EA036055B1 - Применение полипептида, связывающего pcsk9, для лечения атеросклероза или гиперхолистеринемии - Google Patents

Применение полипептида, связывающего pcsk9, для лечения атеросклероза или гиперхолистеринемии Download PDF

Info

Publication number
EA036055B1
EA036055B1 EA201590910A EA201590910A EA036055B1 EA 036055 B1 EA036055 B1 EA 036055B1 EA 201590910 A EA201590910 A EA 201590910A EA 201590910 A EA201590910 A EA 201590910A EA 036055 B1 EA036055 B1 EA 036055B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
sequences
loop
sequence
terminal
Prior art date
Application number
EA201590910A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201590910A1 (ru
Inventor
Рей Кампхаусен
Шерон Т. Клоад
Джонатан Х. Дэвис
Фабиенне М. Денхез
Амна Саеед-Коте
Даса Липовсек
Чи Менг Лоу
Трейси С. Митчел
Джинджер С. Ракестроу
Кэти А. Руссо
Чинг-Хсиунг Фредерик Ло
Боуман Миао
Рекс А. Паркер
Дори Ф. Ситкофф
Original Assignee
Бристол-Майерс Сквибб Компани
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44065227&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA036055(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Бристол-Майерс Сквибб Компани filed Critical Бристол-Майерс Сквибб Компани
Publication of EA201590910A1 publication Critical patent/EA201590910A1/ru
Publication of EA036055B1 publication Critical patent/EA036055B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к применению полипептида, связывающего PCSK9 (пропротеин конвертазы субтилизин/кексин типа 9), для лечения атеросклероза или гиперхолистеринемии, где полипептид включает десятый домен типа III фибронектина человека (Fn3), в котором петля FG содержит последовательность формулы EXXXXXXGYXHR, где Xпредставляет собой любую аминокислоту, Xпредставляет собой Y или F, Xпредставляет собой Y, F или W и Xпредставляет собой S или A. В частном случае, указанный полипептид дополнительно включает петлю BC, содержащую последовательность формулы (X)XG, в которой Xпредставляет собой любую аминокислоту, Z представляет собой число от 6 до 9 и Xпредставляет собой Y или H. В частности, указанный полипептид также дополнительно включает петлю DE, содержащую последовательность формулы XXXX, в которой Xпредставляет собой любую аминокислоту и Xпредставляет собой G или S. Также указанный полипептид, в частном случае, дополнительно содержит одну или более фармакокинетических групп, выбранных из полиэтиленгликоля, сиаловой кислоты, Fc-фрагмента, части Fc-фрагмента, трансферрина, сывороточного альбумина, связывающего сывороточный альбумин белка и связывающего сывороточные иммуноглобулины белка.

Description

Область техники
Изобретение относится к связывающим белок-предшественник конвертазы субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9) белкам, содержащим структурный домен фибронектина. Также изобретение относится к применению данных оригинальных белков в терапевтических приложениях для лечения атеросклероза, гиперхолистеринемии и других заболеваний, связанных с повышенным уровнем холестерина. Также изобретение относится к клеткам, содержащим такие белки, полинуклеотидам, кодирующим такие белки, или их фрагментам и к векторам, содержащим полинуклеотиды, кодирующие данные оригинальные белки.
Введение
Атеросклероз - заболевание артерий, ответственное за развитие ишемической болезни сердца (ИБС), которая является причиной большинства случаев смерти в промышленно развитых странах (Lusis (2000)). В настоящее время некоторые факторы риска развития ИБС хорошо известны: дислипидемии, артериальная гипертензия, сахарный диабет, курение, плохое питание, отсутствие физической нагрузки и стресс. Наиболее клинически значимые и распространенные дислипидемии характеризуются повышением содержания липопротеидов низкой и очень низкой плотности (ЛПНП и ЛПОНП) совместно с гиперхолестеринемией при отсутствии или наличии гипертриглицеридемии (Fredrickson et al. (1967)). Отдельное повышение уровня холестерина в составе ЛПНП является одним из наиболее распространенных факторов риска развития ИБС. Белок PCSK9 (также известный как HCHOLA3, NARC-1, или FH3) является протеазой и подсемейства протеиназы К семейства секреторных субтилаз (Naureckiene et al., Arch. Biochem. Biophy., 420:55-57 (2003)). Показано, что PCSK9 является ключевым регулятором гомеостаза уровня холестерина и уровня циркулирующих липопротеидов низкой плотности. Циркулирующий белок PCSK9 контролирует метаболизм ЛПНП, непосредственно связываясь с рецептором ЛПНП и обеспечивая его деградацию в гепатоцитах. PCSK9-опосредованное снижение представленности и активности рецептора ЛПНП приводит к снижению клиренса ЛПНП из кровотока и повышению уровня ЛПНП. Известно, что некоторые мутантные формы PCSK9, в том числе S127R, N157K, F216L, R218S, и D374Y, с S127R, F216L, и D374Y связаны с аутосомно-доминантной гиперхолестеринемией (АДГ). Считается, что дикий тип PCSK9 увеличивает скорость обмена рецепторов ЛПНП и обуславливает более низкий клиренс ЛПНП (Maxwell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 102(6):2069-2074 (2005), тогда как мутации, приводящие к потере функциональности PCSK9 приводят к повышению уровня рецептора липопротеидов низкой плотности (РЛПНП), увеличению клиренса циркулирующих ЛПНП и соответствующему снижению уровня холестерина в плазме (Rashid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 102(15):5374-5379 (2005)). Таким образом, PCSK9 является потенциальной мишенью для разработки средств лечения атеросклероза, гиперхолестеринемии и других заболеваний, связанных с повышенным уровнем холестерина.
Основанные на последовательности фибронектина структуры представляют собой семейство белков, способных изменять свою структуру таким образом, чтобы связать любое целевое вещество. Белки такого типа, структуры которых обычно образованы на основе фибронектинового домена III типа (Fn3) или Fn3-подобного домена, имеют схожие функциональные свойства со свойствами природных или рекомбинантных антител (поликлональных, моноклональных или одноцепочечных), а также обладают структурными преимуществами. В частности, структура таких миметиков антител создана оптимальной для пространственной укладки, стабильности и растворимости даже в условиях, которые обычно приводят к потере структуры и функции антител. Примером структурных белков на основе фибронектина являются Аднектины (Adnexus, Bristol-Myers Squibb R & D Company).
Фибронектиновые домены III типа (Fn3) содержат следующие участки (по порядку от N-конца к Cконцу): бета- или бета-подобный участок A, петля AB, бета- или бета-подобный участок B, бета- или бета-подобный участок С, петля CD, бета- или бета-подобный участок D, петля DE, бета- или бетаподобный участок Е; петля EF, бета- или бета-подобный участок F; петля FG и бета- или бета-подобный участок G. Любая или все петли AB, BC, CD, DE, EF и FG могут принимать участие в связывании целевой молекулы. Петли BC, DE и FG являются структурными и функциональными аналогами областей определяющих комплиментарность иммуноглобулинов (CDR-участки). В патентной заявке США № 7115396 описываются белки, содержащие домены Fn3, в которых изменения в BC, DE и FG петлях приводят к высокому сродству при связывании ФНОа. В патентной заявке США № 2007/0148126 описываются белки, содержащие домены Fn3, в которых изменения в BC, DE и FG петлях приводят к высокому сродству при связывании VEGFR2.
Получение оптимизированных структурных белков, содержащих домены фибронектинового типа, связывающих PCSK9, для терапевтического применения таких белков при лечении атеросклероза, гиперхолистеринемии и других заболеваний, связанных с повышенным уровнем холестерина.
Сущность изобретения
В изобретении заявлено применение полипептида, связывающего PCSK9 (пропротеин конвертазы субтилизин/кексин типа 9), для лечения атеросклероза или гиперхолистеринемии, где полипептид включает десятый домен типа III фибронектина человека (10Fn3), в котором петля FG содержит последовательность формулы EX4X1X5X1X1X6GYX4HR (SEQ ID NO: 451), где X1 представляет собой любую аминокислоту, X4 представляет собой Y или F, X5 представляет собой Y, F или W и X6 представляет собой S
- 1 036055 или A.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения указанный полипептид связывает PCSK9 с KD менее чем 500 нМ.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения петля FG содержит фрагмент любой из последовательностей SEQ ID NO: 28-38 и 142-172, который выделен затемнением в табл. 3.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения петля FG содержит любую из последовательностей SEQ ID NO: 28-38 и 142-172.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения полипептид дополнительно включает петлю BC, содержащую последовательность формулы (Xi)ZX2G (SEQ ID NO: 449), в которой X1 представляет собой любую аминокислоту, Z представляет собой число от 6 до 9 и X2 представляет собой Y или H.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения петля BC содержит фрагмент любой из последовательностей SEQ ID NO: 2-17, 107-135 и 301-303, который выделен затемнением в табл. 3.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения петля BC содержит любую из последовательностей SEQ ID NO: 2-17, 107-135 и 301-303.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения полипептид дополнительно включает петлю DE, содержащую последовательность формулы X1X1X1X3 (SEQ ID NO: 450), в которой X1 представляет собой любую аминокислоту и X3 представляет собой G или S.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения петля DE содержит фрагмент любой из последовательностей SEQ ID NO: 18-27 и 136-141, который выделен затемнением в табл. 3.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения петля DE содержит любую из последовательностей SEQ ID NO: 18-27 и 136-141.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения последовательность петли BC, DE и FG по меньшей мере на 80% идентичны любым из последовательностей SEQ ID NO: 2-38, 107-172 и 301-303.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения последовательности петель BC, DE и FG по меньшей мере на 80% идентичны последовательностям SEQ ID NO: 14, 25 и 37 соответственно.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения полипептид содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 39-76, 173-290 и 304-309.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения полипептид содержит аминокислотную последовательность 10Fn3 домена, представляющую собой фрагмент 3-96 последовательности SEQ ID NO: 69.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения петля BC содержит последовательность SEQ ID NO: 14, петля DE содержит последовательность SEQ ID NO: 25 и петля FG содержит последовательность SEQ ID NO: 37.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения полипептид содержит SEQ ID NO: 82.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения петля BC содержит последовательность SEQ ID NO: 112, петля DE содержит последовательность SEQ ID NO: 138 и петля FG содержит последовательность SEQ ID NO: 156.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения полипептид содержит SEQ ID NO: 209.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения полипептид дополнительно содержит одну или более фармакокинетических групп, выбранных из полиэтиленгликоля, сиаловой кислоты, Fc-фрагмента, части Fc-фрагмента, трансферрина, сывороточного альбумина, связывающего сывороточный альбумин белка и связывающего сывороточные иммуноглобулины белка.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит десятый домен типа III фибронектина человека (10Fn3).
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения домен 10Fn3 связывает HSA.
Согласно одному из вариантов выполнения заявленного изобретения фармакокинетической группой является полиэтиленгликоль.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 приведено выравнивание примера аминокислотной последовательности анти-PCSK9 Аднектина. Аминокислотные последовательности петель BC, DE и FG выделены подчеркиванием, курсивом и подчеркиванием или жирным шрифтом и подчеркиванием соответственно;
на фиг. 2 изображена схема анализа PCSK9:гомологичный домен предшественника эпидермального фактора роста (домен EGFA) на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), который был применен для измерения способности PCSK9 Аднектинов ингибировать взаимодействие PCSK9:РЛПНП, как описано в примере 2;
- 2 036055 на фиг. 3 - кривая, полученная при FRET-анализе, при измерении ингибирования взаимодействия человеческого PCSK9:EGFA клонами 1459D05, 1784F03, 1813E02, 1922G04 и 1923B02 (панель A) и клонами 1459D05, 2012A04, 2011H05 и 2013E01 (панель B) PCSK9 Аднектина, как описано в примере 2;
на фиг. 4 - кривая, полученная при FRET-анализе, при измерении ингибирования взаимодействия человеческого PCSK9:ATI000972 клонами 1459D05, 1784F03, 1813E02, 1922G04 и 1923B02 (панель A) и клонами 2012A04, 2011H05 и 2013E01 (панель B) PCSK9 Аднектина, как описано в примере 2;
на фиг. 5 показана активность клонов 1459D05, 1784F03, 1813E02, 1922G04 и 1923В02 (панель A) и клонов 2012A04, 2011H05 и 2013E01 (панель B) PCSK9 Аднектина при прямом FRET-анализе связывания PCSK9 человека, как это описано в примере 2;
на фиг. 6 приведено ингибирование активности PCSK9 в клетках линии HepG2, измеренное с помощью метода поглощения DiI-ЛПНП клетками, как это описано в примере 2;
на фиг. 7 показано ингибирование индуцированного PCSK9 снижения количества РЛПНП на поверхности клеток линии HepG2 с помощью PCSK9 Аднектина, экспрессируемого клонами 1459D05, 1784F03, 2012A04 и 2011H05 (панель A) и 2011H05, 2012A04 и 2013E01 (панель B), как это описано в примере 2. Показатель EC50 (нМ) для клонов 1784F03, 2012A04, 2011H05 и 2013Е01 составляет 15.98, 7.78, 8.85 и 12.41 соответственно. Процентный уровень ингибирования PCSK9 при концентрации 75 нМ PCSK9 Аднектина клонов 1459D05, 1784F03, 2012А04, 2011Н05 и 2013Е01 составляет 66.8, 150.2, 190.1, 177.4 и 152.2 соответственно;
на фиг. 8 демонстрируется эффект введения PCSK9 Аднектина ATI000959 (100 мг/кг) на уровень холестерина в плазме (панель A) и на уровень несвязанного hPCSK9 в плазме (панель B) мышам трансгенной линии, экспрессирующим на высоком уровне hPCSK9, как это описано в примере 3. Вариант ATI000959 содержит разветвленный ПЭГ (NOF) массой 40 кДа;
на фиг. 9 демонстрируется эффект введения PCSK9 Аднектина ATI001114 (10 или 60 мг/кг) на уровень холестерина в плазме (панель A) и на уровень несвязанного hPCSK9 в плазме (панель B) мышам трансгенной линии, экспрессирующим на высоком уровне hPCSK9, как это описано в примере 3;
на фиг. 10 - эффект введения PCSK9 Аднектинов ATI000959 (панель A) или ATI001114 (панель B), введенных в количестве 5 мг/кг внутрибрюшинно (i.p.), в однократной дозе, на уровень свободного hPCSK9 в сыворотке мышей трансгенной линии с нормальным уровнем экспрессии hPCSK9 (среднее значение ± SD), как это описано в примере 3;
на фиг. 11 показана дозозависимость эффекта PCSK9 Аднектина ATI001114 на уровень свободного hPCSK9 у мышей трансгенной по hPCSK9 линии с нормальным уровнем экспрессии, как это описано в примере 3;
на фиг. 12 - эффект однократного введения PCSK9 Аднектина ATI001114 (5 мг/кг i.v.) на снижение количества ЛПНП-С у яванских макак (среднее +/- SEM, n=3), как это описано в примере 3;
фиг. 13 - определение аффинности и стехиометрических показателей связывания PCSK9 Аднектина с hPCSK9, определенные с помощью ITC. PCSK9 Аднектины связываются с hPCSK9 в соотношении 1:1. В левой части фигуры приведены данные для PCSK9 Аднектина ATI001081, в правой части для PCSK9 Аднектина ATI001174;
фиг. 14 - ингибирование сигнала PCSK9:EGFA (левая панель) и PCSK9:ATI-972 (правая панель) PCSK9 Аднектинами при анализе с помощью FRET;
фиг. 15 - ингибирование индуцированного PCSK9 снижения количества РЛПНП на поверхности клеток линии HepG2 под влиянием анти-PCSK9 Аднектинов;
фиг. 16 - ингибирование проникновения PCSK9-AF647 в клетки линии HepG2;
фиг. 17 - уровень свободного hPCSK9 в плазме у трансгенных мышей при введении PRD460 (вводимого i.p.);
фиг. 18 - эффект введения PRD460 (15 мг/кг i.v.) на уровень ЛПНП-С и свободного PCSK9 у яванских макак (среднее +/- SEM, n=3);
фиг. 19 - эффект ATI-1081 (также обозначенного ATI001081) на уровень свободного PCSK9 у яванских макак;
фиг. 20 - эффект ATI-1081 на уровень ЛПНП-С у яванских макак;
фиг. 21 - эффект ATI-1081 в PBS при введении трансгенным мышам. На данной фигуре приведены данные об уровне свободного PCSK9 в плазме у трансгенных мышей;
фиг. 22 - эффект подкожного введения ATI-1081 в полиэтиленгликоле трансгенным мышам. На данной фигуре приведены данные об уровне свободного hPCSK9 у трансгенных мышей;
фиг. 23 - время полужизни HSA у мышей (in vivo). HSA вводился бестимусным мышам в дозах 20 мг/кг (левая панель) и 50 мг/кг (правая панель);
фиг. 24 - определение времени полужизни SABA1.1 (панель A), SABA2.1 (панель B), SABA3.1 (панель С) и SABA4.1 (панель D) при введении мышам;
фиг. 25 - график, демонстрирующий увеличение времени полужизни SABA1-4 при одновременном введении с HSA мышам;
фиг. 26 - определение времени полужизни в плазме SABA1.1 (панель A) и SABA5.1 (панель B) у яванского макака;
- 3 036055 фиг. 27 - анализ связывания SABA1.2 с альбуминами человека, мыши и крысы с помощью прямого
ИФА. Определение стехиометрических показателей связывания SABA1.1 и HSA. Стехиометрия данного связывания - 1:1;
фиг. 29 - анализ связывания SABA1.2 с фрагментами рекомбинантного домена HSA с помощью системы BIACORE®;
фиг. 30 - профиль фармакокинетики SABA1.2 у яванских макак при введении в дозировках 1 мг/кг и 10 мг/кг;
фиг. 31 - профиль фармакокинетики SABA1.2 у обезьян при введении внутривенно или подкожно в дозировке 1 мг/кг.
Подробное описание изобретения
Определения.
Под термином полипептид подразумевается любая последовательность из двух или более аминокислот, независимо от длины, посттрансляционных модификаций или функции. Термины полипептид, пептид и белок используются в данном документе равноправно. Полипептиды могут включать как природные, так и неприродные аминокислоты, такие как описанные в заявке U.S. Patent № 6559126 и включенные в данное изобретение посредством ссылки. Полипептиды также могут быть модифицированы с помощью любого из разнообразных стандартных химических способов (например, аминокислота может быть модифицирована с помощью защитной группы, C-концевой карбоксил может быть трансформирован в амидную группу, N-концевой аминокислотный остаток может быть модифицирован с помощью различных групп для повышения липофильности, также полипептид может быть химически гликозилирован или модифицирован другим способом для повышения стабильности и времени полужизни in vivo). Модификации полипептидов могут включать присоединение других структур, например циклических соединений или других молекул к полипептиду. Также полипептиды могут содержать один или более аминокислотных остатков с измененной конфигурацией (например, R, или S, или L, или D). Пептиды, описанные в настоящем изобретении, представляют собой модифицированные производные десятого домена III типа фибронектина, измененные таким образом, чтобы специфически связывать PCSK9. Данные пептиды здесь обозначены следующими названиями: анти-PCSK9 Аднектин или PCSK9 Аднектин.
Термин РК является акронимом термина фармакокинетический и обозначает различные свойства химического вещества, включая, например, абсорбцию, распределение, обмен и выведение субъектом. Термины РК модулирующий белок или РК группа обозначают любой белок, пептид или агент, которые влияют на фармакокинетические свойства биологически активной молекулы, когда они слиты вместе или вводятся в организм совместно с биологически активной молекулой. Примерами РК модулирующих белков или РК-групп являются ПЭГ, вещества, связывающие сывороточный альбумин человека (HSA) (как описано в патентных заявках U.S. Publication № 2005/0287153 и 2007/0003549, PCT Publication № WO 2009/083804 и WO 2009/133208, и молекулы SABA, как описано в данной заявке), сывороточный альбумин человека, Fc-фрагмент или его части и варианты, и сахара (например, сиаловые кислоты).
Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности в заявке определяется как процент аминокислотных остатков кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам выбранной последовательности, после выравнивания последовательностей и введения, при необходимости, пробелов, для достижения максимального процента идентичности последовательности, и рассмотрения любых консервативных замен как отличающейся части сравниваемых последовательностей. Выравнивание для определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть построено различными способами, известными специалистам в соответствующей области, например, с помощью общедоступных компьютерных программ, таких как BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 или Megalign (DNASTAR®). Специалисты в соответствующей области могут определить подходящие параметры для оценки выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания на протяжении всей длины сравниваемых последовательностей.
Термин выделенный применяется для полипептида, который был идентифицирован и выделен из состава его природного окружения. Загрязняющие компоненты природного окружения пептида представляют собой вещества, которые могут мешать диагностическим или терапевтическим применениям данного полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах исполнения полипептид будет очищен: (1) до более чем 95 вес.% при определении методом Лоури и, в наиболее предпочтительных, до более чем 99 вес.%; (2) до степени чистоты, достаточной для выявления, по крайней мере, N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности при использовании секвенатора с вращающимся стаканом; или (3) до гомогенности по результатам ДСН-ПААГ электрофореза в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с окрашиванием кумасси синим или, предпочтительно, серебром. Термин выделенный полипептид включает полипептид в рекомбинантных клетках in situ, так как по крайней мере один компонент естественного окружения полипептида отсутствует. Обычно, однако, выделенный полипептид получают с применением по меньшей мере одной стадии очистки.
- 4 036055
Условное обозначение mpk, мг/кг или мг на кг используется для обозначения дозировки вещества на кг веса. Все эти условные обозначений используются равноправно на протяжении всего данного документа.
Термин время полужизни аминокислотной последовательности или соединения может быть в целом определен как время, необходимое для снижения концентрации полипептида в сыворотке на 50% in vivo, например, вследствие деградации последовательности или соединения и/или выведения или изоляции последовательности или соединения с помощью естественных механизмов. Время полужизни может быть определено любым известным способом, например, путем фармакокинетического анализа. Подходящие методы известны специалисту в соответствующей области, и могут, например, обычно, включать этапы: введения приматам подходящим способом подходящих доз исследуемой аминокислотной последовательности или соединения, описываемых в настоящем изобретении; регулярный сбор образцов крови или других образцов у указанных приматов; определения уровня или концентрации введенной аминокислотной последовательности или соединения в указанных образцах крови и вычисления, на основе полученных таким образом данных, времени, достаточного для того, чтобы уровень или концентрация аминокислотной последовательности или соединения, описываемых в данном изобретении, была снижена на 50% по сравнению с исходным уровнем при введении. Для примера см. стандартные руководства, например Kenneth A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists и Peters et al., Pharmacokinete Analysis: A Practical Approach (1996). Также см. Gibaldi M. et al., Pharmacokinetics, 2nd Rev. Edition, Marcel Dekker (1982).
Время полужизни может быть выражено с использованием таких показателей, как t1/2-alpha, t1/2-beta, HL_Lambda_z и площадь под кривой (AUC). В настоящем описании увеличением времени полужизни обозначается повышение любого из указанных показателей, любых двух из этих параметров, любых трех из этих параметров или всех четырех параметров. Увеличение времени полужизни, в частности, обозначает повышение t1/2-beta и/или HL_Lambda_z, либо совместно, либо нет, с повышением t1/2-alpha и/или AUC.
Обзор.
Данная заявка описывает Аднектины против PCSK9 человека. Для определения специфических антагонистов для PCSK9 молекулы PCSK9 были презентированы для большой синтетической библиотеки Аднектинов. Связавшиеся с PCSK9 Аднектины были охарактеризованы по связыванию с PCSK9, биофизическим свойствам и ингибиторной активности по отношению к PCSK9. Отобранные пулы Аднектинов были подвергнуты мутагенезу и последующим раундам отбора при снижении концентрации связываемого агента и выделения Аднектинов с низкой константой диссоциации. После осуществления описанного процесса оптимизации была отобрана группа Аднектинов, специфически ингибирующих PCSK9, с желаемыми биохимическими и биофизическими свойствами.
В заявке описаны полипептиды, содержащие домен Fn3, в котором одна или более петель, доступных для растворителя, имеют случайную или мутантную первичную последовательность. В некоторых вариантах исполнения такой Fn3 домен представляет собой модифицированный относительно дикого типа домен Fn3, полученный из десятого модуля фибронектинового домена III типа человека (10Fn3). В некоторых вариантах исполнения такой 101и3-полипептид, описанный в данной заявке, является по меньшей мере на 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% идентичным домену 10Fn3 человека.
В некоторых вариантах исполнения одна или более петель из группы BC, DE и FG может быть длиннее или короче соответствующей петли фибронектина человека.
В некоторых вариантах исполнения полипептиды, описанные в данном изобретении, содержат десятый фибронектиновый домен III типа (10Fn3), в котором домен 10Fn3 содержит петли AB, BC, CD, DE, EF и FG и по меньшей мере одну петлю из группы: BC, DE и FG с изменением в первичной последовательности относительно последовательности в соответствующей петле домена 10Fn3 человека.
В некоторых вариантах исполнения полипептид, описанный в данном изобретении, содержит домен Fn3, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичную последовательности непетлевых участков.
В некоторых вариантах исполнения петля BC белка, описываемого в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 217, 106-135 и 301-303. В определенных вариантах исполнения петля BC белка, описываемого в настоящем изобретении, содержит затемненные участки любой из последовательностей SEQ ID NO: 2-17, Юб135 и 301-303, как показано в табл. 3. Например, в одном варианте исполнения петля BC содержит последовательность PPPSHGYG (остатки 3-10 последовательности SEQ ID NO: 2), DAPAHAYG (остатки 310 последовательности SEQ ID NO: 5), EPFSRLPGGGE (остатки 3-13 последовательности SEQ ID NO: 106) или DAPADGGYG (остатки 3-11 последовательности SEQ ID NO: 107).
В некоторых вариантах исполнения петля DE белка, описываемого в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из следующей группы: SEQ ID NO 18-27 и 136-141. В определенных вариантах исполнения петля DE белка, описываемого в настоящем изобретении, содержит затемненные участки любой из последовательностей SEQ ID NO: 18-27 и 136-141, как показано в табл. 3. Например, в одном варианте исполнения петля DE содержит последовательность
- 5 036055
PGKG (остатки 2-5 последовательности SEQ ID NO: 18), VGVG (остатки 2-5 последовательности SEQ ID
NO: 27) или VSKS (остатки 2-5 последовательности SEQ ID NO: 137).
В некоторых вариантах исполнения петля FG белка, описываемого в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из следующей группы последовательностей: SEQ ID NO: 28-38 и 142-172. В определенных вариантах исполнения петля DE белка, описываемого в настоящем изобретении, содержит затененные участки любой из последовательностей SEQ ID NO: 28-38 и 142-172, как показано в табл. 3. Например, в одном варианте исполнения петля FG содержит последовательность EYPYKHSGYYHR (остатки 1-12 последовательности SEQ ID NO: 28), EYPYDYSGYYHR (остатки 1-12 последовательности SEQ ID NO: 142) или EFDFVGAGYYHR (остатки 1-12 последовательности SEQ ID NO: 167).
В некоторых вариантах исполнения домен 10Fn3 может содержать измененные аминокислотные остатки в начале и/или на конце последовательности, а также инсерции или делеции.
В некоторых вариантах исполнения белок, описываемый в данном изобретении, содержит одну петель BC SEQ ID NO: 2-17, 106-135 и 301-303; одну из последовательностей петель DE SEQ ID NO: 18-27 и 136-141; одну последовательностей петли FG SEQ ID NO: 28-38 и 142-172. В определенных вариантах исполнения белок, описываемый в данном изобретении, содержит одну последовательность петли BC, включающей затененную часть любой из последовательностей SEQ ID NO: 2-17, 106-135 и 301-303, показанных в табл. 3; одну последовательность петли DE, включающей затененную часть любой из последовательностей SEQ ID NO: 18-27 и 136-141, показанных в табл. 3; и одну последовательность петли FG, включающей затененную часть любой из последовательностей SEQ ID NO: 28-38 и 142-172, показанных в табл. 3.
В некоторых вариантах исполнения белок, описываемый в данном изобретении, содержит аминокислотные последовательности петель BC, DE и FG совпадающие по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% с любой из последовательностей SEQ ID NO: 2-38, 106-172 и 301-303. В определенных вариантах исполнения белок, описываемый в данном изобретении, содержит аминокислотные последовательности петель BC, DE и FG, совпадающие по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% с любой из затененных частей последовательностей петель BC, DE и FG, показанных в табл. 3, как это описано ранее.
В некоторых вариантах исполнения анти-PCSK9 Аднектин содержит аминокислотную последовательность любой из последовательностей SEQ ID NO: 39-76, 173-290 и 304-309.
В некоторых вариантах исполнения последовательность αнти-PCSK9 Аднектина содержит с 3 по 96 позиции аминокислотной последовательности домена Fn3 любой из последовательностей SEQ ID NO: 39-76, 173-290 и 304-309.
Также в заявке описан анти-PCSK9 Аднектин, содержащий петлю BC с последовательностью SW(X1)ZX2G (SEQ ID NO: 323), в которой X1 представляет собой любую аминокислоту, Z - число от 6 до 9 и X2 представляет собой Y или H.
Также в заявке описан анти-PCSK9 Аднектин, содержащий петлю DE с последовательностью PX1X1X1X3T, (SEQ ID NO: 324), в которой X1 представляет собой любую аминокислоту, а X3 является либо G либо S.
Также в заявке описан анти-PCSK9 Аднектин, содержащий петлю FG с последовательностью EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQ ID NO: 325), в которой X1 представляет собой любую аминокислоту, X4 является Y или F, X5 является Y, F или W, X6 является либо S, либо A. В определенных вариантах исполнения X4 и X5 представляют собой ароматические остатки, каждый из которых независимо является Y, F, W или H.
Также в заявке описан анти-PCSK9 Аднектин, содержащий петлю BC с последовательностью SW(X1)ZX2G (SEQ ID NO: 323), петлю DE с последовательностью PX1X1X1X3T (SEQ ID NO: 324) и петлю FG с последовательностью EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQ ID NO: 325), как определено в данной заявке.
Также в заявке описан анти-PCSK9 Аднектин, содержащий петлю BC с последовательностью SWEPFSRLPGGGE (SEQ ID NO: 106), петлю DE с последовательностью PX1X1X1X3T (SEQ ID NO: 324) и петлю FG с последовательностью EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQ ID NO: 325) как определено в данной заявке.
Также в заявке описан анти-PCSK9 Аднектин, содержащий петлю BC с последовательностью (X1)ZX2G (SEQ ID NO: 449), в которой X1 представляет собой любую аминокислоту, Z - число в диапазоне 6-9, а X2 представляет собой Y или H.
Также в заявке описан анти-PCSK9 Аднектин, содержащий петлю DE с последовательностью X1X1X1X3, (SEQ ID NO: 450), в которой X1 является любой аминокислотой, X3 представляет собой G или S.
Также в заявке описан анти-PCSK9 Аднектин, содержащий петлю FG с последовательностью EX4X1X5X1X1X5GYX4HR (SEQ ID NO: 451), в которой X1 представляет собой любую аминокислоту, X4 представляет собой Y или F, X5 представляет собой Y, F, или W, X6 представляет собой S или A. В определенных вариантах исполнения X4 и X5 представляют собой остатки ароматических аминокислот, каждая из которых, независимо, может быть Y, F, W или H.
Также в заявке описан анти-PCSK9 Аднектин, содержащий петлю BC с последовательностью
- 6 036055 (X1)ZX2G (SEQ ID NO: 449), петлю DE с последовательностью X1X1X1X3 (SEQ ID NO: 450) и петлю FG с последовательностью EX4X1X5X1X1X6GYX4HR (SEQ ID NO: 451), как определено в данной заявке.
В некоторых вариантах исполнения существует по меньшей мере одна аминокислотная делеция на
N-конце последовательности PCSK9 Аднектина.
В некоторых вариантах исполнения существует по меньшей мере одна аминокислотная делеция, инсерция или замена на C-конце последовательности PCSK9 Аднектина.
В некоторых вариантах исполнения на С-конец последовательности PCSK9 Аднектина добавлена линкерная последовательность.
В некоторых вариантах исполнения PCSK9 Аднектин может быть конъюгирован с другой молекулой, нежели 10Fn3, такой как сывороточный альбумин человека (HSA), как это описано в патентных заявках WO 2009/133208 и WO 2009/083804.
В некоторых вариантах исполнения PCSK9 Аднектин может содержать мутации в аминокислотных последовательностях петель AB, CD и EF, как это описано в патентных заявках WO 2009/133208 и WO 2009/083804.
Также в заявке описан PCSK9 Аднектин, содержащий фармакокинетическую группу (РК). В одном варианте исполнения фармакокинетическая группа содержит полиэтиленгликоль (ПЭГ). В отдельных вариантах исполнения фармакокинетическая группа содержит Fc-фрагмент. В некоторых вариантах исполнения фармакокинетическая группа содержит один или несколько Аднектинов, связывающих сывороточный альбумин. Примеры слитых белков анти-PCSK9 Аднектин-Fc приведены в табл. 1. Примеры анти-PCSK9 Аднектинов, связывающих сывороточный альбумин, содержат последовательности SEQ ID NO: 618 или 619.
В определенных вариантах исполнения анти-PCSK9 Аднектины, содержащие РК-группу, содержат последовательность, как указана в SEQ ID NO: 322.
Также в заявке описан анти-PCSK9 Аднектин, не содержащий никакой РК-группы (т.е. свободный анти-PCSK9 Аднектин). В определенных вариантах исполнения свободный анти-PCSK9 Аднектин может вводиться с такой частотой, которая достаточна для достижения желаемого терапевтического эффекта. В другом варианте исполнения свободный анти-PCSK9 Аднектин может вводиться в виде лекарственной формы с пролонгированным высвобождением (например, лекарственная форма для подкожного введения). В некоторых вариантах исполнения лекарственная форма с пролонгированным высвобождением увеличивает длительность фазы абсорбции, или продлевает фармакодинамическое воздействие, или оказывает оба эффекта сразу. В качестве примера, лекарственная форма с пролонгированным высвобождением содержит раствор пропиленгликоля в фосфатном буфере (PBS).
Также в заявке описан слитый полипептид, содержащий связывающий сывороточный альбумин десятый домен III типа фибронектина (10Fn3), и анти-PCSK9 Аднектин, в котором связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 связывается с сывороточным альбумином, например HSA, с Kd 1 мкМ или меньше. В определенных вариантах исполнения связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную последовательности SEQ ID NO: 330. В одном из вариантов исполнения связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 содержит петлю BC с аминокислотной последовательностью, приведенной в последовательности SEQ ID NO: 331, петлю DE с аминокислотной последовательностью, приведенной в последовательности SEQ ID NO: 332, петлю FG с аминокислотной последовательностью, приведенной в последовательности SEQ ID NO: 333. В другом варианте исполнения связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 содержит одну или более петель BC с аминокислотной последовательностью, приведенной в последовательности SEQ ID NO: 331, петель DE с аминокислотной последовательностью, приведенной в последовательности SEQ ID NO: 332, петель FG с аминокислотной последовательностью, приведенной в последовательности SEQ ID NO: 333.
В одном из вариантов исполнения данный связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 из состава слитого полипептида также способен связывать один или несколько альбуминов: сывороточный альбумин макаки-резус (RhSA), сывороточный альбумин яванской макаки (CySA) или сывороточный альбумин мыши (MuSA). В других вариантах исполнения данный связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 не обладает перекрестной реактивностью с одним или несколькими белками среди RhSA, CySA или MuSA.
В определенных вариантах исполнения связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 в составе слитого полипептида связывает HSA с Kd 1 мкМ или менее. В некоторых вариантах исполнения данный связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 связывает HSA с Kd 500 нМ или менее. В других вариантах исполнения данный связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 связывает HSA с Kd по меньшей мере 200, 100, 50, 20, 10 или 5 нМ.
В других вариантах исполнения связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 в составе слитого полипептида связывается с доменами HSA I или II. В одном варианте исполнения связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 связывает оба домена HSA (I и II). В некоторых вариантах исполнения связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 связывает HSA в диапазоне рН от 5,5 до 7,4. В других вариантах исполнения связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 связывает HSA с Kd
- 7 036055
200 нМ или менее при рН 5.5. В других вариантах исполнения связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 связывает HSA с Kd, по меньшей мере, 500, 200, 100, 50, 20, 10 или 5 в диапазоне от рН 5.5 до 7.4. В одном варианте исполнения связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 связывает HSA с Kd по меньшей мере 500, 200, 100, 50, 20, 10 или 5 нМ при рН 5.5.
В некоторых вариантах исполнения период полужизни в плазме слитого полипептида в присутствии сывороточного альбумина по меньшей мере в 5 раз больше, чем период полужизни этого полипептида в отсутствие сывороточного альбумина. В определенных вариантах исполнения период полужизни в плазме слитого полипептида в присутствии сывороточного альбумина по меньшей мере в 2, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 22, 25, 27 или 30 раз выше, чем период полужизни этого полипептида в отсутствие сывороточного альбумина. В некоторых вариантах исполнения сывороточным альбумином является один из следующих альбуминов: HSA, RhSA, CySA или MuSA.
В определенных вариантах исполнения период полужизни в плазме слитого полипептида в присутствии сывороточного альбумина составляет по меньшей мере 20 ч. В определенных вариантах исполнения период полужизни в плазме слитого полипептида в присутствии сывороточного альбумина составляет по меньшей мере 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 90, 100, 110, 120, 130, 150, 170 или 200 ч. В некоторых вариантах исполнения период полужизни слитого полипептида определяется у приматов (например, человек или обезьяна) или у мышей.
В любом из описанных вариантов исполнения связывающий сывороточный альбумин домен 10Fn3 содержит последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 334, 338, 342, 346 и 348-370.
Структуры на основе фибронектина.
В данной заявке описаны полипептиды, содержащие домен Fn3, в котором последовательности одной или нескольких петель, доступных для растворителя, подвергнуты случайному или направленному мутагенезу. В некоторых вариантах исполнения домен Fn3 представляет собой Fn3 домен, полученный из последовательности дикого типа десятого домена III типа фибронектина человека (10Fn3)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVOEFTVPGSK
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ Ш NO: 1).
В указанной последовательности 10Fn3 подчеркнуты петли BC, DE и FG.
Как описано в данной заявке, последовательности 10Fn3, не связывающие лиганды, т.е. являющиеся структурными участками 10Fn3, могут быть изменены в такой степени, чтобы домен 10Fn3 сохранял функции связывания лигандов и/или структурную стабильность. Описано большое количество различных мутантных вариантов структурных участков 10Fn3. В одном из объектов данного изобретения один или более аминокислотных остатков из Asp 7, Glu 9 и Asp 23 заменены на другие аминокислотные остатки, например на неотрицательно заряженные (например, Asn, Lys и др.). Было показано, что такие замены повышают стабильность 10Fn3 при нейтральных значениях рН по сравнению с доменом 10Fn3 дикого типа (см. PCT Publication № WO 02/04523). Описано большое количество дополнительных изменений структурных участков домена 10Fn3, которые либо оказывают полезный, либо нейтральный эффект. См., например, Batori et al., Protein Eng., 15(12): 1015-1020 (Dec. 2002); Koide et al., Biochemistry, 40(34):1032610333 (Aug. 28, 2001).
И мутантный, и дикий тип домена 10Fn3 обладают сходной структурой, описываемой как 7 бетаучастков, обозначаемых буквами от A до G, и 6 петлевых областей (петли AB, BC, CD, DE и FG), соединяющих упомянутые бета-участки. Бета-участки, расположенные наиболее близко к N и C-концам молекулы, могут принимать бета-подобную конформацию в растворе. В последовательности SEQ ID NO: 1 петле АВ соответствуют остатки 15-16, петле BC соответствуют остатки 21-30. Петле CD соответствуют остатки 39-45, петле DE соответствуют остатки 51-56, петле EF соответствуют остатки 60-66, петле FG соответствуют остатки 76-87 (Xu et al., Chemistry & Biology, 9:933-942 (2002)).
В некоторых вариантах исполнения последовательность полипептида 10Fn3 может быть по меньшей мере на 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% идентична последовательности домена 10Fn3 человека, указанной в последовательности SEQ ID NO: 1. Большая часть вариабельности будет, как правило, приходиться на одну или несколько петель. Последовательности каждого из бета и бета-подобных участков полипептида 10Fn3 могут почти полностью состоять из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентична последовательностям соответствующих бета или бета-подобных участков последовательности SEQ ID NO: 1, таким образом, что отличия не нарушают стабильность полипептида при физиологических условиях.
В некоторых вариантах исполнения данное изобретение включает полипептиды, содержащие десятый домен III типа фибронектина (10Fn3), в котором указанный домен 10Fn3 содержит петлю AB, петлю BC, петлю CD, петлю DE, петлю EF и петлю FG, при этом последовательность по крайней мере одной из петель BC, DE, и FG изменена относительно последовательности соответствующей петли домена 10Fn3 человека. В некоторых вариантах исполнения изменены последовательности петель BC и FG, в некоторых вариантах исполнения изменены последовательности петель BC, DE и FG, т.е. домен Fn3 содержит петли, структура которых отличается от таковых у природного домена. В некоторых вариантах исполне- 8 036055 ния изменены последовательности петель AB, CD и/или EF. Под изменением понимается наличие одного или более отличий между данной аминокислотной последовательностью и референсной (соответствующий домен фибронектина человека). Изменение включает в себя вставки, делеции и замены аминокислотных остатков. Изменение аминокислотной последовательности может быть достигнуто через введение направленных, ненаправленных или спонтанных изменений последовательности, как правило, на уровне кодирующей последовательности и может осуществляться любым способом, например ПЦР, ошибочной ПЦР или химическим синтезом ДНК.
В некоторых вариантах исполнения длина одной или более петель из группы BC, DE и FG, может отличаться от последовательности соответствующей петли фибронектина человека в большую и меньшую сторону. В некоторых вариантах исполнения длина петли может быть увеличена на 2-25 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах исполнения длина петли может быть уменьшена на 1-11 аминокислотных остатков. Таким образом, для оптимизации связывания антигена длина какой-либо петли домена 10Fn3 может быть изменена по длине, а также по аминокислотной последовательности для достижения наилучшей возможной гибкости и аффинности при связывании антигена.
В некоторых вариантах исполнения полипептид содержит домен Fn3, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98, 99 ил 100% идентичную не петлевым участкам последовательности SEQ ID NO: 1, в которой по крайней мере одна петля из группы BC, DE и FG является измененной. В некоторых вариантах исполнения измененная последовательность петли BC содержит до 10 аминокислотных замен, до 4 делеций и до 10 инсерций аминокислотных остатков или комбинации данных изменений. В некоторых вариантах исполнения измененная последовательность петли DE содержит до 6 аминокислотных замен, до 4 делеций и до 13 инсерций аминокислотных остатков или комбинации данных изменений. В некоторых вариантах исполнения измененная последовательность петли FG содержит до 12 аминокислотных замен, до 11 делеций и до 25 инсерций аминокислотных остатков или комбинации данных изменений.
Как описано выше, аминокислотные остатки, соответствующие остаткам в позициях 21-30, 51-56 и 76-87 последовательности SEQ ID NO: 1, соответствуют петлям BC, DE и FG соответственно. Однако следует понимать, что не каждый аминокислотный остаток в области петли должен быть изменен для того, чтобы получить высокую аффинность 10Fn3 к выбранной мишени (например, к PCSK9).
Например, нет необходимости изменять остатки 21 (S) и 22 (W) петли BC, как указано в последовательности SEQ ID NO: 1, для связывания с PCSK9. Т.е. домены 10Fn3 с высокой аффинностью связывания PCSK9 могут быть получены при изменении остатков только в позициях 23-30 петли BC, как она показана в последовательности SEQ ID NO: 1. Это наглядно показано на примерах последовательностей петли BC, приведенных в табл. 3, где показано, что изменены только аминокислотные остатки в затемненных позициях приведенных последовательностей. Таким образом, в некоторых вариантах исполнения петля BC в соответствии с данным обозначением содержит затемненную часть любой из последовательностей SEQ ID NO: 2-17, 106-135 и 301-303, как это отражено в табл. 3. Например, в одном из вариантов исполнения петля BC может содержать последовательность PPPSHGYG (остатки 3-10 последовательности SEQ ID NO: 2), DAPAHAYG (остатки 3-10 последовательности SEQ ID NO: 5), EPFSRLPGGGE (остатки 3-13 последовательности SEQ ID NO: 106) или DAPADGGYG (остатки 3-11 последовательности SEQ ID NO: 107).
Сходным образом, нет необходимости изменять аминокислотные остатки в позициях 51 (P) и 56 (T) петли DE последовательности SEQ ID NO: 1 для связывания с PCSK9. Т.е. домены 10Fn3 с высокой аффинностью связывания PCSK9 могут быть получены при изменении остатков только в позициях 52-55 петли DE, как она показана в последовательности SEQ ID NO: 1. Это наглядно показано на примерах последовательностей петли DE, приведенных в табл. 3, где показано, что изменены только аминокислотные остатки в затемненных позициях приведенных последовательностей. Таким образом, в некоторых вариантах исполнения петля DE в соответствии с данным обозначением содержит затемненную часть любой из последовательностей SEQ ID NO: 18-27 и 136-141, как это отражено в табл. 3. Например, в одном из вариантов исполнения петля DE может содержать последовательность PGKG (остатки 2-5 последовательности SEQ ID NO: 18), VGVG (остатки 2-5 последовательности SEQ ID NO: 27) или VSKS (остатки 2-5 последовательности SEQ ID NO: 137).
Сходным образом, нет необходимости изменять аминокислотные остатки в позиции 87 (Р) петли FG последовательности SEQ ID NO: 1 для связывания с PCSK9. Т.е. домены 10Fn3 с высокой аффинностью связывания PCSK9 могут быть получены при изменении остатков только в позициях 76-86 петли FG, как она показана в последовательности SEQ ID NO: 1. Это наглядно показано на примерах последовательностей петли FG, приведенных в табл. 3, где показано, что изменены только аминокислотные остатки в затемненных позициях приведенных последовательностей. Таким образом, в некоторых вариантах исполнения петля FG в соответствии с данным обозначением содержит затемненную часть любой из последовательностей SEQ ID NO: 28-38 и 142-172, как это отражено в табл. 3. Например, в одном из вариантов исполнения петля FG может содержать последовательность EYPYKHSGYYHR (остатки 1-12 последовательности SEQ ID NO: 28), EYPYDYSGYYHR (остатки 1-12 последовательности SEQ ID NO: 142) или EFDFVGAGYYHR (остатки 1-12 последовательности SEQ ID NO: 167).
- 9 036055
В некоторых вариантах исполнения настоящая заявка демонстрирует, что петли BC, DE и FG могут быть в общем виде описаны соответствующими консенсусными последовательностями. Например, петля BC может быть в общем виде описана с помощью консенсусой последовательности SW(X1)ZX2G (SEQ ID NO: 323), в которой X1 представляет собой любую аминокислоту, Z является числом от 6 до 9, X2 представляет собой Y или Н. Данная консенсусная последовательность представлена в виде примеров последовательностей петель BC в табл. 3, за исключением петли BC, определяемой последовательностью SEQ ID NO: 106. В других вариантах исполнения Z является числом от 2 до 5. В определенных вариантах исполнения, X2 является остатком любой ароматической аминокислоты (т.е. Y, F, W или Н).
В другом варианте исполнения петля DE может в общем виде быть выражена с помощью консесусной последовательности PX1X1X1X3T, (SEQ ID NO: 324), в которой X1 представляет собой любую аминокислоту, X3 представляет собой G или S. Данная консенсусная последовательность представлена в виде примеров последовательностей петель DE в табл. 3.
В другом варианте исполнения петля FG может быть в общем виде выражена с помощью консесусной последовательности EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQ ID NO: 325), в которой X1 представляет собой любую аминокислоту, Х4 представляет собой Y или F, X6 представляет собой Y, F или W, X6 представляет собой S или А. В определенных вариантах исполнения Х4 и X5 являются остатками ароматических аминокислот, каждый из которых, независимо, может быть Y, F, W или Н. Данная консенсусная последовательность представлена в виде примеров последовательностей петель FG в табл. 3.
Соответственно, в определенных вариантах исполнения настоящая заявка описывает связывающий PCSK9 Аднектин, содержащий петлю BC с последовательностью SW(X1)ZX2G (SEQ ID NO: 323), петлю DE с последовательностью PX1X1X1X3T (SEQ ID NO: 324) и петлю FG с последовательностью EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQ ID NO: 325) в соответствии с приведенным выше описанием.
В других вариантах исполнения настоящая заявка описывает связывающий PCSK9 Аднектин, содержащий петлю BC с последовательностью SWEPFSRLPGGGE (SEQ ID NO: 106), петлю DE с последовательностью PX1X1X1X3T (SEQ ID NO: 324) и петлю FG с последовательностью EX4X1X5X1X1X6 GYX4HRP (SEQ ID NO: 325) в соответствии с приведенным выше описанием.
В определенных вариантах исполнения последовательность петли BC может быть в общем виде выражена с помощью консенсусной последовательности (X1)ZX2G (SEQ ID NO: 449), в которой X1 представляет собой любую аминокислоту, Z является любым числом от 6 до 9, X2 представляет собой Y или Н. Данная консенсусная последовательность представлена в виде примеров последовательностей петель BC в табл. 3, за исключением петли BC, определяемой последовательностью SEQ ID NO: 106. В других вариантах исполнения Z является любым числом от 2 до 5. В определенных вариантах исполнения Z является любым числом от 10 до 15. В некоторых вариантах исполнения X2 является остатком любой ароматической аминокислоты (т.е. Y, F, W или Н).
В определенных вариантах исполнения петля DE может в общем виде быть выражена с помощью консесусной последовательности Х1Х1Х1Х3, (SEQ ID NO: 450), в которой X1 представляет собой любую аминокислоту, X3 представляет собой G или S. Данная консенсусная последовательность представлена в виде примеров последовательностей петель DE в табл. 3.
В определенных вариантах исполнения петля FG может в общем виде быть выражена с помощью консесусной последовательности EX4X1X5X1X1X6GYX4HR (SEQ ID NO: 451), в которой X1 представляет собой любую аминокислоту, Х4 представляет собой Y или F, X6 представляет собой Y, F или W, X6 представляет собой S или А. В определенных вариантах исполнения Х4 и X5 являются остатками ароматических аминокислот, каждый из которых, независимо, может быть Y, F, W или Н. Данная консенсусная последовательность представлена в виде примеров последовательностей петель FG в табл. 3.
Соответственно, в одном варианте исполнения настоящая заявка описывает связывающий PCSK9 Аднектин, содержащий петлю BC с последовательностью (X1)ZX2G (SEQ ID NO: 449), петлю DE с последовательностью Х1Х1Х1Х3 (SEQ ID NO: 450) и петлю FG с последовательностью EX4X1X5X1X1X6GYX4HR (SEQ ID NO: 451) в соответствии с приведенным выше описанием.
В определенных вариантах исполнения иммуноглобулин-подобные белки, основанные на структурной части 10Fn3, могут быть определены в общем виде следующей последовательностью:
EVVAAT(X)aSLLI(X)xYYRITYGE(X)z,QEFTV(XyATI(X)cDYTITVYAV(X)zISINY
RT (SEQ Ш NO:328)
В последовательности SEQ ID NO: 328 петля АВ представлена Xa, петля CD представлена Xb, петля EF представлена Хс, петля BC представлена Xx, петля DE представлена Xy, петля FG представлена Xz. X обозначает любую аминокислоту, индекс X обозначает целое число аминокислотных остатков. В частности, a в любом месте может составлять 1-15, 2-15, 1-10, 2-10, 1-8, 2-8, 1-5, 2-5, 1-4, 2-4, 1-3, 2-3 или 1-2 аминокислотных остатка; b, c, x, y и z, каждый независимо, в любом месте могут составлять 2-20, 2-15, 210, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7 или 6-7 аминокислотных остатков. В предпочтительных вариантах исполнения a составляет 2 аминокислотных остатка, b составляет 7 аминокислотных остатков, c составляет 7 аминокислотных остатков, x составляет 9 аминокислотных остатков, y составляет 6 аминокислотных остатков, z составляет 12 аминокислотных остатков. Последовательности
- 10 036055 данных бета участков могут иметь в любом месте от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2, от 0 до 1 аминокислотной замены, делеции или вставки на протяжении всех 7 структурных областей относительно соответствующих аминокислотных остатков, указанных в последовательности SEQ ID NO: 1. В определенных вариантах исполнения аминокислотные остатки, составляющие коровую часть, фиксированы и любые замены, консервативные замены, делеции или вставки производятся с любыми другими аминокислотными остатками.
В примерах осуществления петли BC, DE и FG представленные последовательностями (X)x, (X)y и (X)z, соответственно, заменены полипептидами, содержащими последовательности петель BC, DE и FG любых вариантов белков, связывающих PCSK9, представленных в табл. 3, или затемненные области этих вариантов, или консенсусные последовательности 323-325 или 449-451.
В определенных вариантах исполнения иммуноглобулин-подобные белки на основе структуры 10Fn3 могут быть в общем виде определены следующей последовательностью:
EVVAATPTSLLI(X)xYYRITYGETGGNSPVQEFTV(X)yATISGLKPGVDYTITVYA
V(X)ZISINYRT (SEQ Ш NO:329)
В последовательности SEQ ID NO: 329 петля BC представлена Xx, петля DE представлена Xy, петля FG представлена Xz. X обозначает любую аминокислоту, индекс X обозначает целое число аминокислотных остатков. В частности, x, y и z каждый независимо в любом месте может составлять 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7 или 6-7 аминокислотных остатков. В предпочтительных вариантах исполнения x составляет 9 аминокислотных остатков, y составляет 6 аминокислотных остатков, z составляет 12 аминокислотных остатков. Последовательности данных бета участков могут иметь в любом месте от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2, от 0 до 1 аминокислотной замены, делеции или вставки на протяжении всех 7 структурных областей относительно соответствующих аминокислотных остатков, указанных в последовательности SEQ ID NO: 1. В примерах осуществления изобретения последовательности данных бета участков могут иметь в любом месте от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2, от 0 до 1 консервативной аминокислотной замены на протяжении всех 7 структурных областей относительно соответствующих аминокислотных остатков, указанных в последовательности SEQ ID NO: 1. В определенных вариантах исполнения коровые аминокислотные остатки фиксированы и любые замены, консервативные замены, делеции или вставки производятся с любыми другими аминокислотными остатками. В примерах осуществления петли BC, DE и FG, представленные последовательностями (X)x, (X)y, и (X)z, соответственно, заменены полипептидами, содержащими последовательности петель BC, DE и FG любых вариантов белков, связывающих PCSK9, представленных в табл. 3, или затемненные области этих вариантов, или консенсусные последовательности 323-325 или 449-451.
В определенных вариантах исполнения анти- PCSK9 Аднектин, описанный в данной заявке, может содержать последовательность, как указано в SEQ ID NO: 328 или 329, в которой петли BC, DE и FG, представленные последовательностями (X)x, (X)y, и (X)z соответственно, заменены соответствующим набором определенных последовательностей петель BC, DE и FG от любого из клонов в табл. 3, или последовательности, по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичные последовательностям петель BC, DE и FG клонов, приведенных в табл. 3. В примерах осуществления изобретения антиPCSK9 Аднектин, описанный в данной заявке, определяется последовательностью SEQ ID NO: 329 и содержит соответствующий набор последовательностей петель BC, DE и FG из любого из клонов, приведенных в табл. 3. Например, клон 1459D05 в табл. 3 содержит такие же последовательности петель BC, DE и FG, как в последовательностях SEQ ID NO: 2, 18 и 28 соответственно. Таким образом, анти- PCSK9 Аднектин на основе данных петель может содержать последовательность SEQ ID NO: 328 или 329, в которой (X)x содержит последовательность SEQ ID NO: 2, (X)y содержит последовательность SEQ ID NO: 18 и (X)z содержит последовательность SEQ ID NO: 28. Схожие конструкции могут быть реализованы с использованием набора петель BC, DE и FG других клонов, указанных в табл. 3, или консенсусных последовательностей 323-325 или 449-451. Структурные части таких вариантов анти- PCSK9 Аднектина могут содержать в любой части от 0 до 20, от 0 до 15, от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2, от 0 до 1 аминокислотной замены, консервативной аминокислотной замены, делеции или вставки относительно аминокислотных остатков структурной части, указанных в последовательности SEQ ID NO: 1. Такие структурные модификации могут осуществляться до тех пор, пока анти- PCSK9 Аднектин способен связывать PCSK9 с желаемой KD.
В некоторых вариантах исполнения петля BC белка, описываемого в данном изобретении, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из следующей группы: SWPPPSHGYG (SEQ ID NO: 2), SWRPPIHAYG (SEQ ID NO: 3), SWDAPIHAYG (SEQ ID NO: 4), SWDAPAHAYG (SEQ ID NO: 5) и SWDAPAVTYG (SEQ ID NO: 6), SWSPPANGYG (SEQ ID NO: 7), SWTPPPKGYG (SEQ ID NO: 8), SWRPPSHAYG (SEQ ID NO: 9), SWDPPSHAYG (SEQ ID NO: 10), SWEPPSHAYG (SEQ ID NO: 11), SWSPPSHAYG (SEQ ID NO: 12), SWRPPSNGHG (SEQ ID NO: 13), SWVPPSDDYG (SEQ ID NO: 14), SWVPSSHAYG (SEQ ID NO: 15), SWDPSSHAYG (SEQ ID NO: 16) и SWEPSSHAYG (SEQ ID NO: 17). В последующих вариантах исполнения петля BC белка, описываемого в данном изобретении, содержит
- 11 036055 аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 106-135 и 301303. В других вариантах исполнения петля BC белка, описываемого в изобретении, содержит затемненную часть любой из последовательностей SEQ ID NO: 2-17, 106-135 и 301-303, как показано в табл. 3. Например, в одном из вариантов исполнения петля BC содержит последовательность PPPSHGYG (остатки 3-10 последовательности SEQ ID NO: 2), DAPAHAYG (остатки 3-10 последовательности SEQ ID NO: 5), EPFSRLPGGGE (остатки 3-13 последовательности SEQ ID NO: 106) или DAPADGGYG (остатки 3-11 последовательности SEQ ID NO: 107).
В некоторых вариантах исполнения петля DE белка, описываемого в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из следующей группы: PPGKGT (SEQ ID NO: 18), PIVEGT (SEQ ID NO: 19), PGSEGT (SEQ ID NO: 20), PGSKGT (SEQ ID NO: 21), PGSKST (SEQ ID NO: 22), PVGRGT (SEQ ID NO: 23), PVGEGT (SEQ ID NO: 24), PIGKGT (SEQ ID NO: 25), PVNEGT (SEQ ID NO: 26) и PVGVGT (SEQ ID NO: 27). В последующих вариантах исполнения петля DE белка, описываемого в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 136-141. В других вариантах исполнения петля DE белка, описываемого в настоящем изобретении, содержит затемненную часть любой из последовательностей SEQ ID NO: 1827 и 136-141, как показано в табл. 3. Например, в одном из вариантов исполнения петля DE содержит последовательность PGKG (остатки 2-5 последовательности SEQ ID NO: 18), VGVG (остатки 2-5 последовательности SEQ ID NO: 27) или VSKS (остатки 2-5 последовательности SEQ ID NO: 137).
В некоторых вариантах исполнения петля FG белка, описываемого в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из следующей группы: EYPYKHSGYYHRP (SEQ ID NO: 28), EYTFKHSGYYHRP (SEQ ID NO: 29), EYTYKGSGYYHRP (SEQ ID NO: 30), EYTYNGAGYYHRP (SEQ ID NO: 31), EYTYIGAGYYHRP (SEQ ID NO: 32), EYTYEGAGYYHRP (SEQ ID NO: 33), EYAYNGAGYYHRP (SEQ ID NO: 34), EYPWKGSGYYHRP (SEQ ID NO: 35), EFPFKWSGYYHRP (SEQ ID NO: 36), EFPWPHAGYYHRP (SEQ ID NO: 37) и EYAFEGAGYYHRP (SEQ ID NO: 38). В последующих вариантах исполнения петля FG белка, описываемого в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 142-172. В других вариантах исполнения петля FG белка, описываемого в настоящем изобретении, содержит затемненную часть любой из последовательностей SEQ ID NO: 28-38 и 142-172, как показано в табл. 3. Например, в одном из вариантов исполнения петля FG содержит последовательность EYPYKHSGYYHR (остатки 112 последовательности SEQ ID NO: 28), EYPYDYSGYYHR (остатки 1-12 последовательности SEQ ID NO: 142) или EFDFVGAGYYHR (остатки 1-12 последовательности SEQ ID NO: 167).
В некоторых вариантах исполнения белок, описываемый в настоящем изобретении, содержит одну последовательность петли BC, выбранную из группы последовательностей BC, включающих последовательности SEQ ID NO: 2-17, 106-135 и 301-303, или затемненную часть любой одной из последовательностей SEQ ID NO: 2-17, 106-135 и 301-303, как показано в табл. 3; одну последовательность петли DE, выбранную из группы последовательностей петель DE, включающих последовательности SEQ ID NO: 18-27 и 136-141, или затемненную часть любой одной из последовательностей SEQ ID NO: 18-27 и 136141 как показано в табл. 3; и одну последовательность петли FG, выбранную из группы последовательностей FG, включающих последовательности SEQ ID NO: 28-38 и 142-172, или затемненную часть любой одной из последовательностей SEQ ID NO: 28-38 и 142-172 как показано в табл. 3. В некоторых вариантах исполнения белок, описываемый в настоящем изобретении, содержит аминокислотные последовательности петель BC, DE и FG, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичные любой одной из последовательностей SEQ ID NO: 2-38, 106-172, 301-303. В других вариантах исполнения белок, описываемый в настоящем изобретении, содержит аминокислотные последовательности петель BC, DE и FG, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичные затемненной части любой из последовательностей SEQ ID NO: 2-38, 106-172, 301-303, как показано в табл. 3.
В некоторых вариантах исполнения аминокислотная последовательность анти-PSCK9 Аднектина содержит любую из последовательностей SEQ ID NO: 39-76, 173-290 и 304-309. В некоторых вариантах исполнения анти-PSCK9 Аднектин содержит фрагмент аминокислотной последовательности домена Fn3 с 3 по 96 позиции любой из последовательностей SEQ ID NO: 39-76, 173-290 и 304-309. В некоторых вариантах исполнения анти-PSCK9 Аднектин содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичную любой из последовательностей SEQ ID NOS:39-76, 173-290 и 304-309.
Фибронектин связывается с интегринами различных типов за счет интегрин-связывающего мотива аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD). В некоторых вариантах исполнения белок, описываемый в данном изобретении, содержит домен 10Fn3 без интегрин-связывающего (RGD) мотива. Интегринсвязывающий мотив может быть удален путем видоизменения последовательности RGD за счет аминокислотных замен, делеций или инсерций.
В определенных вариантах исполнения молекулы анти-PSCK9 Аднектина, описываемые в настоящем изобретении, могут быть модифицированы за счет удлинения N- или C-концевых частей. Например, последовательность MG может быть добавлена на N-конец последовательности домена 10Fn3, определяемой последовательностью SEQ ID NO: 1. Добавочная аминокислота М обычно отщепляется, оставляя
- 12 036055 на N-конце белка аминокислотный остаток G. В другом случае первые 10 аминокислотных остатков последовательности aHTu-PSCK9 Аднектина, приведенной в табл. 4, могут быть заменены другой Nконцевой последовательностью, называемой в данном документе N-концевым удлинением, как показано в табл. 6 (например, SEQ ID NO: 371-379). Кроме того, М, G или MG могут быть помещены на N-конец любого N-концевого удлинения, SEQ ID NO: 371-379. Ahtu-PSCK9 Аднектины, описанные в данной заявке, могут также содержать различные C-концевые последовательности, называемые в данном документе C-концевыми удлинениями. Например, последовательность aнти-PSCK9 Аднектина, показанная в табл. 4, может быть укорочена после треонина, соответствующего треонину в 94 положении последовательности SEQ ID NO: 1 (т.е. укорочена после последовательности INYRT (SEQ ID NO: 636)). Такой укороченный вариант может быть использован в качестве терапевтической молекулы в укороченной форме, или может быть добавлена другая C-концевая последовательность после остатка треонина. Примеры C-концевых удлиняющих последовательностей приведены в табл. 6 как SEQ ID NO: 380-395. Примеры последовательностей aнти-PSCK9 Аднектина, содержащих C-концевые удлинения, приведены в табл. 4. Например, последовательность SEQ ID NO: 49 (клон 1813Е02) содержит естественную Cконцевую удлиняющую последовательность EIDKPSQ (SEQ ID NO: 380) с последующей последовательностью His6-T3ra (SEQ ID NO: 637). Однако стоит понимать, что последовательность His6-mora полностью необязательна.
В отдельных вариантах исполнения последовательности C-концевого удлинения (также называемые хвосты), содержат остатки Е и D и могут быть от 8 до 50, от 10 до 30, от 10 до 20, от 5 до 10 и 2 и 4 аминокислотных остатка длиной. В некоторых вариантах исполнения последовательности хвостов включают линкеры на основе ED, в которых последовательность состоит из тандемных повторов ED. В примерах осуществления изобретения хвосты содержат 2-10, 2-7, 2-5, 3-10, 3-7, 3-5, 3, 4 или 5 повторов ED. В определенных вариантах исполнения хвосты на основе ED также могут включать дополнительные аминокислотные остатки, такие как, например: EI (SEQ ID NO: 385), EID, ES, EC, EGS и EGC. Эти последовательности сходны с известными последовательностями хвостов Аднектина, такими как EIDKPSQ (SEQ ID NO: 380), в которых удалены остатки D и K. В примерах осуществления изобретения такие ED-хвосты содержат остатки Е, I или EI (SEQ ID NO: 385) перед ED-повторами.
В других вариантах исполнения, N- и C-концевые последовательности могут быть комбинированы с последовательностями других известных линкеров (например, SEQ ID NO: 396-419 в табл. 6), если это необходимо при конструировании слитых вариантов aнти-PSCK9 Аднектина. Примеры последовательностей aнти-PSCK9 Аднектина, содержащих линкерные последовательности, приведены в табл. 4 (например, SEQ ID NO: 53, 55 и 57). В некоторых вариантах исполнения C-концевая последовательность может быть добавлена к последовательности домена 10Fn3 для упрощения прикрепления фармакокинетической группы. Например, цистеин-содержащая линкерная последовательность, такая как GSGC (SEQ ID NO:77), может быть добавлена на С-конец для сайт-направленного пэгилирования данного остатка цистеина.
Фармакокинетические части.
Одним из объектов, описываемых данной заявкой на изобретение, является aнти-PCSK9 Аднектин, содержащий фармакокинетическую (РК) часть. Улучшенная фармакокинетика может быть желательна в соответствии с имеющейся терапевтической необходимостью. Часто желательно повысить биодоступность и/или увеличить время между введением доз препарата, что возможно за счет увеличения периода времени, когда белок остается доступным в сыворотке крови после введения препарата. В некоторых случаях желательно поддерживать постоянную концентрацию белка в плазме (например, уменьшить различие между концентрацией белка в сыворотке вскоре после введения и незадолго до следующего введения). Ahth-PCSK9 Аднектин может быть присоединен к определенной группировке, которая снижает скорость выведения полипептида у млекопитающих (например, мышей, крыс или человека) более чем в три раза по сравнению с немодифицированным aнти-PCSK9 Аднектином. Другие показатели улучшения фармакокинетики включают в себя время полужизни в плазме, которое часто делится на альфа- и бета-фазу. Показатели каждой или обеих фаз могут быть значительно улучшены путем добавления соответствующей РК-группы.
Молекулы, замедляющие выведение белка из крови, в данном документе называются РК-группы и включают полиоксоалкиленовые группы, например, полиэтиленгликоль, сахара (например, сиаловая кислота) и хорошо переносимые белковые группы (например, Fc-фрагмент и его части и их варианты, трансферрин, сывороточный альбумин). Ahth-PCSK9 Аднектин может быть слит с альбумином или с его фрагментом (частью) или с одним из вариантов альбумина, как описано в U.S. Publication № 2007/0048282. В некоторых вариантах исполнения aнти-PCSK9 Аднектин может быть слит с одним или более Аднектином, связывающим сывороточный альбумин, как описано в данной заявке.
В некоторых вариантах исполнения РК-группой является белок, связывающий сывороточный альбумин, например такие белки, как описанные в U.S. Publication № 2007/0178082 и 2007/0269422.
В некоторых вариантах исполнения РК-группой является сывороточный белок, связывающий иммуноглобулины, например такие белки, как описанные в U.S. Publication № 2007/0178082.
В некоторых вариантах исполнения aнти-PCSK9 Аднектин содержит полиэтиленгликоль (ПЭГ). С
- 13 036055 помощью реакций с аминами, тиолами или другими подходящими реакционными группами одна или несколько молекул ПЭГ могут быть соединены с анти-PCSK9 Аднектином в различных положениях. Для этого может быть использована первичная аминогруппа на N-конце белка или боковые группы аминокислотных остатков, таких как лизин или аргинин. В некоторых вариантах исполнения ПЭГ присоединен в одном из положений, выбранных из группы: a) N-конец; b) между N-концом и наиболее близко расположенным к N-концу бета или бета-подобным участком; c) на петле, расположенной на обратной по отношению к сайту связывания поверхности полипептида; d) между C-концом и наиболее близко расположенным к C-концу бета или бета-подобным участком; и e) на C-конце полипептида.
Пэгилирование может осуществляться с помощью сайт-направленного пэгилирования, при котором в белок вводится подходящая реакционная группа для создания сайта, по которому преимущественно будет происходить пэгилирование. В некоторых вариантах исполнения последовательность белка модифицируется введением остатка цистеина в необходимой позиции, что обеспечивает направленное пэгилирование по данному остатку цистеина. ПЭГ различается по молекулярному весу в широких пределах и может быть разветвленным или линейным. В одном варианте исполнения ПЭГ имеет две цепи. В другом варианте исполнения ПЭГ имеет 4 цепи.
В некоторых вариантах исполнения анти-PCSK9 Аднектин слит с иммуноглобулиновым Fcфрагментом, или его частью, или вариантом фрагмента или части. В примере осуществления изобретения используется Fc-фрагмент иммуноглобулинов подкласса IgG1, однако Fc-фрагменты других подклассов иммуноглобулинов (например, IgG2, IgG3 и IgG4) также могут быть использованы. Ниже приведена последовательность Fc-фрагмента иммуноглобулина IgG1 человека, в которой относительные положения каждой области отмечены в соответствии с номенклатурой Евросоюза (EU)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCOKmYCYPCPNPREYGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ Ш NO: 315)
Коровая последовательность шарнирной области выделена подчеркиванием, СН1 область выделена курсивом, СН2 и CH3 области указаны обычным шрифтом. Следует понимать, что C-концевой остаток лизина необязателен.
Указанный слитый белок может быть получен путем присоединения последовательности антиPCSK9 Аднектина к любому из концов последовательности Fc-домена, т.е. могут быть получены слитые белки Fc-анти-PCSK9 Аднектин или анти-PCSK9 Аднектин-Fc. В определенных вариантах исполнения Fc-фрагмент и анти-PCSK9 Аднектин соединяются при помощи линкерной последовательности. Примеры линкерных последовательностей включают AGGGGSG (SEQ ID NO: 310), GSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 311), QPDEPGGS (SEQ ID NO: 312), ELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO: 313), TVAAPS (SEQ ID NO: 314), KAGGGGSG (SEQ ID NO: 620), KGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 621), KQPDEPGGS (SEQ ID NO: 622), KELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO: 623), KTVAAPS (SEQ ID NO: 624), KAGGGGSGG (SEQ ID NO: 625), KGSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO: 626), KQPDEPGGSG (SEQ ID NO: 627), KELQLEESAAEAQDGELDG (SEQ ID NO: 628), KTVAAPSG (SEQ ID NO: 629), AGGGGSGG (SEQ ID NO: 630), GSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO: 631), QPDEPGGSG (SEQ ID NO: 632), ELQLEESAAEAQDGELDG (SEQ ID NO: 633) и TVAAPSG (SEQ ID NO: 634).
В некоторых вариантах исполнения Fc-домен, входящий в состав слитого белка с анти-PCSK9 Аднектином, содержит последовательность шарнирной области Fc-домена. При использовании в данной заявке термин шарнирная область включает коровые аминокислотные остатки шарнирной области молекулы IgG1 в позициях 104-119 последовательности SEQ ID NO: 315 (DKTHTCPPCPAPELLG; SEQ ID NO: 316), соответствующие участку 221-236 по номенклатуре Евросоюза. В определенных вариантах исполнения слитый белок анти-PCSK9 Аднектин-Fc мультимеризуется (например, образует димер), частично за счет остатков цистеина внутри шарнирной области в позициях 109 и 112 последовательности SEQ ID NO: 315 (позиции 226 и 229 по номенклатуре Евросоюза соответственно). В других вариантах исполнения шарнирная область, как описывается в данной заявке, может дополнительно включать аминокислотные остатки областей СН1 и СН2, фланкирующих коровую последовательность шарнирной области, как показано в последовательности SEQ ID NO: 315.
В некоторых вариантах исполнения шарнирная последовательность может содержать замены, придающие желаемые фармакодинамические, биофизические и/или биологические свойства. Некоторые примеры последовательностей шарнирной области включают следующие:
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 317; коровая последовательность шарнирной области подчеркнута), EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 318; коровая последовательность шарнирной области подчеркнута), EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 319; коровая последовательность шарнирной области подчеркнута), DKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 320; коровая последователь
- 14 036055 ность шарнирной области подчеркнута) и DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 321, коровая последовательность шарнирной области подчеркнута). В одном варианте исполнения остаток Р в положении 122 (238 по номенклатуре Евросоюза) последовательности SEQ ID NO: 315 заменен на остаток S для нарушения эффекторной функции Fc-фрагмента. Пример данной замены приведен в любой из последовательностей SEQ ID NO: 318, 319 и 321. В другом варианте исполнения остатки DK в положении 104-105 последовательности SEQ ID NO: 315 (221-222 по номенклатуре Евросоюза) заменены на остатки GS для удаления потенциального сайта сшивки. Пример такой замены показан в последовательности SEQ ID NO: 319. В другом варианте исполнения остаток С в положении 103 последовательности SEQ ID NO: 315 (220 по номенклатуре Евросоюза) заменен на остаток S для предотвращения формирования неправильной дисульфидной связи в отсутствие легкой цепи. Пример такой замены приведен в последовательностях SEQ ID NO: 317-319.
В определенных вариантах исполнения слитый белок анти-PCSK9 Аднектин-Fc может обладать следующими конфигурациями: 1) анти-PCSK9 Аднектин-шарнирная область-Fc, 2) шарнирная областьFc- анти-PCSK9 Аднектин. Таким образом, любой вариант анти-PCSK9 Аднектина, описываемый в настоящем изобретении, может быть введен в состав слитого белка с Fc-доменом, содержащего последовательность шарнирной области, в соответствии с данными конфигурациями. В некоторых вариантах исполнения для соединения модулей анти-PCSK9 Аднектин и шарнирная область-Fc может использоваться линкер. В этом случае слитый белок может обладать, например, следующей конфигурацией: шарнирная область- анти-PCSK9 Аднектин-линкер-Fc. Кроме того, в зависимости от системы наработки слитых белков на N-конце слитого белка может располагаться лидерная сигнальная последовательность. Например, если слитый белок продуцируется в клетках млекопитающих, следующая лидерная последовательность может быть введена на N-конец слитого белка: METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 326). Если слитый белок продуцируется в системе Е.соЕ, на N-конец слитого белка будет введен остаток метионина.
Пример последовательности слитого белка анти-PCSK9 Аднектин-шарнирная область-Fc, продуцируемого в клетках млекопитающих
METDTLLLWVLLLWVPGSTGGESDEPTiDZEmMTPASZZ/SPFEPP^DDFGFFA
ITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTA TISGLKPGVDYTITVYA VEFPWPHAGYYHRPISINYRTEI EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGI<EYI<CI<VSNI<ALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG К (SEQ Ш NO: 322).
В данном примере Fc-домен содержит последовательности областей CH1, CH2 и CH3 иммуноглобулинов G1 человека
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS
RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ Ш NO: 448) и шарнирная область последовательности SEQ ID NO: 319. В последовательности SEQ ID NO: 322 последовательность лидерного пептида выделена жирным шрифтом, последовательность анти-PCSK9 Аднектина выделена курсивом, шарнирная область подчеркнута. Следует понимать, что остаток лизина на конце последовательности SEQ ID NO: 322 необязателен. Эффективность слитого полипептида, приведенного в последовательности SEQ ID NO: 322 (также описываемого в данной заявке как PRD460) показана в примере 4.
Примеры слитых белков PCSK9 Аднектин-Fc приведены в табл. 1. Все последовательности могут начинаться с метионина и лидерной сигнальной последовательности клеток млекопитающих (например, SEQ ID NO: 326).
- 15 036055
Таблица 1. Примеры последовательностей слитых белков aHTu-PCSK9 Аднектин-Fc
EQ ID Клон или название Описание Последовательность
PCSK9 Аднектин-Xi-Fc С-концевые варианты
52 1459 D05-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWPPPSH GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPGKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYPYKHSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV
(SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
53 1784F ОЗ-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRPPIH AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIVEGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYTFKHSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
54 1784F 03-ml-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPIH AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSEGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYTFKHSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
1784F XI является GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAH
- 16 036055
55 03-m2-Fc слитый белок необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYTFKHSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
56 1784F 03-m3-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAV TYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYTFKHSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
57 1813Е 02-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSPPAN GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVGRGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYTYKGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
- 17 036055
NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К QKSLSLSPG
58 1923В 02-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTPPPK GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVGEGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYTYNGAGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
59 1923В 02(N82I)-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTPPPK GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVGEGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYTYIGAGYYHRPISINY RT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
60 1923В 02(N82E) -Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTPPPK GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVGEGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYTYEGAGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV
- 18 036055
EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
61 1923В 02(Т80А) -Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTPPPK GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVGEGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYAYNGAGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
62 1922 G04-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRPPSH AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEY PWKGSGYYHRPISINY RT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
63 1922 G04(R25D)- XI является необязательным и, если GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDPPSH AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATIS
- 19 036055
Fc слитый белок присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GLKPGVDYTITVYAVEYPWKGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
64 1922 G04(R25E)Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPPSH AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYPWKGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
65 1922 G04(R25S) Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fc- GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSPPSH AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYPWKGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
- 20 036055
фрагмент может включать С-концевой остаток К
66 2012 A04-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRPPSN GHGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVNEGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFPFKWSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
67 2013Е 01-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVPPSD DYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFPWPHAGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
68 2011 H05-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVPSSH AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVGVGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYAFEGAGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
- 21 036055
выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
69 2011 H05(V23D)Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDPSSH AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVGVGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYAFEGAGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
70 2011 H05(V23E) Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPSSH AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVGVGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYAFEGAGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
71 2381В 02-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSR LPGGGEYYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEYPYDYSGYYHRPIS
- 22 036055
выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К INYRT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
72 2381В 04-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSR LPGGGEYYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEYPYEHSGYYHRPIS INYRT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
73 2381В 06-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSR LPGGGEYYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEYPYPHSGYYHRPIS INYRT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
- 23 036055
С-концевой остаток К
74 2381В 08-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAD GGYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEYTFPGAGYYHRPISIN YRT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
75 2381 D02-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSR LPGGGEYYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEYPYDHSGYYHRPIS INYRT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
76 2381 D04-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSR LPGGGEYYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFPYDHSGYYHRPIS INYRT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG
- 24 036055
последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
77 2381F 1Ι-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAD GGYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPVSKSTATI SGLKPGVDYTITVYAVEYTFPGAGYYHRPISIN YRT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
78 2381 G03-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSR LPGGGEYYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTA ΤISGLKPGVDYTITVYAVE FPYAHSGYYHRPIS INYRT-X1-X2- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
79 2381 G09-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAG DGYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPVSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVE FT FPGAGYYHRPISIN YRT-Хх-Хг-
- 25 036055
группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
80 2381 НОЗ-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSR LPGGGEYYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEYPYAHSGYFHRPIS INYRT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
81 2382 A01-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWAAPAG GGYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPVSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEYDFPGAGYYHRPISIN YRT-X1-X2- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
- 26 036055
82 2382В 10-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAD AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYDFPGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
83 2382В 09-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAD AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFDYPGSGYYHRPISINY RT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
84 2382С 05-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAD GAYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPVSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEYSFPGAGYYHRPISIN YRT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF
- 27 036055
шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
85 2382C 09-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAE GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFDFPGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
86 2382 D03-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAD EAYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPVSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISIN YRT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
87 2382 D05-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAD GGYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPVSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISIN YRT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
- 28 036055
(SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
88 2382 D08-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAD GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFPFPGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
89 2382 D09-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAE GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
2382F XI является GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAG
- 29 036055
90 02-Fc слитый белок необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GGYGYYRITYGETGGNS PVQE FT VPVSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGSGYYHRPISIN YRT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
91 2382F ОЗ-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAA DAYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPVSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEFNFPGAGYYHRPISIN YRT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
92 2382F 05-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAE AGKHYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPIS INYRT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
- 30 036055
NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К QKSLSLSPG
93 2382F 08-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAE AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFTYPGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
94 2382F 09-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAA AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYDFPGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
95 2382 G04-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAG GGYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISIN YRT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV
- 31 036055
EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
96 2382 НЮ-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); Х2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAG GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFDFPGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
97 2382 Hll-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAD GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVFKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFDYPGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
98 2382 H04-Fc XI является необязательным и, если GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAA GGYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATI
- 32 036055
слитый белок присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К SGLKPGVDYTITVYAVEYDFPGAGYYHRPISIN YRT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
99 2382 H07-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAD AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFDFPGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
00 2382 H09-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fc- GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAA AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFDFPGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
- 33 036055
фрагмент может включать С-концевой остаток К
01 2451 A02-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAA GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFPFPGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
02 2451В 05-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAG GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFDYPGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
03 2451В 06-Fc слитый белок (эквивалент 2382D05) XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAD GGYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPVSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISIN YRT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
- 34 036055
выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
04 245 IC 06-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAG AASYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEFPFPGAGYYHRPISI NYRT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
05 2451 D05-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAG AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFDFPGSGYYHRPISINY RT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
06 245 IF ОЗ-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDPPAE GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFNFPGSGYYHRPISINY
- 35 036055
выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
07 2451 GOl-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAG GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFDFPGSGYYHRPISINY RT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
08 2451 H07-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать GITDVPRDLEVVAATPTSLLISWNPPDV NYGYYRITYGETGGNSPLQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYPYAHAGYYHRPISINY RT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
- 36 036055
С-концевой остаток К
09 2382E ОЗ-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAG DGYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPVSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISIN YRT-X1-X2- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
10 2382Е 04-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAG GGYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPVSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVE FT FPGAGYYHRPISIN YRT-X1-X2- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
11 2382Е 05-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAE GGYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPVSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISIN YRT-X1-X2- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG
- 37 036055
последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
12 2382E 09-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAE AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYDFPGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
13 2381 A04-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSR LPGGGEYYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEYPYPFSGYYHRPIS INYRT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
14 2381 A08-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAD GGYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPGSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEYDFPGAGYYHRPISIN YRT-X1-X2-
- 38 036055
группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
15 2381В 10-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAG GGYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPVSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEYNFIGAGYYHRPISIN YRT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
16 2381С 08-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAD GAYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPVSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEFPYPFAGYYHRPISIN YRT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
- 39 036055
17 2381 G06-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSEKLD GKARRGYYRITYGETGGNSPVQQFTVPGSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFPYDHSGYYHRPIS INYRT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
18 2381 HOl-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSPRDS TGLVRRGYYRITYGETGGNSPVQQFTVPGSKGT ATISGLKPGVDYTITVYAVEYPYDHSGYYHRPI SINYRT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
19 2381 НОб-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWGDVRT NEARQGYYRITYGETGGNSPLQGFTVPGSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEYTYEHSGYYHRPIS INYRT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF
- 40 036055
шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
20 2381 H09-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAG GGYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPVSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEFDFVGAGYYHRPISIN YRT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
21 2382В 1 Ι-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAA AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYDFAGSGYYHRPISINY RT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
22 2382В 08-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAD AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFAFPGAGYYHRPISINY RT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
- 41 036055
(SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
23 2382C 11-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAG GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYDFAGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
24 2382 G03-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAE AEAYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYVFPGAGYYHRPISI NYRT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
2382 XI является GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAE
- 42 036055
25 НОЗ-Fc слитый белок необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GAYGYYRITYGETGGNS PVQE FTVPVSKGTATI SGLKPGVDYTITVYAVEYPYPFAGYYHRPISIN YRT-X1-X2- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
26 2451 AlO-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVTDVPRDMEVVAATPTSLLISWQPPAV TYGYYRITYGETGGNSTLQQFTVPVYKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYPYDHSGYYHRPISINY RT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
27 2451В 02-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAA AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFDYPGSGYYHRPISINY RT-Хх-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
- 43 036055
NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К QKSLSLSPG
28 245 IC 11-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GIVDVPRDLEVVAATPTSLLISWDPPAG AYGYYRITYGETGGNSPKQQFTVPGYKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYPYDHSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
29 2451 HOl-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAA GYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYDFPGSGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
30 2011В 1 Ι-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWAPPSD AYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEY PY SHAGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV
- 44 036055
EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
31 2971 АОЗ-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDPPSD DYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFPWPHAGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
32 2971 A09-Fc слитый белок XI является необязательным и, если присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAD DYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEFPWPHAGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
33 2971Е 02-Fc слитый XI является необязательным и, если GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPSD DYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATIS
- 45 036055
белок присутствует, может быть выбран из следующей группы: Е, EI, EID, EIDK (SEQ ID NO: 384), EIE и EIEK (SEQ ID NO: 635); X2 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; данный Fcфрагмент может включать С-концевой остаток К GLKPGVDYTITVYAVEFPWPHAGYYHRPISINY RT-Xi-Хг- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
Xi-Fc-X2-PCSK9 Аднектин N-концевые варианты
34 Fc- 1459D05 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWPPPSHGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPPGKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYPYKHSGYYHRPISINYRT-Хз
35 Fc- 1784F03 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
- 46 036055
ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRPPIHAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPIVEGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYTFKHSGYYHRPISINYRT-Хз
36 Fc1784F03-ml слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPIHAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPGSEGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYTFKHSGYYHRPISINYRT-Хз
37 Fc1784F03-m2 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAHAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPGSKGTATISGLKPGV
- 47 036055
С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) DYTITVYAVEYTFKHSGYYHRPISINYRT-X3
38 Fc1784F03-m3 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGV DYTITVYAVEYTFKHSGYYHRPISINYRT-Хз
39 Fc- 1813E02 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSPPANGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVGRGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYTYKGSGYYHRPISINYRT-Хз
- 48 036055
последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635)
40 Fc- 1923B02 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; X2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Xi- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTPPPKGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVGEGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYTYNGAGYYHRPISINYRT-Хз
41 Fc1923B02(N82 I) слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Xi- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTPPPKGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVGEGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYTYIGAGYYHRPISINYRT-Хз
- 49 036055
42 Fc1923B02(N82 E) слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTPPPKGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVGEGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYTYEGAGYYHRPISINYRT-Хз
43 Fc1923B02(T80 А)слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTPPPKGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVGEGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYAYNGAGYYHRPISINYRT-Хз
44 Fc- 1922G04 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV
- 50 036055
NO: 317-321; X2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRPPSHAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYPWKGSGYYHRPISINYRT-Хз
45 Fc1922G04(R25 D) слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDPPSHAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYPWKGSGYYHRPISINYRT-Хз
46 Fc1922G04(R25 E) слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF
- 51 036055
ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPPSHAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYPWKGSGYYHRPISINYRT-Хз
47 Fc1922G04(R25 S) слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSPPSHAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYPWKGSGYYHRPISINYRT-Хз
48 Fc- 2012A04 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRPPSNGHGYYR
- 52 036055
присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) ITYGETGGNSPVQEFTVPVNEGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFPFKWSGYYHRPISINYRT-Хз
49 Fc- 2013E01 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVPPSDDYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFPWPHAGYYHRPISINYRT-Хз
50 Fc- 2011Н05 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVPSSHAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVGVGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYAFEGAGYYHRPISINYRT-Хз
- 53 036055
выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635)
51 Fc2011H05(V23 D) слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; X2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDPSSHAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVGVGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYAFEGAGYYHRPISINYRT-Хз
52 Fc2011H05(V23 E) слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPSSHAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVGVGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYAFEGAGYYHRPISINYRT-Хз
- 54 036055
(SEQ ID NO: 635)
53 Fc- 2381B02 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSRLPGGGE YYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTATISGLK PGVDYTITVYAVEYPYDYSGYYHRPISINYRTХз
54 Fc- 2381В04 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSRLPGGGE YYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTATISGLK PGVDYTITVYAVEYPYEHSGYYHRPISINYRTХз
55 Fc- 2381В06 X1 выбирается из последовательностей Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
- 55 036055
слитый белок шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSRLPGGGE YYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTATISGLK PGVDYTITVYAVEYPYPHSGYYHRPISINYRTХз
56 Fc- 2381В08 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPADGGYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEYTFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
57 Fc- 2381D02 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG
- 56 036055
последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSRLPGGGE YYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTATISGLK PGVDYTITVYAVEYPYDHSGYYHRPISINYRTХз
58 Fc- 2381D04 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSRLPGGGE YYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTATISGLK PGVDYTITVYAVEFPYDHSGYYHRPISINYRTХз
59 Fc- 2381F11 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг-
- 57 036055
необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPADGGYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKSTATISGLKPG VDYTITVYAVEYTFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
60 Fc- 2381G03 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSRLPGGGE YYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTATISGLK PGVDYTITVYAVEFPYAHSGYYHRPISINYRTХз
61 Fc- 2381G09 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAGDGYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEFTFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
- 58 036055
последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635)
62 Fc- 2381H03 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSRLPGGGE YYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTATISGLK PGVDYTITVYAVEYPYAHSGYFHRPISINYRTХз
63 Fc- 2382А01 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWAAPAGGGYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEYDFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
- 59 036055
ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635)
64 Fc- 2382B10 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; X2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Xi- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPADAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYDFPGSGYYHRPISINYRT-Хз
65 Fc- 2382В09 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Xi- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPADAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFDYPGSGYYHRPISINYRT-Хз
Fc- X1 выбирается из Xi-
- 60 036055
66 2382C05 слитый белок последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPADGAYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEYSFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
67 Fc- 2382С09 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFDFPGSGYYHRPISINYRT-Хз
68 Fc- 2382D03 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
- 61 036055
выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPADEAYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
69 Fc- 2382D05 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VS DVPRDLEVVAAT PT S LLISWDAPADGGYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
70 Fc- 2382D08 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
- 62 036055
ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPADGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFPFPGSGYYHRPISINYRT-Хз
71 Fc- 2382D09 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
72 Fc- 2382F02 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAGGGYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPG
- 63 036055
С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) VDYTITVYAVEFDFPGSGYYHRPISINYRT-X3
73 Fc- 2382F03 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAADAYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEFNFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
74 Fc- 2382F05 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEAGKHYG YYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLK PGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRTХз
- 64 036055
последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635)
75 Fc- 2382F08 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Xi- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFTYPGSGYYHRPISINYRT-Хз
76 Fc- 2382F09 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Xi- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAAAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYDFPGSGYYHRPISINYRT-Хз
- 65 036055
77 Fc- 2382G04 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAGGGYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
78 Fc- 2382Н10 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAGGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFDFPGSGYYHRPISINYRT-Хз
79 Fc- 2382Н11 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV
- 66 036055
NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPADGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVFKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFDYPGSGYYHRPISINYRT-Хз
80 Fc- 2382H04 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAAGGYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEYDFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
81 Fc- 2382Н07 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF
- 67 036055
ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPADAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPGSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFDFPGSGYYHRPISINYRT-Хз
82 Fc- 2382H09 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAAAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFDFPGSGYYHRPISINYRT-Хз
83 Fc- 2451А02 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAAGYGYYR
- 68 036055
присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFPFPGSGYYHRPISINYRT-Хз
84 Fc- 2451B05 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAGGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFDYPGSGYYHRPISINYRT-Хз
85 Fc2451В06 слитый белок (эквивалент 2382D05) X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VS DVPRDLEVVAAT PT S LLISWDAPADGGYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
- 69 036055
выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635)
86 Fc- 2451C06 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAGAASYGY YRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKP GVDYTITVYAVEFPFPGAGYYHRPISINYRTХз
87 Fc- 2451D05 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAGAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFDFPGSGYYHRPISINYRT-Хз
- 70 036055
(SEQ ID NO: 635)
88 Fc- 2451F03 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; X2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDPPAEGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFNFPGSGYYHRPISINYRT-Хз
89 Fc- 2451 GO 1 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAGGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFDFPGSGYYHRPISINYRT-Хз
90 Fc- 2451Н07 X1 выбирается из последовательностей Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
- 71 036055
слитый белок шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- ITDVPRDLEVVAATPTSLLISWNPPDVNYGYYR ITYGETGGNSPLQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYPYAHAGYYHRPISINYRT-Хз
91 Fc- 2382Е03 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAGDGYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
92 Fc- 2382Е04 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG
- 72 036055
последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAGGGYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEFTFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
93 Fc- 2382E05 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEGGYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
94 Fc- 2382Е09 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг-
- 73 036055
необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYDFPGSGYYHRPISINYRT-Хз
95 Fc- 2381A04 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPFSRLPGGGE YYRITYGETGGNSPLQQFTVPGSKGTATISGLK PGVDYTITVYAVEYPYPFSGYYHRPISINYRTХз
96 Fc- 2381А08 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VS DVPRDLEVVAAT PT S LLISWDAPADGGYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPGSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEYDFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
- 74 036055
последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635)
97 Fc- 2381B10 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAGGGYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEYNFIGAGYYHRPISINYRT-Хз
98 Fc2381С08 слиты й белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPADGAYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEFPYPFAGYYHRPISINYRT-Хз
- 75 036055
ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635)
99 Fc- 2381G06 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; X2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Xi- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSEKLDGKARRG YYRITYGETGGNSPVQQFTVPGSKGTATISGLK PGVDYTITVYAVEFPYDHSGYYHRPISINYRTХз
00 Fc- 2381Н01 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Xi- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSPRDSTGLVRR GYYRITYGETGGNSPVQQFTVPGSKGTATISGL KPGVDYTITVYAVEYPYDHSGYYHRPISINYRT -Хз
Fc- X1 выбирается из Xi-
- 76 036055
01 2381H06 слитый белок последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWGDVRTNEARQG YYRITYGETGGNSPLQGFTVPGSKGTATISGLK PGVDYTITVYAVEYTYEHSGYYHRPISINYRTХз
02 Fc- 2381Н09 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAGGGYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPG VDYTITVYAVEFDFVGAGYYHRPISINYRT-Хз
03 Fc- 2382В11 слиты й белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
- 77 036055
выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAAAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYDFAGSGYYHRPISINYRT-Хз
04 Fc- 2382B08 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPADAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPSSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFAFPGAGYYHRPISINYRT-Хз
05 Fc- 2382С11 слиты й белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
- 78 036055
ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAGGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYDFAGSGYYHRPISINYRT-Хз
06 Fc- 2382G03 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEAEAYGY YRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKP GVDYTITVYAVEYVFPGAGYYHRPISINYRTХз
07 Fc- 2382Н03 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEGAYGYY RITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPG
- 79 036055
С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) VDYTITVYAVEYPYPFAGYYHRPISINYRT-X3
08 Fc- 2451A10 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VTDVPRDMEVVAATPTSLLISWQPPAVTYGYYR ITYGETGGNSTLQQFTVPVYKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYPYDHSGYYHRPISINYRT-Хз
09 Fc- 2451В02 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAAAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFDYPGSGYYHRPISINYRT-Хз
- 80 036055
последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635)
10 Fc- 2451C11 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Xi- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- IVDVPRDLEVVAATPTSLLISWDPPAGAYGYYR ITYGETGGNSPKQQFTVPGYKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYPYDHSGYYHRPISINYRT-Хз
11 Fc- 2451Н01 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Xi- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAAGYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYDFPGSGYYHRPISINYRT-Хз
- 81 036055
12 Fc- 2011B11 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWAPPSDAYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEYPYSHAGYYHRPISINYRT-Хз
13 Fc- 2971А03 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDPPSDDYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFPWPHAGYYHRPISINYRT-Хз
14 Fc- 2971А09 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID Х1- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV
- 82 036055
NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG-Хг- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPADDYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFPWPHAGYYHRPISINYRT-Хз
15 Fc- 2971Е02 слитый белок X1 выбирается из последовательностей шарнирной области SEQ ID NO: 317-321; Х2 выбирается из линкерных последовательностей SEQ ID NO: 310-314 и 620-634; ХЗ является необязательным и, если присутствует, может быть С-концевой «хвостовой» последовательностью, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 380-395 и EIEK (SEQ ID NO: 635) Xi- VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT qkslslspg-x2- VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPSDDYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFPWPHAGYYHRPISINYRT-Хз
В некоторых вариантах исполнения aHTu-PCSK9 Аднектин содержит домен Fn3 и РК-группу. В некоторых вариантах исполнения доменом Fn3 является домен В * 10Fn3. В некоторых вариантах исполнения РК-группа увеличивает время полужизни пептида в сыворотке более чем на 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 400, 600, 800, 1000% или более относительно домена Fn3 без РК-группы.
В некоторых вариантах исполнения РК-группой является полимерный сахар. В некоторых вариантах исполнения РК-группой является полиэтиленгликоль. В некоторых вариантах исполнения РКгруппой является сывороточный альбумин человека. В некоторых вариантах исполнения РК-группой является сывороточный иммуноглобулин-связывающий белок. В некоторых вариантах исполнения РКгруппой является трансферрин.
В некоторых вариантах исполнения РК-группой является другой Аднектин, специфичный к сывороточному белку, например к HSA. В настоящей заявке описываются специфические связывающие сывороточный альбумин молекулы Аднектина (или SABA). В определенных вариантах исполнения последовательность слитого белка PCSK9 Аднектина с SABA может быть в общем виде представлена как X1коровая часть PCSK9 Аднектина-Х2-Х3-Х4-коровая часть SABA-X5 (SEQ ID NO: 618) или X1-коровая часть SABA-X2-X3-X4-коровая часть PCSK9 Аднектина-X5 (SEQ ID NO: 619), где X1 и Х4 представляют собой необязательные N-концевые удлинения, X2 и X5 представляют собой необязательные C-концевые удлинения, X3 представляет собой линкер. В одном из вариантов исполнения Аднектины (либо PCK9, либо связывающие сывороточный альбумин) последовательностей SEQ ID NO: 618 и 619 включают коровую область Аднектина, т.е. коровая последовательность PCSK9 Аднектина может быть любой из последовательностей PCSK9 Аднектинов, представленных в табл. 4, в которой данные последовательности начинаются с аминокислотного остатка, соответствующего остатку Е8 последовательности SEQ ID NO: 1 и заканчиваются аминокислотным остатком, соответствующим остатку Т94 последовательности SEQ ID NO: 1. Коровая последовательность SABA может быть выбрана из любой из коровых последовательно- 83 036055 стей SABA, представленных в табл. 6.
В некоторых вариантах исполнения X1 и Х4 являются независимо необязательными и в случае присутствия являются независимо выбранными из последовательностей SEQ ID NO: 371-379, приведенных в табл. 6. Данные последовательности могут содержать М, G или MG последовательность на N-конце, если такие аминокислотные остатки не включены в последовательность. Для экспрессии в клетках млекопитающих слитые белки могут также содержать на N-конце лидерную сигнальную последовательность, такую как METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 326). В некоторых вариантах исполнения X2 и X5 являются независимо необязательными и в случае присутствия являются независимо выбранными из последовательностей SEQ ID NO: 380-395, приведенных в табл. 6. В определенных вариантах исполнения X3 представляет собой линкерную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 396-419, приведенных в табл. 6. Последовательности в табл. 2 представляют собой примеры слитых белков анти-PCSK9 и SABA. Следует понимать, что любая последовательность PCSK9 Аднектина и SABA, описанная в данной заявке, может быть включена в состав таких слитых белков.
Таблица 2. Примеры последовательностей слитого белка PCSK9 Аднектин-SABA
EQ ID Клон или название Описание Последовательность
16 PCSK9 АднектинSABA слитый белок Последовательность PCSK9 Аднектина подчеркнута; последовательность SABA выделена жирным шрифтом. Последовательность PCSK9 Аднектина представляет собой коровую область от клона 2013Е01; последовательность SABA взята из SABA 1 (SEQ ID NO: 330) Х1- EVVAATPTSLLISWVPPSDDYGYYRITY
GETGGNSPVQEFTVPIGKGTATISGLKP
GVDYTITVYAVEFPWPHAGYYHRPISIN
YRT-X2-X3-X4- EWAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITY GETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRT- Хь
17 SABA- PCSK9 Аднектин слитый белок Последовательность SABA выделена жирным шрифтом, последовательность PCSK9 Аднектина подчеркнута . Последовательность SABA взята из SABA 1 (SEQ ID NO: 330); последовательность PCSK9 Аднектина представляет собой коровую область от клона 2013Е01 Х1- EWAATPTSLLI SWHSYYEQNSYYRITY GETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRT- Х2-Х3-Х4- EVVAATPTSLLISWVPPSDDYGYYRITY
GETGGNSPVQEFTVPIGKGTATISGLKP
GVDYTITVYAVEFPWPHAGYYHRPISIN
YRT-X5
Биофизическая и биохимическая характеристика.
Данная заявка описывает Аднектин, содержащий домен Fn3, связывающий PCSK9. Связывание полипептида с целевой молекулой может быть оценено с помощью констант равновесия (например, константы диссоциации, KD) и кинетических констант (например, константы скоростей прямой и обратной реакций, Kon и Koff соответственно). Аднектин, как правило, связывается с целевой молекулой с KD менее чем 500, 100, 10, 1 нМ, 500, 200, 100 пМ. Однако более высокая KD может быть приемлема в случае, когда достаточно низка Koff или достаточно высока Kon.
Последовательности петель BC, DE и FG анти-PCSK9 Аднектинов (SEQ ID NO), описанных в настоящем изобретении, представлены в табл. 3.
- 84 036055
Таблица 3. Петли BC, DE и FG aHTu-PCSK9 Аднектинов
ID клона АФФи нность (Ктх ЕС SK9- Снижен ие количества Петля ВС SE QIDNO Петл я DE SEQ ID NO Петля FG SEQ ID NO
нМ) EGFA FRET (ЕС™. нМ) LDLR ингибиоования
при 75нМ, ЕС™ (нМВ
1459D05 14.4| 1.58* 26Л 4 66.8, >200 SWPPPSH GYG 2 PPG KGT 18 EYPYKHSGY YHRP 28
1784F03 3.8Л 2 150.2, 26±13 SWRPPIH AYG 3 PIV EGT 19 EYTFKHSGY YHRP 29
1784F03 -ml нд нд ВД, >2000 SWDAPIH AYG 4 PGS EGT 20 EYTFKHSGY YHRP 29
1784F03 -m2 нд нд ВД, >2000 SWDAPAH AYG 5 PGS KGT 21 EYTFKHSGY YHRP 29
1784F03 -m3 нд нд ВД, >2000 SWDAPAV TYG 6 PGS KST 22 EYTFKHSGY YHRP 29
1813E02 <2Л 1.3 нд,16 SWSPPAN GYG 7 PVG RGT 23 EYTYKGSGY YHRP 30
1923B02 1923B02 (N82I) 1923B02 (N82E) 1923B02 (T80A) 1922G04 1922G04 (R25D) 1922G04 (R25E) 1922G04 (R25S) 2012A04 2013E01 2011H05 2011H05 (V23D) 2011H05 (V23E) 2381B02 (1) 2381B04 (1) 2381B06 (1) 0.173* нд нд нд 0.09* нд нд нд 0.25* 1.51| 0.29* 0.08* нд нд 3.29| 0.527f нд 2.3 нд нд нд 1.2 2.5 3.5 нд 2.1 1.6 2.7 5.5 7.4 2.5 2.4 3.5 178.0, 23±7 нд, 14 нд, 28 нд, 42 105.1, 10±2 нд, 29±8 ВД, 29±18 нд, 21 144.5, 12±6 165.5, 10±4 197.6, 12±5 нд, 18±3 нд,12±3 125.4, нд 121.6, нд 119.7, нд SWTPPPK GYG SWTPPPK GYG SWTPPPK GYG SWTPPPK GYG SWRPPSH AYG SWDPPSH AYG SWEPPSH AYG SWSPPSH AYG SWRPPSN GHG SWVPPSD DYG SWVPSSH AYG SWDPSSH AYG SWEPSSH AYG SWEPFSR LPGGGE SWEPFSR LPGGGE SWEPFSR LPGGGE 8 8 8 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 10 6 10 6 10 6 PVG EGT PVG EGT PVG EGT PVG EGT PIG KGT PIG KGT PIG KGT PIG KGT PVN EGT PIG KGT PVG VGT PVG VGT PVG VGT PGS KGT PGS KGT PGS KGT 24 24 24 24 25 25 25 25 26 25 27 27 27 21 21 21 EYTYNGAGY YHRP EYTYIGAGY YHRP EYTYEGAGY YHRP EYAYNGAGY YHRP EYPWKGSGY YHRP EYPWKGSGY YHRP EYPWKGSGY YHRP EYPWKGSGY YHRP EFPFKWSGY YHRP EFPWPHAGY YHRP EYAFEGAGY YHRP EYAFEGAGY YHRP EYAFEGAGY YHRP EYPYDYSGY YHRP EYPYEHSGY YHRP EYPYPHSGY YHRP 31 32 33 34 35 35 35 35 36 37 38 38 38 142 143 144
2381B08 4.1 If 2.6 124.8, нд SWDAPAD GGYG 10 7 PSS KGT 136 EYTFPGAGY YHRP 145
- 85 036055
2381D02 (1) ВД 3.1 185.0, нд SWEPFSR LPGGGE 6 10 PGS KGT 21 EYPYDHSGY YHRP 146
2381D04 (1) 0.2371 2.9 119.2, нд SWEPFSR LPGGGE 6 10 PGS KGT 21 EFPYDHSGY YHRP 147
2381F11 1.59f 4 110.2, нд SWDAPAD GGYG 7 10 PVS KST 137 EYTFPGAGY YHRP 145
2381G03 (1) ВД 3.4 70.2, нд SWEPFSR LPGGGE 6 10 PGS KGT 21 EFPYAHSGY YHRP 148
2381G09 1.12f 3.1 133.0, нд SWDAPAG DGYG 8 10 PVS KGT 138 EFTFPGAGY YHRP 149
2381H03 (1) НД 3.4 89.8, нд SWEPFSR LPGGGE 6 10 PGS KGT 21 EYPYAHSGY FHRP 150
23 82AOI НД 12. 9 119.8, нд SWAAPAG GGYG 9 10 PVS KGT 138 EYDFPGAGY YHRP 151
2382B10 2.35f 3 100.2, нд SWDAPAD AYG 0 11 PSS KGT 136 EYDFPGSGY YHRP 152
2382B09 0.656f 3.8 105.0, нд SWDAPAD AYG 0 11 PVS KGT 138 EFDYPGSGY YHRP 153
2382C05 2.49f 4 105.3, нд SWDAPAD GAYG 1 11 PVS KGT 138 EYSFPGAGY YHRP 154
2382C09 0.757f 3.5 121.7, нд SWDAPAE GYG 2 11 PVS KGT 138 EFDFPGSGY YHRP 155
2382D03 1.53f 3.3 80.4, нд SWDAPAD EAYG 3 11 PVS KGT 138 EFDFPGAGY YHRP 156
2382D05 0.314f 2.6 140.5, нд SWDAPAD GGYG 7 10 PVS KGT 138 EFDFPGAGY YHRP 156
2382D08 ВД 3.1 106.6, нд SWDAPAD GYG 4 11 PVS KGT 138 EFPFPGSGY YHRP 157
2382D09 0.304f 2.6 109.1, нд SWDAPAE GYG 2 11 PVS KGT 138 EFDFPGAGY YHRP 156
2382F02 ВД 2.6 -6.3, нд SWDAPAG GGYG 5 11 PVS KGT 138 EFDFPGSGY YHRP 155
2382F03 НД 2.7 88.6, нд SWDAPAA DAYG 6 11 PVS KGT 138 EFNFPGAGY YHRP 158
2382F05 4.54f 2.4 72.2, нд SWDAPAE AGKHYG 7 11 PVS KGT 138 EFDFPGAGY YHRP 156
2382F08 ВД 2.5 105.0, нд SWDAPAE AYG 8 11 PVS KGT 138 EFTYPGSGY YHRP 159
2382F09 ВД 3.1 109.7, нд SWDAPAA AYG 9 11 PVS KGT 138 EYDFPGSGY YHRP 152
2382G04 lilt 2.9 146.1, нд SWDAPAG GGYG 5 11 PSS KGT 136 EFDFPGAGY YHRP 156
2382H10 1.40f 2.6 118.6, нд SWDAPAG GYG 0 12 PVS KGT 138 EFDFPGSGY YHRP 155
2382H11 ВД 2.9 117.2, нд SWDAPAD GYG 4 11 PVF KGT 139 EFDYPGSGY YHRP 153
2382H04 ВД 3.2 68.2, нд SWDAPAA GGYG 1 12 PSS KGT 136 EYDFPGAGY YHRP 151
- 86 036055
2382H07 ВД 2.7 86.2, нд SWDAPAD AYG 0 11 PGS KGT 21 EFDFPGSGY YHRP 155
2382H09 1.86f 0.9 101.2, нд SWDAPAA AYG 9 11 PSS KGT 136 EFDFPGSGY YHRP 155
2451A02 ВД 3.2 106.4, нд SWDAPAA GYG 2 12 PVS KGT 138 EFPFPGSGY YHRP 157
2451B05 ВД 6.3 91.7, нд SWDAPAG GYG 0 12 PSS KGT 136 EFDYPGSGY YHRP 153
2451B06 ВД 4.5 92.2, нд SWDAPAD GGYG 7 10 PVS KGT 138 EFDFPGAGY YHRP 156
2451C06 1.27| 1.2 89.4, нд SWDAPAG AASYG 3 12 PVS KGT 138 EFPFPGAGY YHRP 160
2451D05 ВД 2.8 115.0, нд SWDAPAG AYG 4 12 PVS KGT 138 EFDFPGSGY YHRP 155
2451F03 нд 2.8 113.2, нд SWDPPAE GYG 5 12 PVS KGT 138 EFNFPGSGY YHRP 161
2451 GO 1 ВД 3.8 90.8, нд SWDAPAG GYG 0 12 PSS KGT 136 EFDFPGSGY YHRP 155
2451H07 (2) 2.08f 0.2 88.8, нд SWNPPDV NYG 6 12 PVS KGT 138 EYPYAHAGY YHRP 162
2382E03 2.94| 2.4 89.5, нд SWDAPAG DGYG 8 10 PVS KGT 138 EFDFPGAGY YHRP 156
2382E04 нд 3 61.5, нд SWDAPAG GGYG 5 11 PVS KGT 138 EFTFPGAGY YHRP 149
2382E05 0.604f 2.8 103.5, нд SWDAPAE GGYG 7 12 PVS KGT 138 EFDFPGAGY YHRP 156
2382E09 нд 6.2 97.2, нд SWDAPAE AYG 8 11 PVS KGT 138 EYDFPGSGY YHRP 152
2381A04 (1) нд 3.3 100.1, нд SWEPFSR LPGGGE 6 10 PGS KGT 21 EYPYPFSGY YHRP 163
2381A08 нд 3.6 91.4, нд SWDAPAD GGYG 7 10 PGS KGT 21 EYDFPGAGY YHRP 151
2381B10 НД 7.3 96.4, нд SWDAPAG GGYG 5 11 PVS KGT 138 EYNFIGAGY YHRP 164
2381C08 НД 0.7 15.3, нд SWDAPAD GAYG 1 11 PVS KGT 138 EFPYPFAGY YHRP 165
2381G06 (3) НД 9 57.7, нд SWSEKLD GKARRG 8 12 PGS KGT 21 EFPYDHSGY YHRP 147
2381H01 (3) НД 4 22.2, нд SWSPRDS TGLVRRG 9 12 PGS KGT 21 EYPYDHSGY YHRP 146
2381H06 (4) НД 5 53.4, нд SWGDVRT NEARQG 0 13 PGS KGT 21 EYTYEHSGY YHRP 166
2381H09 3.23f 3.4 94.4, нд SWDAPAG GGYG 5 11 PVS KGT 138 EFDFVGAGY YHRP 167
2382В11 нд 2.9 88.8, нд SWDAPAA AYG 9 11 PVS KGT 138 EYDFAGSGY YHRP 168
2382B08 НД 2.9 107.2, нд SWDAPAD AYG 0 11 PSS KGT 136 EFAFPGAGY YHRP 169
- 87 036055
2382С11 нд 3.7 82.9, нд SWDAPAG GYG 12 0 PVS KGT 138 EYDFAGSGY YHRP 168
2382G03 нд 2.7 77.8, нд SWDAPAE AEAYG 13 1 PVS KGT 138 EYVFPGAGY YHRP 170
2382Н03 0.677f 3.4 102.1, нд SWDAPAE GAYG 13 2 PVS KGT 138 EYPYPFAGY YHRP 171
2451А10 (5) нд 10. 9 53.7, нд SWQPPAV TYG 13 3 PVY KGT 140 EYPYDHSGY YHRP 146
2451В02 нд 5.3 71.4, нд SWDAPAA AYG 11 9 PVS KGT 138 EFDYPGSGY YHRP 153
2451С11 (6) нд 9.7 70.3, нд SWDPPAG AYG 13 4 PGY KGT 141 EYPYDHSGY YHRP 146
2451Н01 нд 2.8 95.8, нд SWDAPAA GYG 12 2 PVS KGT 138 EYDFPGSGY YHRP 152
2011В11 нд 1.7 144.5, нд SWAPPSD AYG 13 5 PIG KGT 25 EYPYSHAGY YHRP 172
2971А03 0.806f нд 120.1, нд SWDPPSD DYG 30 1 PIG KGT 25 EFPWPHAGY YHRP 37
2971А09 2.791 нд 132.3, нд SWDAPAD DYG 30 2 PIG KGT 25 EFPWPHAGY YHRP 37
2971Е02 1.78f нд 126.2, нд SWDAPSD DYG 30 3 PIG KGT 25 EFPWPHAGY YHRP 37
TKD определены с использованием Octet Red при 37°C; * KD определены с использованием ProteOn при 25°C; Л KD определены с использованием ITC при 37°C; (1) в дополнение к мутациям в петлях данные клоны также содержат мутации V45L и E47Q; (2) в дополнение к мутациям в петлях данные клоны также содержат мутации V1I, S2T и V45L; (3) в дополнение к мутациям в петлях данные клоны также содержат мутацию E47Q; (4) в дополнение к мутациям в петлях данные клоны также содержат мутации V45L и E47G; (5) В дополнение к мутациям в петлях данные клоны также содержат мутации S2T, L8M, Р44Т, V45L и E47Q; (6) в дополнение к мутациям в петлях данные клоны также содержат мутации V1I, S2V, V45K и E47Q.
SEQ ID NO последовательностей семейства анти-PCSK9 Аднектинов, описываемых в настоящем изобретении, представлены в табл. 4
Таблица 4. Семейство Аднектинов анти-PC SK9
Клон Последовательность
Аминокислотная Нуклеотидная
1459D05 также обозначенный какАТЮ00891 или ATI-891 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWPPPSHGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPPGKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEY PY К HSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:39) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGCCGCCGCCGTCTCATGGTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCGCCTGGTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTACAAACATTCTGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:40)
1784F03 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWRPPIHAYGYYRITY GETGGNS PVQE FTVPIVEGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYTFK HSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO :41) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGAGGCCGCCGATTCATGCTTACGGGTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGTTGAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATATACATTTAAACATTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:42)
1784F03- ml MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPIHAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPGSEGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYTFK HSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:43) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGATTCATGCTTACGGGTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGTTCTGAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATATACATTTAAACATTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:44)
- 88 036055
1784F03- m2 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAHAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPGSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYT FK HSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:45) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTCATGCTTACGGGTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATATACATTTAAACATTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:46)
1784F03- m3 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAVTYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPGSKSTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYT FK HSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:47) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGTTACTTACGGGTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAATCTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATATACATTTAAACATTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:48)
1813E02 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWSPPANGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVGRGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYTYK GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO :49) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGTCCCCACCGGCTAACGGTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTGGTAGAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAGTATACCTACAAAGGCTCTGGTTACTACCATCGC CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:50)
1923B02 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWTPPPKGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVGEGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYTYN GAGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO :51) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGACGCCTCCCCCTAAAGGGTATGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTGGTGAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACACGTACAACGGTGCCGGTTACTACCACCGG CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:52)
1923B02( N82I) MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWTPPPKGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVGEGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYTYI GAGYYHRPISINYRTGSGSHHH HHH (SEQ ID NO:53) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGACGCCTCCCCCTAAAGGGTATGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTGGTGAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACACGTACATTGGTGCCGGTTACTACCACCGG CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGGTAGCGGTTCCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO :5 4)
1923В02( N82E) MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWTPPPKGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVGEGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYTYE GAGYYHRPISINYRTGSGSHHH HHH (SEQ ID NO:55) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGACGCCTCCCCCTAAAGGGTATGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTGGTGAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACACGTACGAAGGTGCCGGTTACTACCACCGG CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGGTAGCGGTTCCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO :5 6)
1923В02( Т80А) MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWTPPPKGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVGEGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYAYN GAGYYHRPISINYRTGSGSHHH HHH (SEQ ID NO:57) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGACGCCTCCCCCTAAAGGGTATGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTGGTGAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGCGTACAACGGTGCCGGTTACTACCACCGG CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGGTAGCGGTTCCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO :5 8)
1922G04 также обозначенный здесь как ΑΊΊ001057 или ATI-105 7 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWRPPSHAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPIGKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEY PWK GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO :59) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGCGGCCGCCATCTCATGCTTATGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGGAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTGGAAAGGTTCTGGTTACTACCATCGG CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:60)
1922G04( R25D) MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDPPSHAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPIGKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEY PWK GSGYYHRPISINYRTGSGSHHH HHH (SEQ ID NO:61) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACCCGCCATCTCATGCTTATGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGGAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTGGAAAGGTTCTGGTTACTACCATCGG CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGGTAGCGGTTCCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO:62)
- 89 036055
1922G04( R25E) MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWEPPSHAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPIGKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEY PWK GSGYYHRPISINYRTGSGSHHH ННН (SEQ ID NO:63) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGAACCGCCATCTCATGCTTATGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGGAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTGGAAAGGTTCTGGTTACTACCATCGG CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGGTAGCGGTTCCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO:64)
1922G04( R25S) MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWSPPSHAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPIGKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEY PWK GSGYYHRPISINYRTGSGSHHH HHH (SEQ ID NO:65) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGAGCCCGCCATCTCATGCTTATGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGGAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTGGAAAGGTTCTGGTTACTACCATCGG CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGGTAGCGGTTCCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO :6 6)
2012A04 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWRPPSNGHGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVNEGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVE FPFK WSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO :67) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGCGGCCCCCCTCTAATGGTCACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTAATGAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCCCCTTCAAGTGGTCGGGCTACTACCATCGA CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:68)
2013E01 также обозначенный как ATI001081 или ATI-1081 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWVPPSDDYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPIGKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVE FPWP HAGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:69) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGTCCCGCCTTCAGATGATTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGTAAAGGAACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAGTTTCCGTGGCCACATGCTGGTTACTATCATCGG CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:70)
2011Н05 также обозначенный как ATI001091 или ATI-1091 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWVPSSHAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVGVGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYAFE GAGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO :71) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGTTCCGTCGTCTCATGCCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTGGGGGTAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGCTTTCGAAGGGGCTGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:72)
2011Н05( V23D) MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDPSSHAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVGVGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYAFE GAGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:73) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACCCGTCGTCTCATGCCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTGGGGGTAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGCTTTCGAAGGGGCTGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:74)
2011Н05( V23E) MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWEPSSHAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVGVGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYAFE GAGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:75) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGAACCGTCGTCTCATGCCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTGGGGGTAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGCTTTCGAAGGGGCTGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:76)
2381В02 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWEPFSRLPGGGEYYR ITYGETGGNSPLQQFTVPGSKG TATIS GL KPGVDY TITVYAVE Y PYDYSGYYHRPISINYRTEIDK PSQHHHHHH (SEQ ID NO:173) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGAGCCGTTCAGCCGGTTGCCCGGGGGCGGCGAGTATTACCGGATCACTTACGGCGAAAC AGGAGGCAATAGCCCTCTGCAGCAGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCC TTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTACGACTATTCTGGTTAC TACCATCGCCCCATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCA CCAC (SEQ ID NO:174)
2381В04 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWEPFSRLPGGGEYYR ITYGETGGNSPLQQFTVPGSKG TATIS GL KPGVDY TITVYAVE Y PYEHSGYYHRPISINYRTEIDK PSQHHHHHH (SEQ ID NO:175) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGAGCCGTTCAGCCGGTTGCCCGGGGGCGGCGAGTATTACCGGATCACTTACGGCGAAAC AGGAGGCAATAGCCCTCTGCAGCAGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCC TTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTACGAGCATTCTGGGTAC TATCATCGTCCGATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCA CCAC (SEQ ID NO:176)
- 90 036055
2381B06 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWEPFSRLPGGGEYYR ITYGETGGNSPLQQFTVPGSKG TATIS GL KP GVDY TITVYAVE Y PYPHSGYYHRPISINYRTEIDK PSQHHHHHH (SEQ ID NO:177) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGAGCCGTTCAGCCGGTTGCCCGGGGGCGGCGAGTATTACCGGATCACTTACGGCGAAAC AGGAGGCAATAGCCCTCTGCAGCAGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCC TTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTACCCGCATTCTGGTTAC TACCATCGACCGATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCA CCAC (SEQ ID NO:178)
2381B08 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPADGGYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPSSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEYTF PGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:179) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGATGGAGGGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTAGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACACCTTCCCGGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:180)
2381D02 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWEPFSRLPGGGEYYR ITYGETGGNSPLQQFTVPGSKG TATIS GL KP GVDY TITVYAVE Y PYDHSGYYHRPISINYRTEIDK PSQHHHHHH (SEQ ID NO:181) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGAGCCGTTCAGCCGGTTGCCCGGGGGCGGCGAGTATTACCGGATCACTTACGGCGAAAC AGGAGGCAATAGCCCTCTGCAGCAGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCC TTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTACGACCATTCTGGTTAC TACCATCGTCCCATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCA CCAC (SEQ ID NO:182)
2381D04 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWEPFSRLPGGGEYYR ITYGETGGNSPLQQFTVPGSKG TATIS GL KPGVDY TITVYAVE F PYDHSGYYHRPISINYRTEIDK PSQHHHHHH (SEQ ID NO:183) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGAGCCGTTCAGCCGGTTGCCCGGGGGCGGCGAGTATTACCGGATCACTTACGGCGAAAC AGGAGGCAATAGCCCTCTGCAGCAGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCC TTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCCCGTACGACCATTCTGGTTAC TACCATCGGCCCATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCA CCAC (SEQ ID NO:184)
2381F11 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPADGGYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVEYTF PGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:185) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGACGGGGGGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAAGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACACCTTCCCCGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:186)
2381G03 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWEPFSRLPGGGEYYR ITYGETGGNSPLQQFTVPGSKG TATIS GL KPGVDY TITVYAVE F PYAHSGYYHRPISINYRTEIDK PSQHHHHHH (SEQ ID NO:187) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGAGCCGTTCAGCCGGTTGCCCGGGGGCGGCGAGTATTACCGGATCACTTACGGCGAAAC AGGAGGCAATAGCCCTCTGCAGCAGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCC TTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCCCGTACGCGCATTCTGGGTAC TACCATCGTCCGATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCA CCAC (SEQ ID NO:188)
- 91 036055
2381G09 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAGDGYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFTF PGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:189) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGGGGACGGTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCCGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCACCTTCCCGGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:190)
2381H03 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWEPFSRLPGGGEYYR ITYGETGGNSPLQQFTVPGSKG TATIS GL KPGVDY TITVYAVE Y PYAHSGYFHRPISINYRTEIDK PSQHHHHHH (SEQ ID NO:191) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGAGCCGTTCAGCCGGTTGCCCGGGGGCGGCGAGTATTACCGGATCACTTACGGCGAAAC AGGAGGCAATAGCCCTCTGCAGCAGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCC TTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTACGCGCATTCTGGTTAC TTCCATCGTCCGATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCA CCAC (SEQ ID NO:192)
2382A01 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWAAPAGGGYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEYDF PGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:193) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGCCGCTCCGGCTGGTGGTGGCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGACTTCCCGGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:194)
2382B10 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPADAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPSSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYDFP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:195) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATAAGCTGGGACGCTCCGGCTGACGCGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTAGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGACTTCCCCGGCAGCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:196)
2382B09 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPADAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEFDYP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:197) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGACGCGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTACCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:198)
2382C05 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPADGAYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEYSF PGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:199) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGATGGGGCATACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAGGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACTCCTTCCCCGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:200)
- 92 036055
2382C09 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAEGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEFDFP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NQ:201) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGAGGGTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NQ:202)
2382D03 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPADEAYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFDF PGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:203) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGACGAGGCGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGTGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCCGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NQ:204)
2382D05 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPADGGYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFDF PGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:205) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGATGGTGGTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCGGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NQ:206)
2382D08 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPADGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEFPFP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NQ:207) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGATGGCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCCCCTTCCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:208)
2382D09 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAEGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEFDFP GAGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NQ:209) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGAAGGGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCCGGCGCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NQ:210)
2382F02 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAGGGYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFDF PGSGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:211) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGGCGGGGGGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCGGGCTCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:212)
2382F03 2382F05 2382F08 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAADAYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TIS GL KPGVDY TITVYAVE FN F PGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:213) MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAEAGKHYGYYR ITYGETGGNSPVQEFTVPVSKG TATIS GL KPGVDY TITVYAVE F DFPGAGYYHRPISINYRTEIDK PSQHHHHHH (SEQ ID NO:215) MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAEAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEFTYP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:217) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGCCGATGCTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCAACTTCCCGGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:214) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGAAGCAGGTAAGCACTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAAC AGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCC TTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCGGGCGCCGGTTAC TACCATCGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCA CCAC (SEQ ID NO:216) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGAAGCATACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCACCTACCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:218)
- 93 036055
2382F09 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAAAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYDFP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:219) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGCAGCCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGACTTCCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NQ:220)
2382G04 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAGGGYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPSSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFDF PGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:221) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGGTGGGGGATACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTAGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCGGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:222)
2382H10 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAGGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEFDFP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:223) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGGGGGCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:224)
2382H11 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPADGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVFKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEEDYP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:225) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGATGGTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTTTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTACCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:226)
2382H04 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAAGGYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPSSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEYDF PGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:227) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGCGGGGGGGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTAGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTATATGCTGTCGAATACGACTTCCCCGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:228)
2382H07 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPADAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPGSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEFDFP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:229) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGATGCTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCAGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NQ:230)
2382H09 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAAAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPSSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEFDFP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:231) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGCGGCTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTAGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGC CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:232)
2451A02 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAAGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEFPFP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:233) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGCGGGTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCCCCTTCCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:234)
2451B05 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAGGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPSSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEFDYP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:235) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGGGGGATACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTAGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTACCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:236)
- 94 036055
2451B06 (эквивалент 2382D05) MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPADGGYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFDF PGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:205) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGATGGTGGTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCGGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NQ:206)
2451С06 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAGAASYGYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPVSKGT ATISGLKPGVDYTITVYAVEFP FPGAGYYHRPISINYRTEIDKP SQHHHHHH (SEQ ID NO:237) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGGGGCAGCGTCCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGG AGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTA AACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCCCCTTCCCCGGCGCCGGTTACTAC CATCGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCA C (SEQ ID NO:238)
2451D05 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAGAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEFDFP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:239) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGGCGCGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:240)
2451F03 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDPPAEGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVE FNFP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:241) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACCCTCCGGCTGAAGGTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCAACTTCCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:242)
2451 GO 1 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAGGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPSSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEFDFP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:243) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGGGGGCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTAGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCGGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:244)
2451Н07 MGITDVPRDLEVVAAT PTSLLISWNPPDVNYGYYRITY GETGGNSPLQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEY PYA HAGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:245) ATGGGTATCACGGATGTGCCGCGAGACTTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGAACCCGCCGGATGTGAATTACGGTTATTATCGCATCACTTACGGGGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTTTGCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATATCCGTACGCGCACGCTGGTTACTACCATCGT CCGATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:246)
2382Е03 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAGDGYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFDF PGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:247) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGGGGACGGGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCCGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:248)
2382Е04 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAGGGYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFTF PGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:249) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGGTGGTGGATACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCACCTTCCCGGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NQ:250)
2382Е05 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAEGGYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFDF PGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:251) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGAGGGCGGCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCCGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:252)
- 95 036055
2382E09 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAEAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYDFP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:253) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGAGGCTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGACTTCCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:254)
2381A04 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWEPFSRLPGGGEYYR ITYGETGGNSPLQQFTVPGSKG TATIS GL KPGVDY TITVYAVE Y PYPFSGYYHRPISINYRTEIDK PSQHHHHHH (SEQ ID NO:255) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGAGCCGTTCAGCCGGTTGCCCGGGGGCGGCGAGTATTACCGGATCACTTACGGCGAAAC AGGAGGCAATAGCCCTCTGCAGCAGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCC TTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTACCCGTTTTCTGGTTAC TACCATCGTCCCATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCA CCAC (SEQ ID NO:256)
2381A08 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPADGGYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPGSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEYDF PGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:257) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGACGGCGGGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGACTTCCCGGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:258)
2381B10 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAGGGYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEYNF IGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:259) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGGGGGTGGATACGGTTATTACCGSATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACAACTTCATCGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NQ:260)
2381C08 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPADGAYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFPY PFAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:261) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGACGGTGCCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCCCCTACCCCTTCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:262)
2381G06 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWSEKLDGKARRGYYR ITYGETGGNSPVQQFTVPGSKG TATIS GL KPGVDY TITVYAVE F PYDHSGYYHRPISINYRTEIDK PSQHHHHHH (SEQ ID NO:263) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGTCGGAGAAGTTGGACGGGAAGGCGCGCCGCGGGTATTACCGCATCACATACGGCGAAAC AGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGCAGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCC TTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCCCGTACGACCATTCTGGTTAC TACCATCGTCCCATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCA CCAC (SEQ ID NO:264)
- 96 036055
2381H01 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWSPRDSTGLVRRGYY RITYGETGGNSPVQQFTVPGSK GTATISGLKPGVDYTITVYAVE YPYDHSGYYHRPISINYRTEID KPSQHHHHHH (SEQ ID NO:265) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGAGCCCGCGGGACTCCACCGGCTTGGTGAGGCGGGGGTATTACCGCATCACTTACGGCGA AACAGGAGGCAATAGCCCTGTTCAGCAGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCG GCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTACGACCATTCTGGT TACTACCATCGGCCCATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCA CCACCAC (SEQ ID NO :266)
2381H06 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWGDVRTNEARQGYYR ITYGETGGNSPLQGFTVPGSKG TATIS GL KPGVDY TITVYAVE Y TYEHSGYYHRPISINYRTEIDK PSQHHHHHH (SEQ ID NO:267) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGGCGACGTCCGGACGAACGAGGCGCGGCAGGGCTATTACCGGATCACTTACGGCGAAAC AGGAGGCAATAGCCCTCTCCAGGGGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCC TTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAGTATACGTACGAGCATTCTGGTTAC TACCATCGTCCGATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCA CCAC (SEQ ID NO:268)
2381H09 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAGGGYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFDF VGAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:269) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGGGGGGGGCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCGTCGGCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NQ:270)
2382B11 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAAAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYDFA GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:271) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGCGGCCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGACTTCGCGGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:272)
2382B08 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPADAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPSSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVE FAFP GAGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:273) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGACGCGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTAGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTATATGCTGTCGAATTCGCCTTCCCCGGCGCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:274)
2382C11 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAGGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYDFA GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:275) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGGAGGTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGACTTCGCGGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:276)
2382G03 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAEAEAYGYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPVSKGT ATISGLKPGVDYTITVYAVEYV FPGAGYYHRPISINYRTEIDKP SQHHHHHH (SEQ ID NO:277) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGAAGCAGAAGCGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGG AGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTA AACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGTCTTCCCCGGCGCCGGTTACTAC CATCGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCA C (SEQ ID NO:278)
2382H03 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAEGAYGYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPVSKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEYPY PFAGYYHRPISINYRTEIDKPS QHHHHHH (SEQ ID NO:279) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGAGGGCGCTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGG CAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAAC CTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCCTACCCCTTCGCCGGTTACTACCAT CGTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NQ:280)
2451A10 MGVTDVPRDMEVVAAT PTSLLISWQPPAVTYGYYRITY GETGGNSTLQQFTVPVYKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYPYD HSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:281) ATGGGTGTCACCGATGTGCCGCGCGACATGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGCAGCCGCCGGCTGTTACTTACGGTTATTATCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCACTCTCCAGCAGTTCACTGTGCCTGTTTATAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTACGACCATTCTGGGTACTACCATCGG CCGATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:282)
- 97 036055
2451В02 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPiAAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEFDYP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ НННННН (SEQ ID NO:283) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGCTGCTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTACCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:284)
2451С11 MGIVDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDPPAGAYGYYRITY GETGGNS PKQQ FTVPGY KGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYPYD HSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:285) ATGGGTATCGTGGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACCCGCCGGCTGGTGCTTACGGTTATTATCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCAAAGCAGCAGTTCACTGTGCCTGGTTATAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTACGACCATTCTGGTTACTACCATCGG CCGATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:286)
2451Н01 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPAAGYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPVSKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYDFP GSGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:287) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCTCCGGCTGCGGGGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGACTTCCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:288)
2011В11 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWAPPSDAYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPIGKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVEYPYS HAGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO :289) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGCGCCGCCTTCTGATGCGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTATTCACATGCTGGTTACTACCATCGT CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:290)
2971А03 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDPPSDDYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPIGKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVE FPWP HAGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:304) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACCCGCCTTCGGATGATTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGTAAAGGAACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAGTTTCCGTGGCCACATGCTGGTTACTATCATCGG CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:305)
2971А09 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPADDYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPIGKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVE FPWP HAGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:306) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCGCCTGCGGATGATTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGTAAAGGAACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAGTTTCCGTGGCCACATGCTGGTTACTATCATCGG CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:307)
2971Е02 MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWDAPSDDYGYYRITY GETGGNSPVQEFTVPIGKGTAT ISGLKPGVDYTITVYAVE FPWP HAGYYHRPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO:308) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTG ATCAGCTGGGACGCGCCTTCGGATGATTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAA TAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGTAAAGGAACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTG GCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAGTTTCCGTGGCCACATGCTGGTTACTATCATCGG CCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO:309)
SEQ ID NO последовательностей семейства пэгилированных aHTu-PCSK9 Аднектинов, описываемых в данном изобретении, представлены в табл. 5.
- 98 036055
Таблица 5. Семейство aHTu-PCSK9 Аднектинов, мутантных по остатку цистеина для последующего пэглирования
ATI#/ Клон# [Описание] Последовательность
Аминокислотная Нуклеотидная
ATI001170 [2013Е01-без Hisтэга, мутант по Cys] MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWVPPSDDYGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PIGKGTATISGLKPGVDYT ITVYAVEFPWPHAGYYHRP ISINYRTEIDKPCQ (SEQ ID NO:78) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGGTCCCGCCTTCAGATGATTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGTAAAGGAACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAGTTTCCGTGGCCACATGCTGGTTACTATCATCGGCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATGCCAGTG (SEQ ID NO :79)
ATI001172 [2013Е01-без Hisтэга, мутант по Cys] MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWVPPSDDYGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PIGKGTATISGLKPGVDYT ITVYAVEFPWPHAGYYHRP ISINYRTEGSGC (SEQ ID NO:80) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGGTCCCGCCTTCAGATGATTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGTAAAGGAACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAGTTTCCGTGGCCACATGCTGGTTACTATCATCGGCCAATTTCCAT TAATTACCGAACAGAAGGTAGCGGTTGCTG (SEQ ID NO:81)
ΑΤΙ001174± £2013Е01 -без Hisтэга, мутант по Cys обозначенный как ATI-1174 MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWVPPSDDYGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PIGKGTATISGLKPGVDYT ITVYAVEFPWPHAGYYHRP ISINYRTEIEKPCQ (SEQ ID NO:82) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGGTCCCGCCTTCAGATGATTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGTAAAGGAACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAGTTTCCGTGGCCACATGCTGGTTACTATCATCGGCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGAAATTGAGAAACCATGCCAGTG (SEQ ID NO:83)
ATI001114* £2013Е01му тант по Cvsl также обозначенный как ATI-1114 MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWVPPSDDYGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PIGKGTATISGLKPGVDYT ITVYAVEFPWPHAGYYHRP ISINYRTGSGCHHHHHH (SEQ ID NO:84) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGGTCCCGCCTTCAGATGATTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGTAAAGGAACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAGTTTCCGTGGCCACATGCTGGTTACTATCATCGGCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGGTAGCGGTTGCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO :85)
ATI000959* [1459D05 мутант по Cys] MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWPPPSHGYGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PPGKGTATISGLKPGVDYT ITVYAVEYPYKHSGYYHRP ISINYRTEIDKPCQHHHHH H (SEQ ID NO:86) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGCCGCCGCCGTCTCATGGTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCGCCTGGTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTACAAACATTCTGGTTACTACCATCGTCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATGCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO :87)
ATI001063* [1784F03 мутант по Cys] MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWRPPIHAYGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PIVEGTATISGLKPGVDYT ITVYAVEYTFKHSGYYHRP ISINYRTEIDKPCQHHHHH H (SEQ ID NO:88) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGAGGCCGCCGATTCATGCTTACGGGTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGTTGAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATATACATTTAAACATTCCGGTTACTACCATCGTCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATGCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO :89)
- 99 036055
ΑΊΊ001119* [2012A04 мутант по Cys] MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWRPPSNGHGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PVNEGTATISGLKPGVDYT ITVYAVEFPFKWSGYYHRP ISINYRTGSGCHHHHHH (SEQ ID NO:90) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGCGGCCCCCCTCTAATGGTCACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTAATGAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCCCCTTCAAGTGGTCGGGCTACTACCATCGACCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGGTAGCGGTTGCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO:91)
ΑΊΊ001117* [2011Н05 мутант по Cys] MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWVPSSHAYGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PVGVGTATIS GL KPGVDY T ITVYAVEYAFEGAGYYHRP ISINYRTGSGCHHHHHH (SEQ ID NO:92) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGGTTCCGTCGTCTCATGCCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTGGGGGTAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGCTTTCGAAGGGGCTGGTTACTACCATCGTCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGGTAGCGGTTGCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO :93)
ΑΊΊ001194* [2011HO5(V23D) мутант по Cys] MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWDPSSHAYGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PVGVGTATIS GL KPGVDY T ITVYAVEYAFEGAGYYHRP ISINYRTEGSGCHHHHHH (SEQ ID NO:94) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGGACCCGTCGTCTCATGCCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTGGGGGTAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGCTTTCGAAGGGGCTGGTTACTACCATCGTCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGAAGGTAGCGGTTGCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO :95)
2011Н05 (V23E)-мутант по Cys MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWEPSSHAYGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PVGVGTATIS GL KPGVDY T ITVYAVEYAFEGAGYYHRP ISINYRTEGSGCHHHHHH (SEQ ID NO:96) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGGAACCGTCGTCTCATGCCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTGGGGGTAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACGCTTTCGAAGGGGCTGGTTACTACCATCGTCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGAAGGTAGCGGTTGCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO :97)
ATI001112 [1923В02 мутант по Cys] MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWTPPPKGYGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PVGEGTATISGLKPGVDYT ITVYAVEYTYNGAGYYHRP ISINYRTGSGCHHHHHH (SEQ ID NO:98) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGACGCCTCCCCCTAAAGGGTATGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTGGTGAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACACGTACAACGGTGCCGGTTACTACCACCGGCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGGTAGCGGTTGCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO:99)
АТЮОШО [1922G04 мутант по Cys] MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWRPPSHAYGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PIGKGTATISGLKPGVDYT ITVYAVEY PWKGSGYY HRP ISINYRTGSGCHHHHHH (SEQ ID NQ:100) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGCGGCCGCCATCTCATGCTTATGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGGAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTGGAAAGGTTCTGGTTACTACCATCGGCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGGTAGCGGTTGCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO :101)
- 100 036055
ΑΊΊ001128 [1922G04 мутант по Cys] MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWRPPSHAYGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PIGKGTATISGLKPGVDYT ITVYAVEYPWKGSGYYHRP ISINYRTEIDKPCQHHHHH H (SEQ ID NQ:102) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGCGGCCGCCATCTCATGCTTATGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGGAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTGGAAAGGTTCTGGTTACTACCATCGGCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATGCCAGCACCACCACCACCACCAC (SEQ ID NO :103)
ΑΊΊ001184 * [1922G04(R23E) мутант по Cys] MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWEPPSHAYGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PIGKGTATISGLKPGVDYT ITVYAVEYPWKGSGYYHRP ISINYRTEGSGCHHHHHH (SEQ ID NQ:104) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGGAACCGCCATCTCATGCTTATGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGGAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATACCCGTGGAAAGGTTCTGGTTACTACCATCGGCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGAAGGTAGCGGTTGCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO:105)
2381D04- Cys MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWEPFSRLPGG GEYYRITYGETGGNSPLQQ FTVPGSKGTATISGLKPGV DYTITVYAVEFPYDHSGYY HRPISINYRTGSGCHHHHH H (SEQ ID NO:291) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGGAGCCGTTCAGCCGGTTGCCCGGGGGCGGCGAGTATTACCGGATCACTTACGGCGAAACAGGAG GCAATAGCCCTCTGCAGCAGTTCACTGTGCCTGGTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCT GGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCCCGTACGACCATTCTGGTTACTACCATCGGCC CATTTCCATTAATTACCGCACAGGTAGCGGTTGCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO :292)
2382D09- Cys MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWDAPAEGYGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PVSKGTATISGLKPGVDYT ITVYAVEFDFPGAGYYHRP ISINYRTGSGCHHHHHH (SEQ ID NO :293) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGGACGCTCCGGCTGAAGGGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCCGGCGCCGGTTACTACCATCGTCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGGTAGCGGTTGCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO :294)
2451В06- Cys MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWDAPADGGYG YYRITYGETGGNSPVQEFT VPVS KGTATISGLKPGVDY TITVYAVE FDFPGAGYYHR PISINYRTGSGCHHHHHH (SEQ ID NO :295) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGGACGCTCCGGCTGATGGTGGTTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATA GCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTT GATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCGGGCGCCGGTTACTACCATCGTCCAATTTC CATTAATTACCGCACAGGTAGCGGTTGCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO:296)
2382E05- Cys MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWDAPAEGGYG YYRITYGETGGNSPVQEFT VPVS KGTATISGLKPGVDY TITVYAVE FDFPGAGYYHR PISINYRTGSGCHHHHHH (SEQ ID NO :297) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGGACGCTCCGGCTGAGGGCGGCTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATA GCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTT GATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTTCCCCGGCGCCGGTTACTACCATCGTCCAATTTC CATTAATTACCGCACAGGTAGCGGTTGCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO:298)
2382B09- Cys MGVSDVPRDLEVVA ATPTSLLISWDAPADAYGY YRITYGETGGNSPVQEFTV PVSKGTATISGLKPGVDYT ITVYAVEFDYPGSGYYHRP ISINYRTGSGCHHHHHH (SEQ ID NO:299) ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGAT CAGCTGGGACGCTCCGGCTGACGCGTACGGTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCC CTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGTTTCTAAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGAT TATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAATTCGACTACCCCGGCTCCGGTTACTACCATCGTCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGGTAGCGGTTGCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO :300)
*Примечание: некоторые перечисленные белки не были пэглированы, но являются подходящими для пэгилирования за счет присутствия мутантного остатка цистеина. Белки, которые были пэгилированы, отмечены звездочкой.
Технология слитой нуклеотидной и белковой последовательностей.
Одним из объектов настоящего изобретения является Аднектин, содержащий домен III типа фибронектина, связывающий PCSK9. Одним из способов быстро получения и тестирования доменов Fn3 со специфическими свойствами связывания является технология слитой нуклеотидной и белковой последовательностей подразделения Adnexus, компании Bristol-Myers Squibb R&D Company. В данной заявке описывается технология экспрессии in vivo и введения tag-последовательностей, называемая PROfusion, в которой используется соединение белков с нуклеиновыми кислотами (слитые последовательности РНК- или ДНК-белок), для идентификации новых полипептидов и аминокислотных мотивов, которые существенны для связывания с белками. Технология слитой нуклеотидной и белковой последовательно- 101 стей представляет собой технологию ковалентного спаривания белка с нуклеиновой кислотой, кодирующей данный белок. Подробная информация о технологии слитой нуклеотидной и белковой последовательностей и методах скрининга библиотек белков на основе структурного части фибронектина приведена в Szostak et al., U.S. Patent № 6258558, 6261804, 6214553, 6281344, 6207446, 6518018 и 6818418; и Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:12297-12302 (1997) и включена в данную заявку посредством ссылки.
Векторы и полинуклеотидные варианты исполнения.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие любой из описанных в данной заявке белков или полипептидов, могут быть синтезированы химическим путем. Использование кодонов может быть оптимизировано для повышения экспрессии продукта в клетке. Частота использования определенных кодонов зависит от выбранного типа клеток. Наборы частот использования кодонов известны для Е.соН и других бактерий, а также клеток млекопитающих, клеток растений, дрожжевых клетки и клеток насекомых. См. Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (Jan. 21, 2003); Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(I):96-105 (Oct. 2002); Connell N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (Oct. 2001); Makrides et al., Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (Sep. 1996); и Sharp et al., Yeast, 7(7):657-678 (Oct. 1991).
Общие принципы работы с нуклеиновыми кислотами описаны, например, здесь: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) или Ausubel F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987), и в периодически выпускаемых обновлениях, включенных в данную заявку посредством ссылки. В общем виде последовательность ДНК, кодирующая полипептид, с помощью определенных манипуляций соединяется с последовательностью подходящих транскрипционных или трансляционных регуляторных элементов из генов млекопитающих, вирусов или насекомых. Такие регуляторные элементы включают транскрипционный промотор, необязательную последовательность оператора, для контроля транскрипции, подходящую последовательность для сайта связывания рибосомы на мРНК, последовательности, кодирующие терминацию транскрипции и трансляции. Дополнительно вводятся последовательность ориджина репликации, которая обеспечивает способность конструкции воспроизводиться в клетке-хозяине, и ген, кодирующий селективный признак, облегчающий селекцию трансформированных клеток.
Белки, описаны в данной заявке, могут быть получены с помощью технологии рекомбинантных ДНК не только в интактном виде, но также в составе слитых полипептидов с гетерологичными полипептидами, которыми предпочтительно являются сигнальные последовательности или другие полипептиды, обладающие специфическими сайтами расщепления на N-конце зрелого белка или полипептида. Выбираемые гетерологичные сигнальные последовательности, предпочтительно, должны распознаваться и процессироваться (т.е. отщепляться сигнальной пептидазой) клетки-хозяина. Примером N-концевой сигнальной последовательности для наработки полипептидов в клетках млекопитающих является последовательность METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 326), удаляемая клеткой-хозяином после экспрессии полипептида.
Для клеток прокариот, которые не распознают природные сигнальные последовательности, такие последовательности заменяются прокариотическими сигнальными последовательностями, выбранными, например, из группы лидерных последовательностей щелочной фосфатазы, пенициллиназы, LPP или термостабильного энтеротоксина II.
Для секреции во внешнюю среду при наработке полипептида в дрожжевых клетках нативная сигнальная последовательность может быть заменена, например, сигнальной последовательностью дрожжевой инвертазы, факторов (включая лидерные последовательности альфа-факторов Saccharomyces и Kluyveromyces), кислой фосфатазы, глюкозамилазы Calbicans или сигнальными последовательностями, описанным в U.S. Patent № 5631144. При экспрессии в клетках млекопитающих применяются сигнальные последовательности млекопитающих, а также вирусные сигнальные последовательности для секреции, например сигнальная последовательность вируса простого герпеса gD. Такие последовательности ДНК могут быть лигированы в одной рамке считывания с последовательностью ДНК, кодирующей белок.
Векторные системы для клонирования и экспрессии имеют в своем составе последовательности, обеспечивающие репликацию вектора в одном или нескольких типах клеток-хозяев. В общем случае векторные системы для клонирования содержат последовательность, позволяющую вектору реплицироваться независимо от хромосомной ДНК клетки хозяина, и включают последовательность ориджина репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности хорошо известны для различных бактерий, дрожжей и вирусов. Ориджин репликации плазмиды pBR322 является подходящим для большинства грам-отрицательных бактерий, ориджин 2-микронной плазмиды применим для дрожжевых систем, различные вирусные ориджины (SV40, полиомавирус, аденовирус, вирус везикулярного стоматита, папиломавирус быка) применимы для векторов для клонирования, амплифицируемых в клетках млекопитающих.
Вектора для экспрессии и клонирования могут содержать селективные гены, также называемые генами селективных маркеров. Типичные гены селективных маркеров кодируют белки, которые: a) обеспечивают устойчивость к антибиотиками и другим токсинам, например ампициллин, неомицин, метотрексат, трациклин; b) восстанавливают дефект ауксотрофных генов; c) обеспечивают синтез необходи- 102 036055 мых питательных веществ, недоступных из среды культивирования, например ген, кодирующий Dаланин рацемазу для бактерий Bacilli.
Вектора для экспрессии и клонирования обычно содержат последовательность промотора, распознаваемую системами клетки-хозяина, и присоединенную непосредственно к последовательности, кодирующей белок, описываемый в настоящем изобретении, например белок на основе структурной части фибронектина. Промоторные последовательности, применимые для прокариотических систем, включают промотор гена phoA, промотор бета-лактамазной и лактозной систем, промотор щелочной фосфатазы, промотор триптофановой системы (trp), гибридные промоторы, такие как tan-промотор. Впрочем, другие известные бактериальные промоторы также применимы. Промоторы для применения в бактериальных системах также содержат последовательность Шайна-Дельгарно (Shine-Dalgarno, S.D.), присоединенную непосредственно к ДНК, кодирующей белок, описываемый в настоящем изобретении. Последовательности промоторов для эукариотических систем являются известными. Практически все гены эукариот обладают АТ-богатой областью расположенной за 25-30 п.о. до точки инициации транскрипции. Другая последовательность, расположенная за 70-80 п.о. до точки инициации транскрипции многих генов, CNCAAT, в которой N обозначает любой нуклеотид. На 3'-конце большинства генов эукариот расположена последовательность ААТААА, которая, вероятно, является сигналом полиаденилирования (добавления поли-А) на 3'-конец кодирующей последовательности (мРНК). Все эти последовательности подходят для добавления в структуру векторов для экспрессии в клетках млекопитающих.
Примерами применимых последовательностей промоторов для использования в дрожжевых системах являются промоторы 3-фосфоглицераткиназы или других ферментов гликолиза, таких как енолазы, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, гексокиназы, пируватдекарбоксилазы, фосфофруктокиназы, глюкозо-6-фосфат изомеразы, 3-фосфоглицерат мутазы, пируваткиназы, триозофосфат изомеразы, фосфоглюкозоизомеразы и глюкокиназы.
Процесс транскрипции с векторов для экспрессии в клетках млекопитающих можно контролировать, например, за счет промоторов из вирусных геномов, таких как полиомавирус, вирус оспы кур, аденовирус (такой как Аденовирус 2), вирус папилломы быка, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и, наиболее предпочтительно, вируса SV40; за счет гетерологичных промоторов млекопитающих совместимых с клеткой-хозяином, например, актинового или иммуноглобулинового промоторов; за счет промоторов белков теплового шока.
Уровень транскрипции ДНК, кодирующей описываемые в данном изобретении белки, клетками высших эукариот, в большинстве случаев, повышается за счет введения в последовательность вектора специальных энхансерных последовательностей. В настоящее время известны многие последовательности энхансеров генов млекопитающих (глобин, эластаза, альбумин, альфа-фетопротеин, инсулин). Однако, обычно используются вирусные энхансеры. Примеры включают энхансер вируса SV40, расположенный в конце последовательности ориджина репликации (100-270 п.о.), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы, расположенный в конце последовательности ориджина репликации, энхансеры аденовируса. См. Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) об энхансерных элементах для активации промоторов эукариот. Энхансеры могут быть введены в последовательность вектора в 5' или 3' положении относительно пептид-кодирующей последовательности, однако, предпочтительным является расположение энхансера в 5' положении относительно его промотора.
Экспрессионные векторы, используемые в клетках эукариот (например, дрожжей, грибов, насекомых, растений, человека или ядерных клеток других многоклеточных организмов), также содержат последовательности, необходимые для терминации транскрипции и стабилизации мРНК в клетке. Такие последовательности обычно имеются в 5' и, реже, 3'-нетранслируемых областях эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Такие области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые как сигналы полиаденилирования в нетранслируемой части мРНК, кодирующей белок, описываемый в данном изобретении. Одной из применимых последовательностей, терминирующих транскрипцию, является последовательность области полиаденилирования бычьего гормона роста. См. WO 94/11026 и экспрессионные вектора, описанные здесь.
Рекомбинантная ДНК также может включать тэг-последовательность любого типа, которая применяется для очистки нарабатываемого белка. Примеры тэг-последовательностей включают, но не ограничиваются, гистидиновый тэг, FLAG-тэг, myc-тэг, НА-тэг, GST-тэг. Соответствующие векторные системы для использования в клетках бактерий, грибов, дрожжей и млекопитающих описаны в Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York (1985)), и соответствующее описание которых включается в данную заявку посредством ссылки.
Экспрессионный конструкт вводится в клетки методом, соответствующим типу клеток-хозяев, что очевидно для специалистов в данной области. В соответствующей области знаний разработан широкий набор методов введения нуклеиновых кислот в клетки, включая, но не ограничиваясь, метод электропорации; трансфекции с помощью хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; баллистическая трансфекция; липофекции; инфекции (когда вектор является инфицирующим агентом).
Подходящими клетками-хозяевами являются клетки прокариот, дрожжей, млекопитающих или бак- 103 036055 терий. Подходящими бактериями являются грам-положительные или грам-отрицательные организмы, например Е.соН или Bacillus spp. Также для наработки полипептидов могут быть использованы клетки дрожжей, преимущественно видов рода Saccharomyces, например S.cerevisiae. Различные культуры клеток млекопитающих или насекомых также могут быть использованы для наработки рекомбинантных белков. Бакуловирусные системы для наработки гетерологичные белков в клетках насекомых рассмотрены в Luckow et al. (Bio/Technology, 6:47 (1988)). Примеры применимых линий клеток млекопитающих включают эндотелиальные клетки, клетки почки обезьяны линии COS-7, CV-1, L клетки, С127, 3T3, клетки яичника китайского хомячка (СНО), эмбриональные клетки почки человека, HeLa, 293, 293Т и ВНК. Очищенные полипептиды получают путем культивирования клеток подходящей системы вектор/хозяин для наработки рекомбинантного белка. Для большинства приложений небольшой размер многих полипептидов, описанных в данной заявке, делает предпочтительным наработку продукта в клетках Е.соН. Затем наработанный белок выделяют из среды для культивирования или клеточных экстрактов.
Продукция белка.
Клетки-хозяева трансформируют описанными здесь векторами для экспрессии белка и культивируют в традиционной среде, модифицированной соответствующим образом, для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов, кодирующих целевую последовательность. В приведенных здесь примерах для высокопроизводительной наработки белков (НТРР) и среднемасштабной наработки были использованы бактериальные клетки штамма HMS174. Клетки данного штамма для продукции белков, описываемых в данном изобретении, могут культивироваться в различных средах. Для клеток данного штамма применимы коммерчески доступные среды, такие как Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma)), RPMI-1640 (Sigma) и Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma)). Кроме того, для культивирования клеток данного штамма может быть использована среда, описанная в Ham et al., Meth. Enzymol., 58:44 (1979), Barites et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), U.S. Patent № 4767704, 4657866, 4927762, 4560655, 5122469, 6048728, 5672502 или U.S. Patent № RE 30985. Любая из указанных сред для культивирования может быть дополнена, при необходимости, гормонами и/или другими ростовыми факторами (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальций, магний и фосфат), буферами (таким как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин или тимидин), антибиотиками (такими как Гентамицин), следовыми компонентами (определяемыми как неорганические вещества, конечная концентрация которых обычно находится в микромолярном диапазоне), глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые другие необходимые компоненты также могут быть включены в состав среды в подходящих концентрациях, известных специалистам в данной сфере. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п. являются теми же, что используются для клеток-хозяев данного типа и известны специалистам в соответствующей сфере.
Белки, описанные в данной заявке, могут также быть получены с помощью систем бесклеточной трансляции. Для этого последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид, должны быть модифицированы для транскрипции и трансляции in vitro в конкретной бесклеточной системе (эукариотической, такой как бесклеточная система млекопитающих или дрожжей, или прокариотической, такой как бактериальная система бесклеточной трансляции).
Белки, описанные в данном изобретении, также могут быть получены с помощью химического синтеза (например, с помощью методов, описанных в Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)). Модификации в данные белки также могут вноситься методами химического синтеза.
Белки, описанные в настоящем изобретении, могут быть очищены общеизвестными методами выделения и очистки белковой химии. Неограничивающие примеры включают экстракцию, перекристаллизацию, высаливание (например, сульфатами аммония или натрия), центрифугирование, диализ, ультрафильтрацию, адсорбционную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, нормально-фазную хроматографию, обратно-фазную хроматографию, гель-фильтрацию, гельпроникающую хроматографию, аффинную хроматографию, электрофорез, противотоковое распределение или любые комбинации данных методов. После очистки полипептиды могут быть переведены в различные буферные растворы и/или сконцентрированы с помощью любого из различных методов, известных в соответствующей области, включая, но не ограничиваясь, фильтрацию и диализ.
Степень очистки полипептида предпочтительно составляет по меньшей мере 85% или, предпочтительно, по меньшей мере 95% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 98%. Независимо от точного численного значения степени чистоты данный полипептид является достаточно очищенным для применения в качестве фармацевтического продукта.
Для получения анти-PCSK9 Аднектина был использован платформенный метод производства. Анtu-PCSK9 Аднектин нарабатывается в клетках Escherichia coli (Е.соН). Клетки Е.соН штамма BLR (DE3) были трансформированы экспрессионным вектором (pET9d/ATI001173), кодирующим белок, накапливающийся внутри клетки в растворимой форме. Клетки данного рекомбинантного штамма культивируются при перемешивании в баке ферментера. По окончании процесса ферментации клетки собираются,
- 104 036055 лизируются, после чего лизат осветляется для дальнейшего процесса очистки. ATI001173 представляет собой вариант ATI001114 без His-тэга. Очищенный анти-PCSK9 Аднектин конъюгируется с разветвленным метоксилПЭГом массой 40 кДа с использованием малеинимидного линкера. Конъюгированный белок подвергается повторной очистке для удаления несвязанных ПЭГ и анти-PCSK9 Аднектина, а также примесей. Контроль качества осуществляется с нерасфасованным лекарственным веществом.
Терапевтические применения in vivo.
Одним из объектов изобретения является применение анти-PCSK9 Аднектина при лечении атеросклероза, гиперхолистеринемии и других заболеваний, связанных с повышенным уровнем холестерина. Данная заявка также описывает методы введения анти-PCSK9 Аднектина субъекту. В некоторых вариантах исполнения субъектом является человек. В некоторых вариантах исполнения анти-PCSK9 Аднектин фармацевтически приемлем для млекопитающих, в частности человека. Термин фармацевтически приемлемый полипептид относится к полипептидам, при введении которых животным не наблюдаются существенные побочные эффекты. Такими полипептидами могут быть полипептиды почти свободные от эндотоксина или содержащие очень низкий уровень эндотоксина.
Лекарственная форма и введение.
Данная заявка также описывает фармацевтически приемлемые композиции, содержащие антиPCSK9 Аднектин или слитые белки с анти-PCSK9 Аднектином, описанные в данной заявке, в которых данная композиция практически полностью освобождена от эндотоксина. Терапевтические лекарственные формы, содержащие анти-PCSK9 Аднектин или слитые белки с анти-PCSK9 Аднектином, подготавливают для хранения путем смешивания описанного полипептида с нужной степенью чистоты с необязательными физиологически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (Osol A., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition (1980)) в форме водных растворов, лиофилизированных или высушенных лекарственных форм. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для субъекта в применяемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный, и на основе других органических кислот; антиоксиданты включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадециидиметилбензил хлорида аммония, хлорид гексаметония, хлорид бензалькония, хлорид бензетония, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем 10 аминокислотных остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстраны; хелаторы, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннитол, трегалоза или сорбитол; формирующие соли противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Znпротеиновые комплексы; и/или неионные поверхностно активные вещества, такие как Tween, PLURONIC® или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Лекарственные формы, описываемые в данной заявке, могут также содержать более чем одно активное вещество в зависимости от конкретных показаний при применении, предпочтительно обладающие дополняющими активностями и не влияющими нежелательно один на другой. Такие молекулы подходят для комбинирования в количествах, которые эффективны для достижения целей применения.
Лекарственные формы для применения in vivo должны быть стерильны. Это достигается путем фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны.
Квалифицированный персонал должен понимать, что дозировка каждого терапевтического агента будет зависеть от свойств данного агента.
Для терапевтических применений анти-PCSK9 Аднектин или слитые белки, содержащие антиPCSK9 Аднектин, вводятся субъекту фармацевтически приемлемым путем. Он могут быть введены внутривенно в виде болюса или путем продолжительной инфузии в течение определенного периода времени, или подкожно. Подходящие фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества и разбавители хорошо известны и могут быть определены специалистами в данной сфере на основании клинической ситуации. Примеры подходящих носителей, разбавителей и/или вспомогательных веществ включают: (1) фосфатно-солевой раствор Дульбекко, (2) 0,9%-ный солевой раствор (0,9% w/v NaCl), и (3) 5% (w/v) декстроза.
Метод, описываемый в данном изобретении, может применяться на практике in vitro, in vivo или ex vivo.
Введение анти-PCSK9 Аднектина или слитых белков с анти-PCSK9 Аднектином и одного или более дополнительных терапевтических агентов, вводимых либо совместно, либо последовательно, может осуществляться, как описано выше для терапевтических приложений. Подходящие фармацевтически приемлемые носители, разбавители и вспомогательные вещества для совместного введения определяются специалистами в данной сфере в зависимости от свойств конкретных вводимых терапевтических веществ.
В случае водной лекарственной формы скорее, чем в случае лиофилизованной формы, белок, как правило, будет находиться в концентрации от 0,1 до 100 мг/мл. Однако допустимы вариации в широких
- 105 036055 пределах от указанного диапазона. При лечении заболевания соответствующая дозировка aHTu-PCSK9 Аднектина или слитых с aнти-PCSK9 Аднектином белков будет зависеть от типа, тяжести и степени прогресса заболевания, по отношению к которому проводится лечение, от курса предшествующей терапии, истории болезни, ответа организма на белок и решения наблюдающего врача независимо от целей введения (профилактика или друге терапевтические цели). Данный белок применим для введения пациенту однократно или для серии введений.
Слитые Аднектины, связывающие сывороточный альбумин (SABA).
Другими объектами данного изобретения являются слитые белки, содержащие aнти-PCSK9 Аднектин слитый с 10Fn3 доменами, связывающими сывороточный альбумин человека (Serum Albumin Binding Adnectin (10Fn3 домен) или SABA). Такие слитые белки обладают более длительным временем полужизни в плазме в присутствии альбумина по сравнению с неслитыми aнти-PCSK9 Аднектинами (например, неконъюгированными с РК-группой).
Вследствие небольшого размера (~10 кДа) домены 10Fn3 быстро выводятся из циркулирующей крови за счет почечной фльтраци и деградации (t1/2 = 15-45 мин у мышей; 1-3 ч у обезьян). Слияние домена 10Fn3 , такого как aнти-PCSK9 Аднектин, со вторым полипептидом, содержащим домен 10Fn3 специфически связывающий сывороточный альбумин, например сывороточный альбумин человека (HSA), может быть использовано для увеличения t1/2 aнти-PCSK9 Аднектина.
В определенных вариантах исполнения время полужизни в плазме aнти-PCSK9 Аднектина слитого с SABA повышается по сравнению со временем полужизни в плазме aнти-PCSK9 Аднектина не конъюгированного с SABA. В определенных вариантах исполнения время полужизни в плазме белка слитого с SABA по меньшей мере на 20, 40, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1500, 1800, 1900, 2000, 2500 или 3000% выше по сравнению со временем полужизни в плазме aнти-PCSK9 Аднектина не конъюгированного с SABA. В других вариантах исполнения время полужизни в плазме белка слитого с SABA по меньшей мере в 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 13, 15, 17, 20, 22, 25, 27, 30, 35, 40 или 50 раз выше по сравнению со временем полужизни в плазме aнти-PCSK9 Аднектина не конъюгированного с SABA. В некоторых вариантах исполнения время полужизни в плазме белка слитого с SABA составляет по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 135, 140, 150, 160 или 200 часов.
В определенных вариантах часть слитого белка, связывающая сывороточный альбумин, связывает HSA с KD менее чем 3, 2,5, 2, 1,5, 1 мкМ, 500, 100, 50, 10, 1 нМ, 500, 100 пМ, 100, 50 или 10 пМ. В определенных вариантах исполнения часть слитого белка, связывающая сывороточный альбумин, связывает HSA с KD менее чем 3, 2,5, 2, 1,5, 1 мкМ, 500, 100, 50, 10, 1 нМ, 500, 100 пМ, 100, 50 или 10 пМ в диапазоне рН 5,5-7,4 при температуре 25 или 37°C. В определенных вариантах исполнения часть слитого белка, связывающая сывороточный альбумин, связывается с HSA более сильно при рН менее 7,4, по сравнению со связыванием при рН7,4.
Соответственно, слитые с SABA молекулы, описанные в данной заявке применимы для повышения времени полужизни в плазме aнти-PCSK9 Аднектина путем создания слитых белков aнти-PCSK9 Аднектина с SABA. Настоящее изобретение предполагает применение слитых с SABA молекул при заболеваниях, вызванных дисрегуляцией PCSK9.
Слияние может быть выполнено путем присоединения aнти-PCSK9 Аднектина к любому из концов последовательности SABA, т.е. могут быть получены любые конфигурации: SABA-aнти-PCSK9 Аднектин или aнти-PCSK9 Аднектин-SABA.
У человека концентрация HSA в плазме составляет 600 мкМ, a t1/2 19 дней. Увеличение параметра t1/2, возможно, связано рециркуляцией HSA за счет неонатального Fc-рецептора (FcRn). После эндосомального поглощения клетками эндотелия HSA связывается с FcRn, что приводит к обратному высвобождению HSA в кровоток, минуя лизосомальную деградацию. Данное связывание носит рН-зависимый характер. Рецептор FcRn экспрессируется большим количеством клеток и такой путь рециркуляции HSA считается конститутивным. В большинстве типов клеток почти весь рецептор FcRn находится внутри внутриклеточных сортирующих эндосом. HSA легко интернализуется посредством неспецифического механизма во время пиноцитоза и защищается от деградации в лизосомах за счет взаимодействия с FcRn. В условиях кислого рН внутри эндосомы аффинность связывания HSA с FcRn возрастает (5 мкМ при рН 6.0). Связывание HSA с FcRn отменяет лизосомальную деградацию HSA и приводит к выведению молекулы HSA на поверхность клетки за счет трансцитоза.
В определенных вариантах исполнения часть слитого с SABA белка, связывающая сывороточный альбумин, описанного в данной заявке, способна связывать сывороточный альбумин обезьян, и/или крыс, и/или мышей. В определенных вариантах исполнения часть слитого с SABA белка, связывающая сывороточный альбумин человека (HSA), описанного в данной заявке, способна связывать сывороточный альбумин макаки-резус (RhSA) или сывороточный альбумин яванского макака (CySA) с константой KD менее чем 3, 2,5, 2, 1,5, 1 мкМ, 500, 100, 50, 10, 1 нМ, 500 или 100 пМ.
В определенных вариантах исполнения часть слитого белка с SABA, связывающая сывороточный альбумин, описанного в данной заявке, способна связывать домены I и/или II HSA. В одном из вариантов исполнения часть слитого белка с SABA, связывающая HSA не связывается с доменом III HSA.
- 106 036055
В определенных вариантах исполнения часть слитого белка с SABA, связывающая сывороточный альбумин, содержит последовательность, обладающую по меньшей мере 40, 50, 60, 70, 75, 80 или 85% идентичности с доменом 10Fn3 дикого типа (SEQ ID NO: 1). В одном из вариантов исполнения по меньшей мере одна из петель BC, DE или FG изменена по сравнению с доменом 10Fn3 дикого типа. В другом варианте исполнения по меньшей мере две из петель BC, DE или FG изменены по сравнению с доменом 10Fn3 дикого типа. В другом варианте исполнения все три петли BC, DE или FG изменены по сравнению с доменом 10Fn3 дикого типа. В других вариантах исполнения SABA содержит последовательность, обладающую по меньшей мере 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% идентичности по отношению к любой из 26 последовательностей SABA, приведенных в табл. 6 (т.е. SEQ ID NO: 334, 338, 342, 346 и 348-370) или к любой из удлиненных последовательностей SABA, приведенных в табл. 6 (т.е. SEQ ID NO: 420447, за исключением 6x1 lis-тэга).
В определенных вариантах исполнения последовательности связывающих сывороточный альбумин Аднектинов на основе структуры домена 10Fn3 могут быть в общем виде выражены как
EWAAT(X)aSLLI(X)xYYRITYGE(X)/)QEFTV(X)FATI(X)cDYTITVYAV(X)zIS
INYRT (SEQ ID NO:328)
В определенных вариантах исполнения последовательности связывающих сывороточный альбумин Аднектинов на основе структуры домена 10Fn3 могут быть в общем виде выражены как
EWAATPTSLLI(X)xYYRITYGETGGNSPVQEFTV(X)yATISGLKPGVDYTIT
VYAV(X)zISINYRT (SEQ Ш NO:329)
Как описано в данной заявке для анти-PCSK9 Аднектинов, последовательности SEQ ID NO: 328 и 329 могут быть применены к молекулам SABA таким же образом. В примерах реализации изобретения петли BC, DE или FG, представленные (X)x, (X)y и (X)z, соответственно, замещаются полипептидами, содержащими последовательности петель BC, DE или FG из любого другого белка, связывающего lSA, последовательности которых приведены в табл. 6 ниже (т.е. SEQ ID NO: 330, 334, 338, 342, 346 и 348-370 в табл. 6). В определенных вариантах исполнения последовательности петель BC, DE или FG, приведенные в табл. 6, могут содержать один или более аминокислотный остаток, фланкирующий N- или Сконец. В частности, петля BC может содержать остатки SW на N-конце последовательности петли BC, приведенной в табл. 6, когда замещает (X)x в последовательности SEQ ID NO: 328. Сходно, петля DE может содержать остаток Р перед последовательностью петли DE и остаток Т после петли DE, когда замещает (X)y в последовательности SEQ ID NO: 328. Петля FG может содержать остаток Р после последовательности петли FG, когда замещает (X)z в последовательности SEQ ID NO: 328. Например, в последовательности SEQ ID NO: 330 показано, что петли BC, DE или FG содержат последовательности HSYYEQNS (SEQ ID NO: 638), YSQT (SEQ ID NO: 639) и YGSKYYY (SEQ ID NO: 640) соответственно. Однако при замещении (X)x, (X)y и (X)z в последовательности SEQ ID NO: 328, т.е. петель BC, DE и FG, последовательность (X)x может быть SWHSYYEQNS (SEQ ID NO: 641), последовательность (X)y может быть PYSQTT (SEQ ID NO: 642), последовательность (X)z может быть YGSKYYYP (SEQ ID NO: 643).
В определенных вариантах исполнения последовательность SABA, используемая для создания слитых белков, описанных в данной заявке, может содержать последовательности SEQ ID NO: 328 или 329, в которых последовательности петель BC, DE или FG, представленных соответственно обозначениями (Х)х, (Х)у и (X)z, заменены соответствующим набором последовательностей петель BC, DE или FG из любой из 26 коровых последовательностей SABA (т.е. SEQ ID NO: 330, 334, 338, 342, 346 и 348-370 в табл. 6) или последовательностями, по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичными последовательностям петель BC, DE или FG 26 коровых последовательностей SABA. В примерах осуществления изобретения последовательность SABA, как описано в данной заявке, определяется последовательностью SEQ ID NO: 329 и включает набор последовательностей петель BC, DE или FG из любых из 26 коровых последовательностей SABA (т.е. SEQ ID NO: 330, 334, 338, 342, 346 и 348-370 в табл. 6), опционально с N- или C-концевыми добавлениями к последовательностям петель, как описано выше. Например, SABA1 имеет коровую последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO: 330 и содержит последовательности петель BC, DE или FG, определенные в последовательностях SEQ ID NO: 331-333 соответственно. Таким образом, последовательность SABA, основанная на коровой последовательности SABA1, может содержать последовательность SEQ ID NO: 328 или 329, в которой (Х)х, содержит последовательность SEQ ID NO: 331, (Х)у содержит последовательность SEQ ID NO: 332, (X)z содержит последовательность SEQ ID NO: 333. В некоторых вариантах исполнения последовательности, которые заменяют (Х)х, (Х)у, и (X)z, содержат дополнительный аминокислотный остаток(ки) на одном или на двух концах петель, как описано выше. Настоящим изобретением предполагается использование для сходных конструкций данного набора последовательностей петель BC, DE или FG из других коровых последовательностей SABA. Структурные области такой последовательности SABA могут содержать в любом месте от 0 до 20, от 0 до 15, от 0 до 10, от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2 или от 0 до 1 замены, консервативной замены, делеции или вставки относительно структурных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 1. Такие структурные модификации могут вноситься до тех пор, пока полипептид SABA остается способным связывать сывороточный альбумин,
- 107 036055 например HSA с требуемым значением Kd.
В определенных вариантах исполнения последовательность SABA (например, коровая последовательность SABA или последовательность, основанная на ней, как описано выше) может быть изменена и содержать N-концевую удлиняющую последовательность и/или C-концевую удлиняющую последовательность. Примеры удлиняющих последовательностей приведены в табл. 6. Например, последовательность SEQ ID NO: 420 обозначенная как SABA1.1, содержит коровую последовательность SABA1 (SEQ ID NO: 330) с N-концевой последовательностью MGVSDVPRDLE (SEQ ID NO: 371, обозначенной как AdNT1) и C-концевой последовательностью EIDKPSQ (SEQ ID NO: 380, обозначенной как AdCT1). Последовательность SABA1.1 также содержит 6His-тэг на C-конце, однако это должно быть понятно, что последовательность 6His-тэга полностью необязательна и может располагаться в любом месте N- и Cконцевых удлиняющих последовательностей, а также может полностью отсутствовать. Любой из примеров N- и C-концевых удлиняющих последовательностей, приведенных в табл. 6 (SEQ ID NO: 371-395), а также любые их варианты, могут быть использованы для модификации коровой последовательности SABA, приведенной в табл. 6.
В определенных вариантах исполнения C-концевые удлиняющие последовательности (также называемые хвостами) содержат остатки Е и D и могут быть длиной 8 и 50, 10 и 30, 10 и 20, 5 и 10 и 2 и 4 аминокислотных остатка. В некоторых вариантах исполнения последовательности хвостов включают в себя ED-линкеры, в которых последовательность состоит из тандемных повторов ED. В примерах осуществления изобретения хвостовые последовательности содержат 2-10, 2-7, 2-5, 3-10, 3-7, 3-5, 3, 4 или 5 ED-повторов. В определенных вариантах исполнения данные хвостовые последовательности на основе ED могут также включать дополнительные аминокислотные остатки, такие как, например: EI, EID, ES, EC, EGS и EGC. Такие последовательности основаны, в части, на известных хвостовых последовательностях Аднектина, таких как последовательность EIDKPSQ (SEQ ID NO: 380), в которой остатки D и K удалены. В примерах осуществления изобретения хвостовые последовательности, основанные на последовательности ED, содержат остатки Е, I или EI перед повторами ED.
В других вариантах исполнения хвостовые последовательности могут быть комбинированы с другими известными ликерными последовательностями (например, SEQ ID NO: 396-419 в табл. 6) в случае необходимости при конструировании слитой с SABA молекулы.
Конъюгация/линкеры.
Слитые белки, содержащие SABA, могут быть соединены ковалентно и нековалентно. В некоторых вариантах исполнения домен 10Fn3, связывающий сывороточный альбумин, может быть ковалентно или нековалентно связан с анти-PCSK9 Аднектином посредством полипептидного линкера. Применимыми линкерами для соединения Fn3 доменов являются те, которые позволяют разделить домены, позволяя независимую укладку и формируя пространственную структуру, способную связывать целевую молекулу с высокой аффинностью.
В данной заявке описывается ряд подходящих линкеров, удовлетворяющих этим критериям, включающий глицин-сериновые линкеры, глицин-пролиновые линкеры, а также линкер с аминокислотной последовательностью PSTSTST (SEQ ID NO: 416). Примеры, описанные в данной заявке, демонстрируют, что домены Fn3, соединенные посредством полипептидных линкеров, сохраняют свойства связывания целевой молекулы. В некоторых вариантах исполнения линкером является глицин-сериновый линкер. Данные линкеры содержат остатки глицина и серина и могут быть длиной между 8 и 50, 10 и 30 и 10 и 20 аминокислотных остатков. Примеры включают линкеры с аминокислотной последовательностью (GS)7 (SEQ ID NO: 403), G(GS)6 (SEQ ID NO: 398) и G(GS)3G (SEQ ID NO: 400). Другие линкеры содержат глутаминовую кислоту и включают, например последовательности (GSE)5 (SEQ ID NO: 405) и GGSE GGSE (SEQ ID NO: 409). Другие примеры глицин-сериновых линкеров включают (GS)4 (SEQ ID NO: 402), (GGGGS)7 (SEQ ID NO: 411), (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 412) и (GGGGS)3G (SEQ ID NO: 413). В некоторых вариантах исполнения линкер является глицин-пролиновым. Такие линкеры содержат остатки глицина и пролина и могут быть длиной между 3 и 30, 10 и 30 и3 и 20 аминокислотных остатков. Примеры таких линкеров включают линкеры с последовательностями (GP)3G (SEQ ID NO: 414), (GP)5G (SEQ ID NO: 415) и GPG. В других вариантах исполнения линкер может быть пролин-аланиновым, длиной между 3 и 30, 10 и 30, и 3 и 20 аминокислотных остатков. Примеры пролин-аланиновым линкеров включают последовательности, (РА)3 (SEQ ID NO: 417), (РА)6 (SEQ ID NO: 418) и (РА)9 (SEQ ID NO: 419). Настоящим изобретением предполагается, что оптимальная длина и аминокислотный состав линкера могут быть определены с помощью стандартных экспериментов с учетом сведений, приведенных в данной заявке. В некоторых вариантах исполнения анти-PCSK9 Аднектин соединен с SABA посредством полипептидного линкера, содержащего сайт расщепления протеазы, который может быть расщеплен протеазой в крови или ткани. Такие варианты исполнения могут быть использованы для высвобождения анти-PCSK9 Аднектина с целью облегчения доставки, улучшения терапевтических свойств или более эффективной наработки.
Дополнительные линкеры или спейсеры могут быть введены на С-конец домена Fn3 между последовательностью домена Fn3 и последовательностью полипептидного линкера. Дополнительные линкеры или спейсеры могут быть введены на N-конец домена Fn3 между последовательностью домена Fn3 и
- 108 036055 последовательностью полипептидного линкера.
В некоторых вариантах исполнения aHTu-PCSK9 Аднектин может быть прямо или непрямо соединен с SABA посредством полимерного линкера. Полимерные линкеры могут быть использованы для оптимального варьирования расстояния между компонентами слитого белка для создания слитого белка с одной или несколькими следующими характеристиками: 1) сниженным или повышенным стерическим несоответствием связывания одного или более белковых доменов при связывании целевого белка, 2) повышенной стабильностью или растворимостью белка, 3) сниженным уровнем агрегации белка, 4) повышенной общей авидностью или аффинностью белка.
В некоторых вариантах исполнения анти-PCSK9 Аднектин соединен с SABA посредством биосовместимого полимера, такого как полимерный сахар. Такой полимерный сахар может включать сайт расщепления, расщепляемый каким-либо ферментом в крови или в целевой ткани. Такие варианты исполнения могут быть использованы для высвобождения анти-PCSK9 Аднектина для облегчения доставки, улучшения терапевтических свойств или более эффективной наработки.
Сводные данные по последовательностям.
Многие последовательности, на которые ссылаются разделы Слитые белки на основе Аднектинов, связывающих сывороточный альбумин (SABA) и Конъюгирование/линкеры, собраны в табл. 6 ниже. Если не указано обратное, все N-концевые удлиняющие последовательности отмечены с помощью одинарного подчеркивания, все C-концевые хвосты/удлиняющие последовательности отмечены с помощью двойного подчеркивания, последовательности линкеров заключены в скобки. Области петель BC, DE и FG затемнены для каждой коровой последовательности SABA. В дополнение к вышеуказанному данные модификации последовательностей (например, N- или C-концевые удлинения и линкеры) также могут быть использованы для модификации молекул анти-PCSK9 Аднектина.
Таблица 6. Сводные данные по примерам последовательностей
EQ ID Назван не последователь ности Описание Последовательность
Примеры Аднектинов, связывающих сывороточный альбумин (SABA)
27 10Fn3WT коровая последовательн ость Коровая последовательность дикого типа домена 10Fn3 человека EVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITV YAVTGRGDSPASSKPISINYRT
28 10Fn3v6 Аналог домена 10Fn3 содержащий 6 вариабельных петель EVVAAT (X) aSLLI (X) XYYRITYGE (X) ь QEFTV(X) yATI (X) CDYTITVYAV(X) ZISINYRT
29 10Fn3v3 Аналог домена 10Fn3 содержащий 3 вариабельных петли EVVAATPTSLLI (X) XYYRITYGETGGNSP VQEFTV (X) yATISGLKPGVDYTITVYAV (X) ZIS INYRT
30 SABA1 Коровая последовательность 1 Аднектина EVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITV YAVYGSKYYYPISINYRT
31 ВС SABA1 Коровая последовательность 1 петли ВС HSYYEQNS
32 DE SABA1 Коровая последовательность 1 петли DE YSQT
33 G SABA IF Коровая последовательность 1 петли FG YGSKYYY
- 109 036055
34 SABA2 Коровая последовательность 2 Аднектина EVVAATPTSLLISWPKYDKTGHYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPTRQTTATISGLKPGVDYTITV YAVSKDDYYPHEHRPISINYRT
35 SABA2 ВС Коровая последовательность 2 петли ВС PKYDKTGH
36 SABA2 DE Коровая последовательность 2 петли DE TRQT
37 SABA2F G Коровая последовательность 2 петли FG SKDDYYPHEHR
38 SABA3 Коровая последовательность 3 Аднектина EVVAATPTSLLISWSNDGPGLSYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPSSQTTATISGLKPGVDYTITV YAVSYYTKKAYSAGPISINYRT
39 SABA3 ВС Коровая последовательность 3 петли ВС SNDGPGLS
40 SABA3 DE Коровая последовательность 3 петли DE SSQT
41 SABA3F G Коровая последовательность 3 петли FG SYYTKKAYSAG
42 SABA4 Коровая последовательность 4 Аднектина; содержащая мутации в структурной части (выделены жирным шрифтом); структурно -лучший вариант SABA5 EMVAATPTSLLISWEDDSYYSRYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPSDLYTATISGLKPGVDYTITV YAVTYDVTDLIMHEPISINYRT
- 110 036055
43 SABA4 ВС Коровая последовательность 4 петли ВС EDDSYYSR
44 SABA4 DE Коровая последовательность 4 петли DE SDLY
45 SABA4F G Коровая последовательность 4 петли FG YDVTDLIMHE
46 SABA5 Коровая последовательность 5 Аднектина; см. описание для SABA4; корректированные остатки выделены жирным EWAATPTSLLISWEDDSYYSRYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPSDLYTATISGLKPGVDYTITV YAVTYDVTDLIMHEPISINYRT
47 SABA5 ВС Коровая последовательность 5 петли ВС EDDSYYSR
48 SABA5 DE Коровая последовательность 5 петли DE SDLY
49 SABA5F G Коровая последовательность 5 петли FG YDVTDLIMHE
50 SABA6 Коровая последовательность 6 Аднектина EVVAATPTSLLISWYMDEYDVRYYRITYG ETGGNS PVQE FTVPNYYNTATISGLKPGVDYTITV YAVT RIKANNYMYGPISINYRT
51 SABA7 Коровая последовательность 7 Аднектина EVVAATPTSLLISWNHLEHVARYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPEYPTTATISGLKPGVDYTITV YAVTITMLKYPTQSPISINYRT
52 SABA8 Коровая последовательность 8 Аднектина EVVAATPTSLLISWGHYRRSGHYYRITYG ETGGNSPVQEFTVDPSSYTATISGLKPGVDYTITV YAVSKDDYYPHEHRPISINYRT
- 111 036055
53 SABA9 Коровая последовательность 9 Аднектина EVVAATPTSLLISWDASHYERRYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPRYHHTATISGLKPGVDYTITV YAVTQAQEHYQPPISINYRT
54 SABA 10 Коровая последовательность 10 Аднектина EVVAATPTSLLISWNSYYHSADYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPYPPTTATISGLKPGVDYTITV YAVYSAKSYYPISINYRT
55 SABAH Коровая последовательность 11 Аднектина EVVAATPTSLLISWSKYSKHGHYYRITYG ETGGNS PVQE FTVP SGNATATISGLKPGVDYTITV YAVEDTNDYPHTHRPISINYRT
56 SABA 12 Коровая последовательность 12 Аднектина EVVAATPTSLLISWHGEPDQTRYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPPYRRTATISGLKPGVDYTITV YAVTSGYTGHYQPISINYRT
57 SABA 13 Коровая последовательность 13 Аднектина EVVAATPTSLLISWSKYSKHGHYYRITYG ETGGNSPVQEFTVDPSSYTATISGLKPGVDYTITV YAVSKDDYYPHEHRPISINYRT
58 SABA 14 Коровая последовательность 14 Аднектина EVVAATPTSLLISWYEPYTPIHYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPGYYGTATISGLKPGVDYTITV YAVYGYYQYTPISINYRT
59 SABA 15 Коровая последовательность 15 Аднектина EVVAATPTSLLISWSKYSKHGHYYRITYG ETGGNS PVQE FTVP SGNATATISGLKPGVDYTITV YAVSDDNKYYHQHRPISINYRT
60 SABA 16 Коровая последовательность 16 Аднектина EVVAATPTSLLISWGHYRRSGHYYRITYG ETGGNSPVQEFTVDPSSYTATISGLKPGVDYTITV YAVSKDDYYPHEHRPISINYRT
61 SABA 17 Коровая последовательность 17 Аднектина EVVAATPTSLLISWSKYSKHGHYYRITYG ETGGNS PVQE FTVP SGNATATISGLKPGVDYTITV YAVEDTNDYPHTHRPISINYRT
62 SABA 18 Коровая последовательность 18 Аднектина EVVAATPTSLLISWYEPGASVYYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPSYYHTATISGLKPGVDYTITV YAVYGYYEYEPISINYRT
63 SABA 19 Коровая последовательность 19 Аднектина EVVAATPTSLLISWQSYYAHSDYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPYPPQTATISGLKPGVDYTITV YAVYAGSSYYPISINYRT
- 112 036055
64 SABA20 Коровая последовательность 20 Аднектина EVVAATPTSLLISWGHYRRSGHYYRITYG ETGGNSPVQEFTVDPSSYTATISGLKPGVDYTITV YAVSKDDYYPHEHRPISINYRT
65 SABA21 Коровая последовательность 21 Аднектина EVVAATPTSLLISWPEPGTPVYYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPAYYGTATISGLKPGVDYTITV YAVYGYYDYSPISINYRT
66 SABA22 Коровая последовательность 22 Аднектина EVVAATPTSLLISWYRYEKTQHYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPPESGTATISGLKPGVDYTITV YAVYAGYEYPHTHRPISINYRT
67 SABA23 Коровая последовательность 23 Аднектина EVVAATPTSLLISWVKSEEYYRYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPYYVHTATISGLKPGVDYTITV YAVTEYYYAGAVVSVPISINYRT
68 SABA24 Коровая последовательность 24 Аднектина EVVAATPTSLLISWYDPYTYGSYYRITYG ETGGNSPVQEFTVGPYTTTATISGLKPGVDYTITV YAVSYYYSTQPISINYRT
69 SABA25 Коровая последовательность 25 Аднектина EVVAATPTSLLISWSNDGPGLSYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPSSQTTATISGLKPGVDYTITV YAVSYYTKKAYSAGPISINYRT
70 SABA26 Коровая последовательность 26 Аднектина EVVAATPTSLLISWPDPYYKPDYYRITYG ETGGNSPVQEFTVPRDYTTATISGLKPGVDYTITV YAVYSYYGYYPISINYRT
Примеры последовательностей N-концевых удлинений Аднектинов
71 AdNTl Пример лидерной последовательности MGVSDVPRDL
72 AdNT2 Пример лидерной последовательности GVSDVPRDL
73 AdNT3 Пример лидерной последовательности VSDVPRDL
74 AdNT4 Пример лидерной последовательности SDVPRDL
- 113 036055
75 AdNT5 Пример лидерной последовательности DVPRDL
76 AdNT6 Пример лидерной последовательности VPRDL
77 AdNT7 Пример лидерной последовательности PRDL
78 AdNT8 Пример лидерной последовательности RDL
79 AdNT9 Пример лидерной последовательности DL
Примеры последовательностей С-концевых удлинений Аднектинов
80 AdCTl Пример «хвостовой» последовательности EIDKPSQ
81 AdCT2 Пример «хвостовой» последовательности EIDKPS
82 AdCT3 Пример «хвостовой» последовательности EIDKPC
83 AdCT4 Пример «хвостовой» последовательности EIDKP
84 AdCT5 Пример «хвостовой» последовательности EIDK
85 AdCT6 Пример «хвостовой» последовательности EI
- 114 036055
86 AdCT7 Пример «хвостовой» последовательности EIEKPSQ
87 AdCT8 Пример «хвостовой» последовательности EIDKPSQLE
88 AdCT9 Пример «хвостовой» последовательности EIEDEDEDEDED
89 AdCTIO Пример «хвостовой» последовательности EIEKPSQEDEDEDEDED
90 AdCTll Пример «хвостовой» последовательности EGSGS
91 AdCT12 Пример «хвостовой» последовательности EIDKPCQ
92 AdCT13 Пример «хвостовой» последовательности EIEKPCQ
93 AdCT14 Пример «хвостовой» последовательности GSGC
94 AdCT15 Пример «хвостовой» последовательности EGSGC
95 AdCT16 Пример «хвостовой» последовательности EIDKPCQLE
96 LI G(GS)2 GGSGS
97 L2 G(GS)4 GGSGSGSGS
- 115 036055
98 L3 G(GS)6 GGSGSGSGSGSGS
99 L4 G(GS)7 GGSGSGSGSGSGSGS
00 L5 G(GS)7G GGSGSGSGSGSGSGSG
01 L6 GSGS GSGS
02 L7 (GS)4 GSGSGSGS
03 L7 (GS)7 GSGSGSGSGSGSGS
04 L9 GS(A)9GS GSAAAAAAAAAGS
05 LIO (GSE)5 GSEGSEGSEGSEGSE
06 Lil (PAS)5 PAS PAS PAS PAS PAS
07 L12 (GSP)5 GSPGSPGSPGSPGSP
08 L13 GS(TVAAPS)2 GSTVAAPSTVAAPS
09 L14 (GGSE)2 GGSEGGSE
10 L15 (ST)3G STSTSTG
11 L16 (GGGGS)7 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SGGGGS
12 L17 (GGGGS)s GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG S
13 L18 (GGGGS)3G GGGGSGGGGSGGGGSG
- 116 036055
14 L19 (GP)3G GPGPGPG
15 L20 (GP)5G GPGPGPGPGPG
16 L21 P(ST)3 PSTSTST
17 L22 (РА)3 PAPАРА
18 L23 (РА)6 PAPАРАРАРАРА
19 L24 (РА)9 РАРАРАРАРАРАРАРАРА
Примеры удлинений коровых последовательностей Аднектинов
20 SABA1. 1 Коровая последовательность 1 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3roM MGVSDVPRDLЕVVААТРТSLLISWНSYYЕ QNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGL KPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIDKPSQ НННННН
21 SABA1. 2 Коровая последовательность 1 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCT8 MGVSDVPRDLЕVVААТРТSLLISWНSYYЕ QNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGL KPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEDEDE DEDED
22 SABA1. 3 Коровая последовательность 1 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCT9 с His6-T3roM MGVSDVPRDLЕVVААТРТSLLISWНSYYЕ QNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGL KPGVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEDEDE DEDEDHHHHHH
- 117 036055
23 SABA2. 1 Коровая последовательность 2 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с Н18б-тэгом MGVSDVPRDLЕVVААТРТSLLISWРКYDК TGHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPTRQTTATISGL KPGVDYTITVYAVSKDDYYPHEHRPISINYRTEID KPSQHHHHHH
24 SABA3. 1 Коровая последовательность 3 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3TOM MGVSDVPRDLЕVVААТРТSLLISWSNDGР GLSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSSQTTATISGL KPGVDYTITVYAVSYYTKKAYSAGPISINYRTEID KPSQHHHHHH
25 SABA4. 1 Коровая последовательность 4 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3TOM MGVSDVPRDLEMVAATPTSLLISWEDDSY YSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSDLYTATISGL KPGVDY ТIТVYAVT Y DVT DLIMHEPISINY RTEID KPSQHHHHHH
26 SABA5. 1 Коровая последовательность 5 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3TOM MGVSDVPRDLEVVААТPTSLLISWEDDSY YSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSDLYTATISGL KPGVDY TITVYAVT Y DVT DLIMHEPISINY RTEID KPSQHHHHHH
- 118 036055
27 SAB Аб. 1 Коровая последовательность 6 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3TOM MGVSDVPRDLEVVAAT PT SLLISWYMDEY DVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPNYYNTATISGL KPGVDYТIТVYAVTRIKANNYMYGРISINYRTEID KPSQHHHHHH
28 SABA7. 1 Коровая последовательность 7 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3TOM MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWNHLEH VARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPEYPTTATISGL KPGVDY TITVYAVTITMLKYPTQSPISINY RTEID KPSQHHHHHH
29 SABA8. 1 Коровая последовательность 8 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3TOM MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWGHYRR SGHYYRITYGETGGNSPVQEFTVDPSSYTATISGL KPGVDYTITVYAVSKDDYYPHEHRPISINYRTEID KPSQHHHHHH
30 SABA9. 1 Коровая последовательность 9 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3TOM MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDASHY ERRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRYHHTATISGL KPGVDYTITVYAVTOAOEHYQPPISINYRTEIDKP SQHHHHHH
- 119 036055
31 SABA 10 .1 Коровая последовательность 10 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3TOM MGVSDVPRDLEVVAAT PT SLLISWNS YY Н SADYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYPPTTATISGL KPGVDYTIТVYAVY SAKSYYPISINY RTEIDKPSQ HHHHHH
32 SABAH .1 Коровая последовательность 11 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3TOM MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWSKYSK HGHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSGNATATISGL KPGVDYTITVYAVE DTNDY PHT HRPISINY RTEID KPSQHHHHHH
33 SABA 12 .1 Коровая последовательность 12 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3TOM MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHGEPD QTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPYRRTATISGL KPGVDYTITVYAVTSGYTGHYQPISINYRTEIDKP SQHHHHHH
34 SABA 13 .1 Коровая последовательность 13 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3TOM MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWSKYSK HGHYYRITYGETGGNSPVQEFTVDPSSYTATISGL KPGVDYTITVYAVSKDDYYPHEHRPISINYRTEID KPSQHHHHHH
- 120 036055
35 SABA 14 .1 Коровая последовательность 14 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с Н18б-тэгом MGVSDVPRDLΕVVAATРТSLLISWYЕРYТ PIHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGYYGTATISGL KPGVDYTITVYAVYGYYQYTPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH
36 SABA 15 .1 Коровая последовательность 15 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с Н18б-тэгом MGVSDVPRDLEVVAAT PT SLLISWSKY S К HGHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSGNATATISGL KPGVDYTIТVYAVS DDNKYY HQHRPISINY RTEID KPSQHHHHHH
37 SABA 16 .1 Коровая последовательность 16 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с Н18б-тэгом MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWGHYRR SGHYYRITYGETGGNSPVQEFTVDPSSYTATISGL KPGVDYTITVYAVSKDDYYPHEHRPISINYRTEID KPSQHHHHHH
38 SABA 17 .1 Коровая последовательность 17 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с Н18б-тэгом MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWSKYSK HGHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSGNATATISGL KPGVDYTITVYAVE DTNDY PHT HRPISINY RTEID KPSQHHHHHH
- 121 036055
39 SABA 18 .1 Коровая последовательность 18 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3roM MGVSDVPRDLЕVVAATРТSLLISWYЕРGА SVYYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSYYHTATISGL KPGVDYTIТVYAVY GYYEYEPISINY RTEIDKPSQ HHHHHH
40 SABA 19 .1 Коровая последовательность 19 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3roM MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWQSYYA HSDYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYPPQTATISGL KPGVDYТIТVYAVYAGSSYYРISINYRTEIDKPSQ HHHHHH
41 SABA20 .1 Коровая последовательность 20 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3roM MGVSDVPRDLEVVAAT PT SLLISWGHYRR SGHYYRITYGETGGNSPVQEFTVDPSSYTATISGL KPGVDYTITVYAVSKDDYYPHEHRPISINYRTEID KPSQHHHHHH
42 SABA21 .1 Коровая последовательность 21 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с His6-T3roM MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWPEPGT PVYYYRITYGETGGNSPVQEFTVPAYYGTATISGL KPGVDYTITVYAVYGYYDYSPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH
- 122 036055
43 SABA22 .1 Коровая последовательность 22 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с Н18б-тэгом MGVSDVPRDLEVVAAT PTSLLISWYRYEK TQHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPESGTATISGL KPGVDYTITVYAVYAGYEYPHTHRPISINYRTEID KPSQHHHHHH
44 SABA23 .1 Коровая последовательность 23 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с Н18б-тэгом MGVSDVPRDLEVVAATΡΤSLLISWVKSΕΕ YYRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYYVHTATISGL KPGVDYTITVYAVTEYYYAGAVVSVPISINYRTEI DKPSQHHHHHH
45 SABA24 .1 Коровая последовательность 24 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с Н18б-тэгом MGVSDVPRDLEVVAATΡΤSLLISWΥDΡΥΤ YGSYYRITYGETGGNSPVQEFTVGPYTTTATISGL KPGVDYTITVYAVSYYYSTQPISINY RTEIDKPSQ HHHHHH
46 SABA25 .1 Коровая последовательность 25 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с Н18б-тэгом MGVSDVPRDLEVVAATΡΤSLLISWSΝDGΡ GLSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSSQTTATISGL ΚΡGVDΥΤIΤVΥAVSΥΥΤΚΚΆΥSAGΡISIΝΥRTEID KPSQHHHHHH
47 SABA26 .1 Коровая последовательность 26 Аднектина, содержащая концевые последовательности AdNTl и AdCTl с Н18б-тэгом MGVSDVPRDLEVVAATΡΤSLLISWΡDΡΥΥ KPDYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDYTTATISGL KPGVDYTITVYAVYSYYGYYPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH
Примеры
Пример 1.
Материалы и методы, использованные для данного изобретения.
Технология высокопроизводительной наработки белка (НТРР). Отобранные последовательности, кодирующие связывающие белки, были клонированы в вектор pET9d и трансформированы в клетки Е.соП штамма HMS174. Далее клетки инокулировали в 5 мл среды LB, содержащей канамицин в концентрации 50 мкг/мл, в 24-луночные планшеты и инкубировали при 37°С в течение ночи. Для подготовки к индукции экспрессии 200 мкл ночной культуры переносили в 5 мл свежей среды LB (50 мкг/мл канамицина) в новой лунке. Культуры растили при 37°С до оптической плотности A600 0,6-0,9. Затем индуцировали экспрессию внесением изопропил-в-тиогалактозида до концентрации 1 мМ и инкубировали при 30°С в течение 6 ч, после чего собирали клетки центрифугированием в течение 10 мин при ускорении 2750 g и 4°С.
Клетки осадков (в 24-луночном планшете) были лизированы путем добавления 450 мкл лизириующего буфера (50 мМ NaH2PO4, 0.5М NaCl, 1х Complete Protease Inhibitor Cocktail-EDTA в свободном виде (Roche), 1 мМ PMSF, 10 мМ CHAPS, 40 мМ Имидазола, 1 мг/мл лизоцима, 30 мкг/мл ДНКазы, 2 мкг/мл апротонина, рН 8.0) и перемешивания при комнатной температуре в течение 1-3 ч. Лизаты осветляли и
- 123 036055 переводили в 9-луночнный формат путем фильтрования при повышенном давлении через 96-луночный фильтр Whatman GF/D UNIFILTER® с 96-луночным планшетом для сбора объемом 1,2 мл. Осветленные лизаты переносили в 96-луночный планшет с Ni-хелатирующей смолой, уравновешенной буфером: 50 мМ NaH2PO4, 0.5M NaCl, 40 мМ Имидазола, рН 8.0, и инкубировали в течение 5 мин. Не связавшиеся вещества удаляли под вакуумом. Смолу дважды по 0,3 мл/лунку промывали Отмывочным буфером № 1 (50 мМ NaH2PO4, 0.5М NaCl, 5 мМ CHAPS, 40 мМ имидазола, рН 8.0) под действием вакуума. До элюции в каждую лунку вносили 50 мкл элюирующего буфера (PBS + 20 мМ ЭДТА), инкубировали в течение 5 мин и удаляли при помощи вакуума. Белок элюировали добавляя дополнительные 100 мкл элюирующего буфера в каждую лунку. После 30 мин инкубации при комнатной температуре планшет(ы) центрифугировали в течение 5 мин при 200g, при этом элюируемый белок собирали с помощью 96-ти луночного планшета для сбора, содержащего по 5 мкл 0,5М MgCl2 на дне лунок. Количество элюированного белка измеряли с помощью стандартного ВСА-анализа с использованием SGE в качестве стандарта.
Среднемасштабная экспрессия и очистка нерастворимых связывающих белков на основе структурных частей фибронектина.
Для экспрессии последовательностей клонов, продуцирующих нерастворимые белки, последовательности клона(ов) с 6His-тэгом на конце клонируют в вектор pET9d (EMD Bioscience, San Diego, CA) и экспрессируют в клетках E.coli штамма HMS174. Для этого в 1 л среды LB, содержащей 50 мкг/мл карбенциклина и 34 мкг/мл хлорамфеникола, инокулируют 20 мл культуры клеток (полученной с одной колонии, выращенной рассевом на одной чашке). Культуру инкубируют при 37°С до достижения оптической плотности A600 0,6-1,0. После индукции экспрессии добавлением 1 мМ изопропил-в-тиогалактозида (IPTG) культуру инкубируют в течение 4 ч при 30°С и собирают клетки центрифугированием в течение 30 мин при ускорении >10,000 g при 4°С. Осадки клеток замораживают при -80°С. Затем клеточные осадки ресуспендируют в 25 мл лизирующего буфера (20 мМ NaH2PO4, 0.5М NaCl, 1х Complete Protease Inhibitor Cocktail-EDTA в свободном виде (Roche), 1 мМ PMSF, рН 7.4) используя гомогенизатор ULTRA-TURRAX® (IKA) на льду. Лизирование клеток достигают с помощью высокого давления в гомогенизаторе (>18,000 psi), используя Model M-110S MICROFLUIDIZER® (Microfluidics). Нерастворимую фракцию отделяют центрифугированием в течение 30 мин при ускорении 23,300 g при 4°C. Полученный осадок отмывают буфером с 20 мМ фосфата натрия/500 мМ NaCl, рН 7.4. Затем осадок растворяют в 6,0М растворе гидрохлорида гуанидина в буфере, содержащем 20 мМ фосфата натрия/500 мМ NaCl, pH7.4 при обработке ультразвуком и последующей инкубацией при 37°С в течение 1-2 ч. Растворенный осадок фильтруют через фильтры с размером пор 0,45 мкм и наносят на колонку Histrap, предварительно уравновешенную буфером с 20 мМ фосфата натрия/500 мМ NaCl/6,0 M гуанидина, рН7.4. После нанесения, колонку отмывают 25 объемами колонки буфера для уравновешивания. Связавшийся белок элюируют буфером с 50 мМ имидазола и содержащем 20 мМ фосфата натрия/500 мМ N;iCI/6.0M гуанидинхлорида, рН 7.4. Далее проводят рефолдинг очищенного белка путем диализа против буфера с 50 мМ ацетата натрия/150 мМ NaCl, pH 4,5.
Среднемасштабная экспрессия и очистка растворимых связывающих белков на основе структурных частей фибронектина.
Для экспрессии последовательностей клонов, продуцирующих нерастворимые белки, последовательности клона(ов) с 6His-тэгом на конце были клонированы в вектор pET9d (EMD Bioscience, San Diego, CA) и экспрессированы в клетках E.coli штамма HMS174. Для этого в 1 л среды LB, содержащей 50 мкг/мл карбенциклина и 34 мкг/мл хлорамфеникола, инокулировали 20 мл культуры клеток (полученной с одной колонии, выращенной рассевом на одной чашке). Культуру инкубировали при 37°С до достижения оптической плотности A600 0,6-1,0. После индукции экспрессии добавлением 1 мМ изопропил-втиогалактозида (IPTG) культуру инкубировали в течение 4 ч при 30°С и собирали клетки центрифугированием в течение 30 мин при >10,000 g при 4°С. Осадки клеток замораживали при -80°С. Затем клеточные осадки ресуспендировали в 25 мл лизирующего буфера (20мМ NaH2PO4, 0.5М NaCl, 1х Complete Protease Inhibitor Cocktail-EDTA в свободном виде (Roche), 1мМ PMSF, рН 7.4) используя гомогенизатор ULTRA-TURRAX® (IKA) на льду. Лизирование клеток достигали с помощью высокого давления в гомогенизаторе (>18,000 psi), используя Model M-110S MICROFLUIDIZER® (Microfluidics). Растворимую фракцию отделяли центрифугированием в течение 30 мин при ускорении 23,300 g при 4°С. Полученный супернатант осветляли фильтрованием через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Осветленный лизат наносили на колонку Histrap (GE), предварительно уравновешенную буфером с 20 мМ фосфата натрия/500 мМ NaCl, pH7.4. После нанесения колонку отмывали 25 объемами колонки буфера для уравновешивания, содержащего 20 мМ фосфата натрия/500 мМ NaCl, pH 7.4, с последующей промывкой 20 объемами буфера, содержащего 20 мМ фосфата натрия/500 мМ NaCl/25 мМ имидазола, рН7.4, с последующей промывкой 35 объемами буфера, содержащего 20 мМ фосфата натрия/500 мМ NaCl/40 мМ имидазола, рН 7.4. Белок элюировали 15 объемами колонки буфера, содержащего 20 мМ фосфата натрия/500 мМ NaCl/500 мМ имидазола, рН 7.4. Фракции объединяли на основе поглощения при длине волны 280 нм и диализовали против буферов 1х PBS, 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl. pH 8.5 или 50 мМ NaOAc; 150 мМ NaCl; pH 4.5. Любой осадок удаляли путем фильтрования через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
- 124 036055
Пример 2. Доклиническая фармакология in vitro.
Измерение KD методом SPR.
Характеристики связывания были определены методом поверхностного плазмонного резонанаса (SPR). PCSK9 человека и яванского макака были иммобилизованы в отдельных каналах в одном измерении на поверхностях чипа ProteOn XPR (Bio-Rad) и обработаны 6 различными концентрациями 2013Е01 в другом измерении поверхности того же SPR-чипа. Это позволило определить кинетику в отсутствие регенерации. Для определения кинетики PCSK9 человека и яванского макака при 25°С эксперимент проводился в двух повторах. Оценка кинетических параметров была осуществлена с помощью модели взаимодействия Лэнгмюра и постоянных параметров побора кривой по точкам программного обеспечения ProteOn Manager.
В этих условиях анти-PCSK9 Аднектины связываются с PCSK9 человека с константами диссоциации (KD) в диапазоне от 80 пМ до 1,6 нМ и с PCSK9 яванского макака с константами диссоциации (KD) в диапазоне от 8 до 24 нМ (табл. 7). Скорости ассоциации примерно оценивались как 105 М-1с-1, одновременно со скоростями диссоциации, которые составляли обычно 10-3- 10-5 с1. Для некоторых Аднектинов скорости диссоциации от PCSK9 человека были низкими (порядка 10-5 с1), что близко к пределу детекции с помощью технологии SPR. Таким образом, возможно, что данные константы диссоциации от PCSK9 человека ниже приводимой оценки.
Таблица 7. Кинетические параметры анти-PCSK9 Аднектина по отношению к иммобилизованным напрямую PCSK9 человека и яванского макака, определенные с помощью технологии SPR
ID клона организм- источник PCSK9 Ι.,,,ΐΛΓ' s'1) kOff (s'1) KD (нМ)
14 59D05 человек 1.13Е+05 1.80Е-04 1.58 + 0.176
20 13Е01 человек 7.03 ± 0.1 Е+05 2.42 + 0.3 Е-05 0.292 ± 0.008
20 13Е01 яванский макак 2.19 Е+05 1.77 Е- 03 8.1
19 22G04 человек 5.41Е+05 5.08Е-05 0.094 ± 0.009
19 22G04 яванский макак 4.65Е+05 7.00Е-03 15.03
20 11Н05 человек 1.18Е+05 9.76Е-06 0.079 ± 0.038
20 11Н05 яванский макак 1.90Е+05 4.40Е-03 23.1
20 12А04 человек 2.59Е+05 6.47Е-05 0.251 ± 0.011
20 12А04 яванский макак 1.95Е+05 4.75Е-03 24.32
Измерения KD методом BLI.
Характеристики связывания Аднектинов и PCSK9 человека также определялись методом Bio-Layer Interferometry (BLI). Биотинилированный PCSK9 человека был иммобилизован на сенсорных наконечниках, покрытых суперстрептавидином, который затем погружали в лунки, содержащие разведения Аднектина на время, необходимое для связывания. Затем наконечники помещали в лунки, заполненные чистым буферным раствором для наблюдения диссоциации Аднектина. Эксперименты проводили при контролируемой температуре, либо при 25°С, либо при 37°С. Установленная частота колебаний составляла 1500 об/мин.
Анализ связывания проводился с использованием соответствующего программного обеспечения от компании Fortebio (Fortebio Data Analysis Software version 6.3.0.36). Общее соответствие кривой было построено для всех образцов, используя модель связывания 1:1. На основе этих общих соответствий была получена пара скоростей ассоциации и диссоциации, которые соответствовали друг другу. Значения аффинности (KD), скоростей ассоциации и диссоциации были усреднены для различных уровней нагрузки, использовавшихся в анализе. При данных условиях Аднектины связывают PCSK9 человека с аффинностью в диапазоне от 200 пМ до 7.5 нМ, как показано в табл. 8 ниже. Скорости ассоциации варьировали в пределах 104 - 105 М-1с-1 и соответствовали диссоциации, которая обычно составляла 10-3 - 10-5 с-1.
- 125 036055
Таблица 8. Кинетические параметры связывания PCSK9 Аднектинов с PCSK9 человека, ______________определенные с помощью метода BLI______________
Ш клона или номер ATI kOn (М'1 с'1) kOff (С1) KD (нМ)
2381D04 2.66Е+05 ± 6.4 Е+04 6.90Е-05 ± 6.9 Е-05 ±0.08 0.237
2382D09 5.33Е+05 1.64Е-04 0.304
2382D05 5.05Е+05 ± 2.0Е+05 1.57Е-04± 4.2Е-05 ±0.06 0.314
2381В04 3.09Е±05± 2.1Е+04 1.60Е-04± 1.6Е-04 ±0.11 0.527
2382Е05 4.36Е+05 ± 1.6Е+05 2.50Е-04 ± 1.1Е-05 ±0.21 0.604
2382В09 4.51Е±05± 4.7Е+04 2.91Е-04± 4.0Е-05 ±0.02 0.656
2382Н03 4.71Е+05 ± 1.4Е+05 5.57Е-04± 2.3Е-04 ±0.02 0.677
2382С09 3.49Е+05 2.33Е-04 0.757
2971А03 5.74Е+05 4.20Е-04 0.806
2382G04 4.19Е+05 4.64Е-04 1.11
2381G09 2.71Е+05 2.91Е-04 1.12
2451С06 3.47Е±05± 5.4Е+04 4.35Е-04± 5.4Е+04 0.14 1.27 ±
2382Н10 2.88Е+05 3.82Е-04 1.40
2013Е01 5.46Е+05 8.37Е-04 1.51
2382D03 3.54Е+05 6.63Е-04 1.53
- 126 036055
2381F11 3.23Е+05 5.22Е-04 1.59
2971Е02 3.55Е+05 5.55Е-04 1.78
2382Н09 2.51Е+05 4.83Е-04 1.86
2451Н07 4.48Е+05 9.40Е-04 2.08
23 82В10 3.94Е+05 9.77Е-04 2.35
2382С05 3.68Е+05 8.79Е-04 2.49
2971А09 3.99Е+05 1.05Е-03 2.79
2382Е03 2.20Е+05 5.96Е-04 2.94
2381Н09 1.36Е+05 4.60Е-04 3.23
2381В02 2.65Е+05 8.31Е-04 3.29
2381В08 2.13Е+05 9.40Е-04 4.11
2382F05 2.44Е+05 1.09Е-03 4.54
1459D05 1.49Е+05± 2.5Е+04 2.02Е-03 ± 2.0Е-03 14.4 ± 0.2
ATI 1091 2.863Е+05 8.201Е-05 0.293
ATI001117 1.451Е+05 5.074Е-05 0.554
ATI001057 5.325Е+05 1.403Е-04 0.255
ATI001119 8.190Е+04 4.450Е-04 5.296
ATI001168 1 5.829Е+05 3.335Е-04 0.586
ATI001175 2 6.558Е+05 3.522Е-04 0.543
ATI 1081 8.29Е+05 ± 8.1Е+05 3.49Е-04± ЗЕ-04 0.479 ±0.11
ATI891 1.08Е+05 4.03Е-04 3.56
ATI1114 8.072Е+04 3.952Е-04 4.876
ATI 1174 1.265Е+05 9.012Е-04 7.397
1 ATI001168 представляет собой деиммунизированный вариант 1922G04 с заменой R23E.
2 ATI001175 представляет собой деиммунизированный вариант 1922G04 с заменой R23D. Аффинность в растворе.
KinExA.
Аффинность ATI001081 и ATI001174 к PCSK9 человека в растворе была измерена с использованием Kinetic Exclusion Assay (KinExA). Относительные концентрации несвязанного Аднектина были измерены при связывании с твердой подложкой с иммобилизованным hPCSK9 и последующей детекции с помощью флуоресцентно меченых антител, распознающих структурные области Аднектина. Вследствие технических ограничений наименьшая измеряемая концентрация Аднектинов составляла 1 нМ. Величина KD для ATI001081 составляла 70 пМ (28-127 пМ 95% доверительный интервал), а для ATI001174 - 223 пМ (54-585 пМ 95% доверительный интервал) по результатам общего анализа KD.
Таблица 9. Измерения аффинности Аднектинов к PCSK9 в растворе
АТЮ 01081 АТЮ 01174
KD 69.5 пМ 223 пМ
95% доверительный интервал:
Kd высокая 127 пМ 585 пМ
Kd низкая 28 пМ 54 пМ
- 127 036055
ITC.
Стехиометрия и термодинамика связывания Аднектинов ATI001174 с ATI001081 PCSK9 человека были охарактеризованы с использованием метода изотермической титрационной калорметрии (ITC). Измерения связывания в растворе проводились в буфере, содержащем 25 мМ HEPES, рН 7.41, 150 мМ NaCl при 37°C. Наблюдали значение средней одномолекулярной константы связывания в диапазоне 1.3 ± 0.2 нМ для ATI001174 и 1.4 ± 0.4 нМ для ATI001081. Подробный термодинамический анализ приведен в табл. 10 и на фиг. 13. Различия в наблюдаемой энтальпии (-3,3 ккал/моль) для двух данных Аднектинов предполагают, что снижение величины на порядок происходит вследствие пэгилирования ATI001174, что, по меньшей мере, частично, компенсируется соответствующей разницей в энтропии (-10,4 ккал/моль К)
Таблица 10
Аднектин Стехиометрия (N) КА (Μ'1) KD (нМ) АН (ккал/моль) AS (кал/моль °C)
АТЮ01081 0.926 7.1Е8 ±2.1Е8 1.4 ± 0.4 (±30%) -26.6 ± 0.2 -45.4
ΑΊΊ001174* 0.857 7.5Е8 ± 1.5Е8 КЗ ± 0.2 -29.9 ±0.1 -55.8
среднее после трех экспериментов.
Анализ на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET).
Были разработаны три системы на основе FRET для определения аффинности связывания и потенциала PCSK9-связывающих Аднектинов, адаптированные к общему методу, описанному Maio et al. (See Miao В. et al., Meth. Enzymol., 357:180-188 (2002)). FRET-анализ PCSK9:EGFA (фиг. 2 и 3) измерял ингибирование связывания PCSK9 с рецептором липопротеинов низкой плотности (РЛПНП) гомологичным доменом предшественника эпидермального фактора роста (EGFA доменом), с использованием рекомбинантного PCSK9 человека, экспрессированного в бакуловирусной системе, и синтетического 40членного пептида EGFA (биотинилированного). Показано, что EGFA является ключевыи доменом взаимодействия РЛПНП с PCSK9 (Kwon H.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(6):1820-1825 (2008)). В данном анализе использовалось моноклональное антитело (mAb 4H5), связывающее C-концевой домен PCSK9, меченое Eu-хелатором, для обеспечения FRET-взаимодействия с биотинилированным EGFA за счет комплекса стрептавидин/аллофикоцианиновый флуорофор.
Также были сконструированы два других, похожих, PCS^^bucumbix FRET-системы для анализа. В одной из этих систем количественно измерялось конкурентное замещение биотинилированных Аднектинов ATI000972 или ATI001125 Аднектинами (результаты для ATI000972 показаны на фиг. 4). ATI000972 представляет собой биотинилированный вариант 1459D05, a ATI001125 - биотинилированный вариант ATI001081. В другой системе анализировалось прямое связывание Аднектина (с His-тэгом) с PCSK9, с использованием анти-6His-тэг антитела (фиг. 5). В каждой из данных аналитических FRETсистем концентрация PCSK9 человека составляла 1 или 5 нМ. В некоторых случаях PCSK9 человека был заменен на PCSK9 яванского макака. В табл. 11 представлены сводные данные, полученные с помощью всех трех FRET-систем.
- 128 036055
Таблица 11. Сводные данные по тестированию Аднектинов с помощью 3 FRET-систем с использованием PCSK9 человека и, в одном случае, PCSK9 яванского макака
Ш клона hP CSK9: EGFA IC50 (нМ) hP CSK9: ATI000972 IC50 (нМ) hP CSK9: ATI001125 IC50 (нМ) Прямое связывание hPCSK 9 EC50 (нМ) cPCSK9: EGFA IC50 (нМ)
1459D05 4.0 14 nd 3.9 2300
1784F03 2 1.9 nd 1.6 106
1813Е02 1.3 2.4 nd 2.3 118
1923В02 2.3 3.2 nd 3.2 53.5
1922G04 1.2 2.0 nd 2.5 26.6
2012А04 2.1 1.2 nd 1.4 70.3
2011Н05 2.7 1.4 nd 2.0 17.2
2013Е01 1.6 1.8 nd 0.90 12.5
1922G04 (R25D) 2.5 nd nd nd 48.1
1922G04 (R25E) 3.5 nd nd nd 58.5
2382Е03 2.4 nd 0.5 3.7 10.8
2382Е05 2.8 nd 0.4 3.8 12.6
2381В08 2.6 nd 1 4.1 27.1
2381В02 2.5 nd 0.5 8.4 9.8
2381В04 2.4 nd 0.5 4.2 17.3
2451Н07 0.2 nd 0.2 13.2 27.1
2381D04 2.9 nd 0.5 3.7 12
2381F11 4 nd 0.8 < 1 26.5
2381G09 3.1 nd 1.1 4.5 25.2
2381Н09 3.4 nd 0.5 4.1 20.2
2382В09 3.8 nd 0.6 4.0 37.2
23 82В10 3 nd 0.5 3.1 18.1
2382С05 4 nd 0.9 3.4 27.2
2382С09 3.5 nd 0.6 2.9 23.9
2382D03 3.3 nd 0.6 3.3 11.8
2382D09 2.6 nd 0.4 3.7 13.9
2382F05 2.4 nd 0.9 3.8 14.6
2382G04 2.9 nd 0.5 3.6 20.1
2382Н03 3.4 nd 0.3 3.8 19.8
2382Н09 0.9 nd 0.3 3.6 17.9
2382Н10 2.6 nd 0.4 4.6 18.2
2382D02 4.5 nd 0.5 5.3 57.8
2451С06 1.2 nd 0.4 5.5 24.7
Анализ ингибирования PCSK9 Аднектинами активности PCSK9 с помощью культур клеток.
Анализ поглощения DiI-ЛПНП.
Для анализа способности Аднектинов ингибировать активность PCSK9 по отношению к РЛПНП были разработаны подходы на основе клеточных культур. Эффективными способами измерения клеточной активности РЛПНП являются способы на основе поглощения меченого ЛПНП, как показано Lagace
- 129 036055
T.A. et al. (J. Clin. Invest., 116(11):2995-3005 (2006)). В данной работе адаптирован метод оценки функциональной активности РЛПНП с помощью метода поглощения флуоресцентно-меченого ЛПНП (DiIЛПНП), перенесенного из метода, оригинально разработанного Teupser et al. (Biochim. Biophys. Acta, 1303(3): 193-198 (1996)). На начальном этапе, как показано, клетки инкубируют с рекомбинантным PCSK9 человека (10 мг/мл, 135 нМ) в присутствии и в отсутствие Аднектинов. Через два часа остаточная активность РЛПНП оценивается с помощью инкубации с DiI-ЛПНП (5 мкг) в течение 2 ч и последующей оценки накопленного внутри клеток DiI-ЛПНП с применением флуоресцентной микроскопии высокого разрешения и последующим анализом изображений (Cellomics). На фиг. 6 показан эффект нескольких Аднектинов, ингибирующих активность PCSK9 и восстанавливающих функциональную активность РЛПНП в клетках линии HepG2. В данном анализе Аднектины, ингибировавшие PCSK9 и восстанавливавшие поглощение DiI-ЛПНП, обладали следующими характеристиками ЕС50: 1459D05, ЕС50 = 190 нМ; 1784F03, 210 нМ; 2012А04, 130 нМ; 2013Е01, 160 нМ.
Анализ снижения количества РЛПНП.
Клетки линии HepG2 растили в полной среде Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM, АТСС®) с 10% FBS (Hyclone) с обработкой 0,25% трипсина (Invitrogen) дважды в неделю. Для индукции повышения уровня экспрессии рецептора ЛПНП клетки инкубировали в течение ночи в среде LPDS [RPMI (АТСС) с 5% безлипопротеиновой сыворотки (Intracel), 100 нМ superstation (BMS) и 50 мкМ мевалоната натрия (Sigma)]. На следующий день клетки короткое время обрабатывали 0,05% трипсина (Invitrogen) и ресуспендировали в количестве 2x106 клеток на мл, а затем отбирали аликвоты по 100 мкл в лунку в 96луночные планшеты с V-образным дном. Параллельно предварительно инкубировали Аднектины с PCSK9 в среде LDPS в течение часа при 37°С. Через час клетки центрифугировали и ресуспендировали в 100 мкл смеси Аднектин/PCSK9 и инкубировали в течение ночи при 37°С. На следующий день клетки метили антителом против рецептора ЛПНП (BAF 2148 jn R&D) с последующей обработкой вторичными антителами, конъюгированными с фикоэритрин (РЕ)-стрептавидином (BD554061 от BD Pharmingen) и анализировали на проточном цитофлуориметре FACS Canton (BD).
Перед добавлением к клеткам линии HepG2 раствор PCSK9 с концентрацией 10 нМ инкубировали с возрастающей концентрацией кандидатных Аднектинов. После инкубации в течение ночи уровень РЛПНП измеряли с помощью проточного цитофлюориметра. Процент ингибирования PCSK9опосредованного снижения количества РЛПНП отражался на графике, ЕС50 определяли с помощью PRISM. Клон 1459D05 обладал наименьшей способностью ингибирования (ингибирование не достигало максимума), тогда как другие клоны достигают максимума ингибирования PCSK9 в 150-200% (фиг. 7). Сводные данные по фармакологии PCSK9 Аднектина in vitro приведены ниже в табл. 12.
Таблица 12
ID клона % мономерной формы (ВЭЖ Х-гельфильтрация) Тт (°C , DSC) KD hPCSK9 (37°С, Octet Red) (нМ) KD hPCSK9 (25 °C, ProteOn) (нМ) Кросс-реактивность по отношению к белку яванского макака PCS К9: GFA FRET (ЕС5 о, нМ) Снижение количества РЛПНП
KD CPCSK9 (25 °C, ProteOn) (нМ) PCSK9 макака: EGFA FRET (ЕС50, нМ) % ингибирова ния при 75н М ес5 о(нМ)
14 59D05 >95 63 14.4 1.58 >1000 >1000 5.8 66.8 >20 0
18 13Е02 >95 70 нд нд нд 118.5 2.7 нд 16
17 84F03 >95 65 нд нд нд 106.5 2.01 150.2 26± 13
19 23В02 >95 73 нд 0.17 нд 53.5 2.3 178 23± 7
19 22G04 100 83 нд 0.09 15.0 26.6 1.2 105.1 10± 2
20 13Е01 100 81 нд 0.29 8.1 12.5 1.6 165.5 10± 4
- 130 036055
20 12A04 100 84 нд 0.25 24.3 70.3 2.1 144.5 12± 6
20 11H05 100 76 нд 0.08 23.1 17.2 2.7 197.6 12± 5
23 82D05 97 86 0.314 нд нд 57.8 2.6 140.5 нд
23 82E03 96 83 2.94 нд нд 10.8 2.4 89.5 НД
23 82E05 95 84 0.604 нд нд 12.6 2.8 103.5 НД
23 81B02 96 68 3.29 нд нд 9.8 2.5 125.4 НД
23 81B04 98 77 0.527 нд нд 17.3 2.4 121.6 НД
23 81B08 97 78 4.11 нд нд 27.1 2.6 124.8 НД
23 81D04 98 70 0.237 нд нд 12 2.9 119.2 НД
23 81F11 95 79 1.59 нд нд 26.5 4 110.2 НД
23 81G09 96 78 1.12 нд НД 25.2 3.1 133.0 НД
23 81H09 77 63 3.23 нд нд 20.2 3.4 94.4 НД
23 82B09 99 88 0.656 нд нд 37.2 3.8 105.0 НД
23 82В10 99 82 2.35 нд нд 18.1 3 100.2 НД
23 82С05 97 85 2.49 нд нд 27.2 4 105.3 НД
23 82С09 96 85 0.757 нд НД 23.9 3.5 121.7 НД
23 82D03 97 84 1.53 нд НД 11.8 3.3 80.4 НД
23 82D09 93 84 0.304 нд НД 13.9 2.6 109.1 НД
23 82F05 99 83 4.54 нд НД 14.6 2.4 72.2 НД
23 82G04 95 81 1.11 НД НД 20.1 2.9 146.1 НД
23 82Н03 96 85 0.677 НД НД 19.8 3.4 102.1 НД
23 82Н09 95 81 1.86 НД НД 17.9 0.9 101.2 НД
23 82Н10 97 87 1.40 НД НД 18.2 2.6 118.6 НД
24 51В06 nd nd нд НД НД 57.8 4.5 92.2 НД
24 51С06 96 87 1.27 НД НД 24.7 1.2 89.4 НД
24 51Н07 97 87 2.08 нд нд 27.1 0.2 88.8 нд
- 131 036055
Пример 3. Фармакодинамические свойства PCSK9 Аднектинов in vivo.
Исследования на моделях трансгенных по PCSK9 человека мышей.
Исследование фармакодинамических свойств PCSK9 Аднектинов in vivo проводилось на двух различных трансгенных мышиных моделях. Одна из мышиных моделей экспрессировала PCSK9 человека на высоком уровне, что приводило к гиперхолистеринемии (Lagace T.A. et al., J. Clin. Invest., 116(11):2995-3005 (2006)). У мышей другой модели hPCSK9 был встроен в геном (с использованием ВАС), уровень его экспрессии регулировался в печени сходно с PCSK9 мыши, hPCSK9 экспрессровался в плазме на близком к нормальному у человека уровне. Для измерения уровня несвязанного PCSK9 человека в плазме (т.е. hPCSK9 не в комплексе с вводимым Аднектином) как показателя количества целевого белка был разработан ИФА-тест. на основе видоспецифических сайт-специфически меченых антител и Аднектинов.
Однократные дозы PCSK9 Аднектинов в пэгилированной форме были введены внутрибрюшинно мышам трансгенной линии с повышенным уровнем экспрессии hPCSK9 в дозировках, приведенных на фиг. 8-9. В качестве контроля также вводились PBS или образцы диализата. Введение Аднектина 1459D05-PEG (100 мг/кг внутрибрюшинно) приводило к быстрому снижению общего уровня холестерина и ЛПНП-С в плазме (фиг. 8А) более чем на 35% ниже базального уровня в течение 4 ч. Уровень холестерина у мышей, которым вводился Аднектин, сохранялся ниже уровня в контрольной группе на протяжении 48 ч измерений. Это снижение сопровождалось резким снижением уровня циркулирующего несвязанного hPCSK9 у трансгенных мышей, которым вводился Аднектин (фиг. 8В). Вестерн-блоттинг образцов тканей печени, взятых через 6 ч в параллельном исследовании, показал, что уровень РЛПНП был повышен в ~2 раза у мышей, которым вводился Аднектин (результаты не приведены). При дальнейших исследованиях на мышах этой трансгенной линии ATI001114 вводился в дозировках 10 или 60 мг/кг. Наблюдалось существенное дозозависимое быстрое снижение уровня холестерина в плазме, сопровождаемое дозозависимым снижением уровня несвязанного hPCSK9 (фиг. 9). Эти исследования являются экспериментальной проверкой in vivo способности PCSK9 Аднектинов эффективно снижать уровень холестерина у мышей трансгенной по hPCSK9 линии с гиперхолистеринемией.
Исследования in vivo проводились на линейных трансгенных мышах нормально экспрессирующих hPCSK9. Введение однократных доз 1459D05-PEG или ATI001114 (5 мг/кг) привело к быстрому и выраженному снижению уровня несвязанного hPCSK9 в плазме (фиг. 10). Данный фармакодинамический эффект в отношении несвязанного hPCSK9 был более длительным при введении ATI001114 по сравнению с to1459D05-PEG, поскольку большие степень и длительность эффекта наблюдались для данного Аднектина, обладающего большей аффинностью/потенциалом. Дальнейшее исследование зависимости эффекта от дозы показало, что ингибирующая на 50% дозировка составляла менее 0,1 мг/кг для ATI001114 в период времени от 3 до 48 ч после введения, как показано на фиг. 11. Полученные на модели трансгенных мышей, экспрессирующих на нормальном уровне hPCSK9, данные показывают, что ингибирующие PCSK9 Аднектины оказывают значительные, аффинно- и дозозависимые эффекты на конечные фармкодинамические показатели, которые коррелируют с регуляцией РЛПНП и снижением уровня ЛПНП-холестерина.
Исследования на яванских макаках.
Исследования фармакодинамики проводились на яванских макаках нормального телосложения. Аднектин ATI001114 вводился обезьянам внутривенно в дозировке 5 мг/кг, после чего собирали образцы плазмы через определенные промежутки времени для определения уровня ЛПНП-холестерина и оценки фармакокинетики. Введение однократной дозы ATI001114 быстро приводило к сниженному уровню ЛПНП-С в плазме более чем на 50% по сравнению с базальным уровнем (или по сравнению с контрольной группой, получавшей PBS) на протяжении 48 ч (фиг. 12). Длительность эффекта на уровень ЛПНП-С составляла более недели с последующим обязательным восстановлением до базального уровня за 3 недели. Данный эффект наблюдался для пегилированных двух- и четырехцепочечным ПЭГ ом массой 40 кДа вариантов анти-PCSK9 Аднектина (ATI001114 и ATI001211 соответственно). ATI001211 представляет собой вариант ATI001081 с 4-цепочечной ПЭГ (NOF) - группой массой 40 кДа. Уровень общего холестерина изменялся похожим образом, однако никакого эффекта на ЛПВП или другие метаболические параметры не наблюдалось (данные не приведены). Анализ фармакокинетики показал длительность времени полужизни в плазме примерно 80-120 ч, что согласуется с фармакодинамикой снижения ЛПНП у яванских макак. Полученные данные демонстрируют, что PCSK9 Аднектин является эффективным и быстродействующим агентом, оказывающим быстрый, значительный и специфический эффект снижения ЛПНП-С на модели яванских макак.
Пример 4. Фармакологическая оценка in vitro и in vivo слитого белка PCSK9 Аднектин-Fc (PRD460).
Наработка PRD460.
Клетки линии HEK-293 6Е были трансфецированы вектором, кодирующим PRD460, с помощью полиэтиленимина (PEI). Клетки инкубировали 5 дней при 37°С, 80% влажности и 5% CO2. После этого клетки осаждали, супернатант фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм и наносили на колонку с белком А. Колонку промывали буфером PBS и элюировали белок буфером, содержащим 20 мМ глицина и 150 мМ NaCl pH 2.8. Препарат элюированного белка концентрировали и пропускали через колон
- 132 036055 ку superdex200 в буфере, содержащем 50 мМ MES, 100 мМ NaCl pH 5.8.
Определение KD PRD460 методом SPR.
Характеристики связывания определялись методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Антитело против белков человека иммобилизовали на поверхности подложки BIACORE® chip, после чего белок PRD460 (последовательность указана в SEQ ID NO: 322) был помещен на подложку для связывания. Различные концентрации hPCSK9 вносили в промывающий раствор, используя 3M раствор MgCl2 для регенерации подложки между циклами. Для сравнения белок ATI-1081 был связан с подложкой BIACORE® chip с иммобилизованными антителами к 6Из-тэгу. Эксперименты для PRD460 проводились дважды в разные дни. Определение кинетики проводилось при 25°С. Оценка кинетических параметров проводилась с использованием программного обеспечения BIACORE® Evaluation и Алгоритма связывания 1:1.
В данных условиях ATI-1081 связывался с PCSK9 человека с константой диссоциации (KD) 6,7 нМ при 25°С. Константа диссоциации (KD) PRD460 с PCSK9 человека в данных условиях составляла 3,29 +/0.55 нМ (табл. 13). Определение скорости диссоциации при использовании данного формата анализа, возможно, имеет ограничения вследствие скорости диссоциации связанного лиганда от иммобилизованного связывающего антитела. Таким образом, формат анализа, при котором применяется прямая иммобилизация PCSK9, является более точным для оценки константы диссоциации (KD) для ATI-1081.
Таблица 13. Кинетические параметры связывания для PRD460 и ATI-1081 с иммобилизованным PCSK9 человека
ka (1/Мс) kd (1/с) KD (нМ)
PRD460 3.75+/-0.7 Е+04 1.21 +/-0.05 Е-04 3.29+/- 0.55
ATI-1081 3.65Е+04 2.45Е-04 6.7
Анализы связывания PCSK9 на основе FRET.
Для определения в конкурентных условиях связывающего потенциала PRD460 и других Аднектинов с hPCSK9 были использованы две системы анализа на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET). Система PCSK9:EGFA измеряет связывание PCSK9 с РЛПНП, используя пептид домена А гомологичного предшественнику растворимого эпидермального фактора роста (EGFA) и рекомбинантный PCSK9 человека. Система PCSK9:ATI972 измеряет конкурентное замещение Аднектинами биотиниллированного Аднектина ATI-972 на молекуле PCSK9.
В системе PCSK9:EGFA (при концентрации PCSK9 5 нМ) PRD460 полностью замещал EGFA, связанный с PCSK9, с ЕС50 = 0.7 нМ (фиг. 1, слева). В данном формате анализа PRD460 обладал большей активностью, чем ATI-1174 (ЕС50 =1.9 нМ) или ATI-1081 (EC50 = 3.7 нМ) (фиг. 14). Большая активность PRD460 в данном формате анализа может объясняться бивалентностью связывания Аднектина PRD460 с PCSK9 (теоретически) по сравнению с одновалентным (1:1) связыванием у ATI-1081 и ATI-1174.
В системе PCSK9:ATI972 (при концентрации PCSK9 5 нМ) PRD460 игибировал связывание с ЕС = 0,3 нМ, по сравнению с 0,8 нМ для ATI-1114 и 2,8 нМ для ATI-1081 (фиг. 15). Эти данные демонстрируют, что PRD460 активно замещает Аднектин ATI-972 на его сайтах связывания с PCSK9. Большая активность PRD460 по сравнению с ATI-1081 и ATI-1174 согласуется с бивалентным типом связывания PRD460.
Ингибирование снижения уровня РЛПНП, индуцированного PCSK9, на клетках линии HepG2.
PCSK9 человека индуцирует снижение представленности РЛПНП на поверхности клеток линии HepG2. Предварительная инкубация PCSK9 с PCSK9 Аднектинами ингибирует связывание PCSK9 с РЛПНП и предотвращает снижение представленности РЛПНП на поверхности клеток. Данная система анализа была применена для измерения активности ингибирования ATI-1081, ATI-1174 и PRD460 индуцированного PCSK9 снижения уровня представленности РЛПНП на клеточной поверхности.
Серийные разведения PCSK9 Аднектинов инкубировались с PCSK9 человека в концентрации 10 нМ в течение 1 ч при 37°С. Затем в смеси вносились клетки линии HepG2 и смеси инкубировались далее в течение 24 ч. После этого уровень РЛПНП на клеточной поверхности клеток линии HepG2 измерялся с помощью проточной цитофлуориметрии. На графике указывался рассчитанный уровень ингибирования снижения представленности РЛПНП, индуцируемого PCSK9 (фиг. 15). По результатам данного анализа ATI-1081, ATI-1174 и PRD460 ингибировали активность PCSK9 со сравнимыми значениями ЕС50 (9, 8 и 6 нМ соответственно). Однако для PRD460 неоднократно наблюдался сдвиг данной кривой влево. Указанные значения ЕС50 представляют собой предел измерения для данного анализа.
Анализ PCSK9 клетками линии HepG2.
Связывание PCSK9 с РЛПНП на поверхности гепатоцитов приводит к интернализации комплекса РЛПНП- PCSK9 в ходе эндоцитоза РЛПНП, что приводит к ускоренной деградации РЛПНП. Для измерения опосредованного РЛПНП проникновения внутрь клеток флуоресцентного PCSK9 был разработан специфический анализ. Молекулы PCSK9 человека были ковалентно мечены флуорофором ALEXA FLUOR®-647(AF647). Полученный PCSK9-AF647 инкубировался с клетками линии HepG2 в присутст
- 133 036055 вии и в отсутствие PCSK9-AgHeKTUHoe, после чего измерялась внутриклеточная флуоресценция с помощью флуоресцентной микроскопии высокого разрешения и анализа изображений (Cellomics). Зависимость поглощения PCSK9-AF647 клетками от эндоцитоза РЛПНП была показана в предварительных экспериментах. Клетки линии HepG2 инкубировались с PCSK9-AF647 в концентрации 10 нМ и различными количествами Аднектинов в течение 4 ч при 37°С. По результатам данного анализа активное ингибирование внутриклеточной флуоресценции PCSK9-AF647 наблюдалось для PRD460 (ЕС50 = 6 нМ) и для ATI-1174 (ЕС50 = 10 нМ) (фиг. 16). Эти данные в культуре линии человеческих гепатоцитов демонстрируют эффективное блокирование Аднектинами PRD460 и ATI-1174 связывания PCSK9 с РЛПНП на клеточной поверхности, что, таким образом, снижает уровень интернализации PCSK9-AF647 при эндоцитозе РЛПНП.
Исследования in vivo на трансгенных линиях мышей.
Исследования in vivo проводились на трансгенной линии мышей, экспрессирующих hPCSK9 на нормальном уровне. Предполагается, что связывание Аднектинов с PCSK9 в плазме крови приводит к снижению измеряемого количества несвязанного (свободного) циркулирующего PCSK9. Данное снижение несвязанного PCSK9 является начальным фармакодинамическим эффектом, который приводит к ингибированию взаимодействия PCSK9 с РЛПНП и снижению уровня холестерина ЛПНП. Введение однократных доз PRD460 (внутрибрюшинно, в дозировках от 0,6 до 1,8 мг/кг) трансгенным мышам приводило к быстрому выраженному снижению уровня несвязанного hPCSK9 в плазме крови (фиг. 17). Наблюдалась дозозависимость данного эффекта с ED50<0,6 мг/кг во временной точек 3 ч. Данные результаты, полученные на трансгенной линии мышей с нормальным уровнем экспрессии hPCSK9, демонстрируют активное и выраженное связывание PRD460 с циркулирующим hPCSK9 in vivo.
Исследования фармакодинамики in vivo на яванских макаках.
Фармакодинамические параметры PCSK9 Аднектина PRD460 были определены в исследованиях на яванских макаках нормального телосложения. Для анализа уровня ЛПНП-С и свободного PCSK9 PRD460 вводился обезьянам внутривенно в дозировке 15 мг/кг, после чего собирались образцы плазмы через определенные временные интервалы в течение 4 недель. Однократная доза PRD460 приводила к быстрому снижению уровня ЛПНП-С у обезьян, достигавшему максимального значения в 42% от базового уровня ЛПНП-С (58% снижение, n=3 обезьяны) на третий день после введения (фиг. 18). Уровень ЛПНП-С был снижен на 50% и более в течение недели после введения, оставаясь значительно сниженным по сравнению с базовым на протяжении 3 недель и достигая базового уровня через 4 недели после введения. Уровень общего холестерина изменялся схожим образом, однако уровень ЛПВП не менялся (данные не приведены). Введение PRD460 приводит к немедленному снижению почти до 0 (ниже предела количественного измерения) уровня несвязанного PCSK9 в свободно форме в плазме (фиг. 18). Уровень свободного PCSK9 сохранялся ниже предела детекции в течение нескольких дней, после чего постепенно увеличивался до базового уровня к концу 4-й недели, что согласуется с данным относительно изменения уровня ЛПНП-С при введении PRD460. Полученные данные демонстрируют, что снижение уровня ЛПНП в плазме отражает падение уровня свободного PCSK9, что согласуется с ингибированием PCSK9, регулирующим функцию РЛПНП, после введения PRD460 in vivo. Анализ фармакокинетики в данных исследованиях на обезьянах показал, что время полужизни в плазме Аднектина PRD460 составляло приблизительно 70 ч. Эти данные демонстрируют высокую эффективность и быстродействие слитого белка PCSK9 Аднектин-Fc в значительном, специфичном и длительном снижении уровня ЛПНП-С в исследовании на яванских макаках.
Фармакологическая оценка немодифицированного PCSK9 Аднектина ATI-1081 in vivo.
В дополнение к модифицированным Аднектинам, содержащим РК-группу (например, пэгилированным или слитым с Fc-фрагментом Аднектинам), может вводиться также немодифицированный (свободный) PCSK9 Аднектин. Стратегии для лечения немодифицированным PCSK9 Аднектином включают более частый прием с учетом более короткого времени полужизни в плазме или использование лекарственных форм с подкожным пролонгированным высвобождением для увеличения продолжительности абсорбционной фазы и увеличения длительности фармакодинамики. Многие из таких лекарственных форм могут быть разработаны, включая, как простой пример, растворы в системе пропилен гликоль/PBS для снижения скорости абсорбции и увеличения времени экспозиции Аднектина в кровотоке.
Немодифицированный Аднектин ATI-1081 вводился яванским макакам внутривенно в дозировке 10 мг/кг в PBS. Для сравнения вводился ATI-1114 (пэгилированный вариант того же Аднектина) в дозировке 1 мг/кг в PBS. Введение ATI-1081 вызывало быстрое временное снижение уровня несвязанного PCSK9 в кровотоке. В течение 30 мин степень снижения достигала 100% (ниже предела количественного обнаружения) с последующим возвращением к базовому уровню в течение нескольких часов (фиг. 19). Одновременно наблюдалась тенденция к снижению уровня ЛПНП-С в течение первых 24 ч после введения ATI-1081 обезьянам (фиг. 20).
Немодифицированный Аднектин ATI-1081 также вводился мышам трансгенной линии нормальным уровнем экспрессии hPCSK9 в виде простой подкожной лекарственной формы с пролонгированным высвобождением: смесь 50:50 полипропиленгликоля и PBS, для сравнения с PBS-носителем. Ожидалось, что данная лекарственная форма умеренно снизит скорость абсорбции Аднектина и увеличит время экс
- 134 036055 позиции ATI-1081 в кровотоке, таким образом улучшая фармакодинамику. Введение (внутрибрюшинно) ATI-1081 в дозировке 1 мг/кг в PBS приводило к снижению несвязанного PCSK9 в плазме на 50% через 3 ч по сравнению с 85%-ным снижением при введении ATI-1114 в дозировке 0,3 мг/кг (фиг. 21). В ходе второго эксперимента ATI-1081 вводился трансгенным мышам путем подкожных инъекций с полипропиленгликолевым носителем (PG), что приводило к примерно эквивалентному по сравнению с ATI-1174 снижению несвязанного ЛПНП с увеличенной длительностью данного эффекта на протяжении первых 6 ч исследования (фиг. 22). Эти данные демонстрируют связывание немодифицированного PCSK9 Аднектина ATI-1081 с PCSK9 человека in vivo и улучшение изначальной фармакодинамики при введении немодифицированного PCSK9 Аднектина ATI-1081 подкожно с простым носителем, обеспечивающим пролонгированное время высвобождения. Зависимость эффекта от времени согласовывалась с увеличением времени высвобождения и длительностью эффекта немодифицированного PCSK9 Аднектина.
Пример 5. Аднектины, связывающие сывороточный альбумин (SABA).
Пример 5А. Поиск и селекция кандидатных Аднектинов, связывающих сывороточный альбумин.
Обзор.
Метод селекции, называемый PROfusion (см., например, Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(23): 12297-12302 (1997) и WO 2008/066752), был применен для библиотек ДНК, содержащих сконструированные вариабельные области в петлях BC, DE и FG домена 10Fn3. На основе этих конструкций были созданы библиотеки, содержащие более 1013 случайных последовательностей, подвергнутые затем отбору против биотинилированной формы HSA, для отбора кандидатных Аднектинов, связывающих сывороточный альбумин (SABA) с требуемыми свойствами связывания.
Процесс получения белков с помощью технологии высокопроизводительной наработки белка (High Throughput Protein Production (HTTP)).
Различные Аднектины, связывающие HSA, были получены с помощью технологии высокопроизводительной наработки белков HTTP. Отобранные последовательности, кодирующие связывающие HSA белки, были клонированы в вектор pET9d, содержащий 6Ы18-тэг, после чего данным вектором были трансформированы клетки P.coli штамма BL21(DE3) pLysS. Полученные трансформанты были инокулированы в 5 мл среды LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина, в 24-луночных планшетах. Культуры инкубировались при 37°С в течение ночи. После этого готовили следующие культуры для индукции экспрессии путем добавления 200 мкл ночных культур в свежие 5 мл среды LB (50 мкг/мл канамицина) в соответствующие лунки. Культуры инкубировались при 37°С до достижения оптической плотности A600 0,60,9. Индукция экспрессии осуществлялась добавлением к культуре изопропил-в-тиогалактозида (IPTG) до концентрации 1 мМ, после чего культуры инкубировались в течение 4 ч при 30°С. После этого клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при ускорении 3200 g и температуре 4°С. Полученные осадки клеток замораживали при -80°С.
Осадки клеток (в 24-луночном формате) лизировали ресуспендированием в 450 мкл Лизирующего буфера (50 мМ NaH2PO4, 0.5М NaCl, 1х Complete Protease Inhibitor Cocktail-EDTA в свободной форме (Roche), 1 мМ PMSF, 10 мМ CHAPS, 40 мМ Имидазола, 1 мг/мл лизоцима, 30 мкг/мл ДНКазы, 2 мкг/мл апротонина, рН 8.0) и последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 1 ч. Лизаты осветляли и анализ переводился в 96-луночный формат путем переноса лизатов на 96-луночный фильтрационный планшет Whatman GF/D UNIFILTER®, совмещенный с планшетом для сбора фильтрата объемом 650 мкл, и последующим центрифугированием в течение 5 мин при ускорении 200 g. Осветленные лизаты переносили на 96-луночный планшет с Ni-хелатирующим сорбентом, предварительно уравновешенный буфером для уравновешивания (50 мМ NaH2PO4, 0.5М NaCl, 10 мМ CHAPS, 40 мМ Имидазола, рН 8.0), и инкубировали в течение 5 мин. Несвязавшееся вещество удаляли. Смола отмывалась дважды по 0,3 мл/лунку отмывочным буфером № 1 (50 мМ NaH2PO4, 0.5М NaCl, 5 мМ CHAPS, 40 мМ Имидазола, рН 8.0). Затем трижды промывали смолу по 0,3 мл/лунку PBS. Перед элюцией в каждую лунку вносили по 50 мкл элюирующего буфера (PBS + 20 мМ ЭДТА). После инкубации в течение 5 мин жидкость удаляли с помощью вакуума. Белок элюировали внесением 100 мкл/лунку элюирующего буфера. После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре планшет(ты) центрифугировали в течение 5 мин при ускорении 200g. Элюированный белок собирали в 96-луночный планшет для сбора, содержавший по 5 мкл 0,5М раствора MgCl2 на дне лунок. Концентрацию элюированного белка измеряли с помощью метода ВСА с использованием в качестве белкового стандарта SGE (контрольный Аднектин). SGE Аднектин представляет собой 10Fn3 домен дикого типа (SEQ ID NO: 1), в котором интегринсвязывающий домен (аминокислотные остатки RGD в положении 78-80) заменен на остатки SGE.
HAS, RhSA и MuSA белки в прямом ИФА.
Для анализа прямого связывания с HSA на планшеты MaxiSorp plates (Nunc International, Rochester, NY) был сорбирован HSA (Sigma, St. Louis, МО) из концентрации 10 мкг/мл в течение ночи при 4°С. После сорбции сайты неспецифического связывания блокировались с помощью инкубации планшетов с казеиновым блокирующим буфером (Thermo Scientific, Rockford, IL) в течение 1-3 ч при комнатной температуре. Для скрининга по одной точке очищенный с помощью HTTP Аднектин разбавляли в соотношении 1:20 в казеиновом блокирующем буфере и вносили в лунки для связывания с HSA. Планшеты
- 135 036055 инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. При анализе зависимости связывания от концентрации использовали концентрации в диапазоне от 0,1 нМ до 1 мкМ. После инкубации планшеты отмывали от несвязавшегося Аднектина буфером PBST, после чего для связывания с Аднектином с Hisтэгом в лунки вносили конъюгат анти-His моноклоналных антител с HRP (R&D Systems, MN) в разведении 1:2500 в казеиновом блокирующем буфере и инкубировали планшеты в течение 1 ч при комнатной температуре. Избыток конъюгата удаляли промыванием PBST и детектировали связывание Аднектинов с помощью реактивов, содержащих ТМВ (BD Biosciences), в соответствии с рекомендациями производителя.
Измерение степени агрегации с помощью гель-фильтрационной хроматографии.
Гель-фильтрационную хроматографию (Size exclusion chromatography (SEC)) проводили для SABA, полученных с помощью HTTP. Для этого использовались колонки SUPERDEX® 200 5/150 или SUPERDEX® 75 5/150 (GE Healthcare) на системах для ВЭЖХ Agilent 1100 или 1200 с детекцией при А214 нм и А280 нм, а также с системой для детекции флуоресценции (возбуждение при 280 нм, эмиссия при 350 нм). Для хроматографии использовали следующий буфер: 100 мМ сульфата натрия, 100 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, рН 6.8; при соответствующей используемым колонкам скорости потока. Для калибровки по молекулярному весу использовались стандарты молекулярных весов для гель-фильтрации (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
По результатам гель-фильтрационной хроматографии выделенные и очищенные с помощью HTTP SABA преимущественно являются мономерными и элюируются в области 10 кДа по сравнению с глобулярными стандартами молекулярных весов для гель-фильтрации (BioRad).
Идентификация кандидатных Аднектинов, связывающих сывороточный альбумин (SABA).
В результате скрининга по связыванию с HSA/RhSA/MuSA и биофизическим критериям были идентифицированы и выбраны для дальнейшей оценки времени полужизни в мышиной модели четыре уникальных Аднектина, связывающих сывороточный альбумин (SABA). Для проведения in vitro и in vivo характеристики данные SABA были наработаны в среднемасштабных количествах. В табл. 6 представлены последовательности 26 уникальных коровых последовательностей SABA (обозначены цифрами от 1 до 26), идентифицированных с помощью технологии PROfusion. В последовательности SABA4 перед наработкой в среднемасштабных количествах была зафиксирована мутация в структурной части. Лучшим вариантом структурной части последовательности SABA4 является SABA5. Оба варианта, SABA4 и SABA5, имеют идентичные последовательности петель BC, DE и FG.
Пример 5В. Продукция и лекарственные формы кандидатных SABA.
Среднемасштабная наработка белков SABA.
Отобранные последовательности SABA, описанные в примере 5А, с 6His-тэгом на конце, были клонированы в вектор рЕТ 9d и экспрессированы в клетках E.coIi штамма BL21(DE3) pLysS (в табл. 6 приведены последовательности всех SABA с His-тэгом, обозначенные SABA1.1, SABA2.1, SABA3.1 и SABA5.1). 20 мл культуры клеток (полученных с одной колонии рассеянной на чашке) инокулировали в 1 л среды LB с 50 мкг/мл канамицина. Культуру инкубировали до оптической плотности A600 0,6-1,0 при 37°С. После индукции экспрессии внесением изопропил-в-тиогалактозида (IPTG) до концентрации 1 мМ, культуру инкубировали 4 ч при 30°С, после чего собирали клетки центрифугированием в течение 30 мин при ускорении >10000 g и температуре 4°С. Полученные осадки клеток замораживали при -80°С. Осадки клеток ресуспендировали в 25 мл буфера для лизиса (20 мМ NaH2PO4, 0.5M NaCl, 1х Complete Protease Inhibitor Cocktail-EDTA в свободной форме (Roche), pH 7.4) и лизировали клетки на льду с использованием гомогенизатора ULTRA-TURRAX® (IKA works). Лизис клеток достигался за счет высокого давления при гомогенизации (>18,000 psi) при использовании микрофлюидайзера Model M-110S MICROFLUIDIZER® (Microfluidics). Растворимую фракцию отделяли центрифугированием в течение 30 мин при ускорении 23300 g и температуре 4°С. Полученный супернатант осветляли фильтрованием через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Осветленный лизат наносили на колонку HISTRAP® (GE), предварительно уравновешенную буфером, содержащим 20 мМ NaH2PO4, 0.5М NaCl, pH 7.4. После нанесения колонку промывали 25 объемами колонки буфера 20 мМ NaH2PO4, 0.5М NaCl, pH 7.4, затем 20 объемами буфера 20 мМ NaH2PO4, 0.5М NaCl, 25мМ имидазола рН 7.4, затем 35 объемами 20 мМ NaH2PO4, 0.5М NaCl, 40 мМ имидазола рН 7.4. белок элюировали в 15 объемах колонки буфером, содержащим 20 мМ NaH2PO4, 0.5М NaCl, 500 мМ имидазола рН 7.4. Фракции объединяли на основе значений поглощения при А280, после чего диализовали полученные препараты белков против буфера: 1х PBS, 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl pH 8.5 или 50 мМ NaOAc; 150 мМ NaCl; pH 4.5. Выпавший осадок удаляли фильтрованием через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
В результате среднемасштабной экспрессии и очистки получали высокоочищенные и активные Аднектины, экспрессированные в растворимой форме и очищенные от растворимых фракций бактериального лизата. Анализ с помощью гель-фильтрации на колонках SUPERDEX® 200 или SUPERDEX® 75 10/30GL с подвижной фазой 100 мМ NaPO4, 100 мМ NaSO4, 150 мМ NaCl, pH 6.8 (GE Healthcare) демонстрировал преимущественное присутствие мономерной формы Аднектинов.
Лекарственная форма SABA 1.2.
Определенный SABA, SABA1.2 (SEQ ID NO: 411), был выбран для предварительного подбора ле
- 136 036055 карственной формы. Последовательность SABA1.2 содержит удлинение (ED)5 в коровой последовательности 1 последовательности 10Fn3 (см. SEQ ID NO: 421 в табл. 6). Для SABA1.2 была определена стабильная лекарственная форма в виде раствора, содержащего 10 мМ сукциновой кислоты, 8% сорбитола, 5% глицина и 5 мг/мл белка SABA1.2, рН 6.0. Температура плавления данного белка в такой лекарственной форме составляла 75°С по результатам определения с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) при концентрации белка 1,25 мг/мл. Данная лекарственная формула обеспечивала удовлетворительные физическую и химическую стабильность при 4 и 25°С с исходным уровнем агрегации 1,2%. Спустя месяц хранения уровень агрегации был очень низок (1.6% при 4°C и 3.8% при 25°C). Белок в указанной лекарственной форме также оставался стабильным после 4 циклов замораживания-оттаивания при отогревании с -80 и -20°С до комнатной температуры. Также в указанной лекарственной форме SABA1.2 был растворим до концентрации по меньшей мере 20 мг/мл при 4°С и комнатной температуре, без образования осадка или повышения количества агрегатов.
Пример 5С. Определение биофизических характеристик кандидатных SABA.
Г ель-фильтрационная хроматография.
Образцы кандидатных SABA, наработанных в среднемасштабном количестве, были подвергнуты гель-фильтрационной хроматографии (SEC). Гель-фильтрационная хроматография проводилась на колонках SUPERDEX® 200 10/30 или SUPERDEX® 75 10/30 (GE Healthcare) с использованием систем для ВЭЖХ Agilent 1100 или 1200 и системы детекции поглощения при длинах волн 214 и 280 нм, а также флуоресценции (возбуждение = 280 нм, эмиссия = 350 нм). Для хроматографии использовался буферный раствор следующего состава: 100 мМ сульфата натрия, 100 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, рН 6.8. Хроматографию вели на скоростях потока в зависимости от типа колонки. Для калибровки молекулярного веса применяли набор стандартов молекулярных весов (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
Результаты гель-фильтрационной хроматографии продемонстрировали, что в исследованных образцах Аднектин преимущественно находился в форме мономера и элюировался в примерном диапазоне 10 кДа по сравнению с набором глобулярных стандартов для гель-фильтрации (BioRad).
Термостабильность.
Для определения Tm наработанных в среднемасштабном количестве белков SABA был использован метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК, DSC). Растворы с концентрацией 1 мг/мл были проанализированы с помощью калориметра N-DSC II (Calorimetry Sciences Corp) в диапазоне температур от 5 до 95°С, со скоростью изменения 1°/мин и при давлении в 3 атм. Полученные данные сравнивались с контрольным измерением для соответствующего буфера и алгоритма наилучшего соответствия программного обеспечения Orgin (OrginLab Corp). Результаты гель-фильтрационной хроматографии ДСК сведены в табл. 14.
Таблица 14. Сводные данные гель-фильтрационной хроматографии и ________ДСК для кандидатных вариантов SABA________
Клон Г ель-фильтрационная хроматография ДСК (Tm)
Мономер (%) Димер (%)
SA ВА1.1 92.3 7.7 63.9 °C
SA ВА5.1 88 12 70.1 °C
SA ВА2.1 91 9 58.5 °С/78.2 °C
SA ВА3.1 99 <пд* 65.2 °C
*пд - предел детекции.
Пример 5D. Характеристика связывания с сывороточным альбумином кандидатного варианта SABA1.
Кинетика связывания выбранных клонов SABA, полученных с помощью технологии HTTP или наработанных в среднемасштабных количествах (описано в примерах 5А и 5В), была определена с помощью связывания соответствующего сывороточного альбумина (HSA/RhSA/MuSA) на поверхности чипа Biasensor CM5 и пропускания потока растворов с серийными разведениями SABA через ячейку сравнения и ячейку со связанными альбуминами. В дополнение, связывание с альбуминами проводилось при различных рН, в диапазоне от 5,5 до 7,4. Аднектины, связывающие HSA, SABA2.1, SABA3.1, SABA4.1 и SABA1.1, обладали кросс-реактивностью по отношению к RhSA, однако не связывались с MuSA. Связывание SABA2 и SABA4 с HSA является рН-чувствительным, тогда как связывание с HSA варианта
- 137 036055
SABA3 устойчиво к снижению рН вплоть до 6,0. Вариант SABA1.1 удовлетворяет биохимическим критериям по рН-стабильности и аффинности/кинетике при снижении рН до 5,5.
Картирование доменов проводилось с помощью BIACORE®. Отобранные клоны SABA, очищенные с помощью технологии HTTP или наработанные в среднемасштабных количествах, были проанализированы с помощью связывания HSA или конструкций, содержащих домены I и II HSA или домен III HSA на поверхности чипа Biasensor СМ5и последующего пропускания растворов с серийными разведениями вариантов SABA через ячейку сравнения и ячейку со связанными альбуминами. Клоны SABA2 и SABA1 связывались с HSA и конструкциями домен 1-домен II HSA, но не с доменом III отдельно. Клоны SABA3 и SABA4 связывались с HSA, но ни с одним из вышеуказанных конструктов. Полученные результаты сведены в табл. 15.
Таблица 15. Аффинность связывания и кинетика кандидатных вариантов SABA (SABA1.1, 2.1, 3.1 и 4.1)
Аднек тин Целе вой белок KD (hM) Ko ff/C1) Устойчив ость в диапазоне pH 7.4—>5.5? Эпитоп на HSA
SABA 2 HSA 33.8 +/- 20.5 (n=6) 1. 71E-04 Домен I-II
RhSA 63.6 4. 42E-04
SABA 3 HSA 863 6. 82E-02 +++ (при снижении до 6.0) Ни один из конструктов: домен Ι-II или домен III (междоменный участок?)
RhSA 431 3. 37E-02
SABA 4 HSA 412 +/- 8 (n=4) 7. 82E-04 Ни один из конструктов: домен Ι-II или домен III (междоменный участок?)
RhSA >1000 3. 83E-03
SABA 1 HSA 47.2 +/- 18.2 (n=9) 4. 57E-04 +++ Домен I-II
RhSA 778 +/- 313 (n=4) 5. 45E-03
Пример 5Е. Исследование in vivo параметра t1/2 кандидатных вариантов SABA.
Определение параметров HSA-связывающих Аднектинов проводили на мышах, поскольку данные Аднектины не обладают перекрестным взаимодействием с MuSA. Для этого определяли время полужизни HSA в плазме мышей. 6-недельным самкам мышей линии Ncr nude вводили в хвостовую вену HSA в дозировках 20 мг/кг (фиг. 23А) и 50 мг/кг (фиг. 23В), после чего оценивали с помощью ИФА концентрацию HSA в образцах крови, взятых через определенные интервалы времени после инъекции. Параметр t1/2 введенного HSA определяли для дозировки 20 мг/кг через 24 ч, для дозировки 50 мг/кг через 20 ч после введения.
Определение времени полужизни SABA1-4 у мышей.
В объеме одного литра культуры Е.соН нарабатывались, выделялись, очищались от примесей и от эндотоксина белки клонов SABA1.1, SABA2.1, SABA3.1 и SABA4.1. Каждый из вариантов SABA вводили в хвостовую вену мышей, после чего оценивали с помощью ИФА концентрацию введенных белков в образцах крови, взятых через определенные интервалы времени после инъекции.
Исследования фармакокинетических профилей каждого из вариантов SABA в присутствие и в отсутствие HSA проводили на 6-недельных самках мышей линии Ncr nude. При введении мышам дополнительно с SABA HSA предварительно готовили смесь HSA с SABA (HSA в 3-4 молярном избытке). Исследуемые клоны SABA были специфичны к HSA и RhSA, но не связывались с MuSA. Время полужизни в плазме мышей белка SABA1.1 (клон 1318Н04) составляло 0,56 ч, тогда как совместная инъекция SABA1.1 с HSA приводила к ~10-кратному повышению времени полужизни, которое составляло 5,6 ч (фиг. 24А). Время полужизни в плазме мышей белка SABA2.1 составляло 0,24 ч, тогда как совместная инъекция SABA2.1 с HSA приводила к ~12-кратному повышению времени полужизни, которое составляло 2,8 ч (фиг. 24В). Время полужизни в плазме мышей белка SABA3.1 (клон 1245Н07) составляло 0,28 ч, тогда как совместная инъекция SABA3.1 с HSA приводила к ~2-кратному повышению времени полу- 138 036055 жизни, которое составляло 0,53 ч (фиг. 24С). Время полужизни в плазме мышей белка SABA4.1 составляло 0,66 ч, тогда как совместная инъекция SABA4.1 с HSA приводила к ~7-кратному повышению времени полужизни, которое составляло 4,6 ч (фиг. 24D). Сводные данные по приведенным примерам приведены на фиг. 25. В табл. 16 сведены сходные данные для вариантов SABA1.1, SABA2.1, SABA3.1 и
SABA5.1; по возможности дано сравнение со временем полужизни у яванского макака.
Таблица 16
кло н РК (Т1/2) Примечания
м ыши Яв анский макак
SAB А1.1 5 .6 ч 96- 137 ч Т1/2 = 96-137 4
SAB А5.1 4 .6 ч 12 ч Низкая аффинность связывания с RhSA. При рН<6.0 наблюдается 2кратное повышение KD
SAB А2.1 2 ,8 ч НД Отсутствие связывания при pH <6.5
SAB А3.1 2 мин НД Малое значение Т1/2 наблюдается у мышей
Определение времени полужизни вариантов SABA1.1 и SABA5.1 у яванских макак.
Для предварительной оценки фармакокинетики было проведено исследование на 2 яванских макаках для вариантов SABA1.1 (фиг. 26А) и SABA5.1 (фиг. 26В). Белки вводились однократно внутривенно в дозе 1 мг на кг (мг на кг, mpk). Фармакокинетика оценивалась с использованием количественного анализа на основе ИФА, разработанного для детекции Аднектина в образцах плазмы крови. Вариант SABA1.1 имеет время полужизни в диапазоне 96-137 ч (фиг. 26А и табл. 17А). Время полужизни варианта SABA5.1 составляет около 12 ч. Концентрация SABA5.1 в плазме была достоверно измеряема с помощью ИФА только на протяжении 120 ч после инъекции (фиг. 26В). В табл. 17А сведены данные, полученные для варианта SABA1.1, в табл. 17В - для SABA5.1.
Таблица 17А. SABA1.1
О безьяна Н/ 2(ч) Стах (мкг/мл) AUC all (ч*м кг/мл) С1_о bs (мл/ ч/кг) V zobs ( мл/кг)
#1 95 .8 9.03 673. 7 1.45 2 00.8
#2 13 6.6 7.24 625. 1 1.60 3 15.2
Таблица 17В. SABA5.1
HLLambdaz (ч) Стах (мкг/мл) AUCall (ч* мкг/мл) Clobs (мл/ч/кг) Vz_obs (мл/кг)
N 2 2 2 2 2
Среднее 12.186 17.358 246.882 4.089 72.507
SD 1.451 3.08 36.245 0.596 19.045
Min 11.16 15.18 221.25 3.67 59.04
Мах 13.21 19.54 272.51 4.51 85.97
cv% 11.9 17.7 14.7 14.6 26.3
Пример 5F. Характеристики связывания SABA1 с сывороточным альбумином.
SABA1.1 и 1.2 связываются с HAS и RhSA.
SABA1.2 представляет собой коровую последовательность 1 домена 10Fn3, содержащую удлинение (ED)5 (SEQ ID NO: 421 в табл. 6). SABA1.2 связывался с сывороточным альбумином человека (HSA) при нейтральных значениях рН и температуре 25°С со средней константой скорости ассоциации (ka)
- 139 036055
8,21Е+03 М-1с-1 и средней константой скорости диссоциации (kd) 4,34E-04c-1, с рассчитанной средней Kd 55,3 нМ (табл. 18). Для сывороточного альбумина макаки-резус измеренная константа скорости ассоциации составляла 6.6Е+03 М-1с-1, константа скорости диссоциации составляла 3.78Е-03 с-1, что давало расчетное среднее значение Kd 580 нМ. Измеряемого взаимодействия между SABA1.2 и сывороточными альбуминами мыши или крысы не наблюдалось вплоть до концентрации 1 мкМ (табл. 18 и фиг. 27). При 37°С значения ka и kd повышались от 2 до 5 раз, что приводило примерно к 2-кратному росту аффинности к HSA и 1/2-кратному росту аффинности к RhSA (табл. 18).
Таблица 18. Кинетические параметры связывания альбуминов для SABA1.2 в HBS-P буфере
Альбумин Тем пература (°C) ka (1/Мс) kd (1/с) KD (нМ)
Человек 25 8.21 ± 1.19 Е+03 4.43 ± 0.65 Е-04 55. 3 ± 13.7
Макака-резус 6.60 ± 1.18 Е+03 3.78 + 0.45 Е-03 580 ±62.6
Мышь наблюдаемое связывание отсутствует
Человек 37 3/38Е+04 8/15Е-04 24/ 1
Макака-резус 1/89Е+04 1/85Е-02 977 /4
Мышь наблюдаемое связывание отсутствует
Дополнительно, для определения стехиометрических параметров связывания SABA1 и HSA было проведено калориметрическое титрование. Для данного исследования использовался вариант SABA1.1, представляющий собой коровую последовательность 1 домена 10Fn3, содержащую удлинение в виде 61 lis-'DiB (SEQ ID NO: 420 в табл. 6). HSA (10 мкл на впрыск раствора с концентрацией 115 мкМ) вводили в калориметрическую ячейку, содержавшую SABA1.1 в концентрации 8,1 мкМ. Данный эксперимент проводили при 37°С в PBS при рН 7.4. На фиг. 28 приведены данные, демонстрирующие 1:1 стехиометрию связывания SABA1.1 с HSA.
SABA1.2 активно связывается с HSA при низких значениях рН.
Длительное время полужизни альбуминов (например, t1/2 HSA составляет 19 дней) в большой степени связано с тем, что альбумины связываются с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) при низких значениях рН внутри эндосомы, что позволяет избежать деградации и приводит к возврату молекулы альбумина в кровоток. Данные в табл. 19 показывают, что вариант SABA1.2 активно связывался с HSA при значении рН5.5, совпадающим с рН в эндосоме, что позволяет предполагать, что t1/2 SABA, связанного с HSA, увеличится за счет рециркуляции молекулы при взаимодействии с FcRn.
Таблица 19. Сравнение кинетики связывания альбумина при рН 7.4 и 5.5 в буфере MES
Альбумин pH ka (1/Мс) kd (1/с) KD (нМ)
Человек 7.4 9.26 Е+03 3.88 Е-04 41.9
5.5 9.44 Е+03 2.70 Е-04 28.6
Макакарезус 7.4 6.16 Е+03 2.95 Е-03 479
5.5 7.57 Е+03 2.72 Е-03 359
SABA1.2 связывается с доменами I и II, но не III молекулы HSA.
Сайт связывания SABA1.2 на молекуле альбумина был картирован с использованием рекомбинантных фрагментов HSA. Сайт связывания расположен на конце доменов I или II, тогда как с доменом III связывание не детектируется (фиг. 29). Так как домен III молекулы HSA преимущественно участвует во взаимодействии с FcRn, вероятность конкуренции SAA1.2 при связывании HSA с FcRn невысока, что также повышает вероятность использования механизма рециркуляции за счет FcRn для повышения времени полужизни.
Пример 5G. Фармакология варианта SABA1.2 в исследовании in vivo.
Для оценки фармакокинетики и иммуногенности SABA1.2 на яванских макаках были проведены
- 140 036055 четырехнедельные предварительные токсикологические исследования, при которых SABA1.2 вводили однократно в 2 концентрациях. Также фармакокинетика и иммуногенность оценивалась в трехнедельных предварительных токсикологических исследованиях, включавших два варианта исследования, при которых белок вводили однократно внутривенно или подкожно. Также фармакокинетика SABA1.2 оценивалась в двух независимых предварительных токсикологических исследованиях при однократном введении белка на яванксих макаках. Детекция SABA1.2 в образцах плазмы проводилась с помощью разработанного количественного анализа на основе ИФА.
SABA1.2 вводили обезьянам в дозировках 1 мг/кг и 10 мг/кг внутривенно. Для оценки параметров фармакокинетики применялся некомпартментальный анализ с помощью программного обеспечения WINNONLIN®. Как показано на фиг. 30 и по приведенным ниже параметрам, фармакокинетика SABA1.2 в описанном исследовании имеет дозозависимый характер, что определяется по площади под кривой концентрация-время (AUC). Клиренс (CL) SABA1.2 при 10 мг/кг составлял 0,15 мл/ч/кг, бета фаза времени полужизни (t1/2) составляла 143 ч, объем распределения (Vz) составлял 30 мл/кг, общая экспозиция лекарственного вещества (AUCall) составляла 5 609 457 ч-нмоль/л (табл. 20). Клиренс (CL) SABA1.2 при 1 мг/кг составлял 0,4 мл/ч/кг, бета фаза времени полужизни (t1/2) составляла 124 ч, объем распределения (Vz) составлял 72 мл/кг, общая экспозиция лекарственного вещества (AUCall) составляла 214 636 ч-нмоль/л (табл. 20).
После подкожного или внутривенного введения SABA1.2 профили фармакокинетики бета-фазы были сходны (фиг. 31). Клиренс (CL) SABA1.2 при внутривенном введении 1 мг/кг составлял 0,22 мл/ч/кг, бета фаза времени полужизни (t1/2) составляла 125 ч, объем распределения (Vz) составлял 40 мл/кг, общая экспозиция лекарственного вещества (AUCall) составляла 357 993 ч-нмоль/л (табл. 20). Клиренс (CL) SABA1.2 при подкожном введении 1 мг/кг составлял 0,32 мл/ч/кг, бета фаза времени полужизни (t1/2) составляла 134 ч, объем распределения (Vz) составлял 62 мл/кг, общая экспозиция лекарственного вещества (AUCall) составляла 251 339 ч-нмоль/л (табл. 20). Относительная биодоступность (F) при подкожном введении по сравнению с внутривенным составляла 0,7.
Т аблица 20. Параметры фармакокинетики для SABA1.2 в исследованиях на , обезьянах
Исследовани е # 1 2
Доза (мг/кг) 1 10 1 1
Способ введения i.v. i.v. i.v. S.C.
N 3 5 1 2
CL (мл/ч/кг) 0.4 0.15 0.22 0.32
Vz (мл/кг) 72 30 40 62
AUCall (ч* нмоль/л) 214,63 6 5,609,4 57 357,99 3 251,33 9
beta Т1/2 (ч) 124 143 125 134
Биодоступно сть (F) н/д н/д н/д 0.7
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (22)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение полипептида, связывающего PCSK9 (пропротеин конвертазы субтилизин/кексин типа 9), для лечения атеросклероза или гиперхолистеринемии, где полипептид включает десятый домен типа III фибронектина человека (10Fn3), в котором петля FG содержит последовательность формулы EX4X1X5X1X1X6GYX4HR (SEQ ID NO: 451), где X1 представляет собой любую аминокислоту, Х4 представляет собой Y или F, Х5 представляет собой Y, F или W и X6 представляет собой S или А.
  2. 2. Применение по п.1, где указанный полипептид связывает PCSK9 с KD менее чем 500 нМ.
  3. 3. Применение по любому из пп.1 или 2, где петля FG содержит фрагмент любой из последовательностей SEQ ID NO: 28-38 и 142-172, который выделен затемнением в табл. 3.
  4. 4. Применение по любому из пп.1-3, где петля FG содержит любую из последовательностей SEQ ID NO: 28-38 и 142-172.
  5. 5. Применение по любому из пп.1-4, где полипептид дополнительно включает петлю BC, содержащую последовательность формулы (X1)ZX2G (SEQ ID NO: 449), в которой X1 представляет собой любую аминокислоту, Z представляет собой число от 6 до 9 и Х2 представляет собой Y или Н.
  6. 6. Применение по п.5, где петля BC содержит фрагмент любой из последовательностей SEQ ID NO: 2-17, 107-135 и 301-303, который выделен затемнением в табл. 3.
  7. 7. Применение по любому из пп.5 или 6, где петля BC содержит любую из последовательностей
    - 141 036055
    SEQ ID NO: 2-17, 107-135 и 301-303.
  8. 8. Применение по любому из пп.1-7, где полипептид дополнительно включает петлю DE, содержащую последовательность формулы Х|Х|Х|Х3 (SEQ ID NO: 450), в которой X1 представляет собой любую аминокислоту и X3 представляет собой G или S.
  9. 9. Применение по п.8, где петля DE содержит фрагмент любой из последовательностей SEQ ID NO: 18-27 и 136-141, который выделен затемнением в табл. 3.
  10. 10. Применение по любому из пп.8 или 9, где петля DE содержит любую из последовательностей SEQ ID NO: 18-27 и 136-141.
  11. 11. Применение по любому из пп.8 или 9, где последовательности петель BC, DE и FG по меньшей мере на 80% идентичны любым из последовательностей SEQ ID NO: 2-38, 107-172 и 301-303.
  12. 12. Применение по п.11, где последовательности петель BC, DE и FG по меньшей мере на 80% идентичны последовательностям SEQ ID NO: 14, 25 и 37 соответственно.
  13. 13. Применение по любому из пп.1-12, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 39-76, 173-290 и 304-309.
  14. 14. Применение по п.13, где полипептид содержит аминокислотную последовательность 10Fn3 домена, представляющую собой фрагмент 3-96 последовательности SEQ ID NO: 69.
  15. 15. Применение по п.11, где петля BC содержит последовательность SEQ ID NO: 14, петля DE содержит последовательность SEQ ID NO: 25 и петля FG содержит последовательность SEQ ID NO: 37.
  16. 16. Применение по п.1, где полипептид содержит SEQ ID NO: 82.
  17. 17. Применение по п.11, где петля BC содержит последовательность SEQ ID NO: 112, петля DE содержит последовательность SEQ ID NO: 138 и петля FG содержит последовательность SEQ ID NO: 156.
  18. 18. Применение по п.1, где полипептид содержит SEQ ID NO: 209, необязательно с удаленным His тэгом.
  19. 19. Применение по любому из пп.1-18, где полипептид дополнительно содержит одну или более фармакокинетических групп, выбранных из полиэтиленгликоля, сиаловой кислоты, Fc-фрагмента, части Fc-фрагмента, трансферрина, сывороточного альбумина, связывающего сывороточный альбумин белка и связывающего сывороточные иммуноглобулины белка.
  20. 20. Применение по п.19, где белок, связывающий сывороточный альбумин, содержит десятый домен типа III фибронектина человека (10Fn3).
  21. 21. Применение по п.20, где домен 10Fn3 связывает HSA.
  22. 22. Применение по п.21, где фармакокинетической группой является полиэтиленгликоль.
EA201590910A 2010-04-13 2011-04-13 Применение полипептида, связывающего pcsk9, для лечения атеросклероза или гиперхолистеринемии EA036055B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32356210P 2010-04-13 2010-04-13
US33073110P 2010-05-03 2010-05-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201590910A1 EA201590910A1 (ru) 2016-05-31
EA036055B1 true EA036055B1 (ru) 2020-09-21

Family

ID=44065227

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201270761A EA022983B1 (ru) 2010-04-13 2011-04-13 Белки на основе структурного домена фибронектина, связывающие pcsk9
EA201590910A EA036055B1 (ru) 2010-04-13 2011-04-13 Применение полипептида, связывающего pcsk9, для лечения атеросклероза или гиперхолистеринемии

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201270761A EA022983B1 (ru) 2010-04-13 2011-04-13 Белки на основе структурного домена фибронектина, связывающие pcsk9

Country Status (23)

Country Link
US (6) US8420098B2 (ru)
EP (2) EP3424949A1 (ru)
JP (4) JP5876034B2 (ru)
KR (1) KR20130056871A (ru)
CN (2) CN103068843B (ru)
AR (1) AR081454A1 (ru)
AU (1) AU2011240650A1 (ru)
BR (1) BR112012026216B1 (ru)
CA (1) CA2796338C (ru)
CL (1) CL2012002884A1 (ru)
DK (1) DK2558491T3 (ru)
EA (2) EA022983B1 (ru)
ES (1) ES2689875T3 (ru)
IL (1) IL222376A0 (ru)
MA (1) MA34209B1 (ru)
MX (3) MX2012011781A (ru)
PE (1) PE20130238A1 (ru)
SG (1) SG184220A1 (ru)
TN (1) TN2012000479A1 (ru)
TW (1) TW201141508A (ru)
UY (1) UY33331A (ru)
WO (1) WO2011130354A1 (ru)
ZA (1) ZA201208508B (ru)

Families Citing this family (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2552435A1 (en) 2003-12-05 2005-06-23 Compound Therapeutics, Inc. Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
EP2121743B1 (en) 2006-11-22 2015-06-03 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins for tyrosine kinases receptors, including igf-ir
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
AU2009213141A1 (en) 2008-02-14 2009-08-20 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins that bind EGFR
EP2291399B1 (en) 2008-05-22 2014-06-25 Bristol-Myers Squibb Company Multivalent fibronectin based scaffold domain proteins
TWI496582B (zh) 2008-11-24 2015-08-21 必治妥美雅史谷比公司 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子
BR112012026216B1 (pt) * 2010-04-13 2022-07-26 Bristol-Myers Squibb Company Proteínas com domínio "scaffold" baseado em fibronectina que se ligam à pcsk9, seu uso, bem como composição farmacêutica compreendendo as mesmas
TW201138808A (en) * 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
JP6023703B2 (ja) * 2010-05-26 2016-11-09 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 改善された安定性を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質
EP3144320B9 (en) 2011-04-13 2018-08-22 Bristol-Myers Squibb Company Fc fusion proteins comprising novel linkers or arrangements
EP2710382B1 (en) 2011-05-17 2017-10-18 Bristol-Myers Squibb Company Improved methods for the selection of binding proteins
WO2012158678A1 (en) 2011-05-17 2012-11-22 Bristol-Myers Squibb Company Methods for maintaining pegylation of polypeptides
WO2013067029A2 (en) 2011-10-31 2013-05-10 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin binding domains with reduced immunogenicity
US9603897B2 (en) 2012-03-12 2017-03-28 Massachusetts Institute Of Technology Methods for treating tissue damage associated with ischemia with apolipoprotein D
US9255154B2 (en) 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
WO2013177187A2 (en) 2012-05-22 2013-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with extended-pk il-2 and therapeutic agents
PL2895503T3 (pl) 2012-09-13 2019-09-30 Bristol-Myers Squibb Company Oparte na fibronektynie białka z domeną rusztowania, które wiążą się z miostatyną
US20150361159A1 (en) 2013-02-01 2015-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold proteins
WO2014124017A1 (en) 2013-02-06 2014-08-14 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin type iii domain proteins with enhanced solubility
EP3299378B1 (en) 2013-02-12 2019-07-31 Bristol-Myers Squibb Company High ph protein refolding methods
US20160152686A1 (en) * 2013-03-13 2016-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold domains linked to serum albumin or moiety binding thereto
US8883157B1 (en) 2013-12-17 2014-11-11 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US8986694B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Targeting human nav1.7 variants for treatment of pain
US9023359B1 (en) 2014-07-15 2015-05-05 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9051378B1 (en) 2014-07-15 2015-06-09 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US8992927B1 (en) 2014-07-15 2015-03-31 Kymab Limited Targeting human NAV1.7 variants for treatment of pain
US9045545B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision medicine by targeting PD-L1 variants for treatment of cancer
US9034332B1 (en) 2014-07-15 2015-05-19 Kymab Limited Precision medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9017678B1 (en) 2014-07-15 2015-04-28 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
US9045548B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision Medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US8945560B1 (en) 2014-07-15 2015-02-03 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
US9914769B2 (en) 2014-07-15 2018-03-13 Kymab Limited Precision medicine for cholesterol treatment
US9067998B1 (en) 2014-07-15 2015-06-30 Kymab Limited Targeting PD-1 variants for treatment of cancer
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
WO2015143156A1 (en) 2014-03-20 2015-09-24 Bristol-Myers Squibb Company Stabilized fibronectin based scaffold molecules
KR20220162886A (ko) 2014-03-20 2022-12-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 혈청 알부민-결합 피브로넥틴 유형 iii 도메인
US9150660B1 (en) 2014-07-15 2015-10-06 Kymab Limited Precision Medicine by targeting human NAV1.8 variants for treatment of pain
US9139648B1 (en) 2014-07-15 2015-09-22 Kymab Limited Precision medicine by targeting human NAV1.9 variants for treatment of pain
WO2016025645A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and an immune checkpoint blocker
JP6800141B2 (ja) 2014-08-12 2020-12-16 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー Ｉｌ−２およびインテグリン結合性ｆｃ融合タンパク質による相乗的な腫瘍処置
US10034892B2 (en) 2014-08-21 2018-07-31 Srx Cardio, Llc Composition and methods of use of small molecules as binding ligands for the modulation of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9(PCSK9) protein activity
SG11201703192SA (en) 2014-11-21 2017-05-30 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against cd73 and uses thereof
CA2969067A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Novel pd-l1 binding polypeptides for imaging
JP6894846B2 (ja) 2015-04-24 2021-06-30 ヴィーブ ヘルスケア ユーケー（ナンバー５）リミテッド Ｈｉｖ融合体を標的とするポリペプチド
US10584160B2 (en) * 2015-09-23 2020-03-10 Bristol-Myers Squibb Company Glypican-3-binding fibronectin based scaffold molecules
EP3708580B1 (en) * 2015-09-23 2023-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Fast-off rate serum albumin binding fibronectin type iii domains
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
EP3538140A1 (en) 2016-11-14 2019-09-18 Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) Methods and pharmaceutical compositions for modulating stem cells proliferation or differentiation
US10350266B2 (en) 2017-01-10 2019-07-16 Nodus Therapeutics, Inc. Method of treating cancer with a multiple integrin binding Fc fusion protein
WO2018132516A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 Nodus Therapeutics Combination tumor treatment with an integrin-binding-fc fusion protein and immune modulator
EP3684811A2 (en) 2017-08-17 2020-07-29 Massachusetts Institute of Technology Multiple specificity binders of cxc chemokines and uses thereof
AU2019219200A1 (en) 2018-02-12 2020-08-06 BioNTech SE Treatment using cytokine encoding RNA
KR20210010890A (ko) * 2018-05-16 2021-01-28 립 테라퓨틱스, 엘엘씨 Pcsk9 결합 분자를 포함하는 조성물 및 사용 방법
US20220275043A1 (en) 2018-07-17 2022-09-01 Massachusetts Institute Of Technology Soluble multimeric immunoglobulin-scaffold based fusion proteins and uses thereof
JP7550745B2 (ja) 2018-07-24 2024-09-13 バイオエヌテック エスエー Ｉｌ２アゴニスト
US20210278420A1 (en) 2018-09-05 2021-09-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating asthma and allergic diseases
JP7557882B2 (ja) 2018-09-28 2024-09-30 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー コラーゲンに局在化される免疫調節分子およびその方法
WO2020150473A2 (en) 2019-01-18 2020-07-23 Dogma Therapeutics, Inc. Pcsk9 inhibitors and methods of use thereof
WO2020154032A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Massachusetts Institute Of Technology Combination immunotherapy dosing regimen for immune checkpoint blockade
CA3129100A1 (en) 2019-02-08 2020-08-13 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Treatment involving car-engineered t cells and cytokines
BR112021016962A2 (pt) 2019-03-18 2021-11-23 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Variantes do receptor de interleucina-2 (il2r) e da interleucina-2 (il2) para ativação específica de células efetoras imunes
WO2020200481A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Treatment involving interleukin-2 (il2) and interferon (ifn)
EP3954725B1 (en) 2019-04-08 2024-03-06 Asahi Kasei Medical Co., Ltd. Polyamide medium for purifying protein-containing solution and method for producing polyamide medium
TW202115105A (zh) 2019-06-24 2021-04-16 德商拜恩迪克Ｒｎａ製藥有限公司 Ｉｌ２激動劑
WO2021058091A1 (en) 2019-09-24 2021-04-01 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Treatment involving therapeutic antibody and interleukin-2 (il2)
WO2021129927A1 (en) 2019-12-23 2021-07-01 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Treatment with immune effector cells engineered to express an antigen receptor
WO2021129945A1 (en) 2019-12-27 2021-07-01 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh In vitro and in vivo gene delivery to immune effector cells using nanoparticles functionalized with designed ankyrin repeat proteins (darpins)
CA3171370A1 (en) 2020-03-16 2021-09-23 Ugur Sahin Antigen-specific t cell receptors and t cell epitopes
WO2021197589A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 BioNTech SE Treatment involving non-immunogenic rna for antigen vaccination
IL296789A (en) 2020-03-31 2022-11-01 Repertoire Immune Medicines Inc Barcoded exchangeable peptide-mhc multimer libraries
WO2022087154A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Repertoire Immune Medicines, Inc. Mhc class ii peptide multimers and uses thereof
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
WO2022218891A2 (en) 2021-04-12 2022-10-20 BioNTech SE Rna compositions comprising a buffer substance and methods for preparing, storing and using the same
EP4326317A1 (en) 2021-04-20 2024-02-28 BioNTech SE Virus vaccine
CN112979762B (zh) * 2021-04-26 2021-07-27 中国医学科学院皮肤病医院(中国医学科学院皮肤病研究所) 环肽piz及其用途
WO2022255385A1 (ja) 2021-05-31 2022-12-08 国立大学法人群馬大学 超高分子量ポリエチレン製サブミクロン薄膜およびその製造方法
WO2023051926A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 BioNTech SE Treatment involving non-immunogenic rna for antigen vaccination and pd-1 axis binding antagonists
CA3235180A1 (en) 2021-10-21 2023-04-27 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2023067193A2 (en) 2021-10-22 2023-04-27 BioNTech SE Compositions for administration of different doses of rna
WO2023083434A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 BioNTech SE Rna encoding peptidoglycan hydrolase and use thereof for treating bacterial infection
WO2023126053A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 BioNTech SE Lipid-based formulations for administration of rna
WO2023165681A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 BioNTech SE Rna lipid nanoparticles (lnps) comprising a polyoxazoline and/or polyoxazine polymer
WO2023193892A1 (en) 2022-04-05 2023-10-12 BioNTech SE Nucleic acid compositions comprising an inorganic polyphosphate and methods for preparing, storing and using the same
WO2023196995A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Repertoire Immune Medicines, Inc. T cell receptor multimers and uses thereof
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024017479A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 BioNTech SE Multifunctional cells transiently expressing an immune receptor and one or more cytokines, their use and methods for their production
WO2024028325A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 BioNTech SE Nucleic acid compositions comprising amphiphilic oligo ethylene glycol (oeg)-conjugated compounds and methods of using such compounds and compositions
WO2024027910A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
WO2024028445A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
CN116425836B (zh) * 2022-12-16 2024-04-16 中国医学科学院皮肤病医院(中国医学科学院皮肤病研究所) A+多肽/蛋白质及其应用
WO2024153324A1 (en) 2023-01-18 2024-07-25 BioNTech SE Rna formulations for pharmaceutical use

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005056764A2 (en) * 2003-12-05 2005-06-23 Compound Therapeutics, Inc. Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
US20080057590A1 (en) * 2006-06-07 2008-03-06 Mickey Urdea Markers associated with arteriovascular events and methods of use thereof
WO2009142773A2 (en) * 2008-05-22 2009-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Multivalent fibronectin based scaffold domain proteins

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US5672502A (en) 1985-06-28 1997-09-30 Celltech Therapeutics Limited Animal cell culture
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US6048728A (en) 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
ATE196606T1 (de) 1992-11-13 2000-10-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörpern, die gegen ein differenzierung-antigen gerichtet sind, dessen expression auf menschliche b lymphozyt beschränkt ist, für die behandlung von b-zell-lymphoma
US6261804B1 (en) 1997-01-21 2001-07-17 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
WO1998031700A1 (en) 1997-01-21 1998-07-23 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
EP0985039B1 (en) * 1997-06-12 2008-02-20 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US20050287153A1 (en) 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
CA2404528A1 (en) 2000-03-31 2001-10-04 Institut Pasteur Peptides blocking vascular endothelial growth factor (vegf)-mediated angiogenesis, polynucleotides encoding said peptides and methods of use thereof
JP4578768B2 (ja) 2000-07-11 2010-11-10 リサーチ コーポレイション テクノロジーズ，インコーポレイテッド 人工抗体ポリペプチド
US6927762B2 (en) 2002-04-01 2005-08-09 Aiptek International Inc. Application specific integrated circuit (ASIC) of the electromagnetic-induction system
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
ES2551682T3 (es) 2002-11-08 2015-11-23 Ablynx N.V. Anticuerpos de dominio simple dirigidos contra factor de necrosis tumoral-alfa y usos para los mismos
WO2004085505A2 (en) * 2003-03-24 2004-10-07 Sequoia Pharmaceuticals, Inc. Long acting biologically active conjugates
EP1729795B1 (en) 2004-02-09 2016-02-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20070269422A1 (en) 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
CA2668131A1 (en) * 2006-11-07 2008-05-15 Merck & Co., Inc. Antagonists of pcsk9
EP2121743B1 (en) 2006-11-22 2015-06-03 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins for tyrosine kinases receptors, including igf-ir
EP2137218A2 (en) 2007-04-13 2009-12-30 Novartis Ag Molecules and methods for modulating proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (pcsk9)
BRPI0821924A2 (pt) 2007-12-27 2015-07-07 Novartis Ag Moléculas de ligação baseadas em fibronectina melhoradas e seu uso
AU2009213141A1 (en) * 2008-02-14 2009-08-20 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins that bind EGFR
EP2274331B1 (en) 2008-05-02 2013-11-06 Novartis AG Improved fibronectin-based binding molecules and uses thereof
TWI445716B (zh) * 2008-09-12 2014-07-21 Rinat Neuroscience Corp Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
BR112012026216B1 (pt) * 2010-04-13 2022-07-26 Bristol-Myers Squibb Company Proteínas com domínio "scaffold" baseado em fibronectina que se ligam à pcsk9, seu uso, bem como composição farmacêutica compreendendo as mesmas
EP3144320B9 (en) * 2011-04-13 2018-08-22 Bristol-Myers Squibb Company Fc fusion proteins comprising novel linkers or arrangements

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005056764A2 (en) * 2003-12-05 2005-06-23 Compound Therapeutics, Inc. Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
US20080057590A1 (en) * 2006-06-07 2008-03-06 Mickey Urdea Markers associated with arteriovascular events and methods of use thereof
WO2009142773A2 (en) * 2008-05-22 2009-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Multivalent fibronectin based scaffold domain proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LOPEZ D. "Inhibition of PCSK9 as a novel strategy for the treatment of hypercholesterolemia", Drug News Perspect, 2008, 21(6):pp. 323-330 (реферат) [он-лайн] [найдено 25.01.2016], Найдено из PubMed, PMID:18836590 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2011240650A1 (en) 2012-11-29
JP5876034B2 (ja) 2016-03-02
EP3424949A1 (en) 2019-01-09
CL2012002884A1 (es) 2013-04-01
JP2013531613A (ja) 2013-08-08
EP2558491A1 (en) 2013-02-20
AR081454A1 (es) 2012-09-05
CN105175532B (zh) 2023-01-17
US20130210703A1 (en) 2013-08-15
SG184220A1 (en) 2012-11-29
EA201590910A1 (ru) 2016-05-31
JP2016104792A (ja) 2016-06-09
US20160159883A1 (en) 2016-06-09
IL222376A0 (en) 2012-12-31
PE20130238A1 (es) 2013-03-11
CN105175532A (zh) 2015-12-23
TW201141508A (en) 2011-12-01
BR112012026216A2 (pt) 2020-09-01
US20240239870A1 (en) 2024-07-18
CN103068843A (zh) 2013-04-24
MX2019001095A (es) 2019-07-04
JP2021091702A (ja) 2021-06-17
UY33331A (es) 2011-10-31
US11858979B2 (en) 2024-01-02
TN2012000479A1 (en) 2014-04-01
WO2011130354A1 (en) 2011-10-20
EP2558491B1 (en) 2018-07-04
ZA201208508B (en) 2014-04-30
US9856309B2 (en) 2018-01-02
US8420098B2 (en) 2013-04-16
DK2558491T3 (en) 2018-10-15
EA022983B1 (ru) 2016-04-29
JP2019073514A (ja) 2019-05-16
MX2012011781A (es) 2012-11-16
US20120094909A1 (en) 2012-04-19
US20180201665A1 (en) 2018-07-19
BR112012026216B1 (pt) 2022-07-26
US10947297B2 (en) 2021-03-16
US9234027B2 (en) 2016-01-12
CA2796338A1 (en) 2011-10-20
KR20130056871A (ko) 2013-05-30
MX362632B (es) 2019-01-29
ES2689875T3 (es) 2018-11-16
CA2796338C (en) 2020-03-24
MA34209B1 (fr) 2013-05-02
US20210277089A1 (en) 2021-09-09
CN103068843B (zh) 2015-09-09
EA201270761A1 (ru) 2013-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11858979B2 (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind PCSK9
US9714281B2 (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind IL-23
JP6040464B2 (ja) 作用持続期間が増大し、免疫原性が減少した操作されたポリペプチド
CN106687478B (zh) 新的抗人Tie-2抗体
WO2011150133A2 (en) Fibronectin based scaffold proteins having improved stability
JP6738340B2 (ja) 新規なｅｇｆｒ結合タンパク質
EA044608B1 (ru) Белки на основе структурного домена фибронектина, связывающие pcsk9