タンパク質を含む薬学的に許容される組成物であって、本質的にエンドトキシンを含まない組成物を提供する。抗−PCSK9アドネクチンまたはその融合物を含む治療製剤は、所望の程度の純度を有する記載されているポリペプチドを、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤(Osol, A., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition (1980))と混合することにより、水溶液、凍結乾燥された、または他の乾燥された製剤の形態において保存のために調製される。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、バッファー、例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸;抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸およびメチオニン;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン;単糖類、二糖類および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノースまたはデキストラン;キレート化剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質複合体);および/または非イオン性界面活性剤、例えば、Tween、PLURONIC(登録商標)またはポリエチレングリコール(PEG)を含む。
1つの局面において、本出願は、ヒト血清アルブミンに結合する10Fn3ドメインに融合した抗−PCSK9アドネクチン(血清アルブミン結合アドネクチン(10Fn3ドメイン)またはSABA)を含む融合タンパク質を提供する。このような融合タンパク質は、抗−PCSK9アドネクチン単独(例えば、PK部分に結合していない)と比較して、アルブミンの存在下で伸長した血清半減期を有する。
EVVAAT(X)aSLLI(X)xYYRITYGE(X)bQEFTV(X)yATI(X)cDYTITVYAV(X)zISINYRT(配列番号:328)
EVVAATPTSLLI(X)xYYRITYGETGGNSPVQEFTV(X)yATISGLKPGVDYTITVYAV(X)zISINYRT(配列番号:329)
SABA融合物は、共有的または非共有的に連結され得る。いくつかの態様において、血清アルブミン結合10Fn3は、直接的またはポリペプチドリンカーを介して間接的に抗−PCSK9アドネクチンに連結され得る。Fn3ドメインを結合するために適当なリンカーは、個々のドメインが互いに独立してフォールディング可能であり、標的分子への高親和性結合を可能にする三次元構造を形成するものである。
上記「血清アルブミン結合アドネクチン(SABA)の融合物」および「コンジュゲーション/リンカー」の欄に示されている多数の配列は、以下の表6に要約される。特記されない限り、全てのN−末端伸長は、一本下線で示され、全てのC末端テール/伸長は、二本下線で示され、リンカー配列は囲まれている。ループ領域BC、DEおよびFGは、それぞれのコアSABA配列に対して網掛けされている。さらに上記のとおり、修飾配列(例えば、NまたはC末端伸長およびリンカー)はまた、抗−PCSK9アドネクチン分子を修飾するために使用することができる。
表6
典型的な配列の要約
本明細書において使用される材料および方法
ハイスループットタンパク質生成(HTPP)
pET9dベクターにクローニングし、大腸菌HMS174細胞に形質転換された選択されたバインダーを、24−ウェルフォーマットにおいて50μg/mLのカナマイシンを含む5mlのLB培地に播種し、37℃で一晩増殖させた。新鮮な5mlのLB培地(50μg/mLのカナマイシン)培養物を、一晩培養物から200μlの吸引および適当なウェルにに分配することにより、誘導発現のために調製した。培養物を、37℃でA600 0.6−0.9まで増殖させた。1mMのイソプロピル−β−チオガラクトシド(IPTG)での誘導後、培養物を30℃で6時間で発現させ、4℃で2750gで10分間の遠心分離により回収した。
不溶性クローンの発現のために、クローン、次にHIS6タグを、pET9d(EMD Bioscience, San Diego, CA)ベクターにクローニングし、大腸菌HMS174細胞において発現させる。20mlの接種培養物(単一被覆コロニーから産生された)を使用し、50μg/mlのカルベニシリンおよび34μg/mlのクロラムフェニコールを含む1リットルのLB培地に播種する。培養物を37℃でA600 0.6−1.0まで増殖させる。1mMのイソプロピル−β−チオガラクトシド(IPTG)で誘導後、培養物を30℃で4時間増殖させ、4℃で≧10,000gで30分間の遠心分離により回収する。細胞ペレットを−80℃で凍結する。細胞ペレットを、氷上でULTRA−TURRAX(登録商標)ホモジェナイザー(IKA works)を使用して、25mlの溶解バッファー(20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、1× Complete Protease Inhibitor Cocktail−EDTA free (Roche)、1mMのPMSF、pH7.4)に再懸濁する。細胞溶解は、Model M−110S MICROFLUIDIZER(登録商標)(Microfluidics)を使用する高圧ホモジナイゼーション(≧18,000psi)によりなし遂げる。不溶性画分を、4℃で23,300gで30分間の遠心分離により分離する。溶解物の遠心分離から回収された不溶性ペレットを20mMのリン酸ナトリウム/500mMのNaCl、pH7.4で洗浄する。ペレットを、超音波処理で20mMのリン酸ナトリウム/500MのNaCl pH7.4の6.0Mの塩酸グアニジンに再溶解し、次に37℃で1−2時間インキュベーションする。再溶解されたペレットを0.45μmに濾過し、20mMのリン酸ナトリウム/500MのNaCl/6.0Mのグアニジン pH7.4 バッファーで平衡化されたHistrapカラム上に負荷する。ローディング後、カラムを、同じバッファーでさらなる25CVのために洗浄する。結合しているタンパク質を、20mMのリン酸ナトリウム/500mMのNaCl/6.0Mのguan−HCl pH7.4の50mMのイミダゾールで溶離する。精製されたタンパク質は、50mMの酢酸ナトリウム/150mMのNaCl pH4.5に対する透析により再フォールディングされる。
可溶性クローンの発現のために、クローン、次にHIS6タグを、pET9d(EMD Bioscience, San Diego, CA)ベクターにクローニングし、大腸菌HMS174細胞において発現させた。20mlの接種培養物(単一被覆コロニーから産生された)を使用し、50μg/mlのカルベニシリンおよび34μg/mlのクロラムフェニコールを含む1リットルのLB培地に播種した。培養物を37℃でA600 0.6−1.0まで増殖させた。1mMのイソプロピル−β−チオガラクトシド(IPTG)で誘導後、培養物を30℃で4時間増殖させ、4℃で≧10,000gで30分間の遠心分離により回収した。細胞ペレットを−80℃で凍結した。細胞ペレットを、氷上でULTRA−TURRAX(登録商標)ホモジェナイザー(IKA works)を使用して、25mlの溶解バッファー(20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、1× Complete Protease Inhibitor Cocktail−EDTA free (Roche)、1mMのPMSF、pH7.4)に再懸濁した。細胞溶解は、Model M−110S MICROFLUIDIZER(登録商標)(Microfluidics)を使用する高圧ホモジナイゼーション(≧18,000psi)によりなし遂げた。可溶性画分を、4℃で23,300gで30分間の遠心分離により分離した。上清を0.45μmフィルターを介して浄化化した。浄化した溶解物を、20mMのリン酸ナトリウム/500MのNaCl pH7.4であらかじめ平衡化されたHistrap カラム(GE)上に負荷した。次に、カラムを、25カラム容量の同じバッファー、次に20カラム容量の20mMのリン酸ナトリウム/500MのNaCl/25mMのイミダゾール、pH7.4、次に、35カラム容量の20mMのリン酸ナトリウム/500MのNaCl/40mMのイミダゾール、pH7.4で洗浄した。タンパク質を、15カラム容量の20mMのリン酸ナトリウム/500MのNaCl/500mMのイミダゾール、pH7.4で溶離し、画分をA280での吸光度に基づいてプールし、1×PBS、50mMのTris、150mMのNaCl pH8.5または50mMのNaOAc;150mMのNaCl;pH4.5に対して透析した。あらゆる沈殿物が、0.22μmで濾過することにより除去された。
インビトロの非臨床薬理学
SPRによるKD
結合特性は、表面プラズモン共鳴(SPR)により特徴付けた。ヒトPCSK9およびカニクイザルPCSK9を、ProteOn XPR(Bio−Rad)チップ表面の一次元上の別々のチャネル上に固定し、同じSPRチップ表面の他の次元において6つの異なる濃度の2013E01に暴露した。これは、再生の非存在下での速度論的定量を与えた。デュプリケートチップを、25℃でのヒトおよびカニクイザルPCSK9の速度論的定量のために使用した。速度論的パラメーターの評価は、Langmuir相互作用モデルおよびProteOn Managerソフトウェアでの定数パラメーターフィッティングを使用して行った。
表7
直接的に固定されたヒトおよびCynoPCSK9に対する抗−PCSK9アドネクチンに対するSPR決定速度論的パラメーター
アドネクチンおよびヒトPCSK9の結合特性はまた、バイオレイヤー干渉法(BLI)により決定した。ビオチン化ヒトPCSK9をスーパーストレプトアビジンセンサーチップ上に固定し、次に結合相の期間、希釈されたアドネクチンを含むウェルに浸した。次に、チップを、アドネクチン解離の観察のために、バッファーのみのウェルに浸した。実験を、25または37℃のいずれかで温度コントロール環境下で行い、振動スピードは1500rpmに合わせた。
表8
ヒトPCSK9に対するPCSK9アドネクチンに対するBLI決定速度論的パラメーター
2ATI001175はR23D置換を有する1922G04の脱免疫化バージョンである。
KinExA
ヒトPCSK9に対するATI001081およびATI001174の溶液親和性は、Kinetic Exclusion Assay(KinExA)を使用して測定した。相対的非結合アドネクチン濃度は、hPCSK9固体マトリックス上の捕捉、次に、アドネクチンスカフォールドを認識する蛍光的に標識された抗体での検出により測定した。技術的限界によって、試験することができたアドネクチンの最も低い濃度は1nMであった。全体的KD分析では、ATI001081に対してKD=70pM(95%信頼区間内で28−127pM)およびATI001174に対してKD=223pM(95%信頼区間内で54−585pMの範囲)と概算する。
表9
ヒトPCSK9へのアドネクチンATI001174およびATI001081の結合の熱力学および化学量論は、等温滴定熱量計(ITC)により特徴付けた。溶液相結合は、37℃で25mMのHEPES、pH7.41、150mMのNaCl中で測定した。1.3±0.2nMの平均単分子結合定数がATI001174に対して、および1.4±0.4nMがATI001081に対して観察された。詳細な熱力学的分析は、表10および図13に示される。2つのアドネクチンに対して観察されるエンタルピーの違い(−3.3kcal/mol)は、ATI001174が、エントロピーにおける対応する違い(−10.4cal/mol・K)によって少なくとも部分的に相殺される、ペグ化によってPCSK9に対する親和性における大きさの減少の秩序をもたらすということを示唆する。
表10
これらのFRETベースのアッセイは、Maioら(Miao, B.ら Meth. Enzymol., 357:180-188 (2002)参照)により以前に記載されている一般的な方法から採用されたPCSK9結合アドネクチンの結合親和性および効力を決定するために開発された。PCSK9:EGFA FRETアッセイ(図2および3)によって、バキュロウイルスにおいて発現される組換えヒトPCSK9および合成40−mer EGFAペプチド(ビオチン化)を使用して、低比重リポタンパク質受容体(LDLR)上皮細胞増殖因子前駆体相同性ドメイン(EGFAドメイン)へのPCSK9結合の阻害を測定した。EGFAは、PCSK9とLDLRの重要な相互作用ドメインを示すことが示されている(Kwon, H.J.ら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(6):1820-1825 (2008))。このアッセイは、ストレプトアビジン/アロフィコシアニン フルオロフォア複合体を介するビオチン化EGFAとのFRET相互作用を提供するために、Eu−キレートで標識化されたPCSK9 C−末端ドメイン結合mAb(mAb 4H5)を使用した。
表11
ヒトPCSK9を使用する3つのFRETアッセイおよびCyno PCSK9に対する1つのアッセイに対するアドネクチン試験データの要約
DiI−LDL摂取アッセイ
細胞培養方法を、アドネクチンがLDLRにおけるPCSK9活性を阻害する能力をアッセイするために開発した。細胞性LDLR活性を測定するための有効な方法は、Lagace, T.A.ら(J. Clin. Invest., 116(11):2995-3005 (2006))により示されているとおりに、標識化LDLの摂取に関するアッセイを通す。本試験は、Teupserら (Biochim. Biophys. Acta, 1303(3):193-198 (1996))により最初に示された方法から採用された蛍光標識化LDL(DiI−LDL)摂取を使用するLDLR機能活性のための方法をさらに採用した。最初に、細胞を示されているアドネクチンの存在および非存在下で組換えヒトPCSK9タンパク質(10ug/mL、135nM)とプレインキュベートした。2時間後、残りのLDLR活性を、2時間DiI−LDL(5ug)とのインキュベーション、次に、高含量蛍光顕微鏡およびイメージング分析(Cellomics)を使用する細胞内の蓄積されたDiI−LDLの評価によりアッセイした。図6は、PCSK9活性を阻害し、HepG2細胞においてLDLR機能活性を回復させるいくつかのアドネクチンの効果を示す。このアッセイにおいて、アドネクチンは、以下のEC50値でPCSK9を阻害し、DiI−LDL摂取を回復させた:1459D05、EC50=190nM;1784F03、210nM;2012A04、130nM;2013E01、160nM。
HepG2細胞を、10%のFBS(Hyclone)を有する完全培地、Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM、ATCC(登録商標))中で培養し、トリプシン 0.25%(Invitrogen)で週に2回スプリットした。LDL受容体の上方調節を誘導するために、細胞をLPDS培地[5%のリポタンパク質欠失血清(Intracel)、100nMのスーパーステイション(superstation)(BMS)および50uMのメバロン酸ナトリウム(Sigma)を有するRPMI(ATCC)]中で一晩インキュベートした。次の日、細胞を、簡潔にはトリプシン 0.05%(Invitrogen)でトリプシン処理し、2×10^6個の細胞/mlで再懸濁し、次にV底96ウェルプレート中100ul/ウェルでアリコートした。その後、アドネクチンを37℃で1時間LPDS培地中でPCSK9とプレインキュベートそた。1時間後、細胞を遠心し、100ulのアドネクチン/PCSK9混合物に再懸濁し、37℃で一晩インキュベートした。次の日、細胞をLDL受容体に対する抗体(R&DからのBAF 2148)、次にフィコエリトリン(PE)−ストレプトアビジン結合二次抗体(BD PharmingenからのBD554061)で標識化し、FACS CantoII(BD)におけるFACSにより分析した。
表12
PCSK9アドネクチンのインビボ薬物動力学効果
ヒトPCSK9トランスジェニックマウスモデル
PCSK9アドネクチンは、2つの異なるヒトトランスジェニックマウスモデルにおけるインビボでの薬物動力学効果を示した。1つのマウスモデルはヒトPCSK9レベルを著しく過剰発現し、結果として高コレステロール血症を示す(Lagace, T.Aら J. Clin. Invest., 116(11):2995-3005 (2006))。他のマウスモデルは、マウスPCSK9と同様に肝臓において制御され、血漿中でほぼヒト正常レベルのhPCSK9を発現するゲノムhPCSK9トランスジェニック(BAC−トランスジェニック)である。これらの試験のために、種特異的、部位特異的標識された抗体およびアドネクチンを使用するELISAアッセイを、標的分子への結合の指標としての血漿非結合ヒトPCSK9レベル(すなわち、投与されたアドネクチンと複合体化していないhPCSK9)を測定するために開発した。
薬物動力学試験を、正常な細身の(lean)カニクイザルにおいて行った。アドネクチンATI001114を5mg/kgでcynoの静脈内に投与し、血漿サンプルをLDL−Cアッセイおよび薬物動態学評価のために時間間隔で回収した。ATI001114の単回投与は、48時間以内に、ベースライン(またはPBSコントロールグループ)に対して、血漿LDL−Cレベルを>50%に迅速に低下させた(図12)。LDL−Cにおける効果の期間は1週間以上持続し、3週間でベースラインへ最終的に戻った。この効果を、抗−PCSK9アドネクチンの二分岐および四分岐40kDaペグ化形態(それぞれATI001114およびATI001211)の両方で観察した。ATI001211は、40kDaの4分岐NOF PEG部分と有するATI001081である。総コレステロールは同様のパターンを示したが、HDLまたは他の代謝パラメーターにおける効果は観察されなかった(本明細書に示されていない)。薬物動態学分析は、血漿半減期がcynoにおけるLDL低下の薬物動力学と一致する約80−120時間であったことを示した。これらの発見は、PCSK9アドネクチンが、カニクイザルモデルにおいてLDL−C低下に対して迅速な、強力な、特異的な効果で有効かつ即効性であることを示す。
PCSK9アドネクチン−Fc融合タンパク質であるPRD460のインビトロおよびインビボでの薬理学的評価
PRD460の生産
PRD460をコードするベクターを、ポリエチレンイミン(PEI)を使用してHEK−293 6E細胞にトランスフェクトした。細胞を、80%加湿および5%CO2で37℃で5日間培養した。次に細胞をペレット化し、上清を0.22umフィルターに通し、次に、タンパク質Aカラムに負荷した。カラムをPBSで洗浄し、タンパク質を20mMのGylcine、150mMのNaCl pH2.8に溶離した。溶出されたタンパク質を濃縮し、50mMのMES、100mMのNaCl pH5.8中でsuperdex200カラムを通した。
表13
捕捉されたヒトPCSK9に対するPRD460およびATI−1081に対する速度論的パラメーター
2つの蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ベースのアッセイを使用して、hPCSK9へのPRD460および他のアドネクチンの競合的結合効力を決定した。PCSK9:EGFA FRETアッセイは、可溶性上皮細胞増殖因子前駆体相同性ドメイン−A(EGFA)ペプチドおよび組換えヒトPCSK9を使用して、LDLRへのPCSK9の結合を測定する。PCSK9:ATI972 FRETアッセイは、PCSK9からビオチン化アドネクチンATI−972のアドネクチンによる競合的置換を測定する。
ヒトPCSK9は、HepG2細胞の表面からのLDLRの枯渇を促進する。PCSK9のPCSK9アドネクチンとのプレインキュベーションは、LDLRへのPCSK9結合を阻害し、細胞表面からのLDLRの枯渇を防止する。このアッセイは、ATI−1081、ATI−1174およびPRD460が細胞表面からのLDLRのPCSK9誘導枯渇を阻害する効力を測定するために使用された。
肝細胞の表面上のLDLRへのPCSK9結合は、LDLRエンドサイトーシス中、LDLR−PCSK9複合体の共内在化をもたらし、LDLRの増強された分解をもたらす。。細胞ベースアッセイを、蛍光PCSK9のLDLR依存性細胞侵入を測定するために開発した。ヒトPCSK9を、フルオロフォア ALEXA FLUOR(登録商標)−647(AF647)を使用して共有的に標識化した。PCSK9−AF647を、PCSK9−アドネクチンの存在または非存在下でHepG2細胞とインキュベートし、細胞内蛍光を、高含量蛍光顕微鏡および画像分析(Cellomics)により定量した。PCSK9−AF647細胞への侵入のLDLRエンドサイトーシスへの依存が、予備実験において確立された。HepG2細胞を、10nMのPCSK9−AF647および種々のレベルのアドネクチンと37℃で4時間インキュベートした。このアッセイにおいて、PCSK9−AF647細胞内蛍光の強力な阻害は、PRD460(EC50=6nM)ならびにATI−1174(EC50=10nM)に対して観察された(図16)。これらの発見は、アドネクチンPRD460およびATI−1174が、培養中のヒト肝臓由来の細胞系においてPCSK9の細胞表面LDLRへの結合を有効にブロックし、それにより、LDLRエンドサイトーシス中、PCSK9−AF647の内在化を減少させたことを示す。
インビボ試験を、正常発現体hPCSK9トランスジェニックマウスモデルにおいて実施した。血漿中のアドネクチンのPCSK9への結合は、非結合(遊離)血中PCSK9の測定された量における減少をもたらすことが予期される。非結合PCSK9における減少は、最初の薬物動力学事象であり、PCSK9−LDLR相互作用の阻害およびLDLコレステロール低下をもたらす。トランスジェニックマウスへのPRD460の単回投与(i.p.投与 0.6から18mg/kg)は、血漿非結合hPCSK9レベルにおいて迅速な、強い減少を引き起こした(図17)。非結合PCSK9における用量依存的増加は、3時間の時点でED50<0.6mg/kgで観察された。正常発現体ヒトPCSK9トランスジェニックマウスモデルにおけるこれらの発見は、PRD460がインビボで血中hPCSK9に強く、強力に結合することを示す。
PCSK9アドネクチンPRD460の薬物動力学効果は、正常な細身のカニクイザルにおいて評価した。PRD460を、15mg/kgでのi.v.投与によりサルに投与し、LDL−Cおよび遊離PCSK9レベルのアッセイのために血漿サンプルを4週間にわたって時間間隔で回収した。PRD460の単回投与は、サルにおいて血漿LDL−Cレベルを迅速に低下させ、投与3日後までにベースラインLDL−Cの42%の平均最大効果(58%減少;n=3匹サル)に到達した(図18)。LDL−Cレベルは、投与で1週間、50%またはそれ以上減少し、3週間ベースライン以下を有意に維持し、4週間でベースラインに戻った。総コレステロールは同様のパターンを示したが、HDLでは効果が観察されなかった(示されていない)。PRD460での処置は、非結合、遊離形の血漿PCSK9において、0付近(定量下限以下)への即座の低下を引き起こした(図18)。遊離PCSK9レベルは、数日間、検出下限付近を維持し、4週間の終わりまでにベースラインレベルに徐々に戻り、血漿LDL−Cとの因果関係と一致した。該データは、血漿LDL低下が遊離PCSK9レベルにおける低下を反映し、インビボでのPRD460での処置後、LDLR機能を制御するPCSK9阻害と一致することを示す。薬物動態学分析は、アドネクチンPRD460の血漿半減期が該カニクイザル試験において約70時間であったことを示した。これらの発見は、PCSK9アドネクチン−Fc融合タンパク質が、カニクイザルモデルにおいてLDL−C低下に対する強力な、特異的な、かつ長期の効果で高度に有効的かつ即効性であることを示す。
PK部分(例えば、ペグ化およびFc−融合アドネクチン)を含む修飾アドネクチンに加えて、非修飾(「裸の」)PCSK9アドネクチンもまた投与することができる。非修飾PCSK9アドネクチン処置のための戦略は、より短いPK半減期に適応させるためにより頻繁な投与、または吸収相の長さを増加させ、薬物動力学効果を伸長させるために持続放出皮下製剤の使用を含む。多数のこのような製剤は、1つの例として、吸収速度を遅延させ、血中でアドネクチンへの暴露時間を増加させるためにプロピレングリコール/PBS溶液を含むことを構想することができる。
血清アルブミン結合アドネクチン(SABA)
実施例5A.候補血清アルブミン結合アドネクチンのスクリーニングおよび選択
概観
PROfusionとして知られる選択技術(例えば、Robertsら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(23):12297-12302 (1997)およびWO2008/066752参照)を、10Fn3のBC、DEおよびFGループに設計された可変領域を有するDNAライブラリーに適用した。1013個以上の分子のランダムライブラリーをこの設計から作りだし、選択圧をHSAのビオチン化形態に対して適用し、望ましい結合特性を有する候補血清アルブミン結合アドネクチン(SABA)を単離した。
種々のHSA結合アドネクチンを、ハイスループットタンパク質生産処理(HTPP)を使用して精製した。選択されたバインダーを、HIS6タグを含むpET9dベクターにクローニングし、大腸菌BL21(DE3)pLysS細胞に形質転換した。形質転換細胞を24−ウェルフォーマット中で50μg/mLのカナマイシンを含む5mlのLB培地に植菌し、37℃で一晩培養した。新鮮な5mlのLB培地(50μg/mLのカナマイシン)培養物を、誘導発現のために、一晩培養物から200μl吸引し、適当なウェルに分配することにより調製した。培養物をA600 0.6−0.9まで37℃で培養した。1mMのイソプロピル−β−チオガラクトシド(IPTG)で誘導後、培養物を30℃でさらに4時間培養し、4℃で3220×gで10分遠心分離により回収した。細胞ペレットを−80℃で冷凍した。
HSAに対する直接的バインダーをアッセイするために、MaxiSorpプレート(Nunc International, Rochester, NY)をPBS中10ug/mLのHSA(Sigma, St. Louis, MO)で4℃で一晩でコーティングし、カゼインブロックバッファー(Thermo Scientific, Rockford, IL)で室温で1−3時間ブロックした。一点スクリーニングアッセイのために、精製されたHTPPアドネクチンをカゼインブロックバッファーで1:20に希釈し、それぞれのウェル中で室温で1時間HSAに結合させた。用量応答アッセイのために、0.1nMから最大1μMの範囲の濃度を使用した。非結合アドネクチンを除去するためにPBSTで洗浄後、カゼインブロックバッファーで1:2500に希釈された抗−His mAb−HRPコンジュゲート(R&D Systems, MN)を結合His−タグ アドネクチンに室温で1時間で加えた。過剰なコンジュゲートをPBSTで洗浄することにより除去し、結合したアドネクチンを製造業者の指示にしたがってTMB検出試薬(BD Biosciences)を使用して検出した。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)をHTPPから得られるSABAにおいて実施した。HTPP由来物質のSECを、A214nmおよびA280nmでのUV検出ならびに蛍光検出(励起=280nM、発光=350nm)にて、Agilent 1100または1200HPLCシステムにおいてSUPERDEX(登録商標) 200 5/150またはSUPERDEX(登録商標) 75 5/150 カラム(GE Healthcare)を使用して実施した。100mMの硫酸ナトリウム、100mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、pH6.8のバッファーをSECカラムの適当な流速で使用した。ゲル濾過標準(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を分子量校正のために使用した。
HSA/RhSA/MuSA結合および生物物理学基準のスクリーニングの結果として、4つのユニークな(unique)血清アルブミン結合アドネクチン(SABA)が、マウスにおいて評価されたそれらの半減期を有するように同定され、選択された。インビトロおよびインビボでの特性化を行うために、中規模を4つのSABAのために行った。表6は、SABA1−26として示されるPROfusionから同定された26個のユニークなSABAコア配列の配列を提供する。SABA4は、スカフォールド変異を有し、中規模化の前に固定された。SABA4のスカフォールド−完全バージョンはSABA5である。SABA4およびSABA5は、BC、DEおよびFGループにおいて同一の配列を有する。
SABAの中規模タンパク質生産
実施例5Aに記載されている選択されたSABA、次にHis6タグを、pET 9dベクターにクローニングし、大腸菌BL21(DE3)pLysS細胞において発現させた(設計されたSABA1.1、SABA2.1、SABA3.1およびSABA5.1のそれぞれのHis−タグSABA配列について表6参照)。20mlの接種培養物(単一被覆コロニーから産生された)を使用し、50μg/mLのカナマイシンを含む1リットルのLB培地に播種する。培養物を37℃でA600 0.6−1.0まで増殖させた。1mMのイソプロピル−β−チオガラクトシド(IPTG)で誘導後、培養物を30℃でさらに4時間増殖させ、4℃で≧10,000gで30分間の遠心分離により回収した。細胞ペレットを−80℃で凍結した。細胞ペレットを、氷上でULTRA−TURRAX(登録商標)ホモジェナイザー(IKA works)を使用して、25mLの溶解バッファー(20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、1× Complete Protease Inhibitor Cocktail−EDTA free (Roche)、pH7.4)に再懸濁した。細胞溶解は、Model M−110S MICROFLUIDIZER(登録商標)(Microfluidics)を使用する高圧ホモジナイゼーション(≧18,000psi)によりなし遂げた。可溶性画分を、4℃で23,300gで30分間の遠心分離により分離した。上清を0.45μmフィルターを介して洗浄した。浄化された溶解物を20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、pH7.4で平衡化されたHISTRAP(登録商標)カラム(GE)上に負荷した。次に、カラムを、25カラム容量の20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、pH7.4、次に20カラム容量の20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、25mMのイミダゾール pH7.4、次に35カラム容量の20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、40mMのイミダゾール pH7.4で洗浄した。タンパク質を、15カラム容量の20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、500mMのイミダゾール pH7.4で溶離し、画分をA280での吸光度に基づいてプールし、1×PBS、50mMのTris、150mMのNaCl pH8.5または50mMのNaOAc;150mMのNaCl;pH4.5に対して透析した。あらゆる沈殿物が、0.22μmで濾過することにより除去された。
1つの特定のSABA、SABA1.2(配列番号:411)を、予備的製剤スクリーンのために選択した。SABA1.2は、10Fn3の「コア1」配列において(ED)5伸長を含む(表6における配列番号:421参照)。SABA1.2において、10mMのコハク酸、8%のソルビトール、5%のグリシン pH6.0および5mg/mLの生成物濃度の安定な製剤を同定した。この製剤化において、タンパク質融解温度は1.25mg/mLのタンパク質濃度を使用して示差走査熱量測定(DSC)により決定されたとき、75℃であった。該製剤は、4℃および25℃で1.2%の最初の凝集レベルを有する満足な物理化学的安定性を提供した。1月安定後、凝集レベルは非常に低かった(4℃で1.6%および25℃で3.8%)。該タンパク質はまた、−80℃および−20℃から環境温度への変化としての凍結融解の5サイクル後に該製剤中で安定であった。加えて、この製剤化において、SABA1.2は、沈殿または凝集の増加なしで4℃および環境温度で少なくとも20mg/mLのタンパク質濃度まで溶解できた。
サイズ排除クロマトグラフィー
標準サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を、中規模プロセスから得られた候補物SABAについて実施した。中規模(midscaled)材料のSECを、A214nmおよびA280nmでのUV検出ならびに蛍光検出(励起=280nM、発光=350nm)にて、Agilent 1100または1200HPLCシステムにおいてSUPERDEX(登録商標) 200 10/30またはSUPERDEX(登録商標) 75 10/30 カラム(GE Healthcare)を使用して実施した。100mMの硫酸ナトリウム、100mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、pH6.8のバッファーを、SECカラムの適当な流速で使用した。ゲル濾過標準(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を分子量校正のために使用した。
中規模SABAの示差走査熱量測定(DSC)分析を実施して、それぞれのTmを決定した。1mg/mlの溶液を、N−DSC II熱量計(Calorimetry Sciences Corp)において、3気圧下で1分当たり1℃の速度で5℃から95℃に勾配をつけることによりスキャンした。データは、Orginソフトウェア(OrginLab Corp)を使用し、最適適合を使用して、適当なバッファーのコントロール実施に対して分析した。SECおよびDSC分析の結果を表14に要約する。
表14
候補物SABAにおけるSECおよびDSC分析の要約
実施例5Aおよび5Bに記載されているHTPPおよび/または中規模材料から精製された選択されたSABAクローンの動力学を、Biasensor CM5 チップの表面上のそれぞれの血清アルブミン(HSA/RhSA/MuSA)を捕捉し、参照フロー細胞および捕捉アルブミンの両方に、濃度系列のSABAを流すことにより決定した。加えて、アルブミンへの結合を、pH5.5からpH7.4の範囲の種々のpH条件下で行った。HSA結合アドネクチン SABA2.1、SABA3.1、SABA4.1およびSABA1.1はRhSAと公差反応したが、MuSAと公差反応しなかった。SABA2およびSABA4結合はpH感受性であるが、クローンSABA3は、pH6.0に至るまでHSAへのpH抵抗性結合を証明した。SABA1.1は、pH5.5に至るまでpH抵抗性および親和性/動力学に対する生化学的基準に合う。
表15
候補物SABA(SABA1.1、2.1、3.1および4.1)の結合親和性および動力学
HSA結合アドネクチンがMuSAと交差反応しないため、マウスにおいてHSAの半減期を、マウスにおいてHSA結合アドネクチンの評価を可能にするように決定した。HSAを、20mg/kg(図23A)および50mg/kg用量(図23B)で約6週齢Ncr nude メス マウスの尾静脈に注射し、注射後間隔で採取された血液サンプルにおけるHSAの濃度をELISAにより決定した。20mg/kgおよび50mg/kgでマウスに注射されたHSAのt1/2は、それぞれ〜24時間および〜20時間であると決定された。
HSA結合クローンSABA1.1、SABA2.1、SABA3.1およびSABA4.1の1リットルの大腸菌培養物を調製し、精製し、エンドトキシンを除去した。それぞれのSABA変異体をマウスの尾静脈に注射し、注射後間隔で採取された血液サンプルにおける濃度をELISAにより決定した。
表16
SABA1.1(図26A)およびSABA5.1(図26B)の概念試験の3週間単回投与試験をカニクイザルにおいて行い、2匹のカニクイザルにおいて1mg/kg(mpk)のIV投与にて薬物動態学を評価した。薬物動態学は、血漿サンプル中のアドネクチンを検出するために開発された定量ELISAベースのアッセイを使用して評価した。SABA1.1は、96−137時間(図26Aおよび表17A)の範囲の半減期を有した。SABA5.1は、約12時間の半減期を有し、唯一、ELISAにおいて最大120時間測定可能であった(図26B)。表17Aは、SABA1.1に対するデータを要約し;表17Bは、SABA5.1に対するデータを要約する。
表17A
SABA1.1
SABA5.1
SABA1.1および1.2はHSAおよびRhSAに結合する
(ED)5伸長を含む「コア1」10Fn3であるSABA1.2(表6における配列番号:421)は、中性pHおよび25℃で8.21E+03M−1s−1の平均会合速度定数(ka)および4.43E−04s−1の平均解離速度定数(kd)、計算された55.3nMの平均Kdにてヒト血清アルブミン(HSA)に結合した(表18)。アカゲザル血清アルブミン(RhSA)について、測定された平均会合速度定数は6.6E+03M−1s−1であり、解離速度定数は3.78E−03s−1であり、580nMの計算された平均Kdであった。SABA1.2とマウスまたはラット血清アルブミン間の測定可能な相互作用は、最大1μMで観察することができなかった(表18および図27)。37℃で、kaおよびkdは2から5倍増加し、HSAに対する親和性において〜2倍増加ならびにRhSAに対する親和性において1/2となった(表18)。
表18
HBS−Pバッファー中のアルブミンへのSABA1.2結合に対する速度論的パラメーター
アルブミンの長半減期(例えば、HSAのt1/2は19日間である)は、主に、エンドソーム内部に存在する低pH条件下で新生児のFc受容体であるFcRnに結合することによりエンドサイトーシス経路からリサイクルされるという事実による。表19に示されるとおり、SABA1.2は5.5のpHでエンドソームにてHSAに強く結合し、SABA1のt1/2は、HSAに結合すると、また、FcRnリサイクルメカニズムから利益を得ることを示唆した。
表19
MESバッファー中のpH7.4および5.5でのアルブミン結合動力学の比較
アルブミン上の結合部位SABA1.2は、組換えHSAフラグメントを使用してN−末端ドメインIまたはIIにマッピングされ、ドメインIIIへの検出可能な結合は有さなかった(図29)。ドメインIIIが主にFcRnと相互作用するHSAのドメインであるため、SABA1.2がFcRnへのHSA結合に対して競合する可能性は少なく、再び、半減期の延長のためにリサイクルメカニズムを少なくとも利用する可能性を増加させる。
SABA1.2の4週間、単回投与、前毒性試験を、カニクイザルにおいて行い、2つの異なる用量レベルで薬物動態学および免疫原性を評価した。薬物動態学および免疫原性もまた、静脈内および皮下腕投与の両方を含む3週間、単回投与、前毒性試験において評価した。さらに、SABA1.2の薬物動態学を、血漿サンプル中のSABA1.2を検出するために開発された定量ELISAベースのアッセイを使用して、カニクイザルにおける2回別々、単回投与、前毒性試験において評価した。
表20
サルにおけるSABA1.2に対する薬物動態パラメーター
Claims (16)
- フィブロネクチンIII型第10ドメイン(10Fn3)を含むポリペプチドであって、該10Fn3は、BC、DEおよびFGループを有し、
BCループは配列番号:14を含み、DEループは配列番号:25を含み、FGループは配列番号:37を含むか、または
BCループは配列番号:112を含み、DEループは配列番号:138を含み、FGループは配列番号:156を含み、
該ポリペプチドは前駆タンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9型(PCSK9)に結合するポリペプチド。 - フィブロネクチンIII型第10ドメイン(10Fn3)を含むポリペプチドであって、該10Fn3は、BC、DEおよびFGループを有し、
BCループは配列番号:14を含み、DEループは配列番号:25を含み、FGループは配列番号:37を含み、
該ポリペプチドは前駆タンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9型(PCSK9)に結合するポリペプチド。 - 10nM未満のKDでPCSK9に結合する、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- 10 Fn3ドメインを含むポリペプチドであって、
配列番号:82または配列番号:209から選択される配列を含み、PCSK9に結合するポリペプチド。 - 10 Fn3ドメインを含むポリペプチドであって、
配列番号:82の配列を含み、PCSK9に結合するポリペプチド。 - 10nM未満のKDでPCSK9に結合する、請求項4または5に記載のポリペプチド。
- ポリエチレングリコールコンジュゲートをさらに含む、請求項1−6のいずれかに記載のポリペプチド。
- シアル酸コンジュゲートをさらに含む、請求項1−6のいずれかに記載のポリペプチド。
- FcまたはFcフラグメントをさらに含む、請求項1−6のいずれかに記載のポリペプチド。
- トランスフェリンアミノ酸配列をさらに含む、請求項1−6のいずれかに記載のポリペプチド。
- 血清アルブミンアミノ酸配列または血清アルブミン結合タンパク質アミノ酸配列をさらに含む、請求項1−6のいずれかに記載のポリペプチド。
- 血清免疫グロブリン結合タンパク質アミノ酸配列をさらに含む、請求項1−6のいずれかに記載のポリペプチド。
- アテローム性動脈硬化症または高コレステロール血症の処置のために使用される、請求項1−12のいずれかに記載のポリペプチド。
- 請求項1−13のいずれかに記載のポリペプチドを含む薬学的に許容される組成物。
- アテローム性動脈硬化症または高コレステロール血症の処置のために使用される、請求項14に記載の薬学的に許容される組成物。
- アテローム性動脈硬化症または高コレステロール血症の処置のために使用される薬学的に許容される組成物の製造のための、請求項1−13のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
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JP2021091702A (ja) * | 2010-04-13 | 2021-06-17 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーBristol−Myers Squibb Company | Pcsk9に結合するフィブロネクチンベースのスカフォールドドメインタンパク質 |
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