JP6881760B2 - ジユビキチン変異タンパク質に基づくHer2結合タンパク質 - Google Patents
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Description
しかし、モノクローナル抗体は、複雑な分子構造、大きいサイズ、困難な製造方法等、大きな欠点を有する。更に、現在入手可能なHer2結合分子で疾患を治療することは、全ての患者にとって有効ではなく、深刻な副作用をもたらす場合がある。
「タンパク質」及び「ポリペプチド」の用語は、ペプチド結合により連結された任意の2以上のアミノ酸鎖を指し、産物の特定の長さを指さない。従って、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は2以上のアミノ酸鎖を指すのに用いられる任意の他の用語は「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」の用語は、これらの用語のいずれかに代わり又は置き換えて用いることができる。「ポリペプチド」の用語は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、タンパク質分解切断、非天然アミノ酸による修飾、及び当技術分野で周知の同様の修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの翻訳後修飾の産物を指すことをも意図している。従って、2以上のタンパク質部分を具える結合タンパク質も、「タンパク質」又は「ポリペプチド」の用語の定義に該当する。
本発明のHer2結合タンパク質は、ヘッドトゥーテール方向でリンカーなしに直接結びついた、2つの異なって修飾されたユビキチン部分を具え、本質的にそれからなり、又はそれからなる。本発明のHer2結合タンパク質は、ジユビキチン(配列番号:4)に対して少なくとも85%のアミノ酸同一性を有し、つまり、Her2に対するジユビキチン(配列番号:4)の新規の結合特性を生成するのに、最大で23のアミノ酸がジユビキチン(配列番号:4)で修飾される(合計152のアミノ酸)。新規のHer2結合タンパク質の更に好ましいアミノ酸同一性は、ジユビキチン(配列番号:4)に対して少なくとも86%、少なくとも87%(修飾された20のアミノ酸に相当)、少なくとも88%、又は少なくとも89%、少なくとも90%(修飾された15のアミノ酸に相当)、少なくとも91%(修飾された14のアミノ酸に相当)、少なくとも92%(修飾された12のアミノ酸に相当)である。従って、本発明のHer2結合タンパク質は、ジユビキチンに対して85%から92%の同一性、より好ましくはジユビキチンに対して87%から91%の同一性を示す。Her2に対して700nM以下の結合親和性(KD)を有する本発明のHer2結合タンパク質は、ジユビキチン(配列番号:4)によるアミノ酸配列を具え、本質的にそれからなり、又はそれからなる。ここで、ジユビキチン(配列番号:4)のR42、I44、H68、V70、R72、L73、R74、K82、L84,Q138、K139、E140、S141及びT142位から選択される少なくとも12、13、又は14のアミノ酸から選択されるアミノ酸が置換され、ここで、Her2結合タンパク質は、ジユビキチン(配列番号:4)に対して少なくとも85%の配列同一性を有する。本発明に記載されるHer2結合タンパク質は、配列番号:4に対して92%以下の配列同一性を示す。好ましいHer2結合タンパク質は、R42、I44、H68、V70、R72、L73、R74、K82、L84、Q138、K139、E140、S141及びT142から選択される少なくとも12、13、又は14のアミノ酸が置換される限り、ジユビキチン(配列番号:4)に対して少なくとも85%を有する152のアミノ酸を具える。全てのHer2結合タンパク質は、R42、V70、R72、L73、K82、L84、Q138、K139、E140、及びT142位で、好ましくはI44、H68、R74、及びS141位で置換を有する。驚くことに、配列番号:4の当該12、13又は14位における置換の特定の組み合わせは、高親和性のHer2結合タンパク質をもたらす。これらのタンパク質は、de novoで作られた人工タンパク質である。本発明のHer2結合タンパク質は天然には存在しない。de novoで作られたHer2結合タンパク質の例は、配列番号:5−38に提供される。
ライブラリー構築及びクローニング。バランス良く調整されたアミノ酸分布を実現するため、それぞれ7つのランダム化したアミノ酸の位置を具える2つのユビキチン部分が、トリプレット技術(MorphoSys Slonomics,Germany)により合成された。システインを除く19のアミノ酸をコードする予め作られた二重鎖のトリプレットの混合物が合成に用いられた。両方のユビキチン部分は、(それら2つのユビキチン部分の間のリンカーなしで)ヘッドトゥー方向で直接連結され、14のランダム化したアミノ酸の位置を有する152のアミノ酸のタンパク質をもたらす。14のランダム化した位置を有するジユビキチンの配列が、配列番号:3に示される:
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQXLXFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLXLXLXXXAAMQIFVXTXTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIXXXXXLHLVLRLRAA。
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRAAMQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRAA。
アフィリン分子を、当業者に知られる標準的な方法を用いて、発現ベクターにクローニングし、以下で述べるように精製及び分析した。全てのアフィリンタンパク質が発現され、アフィニティクロマトグラフィー及びゲル濾過により高純度に精製した。アフィニティクロマトグラフィー精製後、Aekta system及びSuperdex(商標)200 Hiload 16/600カラム(GE Healthcare)を用いてサイズ排除クロマトグラフィー(SE HPLC又はSEC)を行った。カラムは、120mlの容量を有し、2CVで平衡化された。サンプルへは、精製バッファーを1ml/分の流速で注いだ。信号強度が10mAUに達するとフラクションコレクションが開始する。SDS−PAGE分析に続いて、陽性のフラクションをプールし、それらのタンパク質濃度を測定した。
上清及び再懸濁されたペレットは、NuPage Novex 4−12% Bis−Tris SDS ゲルにより分析し、クマシ―により染色した。タンパク質は、8M尿素の添加により、ペレットから回収した。Her2結合タンパク質は、少なくとも80%可溶(配列番号:5、27、30、37、38)、少なくとも90%可溶(配列番号:6、20、23、28、34)、少なくとも95%可溶(配列番号:7、9、10、11、22、29)、100%可溶(配列番号:8、12、13、14、15、16、17、18、19、21、25、26、33、35、36)という高い可溶性を示した。
本発明の結合タンパク質の熱安定性は、示差走査蛍光定量法(DSF)により測定された。それぞれのプローブを、0.1μg/μLの濃度でMicroAmp Optical 384−ウェルプレートに移し、SYPROオレンジ染料を適切な希釈で添加した。25から95℃の温度匂配を毎分1℃の加熱速度でプログラムした(ViiA−7、Applied Biosystems)。蛍光は、520nmの励起波長及び623nmの発光波長で常に測定した(ViiA−7、Applied Biosystems)。熱アンフォールディング(Tm、融点)の転移中点を、選択された変異体について図2に示す。本発明のHer2結合タンパク質は、同様の融解温度を有する。全ての結合タンパク質の安定性は、対照タンパク質の安定性と同等である。
CM5センサーチップ(GE Healthcare)を、SPRランニングバッファーで平衡化した。表面露出カルボキシルは、反応性エステル基を得るため、EDC及びNHSの混合物を通過することにより活性化した。700−1500RUのHer2−Fc(オン‐リガンド)をフローセル上に固定し、IgG−Fc(オフ‐リガンド)は別のフローセル上に、標的に対して1:3(hIgG−Fc:標的)の比で固定化した。未反応のNHS基をブロックするため、リガンド固定化後にエタノールアミンの注入を用いた。リガンド結合に伴い、タンパク質分析物が表面に蓄積し、屈折率が増加した。この屈折率の変化をリアルタイムで計測し、レスポンス又はレゾナンス単位(RU)対時間としてプロットした。分析物を、30μl/分の流速でチップに段階希釈して注いだ。会合を30秒間、解離を60秒間行った。各ランの後、チップの表面を、30μlの再生バッファーで再生し、ランニングバッファーで平衡化した。トラスツズマブの希釈系列は陽性対照として機能し、一方、非修飾ユビキチンの希釈系列は陰性対照を表す。対照サンプルを、30μl/分の流速でマトリックスに注入する一方、会合を60秒間、解離を120秒間行った。再生及び再平衡化が前述のとおり行われた。Biacore3000(GE Healthcare)を用いて結合の試験を行った;データ評価は、Langmuir 1:1モデル(Rl=0)を用いて、製造業者により提供されたBIAevaluation 3.0ソフトウェアを介して行った。Her2への結合の結果を図2に示す。評価した解離定数(KD)はオフ‐ターゲットに対して標準化して、示した。
Her2結合タンパク質の表面露出Her2との相互作用を分析するのに、フローサイトメトリーを用いた。Her2を過剰発現するヒト乳腺腺癌由来SkBr3細胞、Her2を過剰発現するトランスフェクトされたCHO−K1細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞)、Her2非発現のヒト胎児腎細胞株HEK/293、及び空ベクターの対照CHO−K1細胞を用いた。結果を図4−8に要約する。
外来性のヒトHer2を発現する細胞上で、本発明のタンパク質の結合が確認された。50nMのアフィリン‐141884、アフィリン‐142628、アフィリン‐141926、アフィリン‐144637、アフィリン‐142418、及びアフィリン‐144567が、Her2発現SkBr3細胞、及び陰性対照細胞株HEK/293について試験された。陰性対照としてジユビキチン(139090)が用いられ、10nMのトラスツズマブが、陽性対照として機能した。細胞は、1×105細胞/mlの濃度で、Lab−Tek(登録商標)チャンバースライド(Sigma Aldrich)に蒔いた。72時間を超える培養後、細胞を、メタノールで固定し(5分、20℃)、続いてブロッキング(PBSに5%のウマ胎児血清、1時間)、及び50nMのアフィリンで、常温で45分間インキュベーションを行った。1時間のウサギ抗Strep−Tag抗体(1:500)のインキュベーション、及び続いて1時間の抗ウサギIgG−Alexa488抗体(1:1000)のインキュベーションにより、アフィリン結合を検出した。トラスツズマブの結合は、抗ヒト‐IgG−Alexa488抗体(1:1000)で証明された。細胞核は、4μg/ml DAPIで染色した。全てのインキュベーションステップは、室温で行った。図9Aは、アフィリン‐141884、アフィリン‐142628、アフィリン‐141926、アフィリン‐144637、及びアフィリン‐142418の強い結合を示す。アフィリン‐144567及びジユビキチンの弱い結合又は陰性結合を、図9Bに示す。同等の結合がトラスツズマブで検出された。Her2陰性細胞株HEK/293について非特異的結合は見られなかった。
SKOV−3腫瘍、肺、肝臓、心筋、及び卵巣のクライオ組織セクションが、本発明の結合タンパク質を分析するのに用いられた。組織断片を、氷冷アセトンで10分間固定し、続いて、アフィリン‐141884及びアフィリン‐142628の異なる濃度(20nM及び50nM)、及び同等量の陰性対照としてジユビキチンクローン139090又は陽性対照として10nMのトラスツズマブを用いて1時間ブロック及びインキュベーションを行った。PBSで洗浄後、組織をウサギ抗Strep−Tag抗体(1:500)でもって室温で1時間インキュベートションを行い、続いて、トラスツズマブへの二次抗体として、ヤギ抗ウサギ Alexa488(1:1000)又はヤギ抗ヒト IgG Alexa594(1:1000)でインキュベーションを行った。細胞核は、DAPIで可視化した。チャンバースライドは覆われ、ガラススライドをMowiol及びカバーガラスで覆った。スライスは、Zeiss Axio Scopeで画像取得した。A1顕微鏡及び画像は、標準的なソフトウェアパッケージを用いて処理した。図10及び11は、非結合タンパク質クローン139090と比較した、SKOV−3腫瘍スライスへのアフィリン‐141884及びアフィリン‐142628の特異的結合を示す。肺組織上では結合は見られなかった(図11)。更なる組織スライス(肝臓、心筋、及び卵巣組織)を試験したが、特異的染色は見られなかった。
特定のトラスツズマブの異なるHer2エピトープに結合するアフィリンタンパク質は、特定の医療実施例において有用である。本発明の単離されたHer2結合タンパク質が、抗Her2モノクローナル抗体トラスツズマブと競合可能であるか否かを調べるため、以下のアッセイを行った:(Acrobiosystemsからの)Her2をNHS/EDC化学によりCM5 Biacoreチップ上に固定し、1000レスポンス単位(RU)を得た。第1の実験では、全ての変異体は、1つの定められた濃度(2.5μM)で、30μl/分 PBST 0.005% Tween 20(図12)の流速で注入した。第2の実験では、最初にチップの表面が飽和するまで、同一のフローチャネルへトラスツズマブ(200nM)を前投与した(図13)。トラスツズマブを投与した後、変異体は実験1と同一の方法(2.5μM)で注入した。より明確にするため、両方のセンソグラムのトレースは、最後に注入したHer2結合タンパク質に合わせた。
Her2結合タンパク質を、抗EGFRモノクローナル抗体セツキシマブの軽鎖又は重鎖のC又はN末端に連結した。融合タンパク質は、Her2結合タンパク質(例えば、アフィリン‐141926)をそれぞれ、抗EGFR抗体セツキシマブの重鎖のN末端に融合(NH141926、配列番号:47という)、抗EGFR抗体セツキシマブの重鎖のC末端に融合(CH141926、配列番号:45という)、抗EGFR抗体セツキシマブの軽鎖のN末端に融合(NL141926、配列番号:46という)、及び、抗EGFR抗体セツキシマブの軽鎖のC末端に融合(Erbitux(登録商標)、CL141926、配列番号:44という)することにより生成した。配列番号:44−47の最初の20のアミノ酸までがシグナル配列である。融合タンパク質をコードするcDNAを、過度的にFreeStyle(登録商標)293−F細胞にトランスフェクトし、無血清/無動物成分媒体中で発現した。発現は、Western Blot分析により確認した。融合タンパク質は、AEKTAxpress(登録商標)(GE Healthcare)でProtain A アフィニティクロマトグラフィー(GE−Healthcare cat no17−0402−01)により上清から精製した。融合タンパク質の更なる精製は、ゲル濾過により達成した。更なる分析には、SDS−PAGE、SE−HPLC、及びRP−HPLCが含まれた。本発明の結合タンパク質の熱安定性は、上述のような示差走査型蛍光定量法により決定した。熱のアンフォールディング(Tm、融点)の転移中点を、融合タンパク質について決定した;全ての融合タンパク質は、Tm=63.9℃から67.9℃の間の熱安定性を有する(表3を参照)。全ての結合タンパク質の安定性は、対照タンパク質の安定性と同等である。
Claims (17)
- アミノ酸配列を含むHer2結合タンパク質であって、ジユビキチン(配列番号:4)のR42、I44、H68、V70、R72、L73、R74、K82、L84、Q138、K139、E140、S141、及びT142位から選択される12、13、又は14のアミノ酸が置換され、前記Her2結合タンパク質はジユビキチン(配列番号:4)に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、前記Her2結合タンパク質はHer2に対して700nM未満の結合親和性(KD)を有し、
42位から選択されるアミノ酸は、極性アミノ酸又はロイシンにより置換され、
44位から選択されるアミノ酸は、疎水性又は極性アミノ酸により置換され、
68位から選択されるアミノ酸は、芳香族アミノ酸により置換され、
70位から選択されるアミノ酸は、芳香族アミノ酸により置換され、
72位から選択されるアミノ酸は、極性又は芳香族アミノ酸又はグリシンにより置換され、
73位から選択されるアミノ酸は、塩基性又は酸性アミノ酸以外の任意のアミノ酸により置換され、
74位から選択されるアミノ酸は、芳香族、塩基性又は極性アミノ酸により置換され、
82位から選択されるアミノ酸は、塩基性又は酸性アミノ酸以外の任意のアミノ酸により置換され、
84位から選択されるアミノ酸は、塩基性又は酸性アミノ酸又はセリンにより置換され、
138位から選択されるアミノ酸は、塩基性又は酸性又は極性アミノ酸により置換され、
139位から選択されるアミノ酸は、酸性又は疎水性アミノ酸又はグリシンにより置換され、
140位から選択されるアミノ酸は、芳香族アミノ酸により置換され、
141位から選択されるアミノ酸は、疎水性又は極性又は塩基性アミノ酸により置換され、及び/又は
142位から選択されるアミノ酸は、疎水性又は極性アミノ酸により置換される
ことを特徴とするHer2結合タンパク質。 - 請求項1に記載のHer2結合タンパク質において、ジユビキチン(配列番号:4)の1、2、3、4、5、又は6の更なる置換を、請求項1で特定した位置以外で含むことを特徴とするHer2結合タンパク質。
- 請求項1または2に記載のHer2結合タンパク質において、前記アミノ酸はR42T、R42S、R42L、I44A、I44V、I44S、I44T、H68W、H68Y、H68F、V70Y、V70W、R72T、R72F、R72G、R72Y、L73W、L73S、L73V、L73I、R74Y、R74S、R74N、R74K、K82T、K82L、K82N、K82I、K82Y、L84H、L84D、L84E、L84S、Q138S、Q138R、Q138E、K139E、K139G、K139L、E140W、S141A、S141R、T142I、T142L、及び/又はT142Nから選択されることを特徴とするHer2結合タンパク質。
- 請求項3に記載のHer2結合タンパク質において、前記アミノ酸はQ138S、K139E、E140W、S141A、及びT142I;又はQ138R、K139G、E140W、及びT142L;又はQ138E、K139L、E140W、S141R、及びT142Nから選択されることを特徴とするHer2結合タンパク質。
- 請求項3に記載のHer2結合タンパク質において、前記アミノ酸はR42T、I44A、H68W、V70Y、R72T、L73W、R74Y、K82T、及びL84Hから選択されることを特徴とするHer2結合タンパク質。
- 請求項3に記載のHer2結合タンパク質において、前記アミノ酸はR42S、I44V、H68Y、V70Y、R72F、L73S、K82L、及びL84Dから選択されることを特徴とするHer2結合タンパク質。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のHer2結合タンパク質において、前記アミノ酸配列は配列番号:5−38のアミノ酸配列のうち1つから選択されることを特徴とするHer2結合タンパク質。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のHer2結合タンパク質において、前記Her2結合タンパク質はモノクローナル抗体トラスツズマブと異なる又は非重複のHer2エピトープに結合することを特徴とするHer2結合タンパク質。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載のHer2結合タンパク質が、好ましくは、(i)ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、アルブミン結合ペプチド、又は免疫グロブリン、又は免疫グロブリン断片、多糖から選択される薬物動態を調節する部分、及び(ii)任意に、モノクローナル抗体又はその断片、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒性化合物、酵素、又はそれらの誘導体、又は放射性核種から選択される治療活性成分、及び(iii)任意に、蛍光化合物、光増感剤、タグ、酵素、又は放射性核種から選択される診断成分、からなる群(i)、(ii)、(iii)の少なくとも1員から選択される、少なくとも1つの追加の分子に融合している又はコンジュゲートしていることを特徴とするHer2結合タンパク質。
- 請求項9に記載のHer2結合タンパク質において、EGFR特異性を有するモノクローナル抗体を含むことを特徴とする、Her2結合タンパク質。
- 診断において使用するための、好ましくは、癌の診断において使用するための診断剤であって、前記診断剤が、請求項1から10のいずれか一項に記載のHer2結合タンパク質及び診断上許容可能なキャリアを含むことを特徴とする診断剤。
- 医学において使用するための、好ましくは、癌の治療において使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、請求項1から10のいずれか一項に記載のHer2結合タンパク質及び薬学的に許容可能なキャリアを含むことを特徴とする医薬組成物。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載のHer2結合タンパク質をコードする核酸分子。
- 請求項13に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載のHer2結合タンパク質、請求項13に記載の核酸分子、及び/又は請求項14に記載のベクターを含む宿主細胞又は非ヒト宿主。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載のHer2結合タンパク質、請求項13に記載の核酸分子、請求項14に記載のベクター、及び/又は請求項15に記載の宿主細胞を含む組成物。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載のHer2結合タンパク質の製造方法であって、前記Her2結合タンパク質を得るために適切な条件下で請求項15に記載の宿主細胞を培養するステップ、及び、任意に、前記Her2結合タンパク質を単離するステップを備えることを特徴とする方法。
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