JP6738340B2 - 新規なegfr結合タンパク質 - Google Patents
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Description
「タンパク質」と「ポリペプチド」の用語は、ペプチド結合によって結合された2またはそれ以上のアミノ酸鎖を意味し、製品の特定の長さを意味するものではない。したがって、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、あるいは2またはそれ以上のアミノ酸鎖を意味するのに使用したその他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語に代えてあるいは置き換えて使用することができる。用語「ポリペプチド」は、また、ポリペプチドの翻訳後修飾製品を意味することもある。これは、限定することなく、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、タンパク質分解的切断、非自然発生アミノ酸、及びこの分野でよく知られている同様の修飾を含む。したがって、2またはそれ以上のタンパク質部分を含む結合タンパク質も、用語「タンパク質」又は「ポリペプチド」の定義に含まれる。
本発明に係るEGFR結合タンパク質は、上皮細胞成長因子受容体(EGFR)に対して700nMより小さい結合親和性(KD)を有するユビキチン変異タンパク質を含んでおり、このユビキチン変異タンパク質は、ユビキチン(配列番号:1)に対して80%乃至93%の相同性を、あるいは配列番号:4のユビキチンダイマーに対して80%乃至93%相同性を示し、64位のアミノ酸がP、V、及びAから選択され、65位のアミノ酸は、D及びEから選択され、66位のアミノ酸は、I、V、A、M、F、Y、W、及びLから選択される。好ましくは、64位、65位、及び66位のアミノ酸配列は、アミノ酸P、D、及びIから、あるいはアミノ酸V、D、及びIから、あるいは、アミノ酸A、D、及びIから、あるいはアミノ酸V、D、及びVから、あるいはアミノ酸P、D及びVから、選択される。本発明によるEGFR結合タンパク質は、上皮細胞成長因子(EGFR)に対して700nMより小さい結合親和性(KD)を有するユビキチン変異タンパク質を含み、このユビキチン変異タンパク質は、野生型アミノ酸配列QKESTに比べて、アミノ酸配列を含み、配列番号:3のX62、X63、X64、X65、及びX66に対応するアミノ酸62−66から選択された3つのアミノ酸が、置換されており、ユビキチン変異タンパク質は、配列番号:3に対して少なくとも90%の配列相同性を有する。
上述した通り、本発明の結合分子は、一またはそれ以上の修飾ユビキチンサブユニットを含んでいてもよく、及び/又は、その他の融合タンパク質部分に遺伝子学的に融合してもよい。このような本発明の融合タンパク質のコンテキストでは、用語「リンカー」は、単一アミノ酸または、少なくとも二つのその他のタンパク質分子に共有結合したポリペプチドを意味する。
上皮細胞成長因子受容体(EGFR:別名HER1又はErbB1)は、上皮細胞成長因子ファミリ(EGF−ファミリ)の員に対する細胞表面受容体である。(NCBI参照番号:NP_005219)。EGFRは、肺がん、頭部及び頸部がん、大腸がんでの役割で知られている。用語「上皮細胞成長因子受容体」又は「EGFR」は、NP_005219に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、又は97%又はそれ以上、あるいは100%の配列相同性を示すすべてのポリペプチドを含み、EGFRの機能を有する。用語「EGFR」は、N−末端メチオニン、融合ポリペプチド、及び、種間相同性の追加を含む、対立遺伝子多型、スプライス変異体、誘導変異体、置換変異体、欠損変異体、及び/又は、挿入変異体に関連するポリペプチドを含む。イソフォームについては、例えば、本明細書に引用により組み込まれているAlbitar et al. Molecular Cancer 2010, 9: 166を参照されたい。特に、用語「EGFR」は、EGFRのクラスIII変異体(EGFRvIII)(エキゾン2−7の欠損、アミノ酸5−274の欠損、Wikstrand et al., J NeuroViro 1998, 4: 148-158参照)を含む。本明細書で理解されている用語「EGFR」は、また、EGFRクラスI、クラスII、クラスIV、クラスV、クラスVI、及びクラスVII突然変異体及びその異形を含む。(Wikstrand et al., supra参照)。EGFRポリペプチドは、タグ残基、シグナルペプチド配列残基、ターゲット残基、アミノ末端メチオニン残基、リシン残基などの末端残基を含んでいてもよい。EGFRへの参照は、異形、イソフォーム、及びヒトEGFRの種同族体を含む。用語EGFRはまた、天然の突然変異型を含む(例えば、Humphrey et al. PNAS(USA)87:4207-4211参照)。「EGFR」は、天然配列EGFRであってもよく、そのアミノ酸配列異形であってもよい。成熟EGFRの細胞外部分は、621のアミノ酸と4つの受容体ドメインからなる。ドメインIは、残基1−165に及び、ドメインIIは残基166−312に、ドメインIIIは残基313−481に、及びドメインIVは残基482−621に及ぶ(例えば、Cochran et al. (2004)J.Immunol. Methods, 287, 147-158参照)。
64位、65位、及び66位に特異的3−アミノ酸配列モチーフを有するEGFR結合タンパク質の多くの例が本発明で提供されている(例えば、配列番号:8−73及び113−114を参照)。本発明のEGFR結合Affilin分子は、測定可能な結合親和性のあるEGFRに自然には結合しない非修飾ユビキチンに比べて、700nMより小さい測定可能な結合親和性のあるEGFRの単離した細胞外ドメインに結合する。好ましいEGFR結合分子には、ユビキチン(配列番号:1)に対して80%乃至93%、配列番号:4のユビキチン−ダイマーに80%乃至93%の相同性を持つユビキチン変異タンパク質があり、ここで、64位のアミノ酸は、P、V、及びAから選択され、65位のアミノ酸は、D及びEから選択され、66位のアミノ酸は、I、V、A、M、F、Y、W及びLから選択される。領域62−68内の部分のC−末端部分で少なくとも5個のアミノ酸が置換されているユビキチン変異タンパク質では、これらのアミノ酸のうち3つのアミノ酸が特異的「PDI」モチーフを示す。好ましくは、64位、65位、及び66位におけるアミノ酸配列は、PDI、VDI、ADI、PDV、又はVDVから選択される(例えば、図1参照)。EGFR結合タンパク質の特定の例は、アミノ酸残基V、D及びIを有するAffilin139820(結合カートリッジ(PWYGYD)TTVDI及び更なる一つの交換123T;配列番号:113)、アミノ酸残基A、D及びIを有するAffilin139754;アミノ酸残基V、D及びVを有するAffilin139791;及び、アミノ酸残基P、D及びVを有するAffilin144747(結合カートリッジ(DDKGYD)QNPDV及び更なる一つの交換K6N;配列番号:114)である。EGFR結合タンパク質は、更なる置換と選択的に2−10のアミノ酸の挿入がある、更なるアミノ酸修飾をしたユビキチン変異タンパク質を含む。本発明の一実施例では、EGFRに対する測定可能な結合親和性を作るために、配列番号:1の8位乃至11位に対応するループ領域における2−10のアミノ酸の挿入と組み合わせて、ユビキチンが、配列番号:1の62位、63位、64位、65位、66位に対応する5つのアミノ酸において少なくとも置換されている。いくつかの実施例では、ユビキチン変異タンパク質は、64位、65及び66位の置換と更なる修飾に加えて、好ましくはN−末端部分の第1ループ内の天然ループ領域内にアミノ酸の挿入を含む。ユビキチンに基づく好ましいEGFR結合タンパク質は、配列番号:1又は配列番号:2のアミノ酸領域62−66が、配列番号:1に対応するユビキチン変異タンパク質の天然ループ領域、好ましくは領域8−11、より好ましくは9位及び10位の間における2−10のアミノ酸、好ましくは4−8のアミノ酸、より好ましくは6のアミノ酸の挿入と組み合わせて、置換されている。2−10のアミノ酸長の挿入は、好ましくは配列番号:1の9位−10位である。配列番号:8−52に例示されている。これらの配列は、ユビキチン(配列番号:1)に80%乃至93%の相同性を示し、好ましくは89%乃至92%の相同性を示す。特に、配列番号:9−24、26−28,30−32、35−50、及び52は、配列番号:1に92%の相同性を示し、配列番号:25、29、34、51及び53は、配列番号:1に91%の相同性を示し、配列番号:33は、配列番号:1に89%の相同性を示す。(この挿入は、一の差異としてカウントされ、45位、75位、76位の相同は上述の定義にしたがって考慮されていない。)
本発明は、上皮細胞成長因子受容体(EGFR)の細胞外ドメインに対して700nMより小さい結合親和性(KD)を有するユビキチン変異タンパク質を含むEGFR結合タンパク質を提供するものであり、このユビキチン変異タンパク質は、アミノ酸配列QKESTに比較してユビキチンのアミノ酸62乃至66(配列番号:3のX62、X63、X64、X65、及びX66に対応)から選択された3つのアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含み、このユビキチン変異タンパク質はユビキチン(配列番号:1)に対してあるいはジユビキチン(配列番号:4)に対して80%乃至93%、あるいは配列番号:3に対し少なくとも90%の配列相同性を有する。ここで、ユビキチンの62位及び63位(X62及びX63)は、アミノ酸で置換されていてもよく、ユビキチンの64位(X64)はP、V、及びAから選択されたアミノ酸で置換されており、ユビキチンの65位(X65)は、D及びEから選択されたアミノ酸で置換されており、ユビキチンの66位(X66)はI、V、A、M、F、Y、W、及びLから選択されたアミノ酸で置換されている。好ましくは、ユビキチンの64位、65位、66位(X64、X65、及びX66)は、P、D、及びI、又はV、D、及びI、又はA、D、及びI、又はV、D、及びV、又はP、D及びVから選択されたアミノ酸で置換されている。
EGFR結合ユビキチン変異タンパク質のさらなる特性化は、可溶性タンパク質の形で行うことができる。適切な方法は、この分野の当業者に公知であり、文献に記載されている。単離した異型の親和性と特異性はこの分野で当業者に公知であり、上述したように、また例示したように、生化学的標準的方法によって検出できる。安定性の分析のために、例えば、化学的又は物理的変性と組み合わせた分光あるいは蛍光ベースの方法が当業者に知られている。EGFR結合タンパク質の特性化の例示的方法が上記に説明されており、本発明の実施例の部分において概要が述べられている。
更なる実施例においては、本発明のEGFR結合タンパク質は、ターゲット特異性が同じあるいは異なる、及び/又は、EGFRの同じ又は異なるエピトープに結合する、少なくとも二つのユビキチン変異タンパク質(Affilinタンパク質)を含む。図9−12に例が挙げられている。
本発明の結合タンパク質は、また、モノクローナル抗体又はその断片、又は第2のAffilin分子を含む又はこれからなる第2結合タンパク質を含む。一実施例では、第2の結合タンパク質はEGFRに対して特異性を持つ抗体である。
本発明の一実施例は、ユビキチン変異タンパク質とさらに少なくとも一の追加のタンパク質又は分子を含む本発明のEGFR結合タンパク質に及ぶ。追加のタンパク質は第1結合タンパク質としての抗原に対して同じ又は異なる特異性を有するユビキチン変異タンパク質(Affilin)である。更なる実施例では、本発明の結合タンパク質は、第3の結合タンパク質を含み、この第3の結合タンパク質は、第1のタンパク質と同じ又はこれと異なるエピトープに対して700nMより小さい特異的結合親和性を有するユビキチン変異タンパク質であり、このユビキチン変異タンパク質は例えば、配列番号:1によって規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列相同性を有し、第3の結合タンパク質が、第2の結合タンパク質(モノクローナル抗体)の第1の結合タンパク質と異なる末端に、あるいは、第1の結合タンパク質のN−末端又はC−末端にリンクしている。
実施例として、突然変異生成の開始点は、例えば、配列番号:1−4によるユビキチンのcDNA又はゲノムDNAである。さらに、このユビキチンタンパク質の遺伝子コードは、合成により作成できる。配列番号:1−4のユビキチンのDNAをこの分野で当業者に知られた方法によって作成し、変性させ、及び増幅することができる。部位特定突然変異生成法、ランダム突然変異生成法、PCRを用いた突然変異生成、あるいは同様の方法といった、公知の様々な方法自体を突然変異生成に使用できる。これらの方法はすべて当業者に知られている。本発明の好ましい実施例では、突然変異生成のためのアミノ酸の位置を決定する。それぞれの場合において、様々な突然変異体のライブラリが設定され、公知の方法を用いて検査される。一般的に、修飾すべきアミノ酸の予選択は、修飾すべきユビキチンタンパク質について入手可能な構造的情報に基づいて行うことができる。ランダム化する様ざまなアミノ酸セットの選択が、様々なライブラリにつながる。
上述したように取得された遺伝子プールライブラリは、ディスプレイ法などの選択方法用のタンパク質の発現を可能にする適宜の機能遺伝要素と組み合わせることができる。本発明によれば、発現したタンパク質はターゲット分子と接触して、結合親和性があれば、パートナーとの互いに対する結合が可能である。このプロセスにより、ターゲット分子に対する結合活性を有するユビキチン変異タンパク質の同定が可能である。選択方法の更なる詳細については、例えば、WO2011/073214、WO2011/073208、WO2011/073209を参照されたい。WO2011/073214、WO2011/073208、WO2011/073209の内容は、本明細書に引用により組み込まれている。
本発明のEGFR結合分子は、単純な有機合成戦略、固相支援合成技術、又は商業的に入手可能な自動合成器といった、数多くの従来公知の技術で作成できる。一方で、この分子は、従来の遺伝子組み換え技術単独で、あるいは、従来の合成技術と組み合わせて作成することもできる。本発明に係るコンジュゲートは、上述したように、例えば、リシン又はシステインベースの化学的性質などの、化学的方法で取得できる。
本発明の結合タンパク質の更なる特性化は、単離した可溶性タンパク質の形で実行できる。適切な方法は、この分野の当業者に公知であるか、文献に記載されている。このような方法は、タンパク質の物理的、生物物理学的、機能的特性の決定を行う。単離した変異体の親和性と特異性は、この分野の当業者に公知であり、上記に述べるとともに実施例に述べた、SPR分析、又はELISAといった生化学の標準的方法によって検出できる。安定性の分析には、例えば、化学的又は物理的方法と共に、例えば差走査型蛍光定量法(DSF)を含む、分光又は蛍光ベースの方法がこの分野の当業者に知られている。機能特性化は、適宜の細胞ベースのアッセイ又はインビボでの実験において実行することができる。結合タンパク質の特性化の例示的方法は、上述するとともに、本発明の実施例に概略が示されている。
本発明の更なる態様では、EGFR結合ユビキチン変異タンパク質又は融合タンパク質又はコンジュゲートを、医薬、特に、がんの医薬的治療又は診断法に使用する。
本発明の更なる理解のために以下に実施例を提供する。本発明は、特に、EGFRに結合するユビキチンの特定の修飾を例示する。しかしながら、本発明はこの例に限定されるものではなく、以下の実施例は単に、上述の記載に基づいて本発明の実行可能性を示すものである。本発明を完全に開示するために、この出願に引用により全体が組み込まれている本出願に記載した文献を参照する。
ターゲット:遺伝子組み換えヒトEGFR−FcキメラをR&D Systems 社から購入した(カタログNo.344−ER−050)。ヒトEGFR(NP_005219)の細胞外ドメイン(Met 1 - Ser 645)をコード化するDNA配列を、C−末端におけるヒトIgG1のFc領域と融合させた。
8Mの尿素を加えることによってペレットからタンパク質を回収した。浮遊物と再懸濁したペレットをNuPage Novex 4−12%Bis-Tris SDS gelによって分析し、Coomassieで染色した。すべてのAffilinタンパク質は可溶性であった。例えば、Affilin139819は高い可溶性を示した(100%の可溶性発現)。
本発明の結合タンパク質の熱安定性を、示差走査型蛍光定量法によって測定した。各プローブは、濃度0.1μg/μLで、MicroAmp(登録商標)Optical 384−ウエルプレートへ移し、SYPRO Orange 染料を適当に希釈して加えた。25乃至95℃の温度勾配を、分あたり1℃の加熱速度でプログラムした(ViiA-7 Applied Biosystems)。520nmの励起波長と623nmの放射波長でコンスタントに測定した(ViiA-7 Applied Biosystems)。熱変性の遷移中点(Tm、融点)が、図1に選択された変異体について示されている。本発明の抗−EGFRAffilinタンパク質は、約60℃乃至80℃の温度範囲においてタンパク質の変性(熱安定性)について計算された熱遷移点を有する。抗−EGFR Affilinとモノクローナル抗体を含む融合タンパク質は、同様の融点(65−69℃)を示す。同様の融点は、関連するタンパク質の構造に相関する。すべての抗−EGFR Affilinタンパク質は、同様の溶融温度である。すべての結合タンパク質の安定性は、コントロールタンパク質の安定性に比較可能である。
CM5センサーチップ(GE Healthcare)を、SPR駆動バッファと平衡させた。表面に露出したカルボン酸基を、EDCとNHSの混合物を通過させて活性化して、反応エステル基を精製した。700−1500RU EGFR−Fc(オンリガンド)をフローセルに固定して、IgG−Fc(オフリガンド)を、ターゲット(hlgG−Fc:ターゲット)に対して1:3の比率で別のフローセルに固定した。リガンドを固定した後、エタノールアミンを注入して、非共有結合リガンドを除去した。リガンドが結合すると、被検査タンパク質が表面上にたまって、屈折率が高くなる。この屈折率の変化をリアルタイムで測定し、応答あるいは共鳴ユニット(RU)対時間としてプロットした。この検査対象を、流速30μl/分で一連の希釈液中でチップに適用した。30秒間会合が行われ、60秒間分離が行われた。各手順の後、30μlの再生バッファでチップ表面を再生し、稼働バッファと平衡させた。希釈系列のセツキシマブが陽性コントロールとして作用し、希釈系列の非修飾ユビキチンは陰性コントロールを意味する。コントロールサンプルを流速30μl/分でマトリックスに当て、60秒間会合させて、120秒間分離した。遺伝子組み換えと再平衡を上述した通り行った。結合の観察を、Biacore(登録商標)3000(GE Healthcare)を使用して行った。製造業者によって提供されたBlAevaluation 3.0 softwareを介して、Langmuir 1:1 model (RI=0)を使用して、データ評価を行った。EGFRに対する結合の結果を図1に示す。評価したかい離定数(KD)をオフターゲットに対して標準化して、表示した。試験を行ったすべての抗−EGFR Affilinタンパク質が、高い親和性でEGFRに結合した。PDIモチーフ(配列番号:77)のないクローン138840は、EGFRへの結合親和性を示さない。
フローサイトメトリーを使用して、抗−EGFR Affilinタンパク質と表面露出EGFRとの相互作用を分析した。EGFR過剰発現CHO−K1細胞と空(empty)ベクターコントロールCHO−K1細胞を用いた。抗−EGFRモノクローナル抗体セツキシマブを陽性コントロールとして用いた。結果を図2にまとめた。
細胞を培地フラスコの底から取り出して、あらかじめ冷却したFACSブロックバッファで希釈し、細胞懸濁液の希釈物を作成して細胞を染色した。細胞の数を測定すると、細胞が1×106細胞/mlに調整された。次いで、希釈した細胞懸濁液を96ウエルプレート(Greiner)に移して、各細胞ラインにつき3つ作成した。
抗EGFR抗体が結合するエピトープについて説明した。例えば、Freeman et al. 2008, Journal of Clinical Oncol., 26:14536参照。セツキシマブで認識された立体配座エピトープは、EGFRのドメインIIIの大きな表面に及ぶ(例えば、Li et al, 2005, Cancer Cell 7:301-311及びChao et al., 2004, J Mol Biol. 342:539-550参照)。セツキシマブと異なるEGFRエピトープに結合するAffilin分子は、所定の医療例に有益である。単離した抗EGFRAffilin変異体が、認識された抗EGFR抗体セツキシマブと競合するかどうかを調べるために、以下のアッセイを行った。EGFR(例えば、His−tagを有するEGFRの細胞外ドメイン:Acrobiosystems)を、NHS/EDCの性質を使用して、CM5Biacoreチップ上に固定して、1000の反応単位(RU)とした。第1実施例では、全てのAffilin分子を(139819と142205)を、規定した濃度(2.5μM)、流速30μl/分で、PBST0.005%Tween20に注入した(図5、実線)。第2の実験では、同じフローチャネルに、まず、セツキシマブ(200nM)を、チップ表面が飽和するまであらかじめ装填した。セツキシマブを装填したのち、実施例1と同じように、変異体を適用した(2.5μM、図5、破線)。より明確にするために、両方のセンサーグラムのトレースを、最後の注入したAffilinで整列させた。
本発明の様々な濃度の結合タンパク質を、MDA−MB231腫瘍組織片上のEGFR結合と比較した。厚さ6μmの組織片は、よく冷やした絶対アセトンに固定した。5%のウマ血清でブロックしたのち、組織片を500nM又は100nMのAffilin138819(配列番号:71)、Affilin138838(配列番号:69)、Affilin138840(配列番号:77、PDIモチーフなし)、及びAffilin138845(配列番号:73)、でインキュベートした。また、コントロールとして非修飾ユビキチン(配列番号:7)でインキュベートした。結合タンパク質を、ウサギ抗−Strep Tag−抗体と、抗−ウサギ−IgG-Alexa488を用いて検出した。図6に示すように、EGFRへのAffilinタンパク質結合はすべてヒト腫瘍組織に発現し、特に、PDIモチーフのあるAffilinタンパク質は、EGFRへの強い結合を示す。
A431細胞は、類表皮がん由来であり、高いEGFR発現レベルで知られている。A431細胞は、Lab-Tek(登録商標)Chamber Slides (Sigma-Aldrich)で播種され、37℃、5%CO2で2日間インキュベートした。3%のパラホルムアルデヒドを用いて、RTで10分間、細胞を固定し、PBSで洗浄し、次いで、ブロック溶液(BS,3%BSA+0.1%Triton-X100)を用いて、4℃で30分間ブロックした。次いで、細胞を500nMの結合タンパク質(Affilineタンパク質139791、139819、139989、142232、142265)、あるいはコントロールとしての10nMのセツキシマブで、4℃で1時間インキュベートした。非修飾ユビキチン(図7では139090、配列番号:4)が、陰性コントロールとして作用した。PBS細胞で洗浄したのち、細胞をウサギ抗−Strep−抗体(1:500)で4℃で1時間インキュベートした。次いで、ロバ抗−ウサギAlexa488(1:1000)又は、ヤギ抗−ヒトAlexa594(1:1000)の二次抗体でインキュベートし、続いて、細胞核をDAPIで視覚化した。チャンバースライドを解体して、ガラススライドをMowiolとカバーガラスで覆った。細胞をZeiss Axio Scope.A1顕微鏡で撮像し、標準的なソフトウェアパッケージを使って画像を処理した。
EGFR−Affilin139819(配列番号:39)(又は、非修飾ジユビキチン、配列番号:4)を、抗EGFR抗体セツキシマブの軽鎖又は重鎖のC−末端又はN−末端にリンクさせた。配列番号:86−89及び107−110の最初の20までのアミノ酸をシグナル配列とする。セツキシマブをエンコードするcDNAあるいは融合タンパク質を、FreeStyle(登録商標)293-F細胞に一時的に導入して、血清−フリー/動物性分フリー媒体中で発現させた。発現を、Western Blot分析法によって確認した。融合タンパク質をProtein A 親和性クロマトグラフィー(GE-Healthcare cat no 17-0402-01)によって、AKTAxpress(登録商標)(GE Healthcare)を用いて上澄みから生成した。ゲルフィルタレーションで融合タンパク質の更なる精製を行った。更なる分析には、SDS-PAGE、SE-HPLC、及びRP-HPLCが含まれる。結合の調査は、上述し、図8に示すBiacore(登録商標)3000 (GE-Healthcare)を使用して行った。さらに、CHO−K1細胞に発現したヒトEGFRへの融合タンパク質結合のFACS分析を表1に示す。
EGFR−Affilin139819のホモ−二量体(配列番号:39)を実施例1に記載したように発現させ;Western Blot分析法によってこの発現を確認した。ホモ−二量体を、Protein A親和性クロマトグラフィー(GE-Helthcare cat no 17-0402-01)によって、AKTAxpress(GE Healthcare)を用いて精製した。融合タンパク質の更なる精製を、ゲルフィルタレーションによって行った(Superdex 75 16/600)。更なる分析には、上述したように、SDS-PAGE、SE-HPLC、及びRP-HPLCが含まれる。結合の調査は、上述し、図11に示すようにBiacore3000 (GE Healthcare)を使用して行った。さらに、CHO−K1細胞又はA549細胞に発現したヒトEGFRへのホモ−二量体結合のFACS分析を図12A−Dに示す。ホモ−二量体の親和性はAffilin139819より10フォールド高い。
EGFR−Affilin139791(配列番号:49)とEGFR−Affilin139819(配列番号:39)のヘテロ−二量体融合タンパク質を実施例1に記載したようにして発現させた。発現をWestern Blot分析法で確認した。ホモ−二量体を、上述したようにProtein A親和性クロマトグラフィーとゲルフィルタレーションで精製した。更なる分析には、SDS-PAGE、SE-HPLC、及びRP-HPLCが含まれる。結合の調査は、上述し、表2に示すように、Biacore(登録商標)3000 (GE Healthcare)を使用して行った。
Claims (16)
- ユビキチン変異タンパク質を含む上皮細胞成長因子受容体(EGFR)結合タンパク質であって、前記ユビキチン変異タンパク質が、
(a)PDI、VDV、及びADIから選択される、ユビキチン(配列番号:1)又はジユビキチン(配列番号:4)の64位、65位、及び66位に対応する位置の3アミノ酸残基モチーフ;
(b)R、Q、H、G、S、T、V、及びIから選択される、62位に対応するアミノ酸;
(c)N、H、A、S、R、E、T、及びQから選択される、63位に対応するアミノ酸;
(d)配列番号:1に対して、又は配列番号:4に対して80%乃至93%の配列相同性;および
(e)EGFRに対して700nM未満の結合親和性(K D )
を有することを特徴とするEGFR結合タンパク質。 - 請求項1に記載のEGFR結合タンパク質において、更なるアミノ酸修飾が、さらに置換、及び選択的に2−10のアミノ酸の挿入を含むことを特徴とするEGFR結合タンパク質。
- 請求項1又は2に記載のEGFR結合タンパク質において、前記EGFR結合タンパク質が、抗−EGFRモノクローナル抗体セツキシマブと異なるEGFRエピトープに結合することを特徴とするEGFR結合タンパク質。
- 請求項1乃至3のいずれか1項に記載のEGFR結合タンパク質において、前記EGFR結合タンパク質が、同じ若しくは異なる標的特異性の、及び/又はEGFRの同じ若しくは異なるエピトープへ結合する、少なくとも二つのユビキチン変異タンパク質を含むことを特徴とするEGFR結合タンパク質。
- 請求項1乃至4のいずれか1項に記載のEGFR結合タンパク質において、前記EGFR結合タンパク質が、ペプチドリンカーで結合された二つの同一のあるいは二つの異なるユビキチン変異タンパク質の融合タンパク質を含むことを特徴とするEGFR結合タンパク質。
- 請求項1乃至5のいずれか1項に記載のEGFR結合タンパク質において、前記ユビキチン変異タンパク質が、RNPDI、QNPDI、RHPDI、QHPDI、QAPDI、QQPDI、GEPDI、GHPDI、IHADI、HHPDI、RRVDV、SAPDI、SHPDI、THPDI、TSPDI、VNPDI、及びQSPDIから選択される、62位、63位、64位、65位、及び66位に対応する位置のアミノ酸配列モチーフを有することを特徴とするEGFR結合タンパク質。
- 請求項1乃至6のいずれか1項に記載のEGFR結合タンパク質において、前記ユビキチン変異タンパク質が、配列番号:8−73からなる群の少なくとも一の員から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするEGFR結合タンパク質。
- 請求項1乃至7のいずれか1項に記載のEGFR結合タンパク質が、さらに(i)ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、抗ヒト血清アルブミン、アルブミン−結合ペプチド、ランダムコイルを形成するポリマー配列、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン断片、又はポリサッカライド、から選択される血清半減期を調節する薬物動態部分;及び(ii)選択的に、モノクローナル抗体若しくはこのモノクローナル抗体の結合特異性を有する断片、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒性化合物、酵素、又はこれらの誘導体、又は放射性核種から選択される治療活性成分;及び(iii)選択的に、蛍光化合物、光感光剤、放射性核種から選択される診断用成分;からなる群(i)、(ii)及び(iii)の少なくとも一の員から選択される少なくとも一の追加の分子を含むことを特徴とするEGFR結合タンパク質。
- 請求項8に記載のEGFR結合タンパク質において、モノクローナル抗体セツキシマブに融合した請求項1のユビキチン変異タンパク質を含むことを特徴とするEGFR結合タンパク質。
- 請求項1乃至9のいずれか1項に記載のEGFR結合タンパク質をコードする核酸分子。
- 請求項10に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項1乃至9のいずれか1項に記載のEGFR結合タンパク質、請求項10に記載の核酸分子、又は請求項11に記載のベクターを含む宿主細胞又は非ヒト宿主。
- 医学において使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、
(a)請求項1乃至9のいずれか1項に記載のEGFR結合タンパク質、又は請求項10に記載の核酸分子、又は請求項11に記載のベクター、又は請求項12に記載の宿主細胞;及び
(b)医薬的に受容可能なキャリア
を含むことを特徴とする医薬組成物。 - 癌の治療に使用するための、請求項13に記載の医薬組成物。
- 請求項1乃至9のいずれか1項に記載のEGFR結合タンパク質、又は請求項10に記載の核酸分子、又は請求項11に記載のベクター、又は請求項12に記載の宿主細胞、を含む組成物。
- 請求項1乃至9のいずれか1項に記載のEGFR結合タンパク質の製造方法において、前記EGFR結合タンパク質を取得するために適切な条件下で請求項12に記載の宿主細胞を培養するステップ、及び選択的に、前記EGFR結合タンパク質を単離するステップを具えることを特徴とする方法。
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