JP6800141B2

JP6800141B2 - Ｉｌ−２およびインテグリン結合性ｆｃ融合タンパク質による相乗的な腫瘍処置

Info

Publication number: JP6800141B2
Application number: JP2017507391A
Authority: JP
Inventors: カールデインウィットラップ，; ジェニファーアール．コックラン，; バイロンフアクワン，
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2014-08-12
Filing date: 2015-08-12
Publication date: 2020-12-16
Anticipated expiration: 2035-08-12
Also published as: US20220193197A1; JP2017524713A; AU2015301753A1; US10166273B2; EP3180018B1; US20190343925A1; CA3133162A1; US20170216402A1; CA2957717A1; AU2015301753B2; DK3180018T3; EP3646879A1; WO2016025642A1; CA2957717C; US11096989B2; EP3646879B1; EP3180018A1; CA3133162C

Description

関連出願
この出願は、２０１４年８月１２日に出願された米国仮出願第６２／０３６５５４号の優先権の利益を主張する。この仮出願の内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。

政府の資金供与
この発明は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈによって付与された契約ＣＡ１７４７９５の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

インターロイキン２（ＩＬ−２）は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を活性化および誘導する多面的なサイトカインである。ＩＬ−２は、ＦＤＡによる認可を受けた療法であるが、全身性のＩＬ−２処置には著しい毒性があり、したがって、患者の奏効率は２５％未満である。半減期が延長されたＩＬ−２と、腫瘍特異的抗原に対する抗体との組み合わせにより、処置に関する有望な結果が示されている。しかし、抗体に基づく療法は、多くの場合、多くの腫瘍には公知の腫瘍関連抗原がないという事実が問題となっている。

インテグリンは、固形腫瘍の開始、進行および転移に極めて重要な一連の多様な細胞機能を調節する細胞外マトリクス接着受容体のファミリーである。腫瘍の進行における重要性により、インテグリンはがん療法の魅力的な標的となっており、また、種々のがんの型の処置が可能になる。がん性細胞上に存在するインテグリンとしては、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、およびα_５β_１が挙げられる。抗体、直鎖状ペプチド、環状ペプチド、およびペプチド模倣薬を含めた、がんに関連する個々のインテグリンを標的化する種々の治療薬が開発されてきた。しかし、小さな、構造化されたペプチド足場が利用されたことも、または２種超のインテグリンが同時に標的化されたこともない。さらに、現行のインテグリン標的化薬物は、単独療法として提供されている。種々のがんに対してより有効に闘うためには新規の併用療法が必要である。

本発明は、薬物動態改変基に付加したＩＬ−２（以降、「薬物動態（ＰＫ）延長ＩＬ−２」と称される）およびインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質を投与することにより、相乗的な腫瘍制御がもたらされ、いずれかの薬剤単独での単独療法と比較して生存が延長されるという発見に一部基づく。インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質は、（ｉ）インテグリン結合性ループおよびノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）ポリペプチド足場を有するインテグリン結合性ポリペプチドならびに（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインを含み、インテグリン結合性ポリペプチドはＦｃドメインと作動可能に連結している。有効量のＩＬ−２およびインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質の併用投与を伴う、改善されたがん療法が提供される。

したがって、一態様では、本発明は、被験体におけるがんを処置するための方法であって、被験体に、インターロイキン（ＩＬ）−２と、（ｉ）インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインを含むインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質であって、インテグリン結合性ポリペプチドがＦｃドメインと作動可能に連結しているインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質とを有効量で投与するステップを含む方法を提供する。

前述の態様の一実施形態では、ＩＬ−２は、ＩＬ−２融合タンパク質などのＰＫ延長ＩＬ−２の形態である。一実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ−２部分と、免疫グロブリン断片、ヒト血清アルブミン、およびＦｎ３からなる群より選択される部分とを含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインと作動可能に連結したＩＬ−２部分を含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、ヒト血清アルブミンと作動可能に連結したＩＬ−２部分を含む。別の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２は、非タンパク質ポリマーとコンジュゲートしたＩＬ−２部分を含む。一実施形態では、非タンパク質ポリマーは、ポリエチレングリコールである。

前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質は、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、およびα_５β_１からなる群より選択される腫瘍関連インテグリンまたはその組み合わせに結合するインテグリン結合性ポリペプチドを含む。一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、およびα_５β_１に結合する。

前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、ノッチンポリペプチド足場内にインテグリン結合性ループを含む。一部の実施形態では、ノッチンポリペプチド足場は、少なくとも３つのシステインジスルフィド結合または架橋結合したシステイン残基を含み、インテグリン結合性ループはノッチンポリペプチド足場のシステイン残基に近接している。一実施形態では、インテグリン結合性ループは、ＲＧＤペプチド配列を含む。別の実施形態では、ノッチンポリペプチド足場は、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＡｇＲＰ、およびアガトキシンからなる群より選択されるノッチンタンパク質に由来する。一実施形態では、ノッチンタンパク質はＥＥＴＩ−ＩＩである。

前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、ＲＧＤペプチド配列を含むインテグリン結合性ループを含み、ノッチンポリペプチド足場は、ＥＥＴＩ−ＩＩに由来する。

前述の態様の一実施形態では、ノッチンポリペプチド足場は、ＥＥＴＩ−ＩＩに由来するものであり、インテグリン結合性ループは、配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＲＧＤＸ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１を含み、各Ｘは任意のアミノ酸を表し、当該ループは、ＥＥＴＩ−ＩＩ配列内の２つのシステイン残基の間に挿入され、ネイティブなＥＥＴＩ−ＩＩ配列を置き換えている。別の実施形態では、インテグリン結合性ループは、ネイティブなＥＥＴＩ−ＩＩ配列内の第１のシステインの後に挿入されている。

前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、配列番号４２または４３に記載のアミノ酸配列を含み、Ｘ_１は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｈ、Ｄ、およびＮからなる群より選択され；Ｘ_２は、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｅ、およびＱからなる群より選択され；Ｘ_３は、Ｇ、Ａ、およびＰからなる群より選択され；Ｘ_７は、ＷおよびＮからなる群より選択され；Ｘ_８は、Ａ、Ｐ、およびＳからなる群より選択され；Ｘ_９は、ＰおよびＲからなる群より選択され；Ｘ_１０は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、およびＥからなる群より選択され；Ｘ_１１は、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、およびＥからなる群より選択される。さらなる実施形態では、インテグリン結合性Ｆｃ融合物は、配列番号２または３に記載されているヒトＩｇＧＦｃドメインと作動可能に連結した、配列番号４２または４３に記載されているインテグリン結合性ポリペプチドを含む。

前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、表１に記載されているアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、配列番号６７〜１３３からなる群からのアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、表１に記載されているインテグリン結合性ポリペプチドは、配列番号２または３に記載されているヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインと作動可能に連結している。

前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、配列番号９３、９４、９５または９６のアミノ酸配列を含む。

前述の態様の一実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインである。

前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、リンカーを伴ってまたは伴わずに、Ｆｃドメインと作動可能に連結している。一部の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、リンカーを伴わずにＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端と連結している。他の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーなどのリンカーを伴って、ＦｃドナーのＮ末端またはＣ末端と連結している。

前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号４８、４９、５０または５１のアミノ酸配列を含む。

前述の態様のいずれかでは、方法は、ＩＬ−２およびインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質を、薬学的に許容される担体を伴う医薬組成物の形態で投与するステップを含む。

一部の実施形態では、インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質は、二量体の形態である。

前述の態様のいずれかでは、方法は、ＩＬ−２およびインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質を同時にまたは逐次的に投与するステップを含む。

前述の態様のいずれかでは、方法は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、またはＢ７ファミリーのメンバーを標的化する抗体または抗体断片などの免疫チェックポイント遮断薬を投与するステップをさらに含む。一実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、ＰＤ−１を標的化する抗体またはその抗体断片である。別の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、ＣＴＬＡ４を標的化する抗体または抗体断片である。

ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬の代わりにＶＥＧＦのアンタゴニストを投与する。さらなる実施形態では、ＶＥＧＦのアンタゴニストは、ＶＥＧＦに結合する抗体もしくはその抗体断片、ＶＥＧＦ受容体に結合する抗体もしくはその抗体断片、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤、ドミナントネガティブＶＥＧＦ、またはＶＥＧＦ受容体である。

前述の態様の一実施形態では、方法は、インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質および免疫チェックポイント遮断薬を、ＩＬ−２を伴ってまたは伴わずに投与するステップを含む。

前述の態様のいずれかでは、がんは、メラノーマ、白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸がん、腎細胞癌、膵がん、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ）、および脳がんからなる群より選択される。一部の実施形態では、がんは、メラノーマである。他の実施形態では、がんは、髄芽腫（ｍｅｄｕｌｌａｂｌａｓｔｏｍａ）などの脳がんである。他の実施形態では、がんは結腸がんである。

別の態様では、本発明は、被験体における腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法であって、被験体に、薬物動態（ＰＫ）延長インターロイキン（ＩＬ）−２と、（ｉ）インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインを含むインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質であって、インテグリン結合性ポリペプチドがＦｃドメインと作動可能に連結しているインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質とを有効量で投与するステップを含む方法を提供する。

別の態様では、本発明は、被験体における腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法であって、被験体に、（ｉ）インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインを含むインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質であって、インテグリン結合性ポリペプチドがＦｃドメインと作動可能に連結しているインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質と、免疫チェックポイント遮断薬とを有効量で投与するステップを含む方法を提供する。さらなる実施形態では、有効量のＩＬ−２も投与する。

前述の態様の一実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、ＰＤ−１を標的化する抗体または抗体断片である。別の態様では、免疫チェックポイント遮断薬は、ＣＴＬＡ−４を標的化する抗体または抗体断片である。

別の態様では、本発明は、被験体における腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法であって、被験体に、（ｉ）インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインを含むインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質であって、インテグリン結合性ポリペプチドがＦｃドメインと作動可能に連結しているインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質と、ＶＥＧＦのアンタゴニストとを有効量で投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦのアンタゴニストは、ＶＥＧＦに結合する抗体もしくはその抗体断片、ＶＥＧＦ受容体に結合する抗体もしくはその抗体断片、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤、ドミナントネガティブＶＥＧＦ、またはＶＥＧＦ受容体である。

例えば、本発明の実施形態の例として以下の項目が挙げられる。
（項目１）
被験体におけるがんを処置するための方法であって、前記被験体に、インターロイキン（ＩＬ）−２と、（ｉ）インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインを含むインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質であって、前記インテグリン結合性ポリペプチドが前記Ｆｃドメインと作動可能に連結している、インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質とを有効量で投与するステップを含む、方法。
（項目２）
ＩＬ−２が、薬物動態（ＰＫ）延長ＩＬ−２である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＰＫ延長ＩＬ−２が、融合タンパク質を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記融合タンパク質が、ＩＬ−２部分と、免疫グロブリン断片、ヒト血清アルブミン、およびＦｎ３からなる群より選択される部分とを含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃドメインと作動可能に連結したＩＬ−２部分を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記融合タンパク質が、ヒト血清アルブミンと作動可能に連結したＩＬ−２部分を含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記ＰＫ延長ＩＬ−２が、非タンパク質ポリマーとコンジュゲートしたＩＬ−２部分を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記非タンパク質ポリマーがポリエチレングリコールである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、α _ｖ β _３、α _ｖ β _５、およびα _５ β _１からなる群より選択される腫瘍関連インテグリンまたはその組み合わせに結合する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、α _ｖ β _３、α _ｖ β _５、およびα _５ β _１に結合する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ノッチンポリペプチド足場が、少なくとも３つのシステインジスルフィド結合または架橋結合したシステイン残基を含み、前記インテグリン結合性ループが、前記ノッチンポリペプチド足場のシステイン残基に近接している、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記インテグリン結合性ループが、ＲＧＤペプチド配列を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ノッチンポリペプチド足場が、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＡｇＲＰ、およびアガトキシンからなる群より選択されるノッチンタンパク質に由来する、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記ノッチンタンパク質が、ＥＥＴＩ−ＩＩである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記インテグリン結合性ループが、ＲＧＤペプチド配列を含み、前記ノッチンポリペプチド足場が、ＥＥＴＩ−ＩＩに由来する、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記ノッチンポリペプチド足場が、ＥＥＴＩ−ＩＩに由来するものであり、前記インテグリン結合性ループが、配列Ｘ _１Ｘ _２Ｘ _３ＲＧＤＸ _７Ｘ _８Ｘ _９Ｘ _１０Ｘ _１１を含み、ここで各Ｘは任意のアミノ酸を表し、前記ループが、ＥＥＴＩ−ＩＩ配列内の２つのシステイン残基の間に挿入され、ネイティブなＥＥＴＩ−ＩＩ配列を置き換えている、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記インテグリン結合性ループが、ネイティブなＥＥＴＩ−ＩＩ配列内の第１のシステインの後に挿入されている、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、配列番号４２または４３に記載されているアミノ酸配列を含み、ここでＸ _１が、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｈ、Ｄ、およびＮからなる群より選択され；Ｘ _２が、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｅ、およびＱからなる群より選択され；Ｘ _３が、Ｇ、Ａ、およびＰからなる群より選択され；Ｘ _７が、ＷおよびＮからなる群より選択され；Ｘ _８が、Ａ、Ｐ、およびＳからなる群より選択され；Ｘ _９が、ＰおよびＲからなる群より選択され；Ｘ _１０が、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、およびＥからなる群より選択され；Ｘ _１１が、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、およびＥからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、配列番号６７〜１３３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、配列番号９４または９６のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインである、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、リンカーを伴ってまたは伴わずに、前記Ｆｃドメインと作動可能に連結している、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、前記ＦｃドメインのＮ末端と作動可能に連結している、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、前記ＦｃドメインのＣ末端と作動可能に連結している、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号４８、４９、５０、または５１のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記ＰＫ延長ＩＬ−２および前記インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質を同時にまたは逐次的に投与する、項目１から２５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
免疫チェックポイント遮断薬を投与するステップをさらに含む、項目１から２５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記免疫チェックポイント遮断薬が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、およびＢ７ファミリーのメンバーからなる群より選択されるタンパク質を標的化する抗体または抗体断片である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記免疫チェックポイント遮断薬が、ＰＤ−１を標的化する抗体または抗体断片である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記免疫チェックポイント遮断薬が、ＣＴＬＡ４を標的化する抗体または抗体断片である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
ＶＥＧＦのアンタゴニストを投与するステップをさらに含む、項目１から２５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記ＶＥＧＦのアンタゴニストが、ＶＥＧＦに結合する抗体もしくはその抗体断片、ＶＥＧＦ受容体に結合する抗体もしくはその抗体断片、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤、ドミナントネガティブＶＥＧＦ、またはＶＥＧＦ受容体である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記がんが、メラノーマ、白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸がん、腎細胞癌、膵がん、子宮頸がん、および脳がんからなる群より選択される、項目１から３２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
被験体における腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法であって、前記被験体に、薬物動態（ＰＫ）延長インターロイキン（ＩＬ）−２と、（ｉ）インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインを含むインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質であって、前記インテグリン結合性ポリペプチドが前記Ｆｃドメインと作動可能に連結している、インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質とを有効量で投与するステップを含む、方法。
（項目３５）
被験体における腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法であって、前記被験体に、（ｉ）インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインを含むインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質であって、前記インテグリン結合性ポリペプチドが前記Ｆｃドメインと作動可能に連結している、インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質と、免疫チェックポイント遮断薬とを有効量で投与するステップを含む、方法。
（項目３６）
前記免疫チェックポイント遮断薬が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、およびＢ７ファミリーのメンバーからなる群より選択されるタンパク質を標的化する抗体または抗体断片である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記免疫チェックポイント遮断薬が、ＰＤ−１を標的化する抗体または抗体断片である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記免疫チェックポイント遮断薬が、ＣＴＬＡ４を標的化する抗体または抗体断片である、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
被験体における腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法であって、前記被験体に、（ｉ）インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインを含むインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質であって、前記インテグリン結合性ポリペプチドが前記Ｆｃドメインと作動可能に連結している、インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質と、ＶＥＧＦのアンタゴニストとを有効量で投与するステップを含む、方法。
（項目４０）
前記ＶＥＧＦのアンタゴニストが、ＶＥＧＦに結合する抗体もしくはその抗体断片、ＶＥＧＦ受容体に結合する抗体もしくはその抗体断片、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤、ドミナントネガティブＶＥＧＦ、またはＶＥＧＦ受容体である、項目３９に記載の方法。
本発明のこれらのおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明、および添付図に関してよりよく理解されよう。

図１は、ノッチンタンパク質ＥＥＴＩ−ＩＩ（配列番号３９）、ＡｇＲＰ（配列番号４０）およびオメガアガトキシン４Ｂ（配列番号４１）の配列内のＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合の位置を示す。システイン残基は、この工学的に操作されたペプチドでは角括弧内に入ったＲＧＤ模倣ループのすぐ隣に見ることができる。例えば、ＡｇＲＰではＲＧＤ配列に隣接するシステインが互いと連結するが、ＥＥＴＩではＲＧＤ配列に隣接するシステインは互いと連結しないことを見ることができる。移植される配列のサイズは、分子フレームワーク構造に左右され、したがって、ループがフレームワーク内の連結したシステインに近接する場合には、より短いものであることが好ましい。他のノッチンタンパク質に関するジスルフィド結合は、ノッチンデータベースに記載されている。図１の出典はＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４０巻、１５５２０〜１５５２７頁（２００１年）およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、２７８巻：６３１４〜６３２２頁である。

図２は、皮下Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍におけるＴＡ９９を用いた腫瘍制御およびインテグリン結合性ノッチン−Ｆｃ（配列番号４５）を用いた腫瘍制御を比較したグラフである。ＴＡ９９は、メラノーマ細胞上で過剰発現する抗原であるＴＹＲＰ−１に対する抗体である。Ｂ１６Ｆ１０細胞２．５×１０^５個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射することによって腫瘍を樹立した。８０μｇのノッチン−Ｆｃ、８０μｇのノッチン−ＦｃＤ２６５Ａ、または２００μｇのＴＡ９９を、腫瘍接種日に開始し、その後２日毎に投与した。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。

図３Ａおよび３Ｂは、樹立Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。Ｂ１６Ｆ１０細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および／または５００μｇのノッチン−Ｆｃを、腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。図３Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図３Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。図３Ａおよび３Ｂは、樹立Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。Ｂ１６Ｆ１０細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および／または５００μｇのノッチン−Ｆｃを、腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。図３Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図３Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。

図４Ａおよび４Ｂは、樹立ＭＣ３８結腸腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。ＭＣ３８細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射し、３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および／または５００μｇのノッチン−Ｆｃを、腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。図４Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図４Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。図４Ａおよび４Ｂは、樹立ＭＣ３８結腸腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。ＭＣ３８細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射し、３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および／または５００μｇのノッチン−Ｆｃを、腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。図４Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図４Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。

図５Ａおよび５Ｂは、樹立Ａｇ１０４Ａ線維肉腫腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。Ａｇ１０４Ａ細胞１×１０^６個をＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの側腹部に注射した。１２．５μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および／または５００μｇのノッチン−Ｆｃを、腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。図５Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図５Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。図５Ａおよび５Ｂは、樹立Ａｇ１０４Ａ線維肉腫腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。Ａｇ１０４Ａ細胞１×１０^６個をＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの側腹部に注射した。１２．５μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および／または５００μｇのノッチン−Ｆｃを、腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。図５Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図５Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。

図６Ａおよび６Ｂは、樹立Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。Ｂ１６Ｆ１０細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および５００μｇのノッチン−Ｆｃまたはノッチン−ＦｃＤ２６５Ａを、腫瘍接種の６日後、およびその後毎日、合計４回の処置で投与した。図６Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図６Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。

図７Ａおよび７Ｂは、樹立ＭＣ３８腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。ＭＣ３８細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射し、３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および５００μｇのノッチン−Ｆｃまたはノッチン−ＦｃＤ２６５Ａを、腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。図７Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図７Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。

図８Ａおよび８Ｂは、樹立Ｂ１６Ｆ１０腫瘍における抗体を用いた相乗的な腫瘍制御を示す。Ｂ１６Ｆ１０細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２を、腫瘍接種の６日後に開始して６日毎に、合計５回の処置で投与した。２００μｇのノッチン−Ｆｃを腫瘍接種の６日後から３０日後まで毎日投与した。ＴＹＲＰ−１に対する抗体（ＴＡ９９）をマウス当たり１００μｇで腫瘍接種の６日後に開始して６日毎に投与した。ＰＤ−１に対する抗体（免疫チェックポイント遮断用）をマウス当たり２００μｇで腫瘍接種の６日後に開始して６日毎に投与した。図８Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図８Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。図８Ａおよび８Ｂは、樹立Ｂ１６Ｆ１０腫瘍における抗体を用いた相乗的な腫瘍制御を示す。Ｂ１６Ｆ１０細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２を、腫瘍接種の６日後に開始して６日毎に、合計５回の処置で投与した。２００μｇのノッチン−Ｆｃを腫瘍接種の６日後から３０日後まで毎日投与した。ＴＹＲＰ−１に対する抗体（ＴＡ９９）をマウス当たり１００μｇで腫瘍接種の６日後に開始して６日毎に投与した。ＰＤ−１に対する抗体（免疫チェックポイント遮断用）をマウス当たり２００μｇで腫瘍接種の６日後に開始して６日毎に投与した。図８Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図８Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。

図９Ａおよび９Ｂは、樹立ＭＣ３８腫瘍における抗体を用いた相乗的な腫瘍制御を示す。ＭＣ３８細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２、５００μｇのノッチン−Ｆｃ、および／または２００μｇの抗ＰＤ−１抗体を腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。図９Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図９Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。図９Ａおよび９Ｂは、樹立ＭＣ３８腫瘍における抗体を用いた相乗的な腫瘍制御を示す。ＭＣ３８細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２、５００μｇのノッチン−Ｆｃ、および／または２００μｇの抗ＰＤ−１抗体を腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。図９Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図９Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。

図１０は、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおける、ノッチン−ＦｃおよびＭＳＡ−ＩＬ−２の投薬スケジュールを比較した腫瘍成長制御を示す線グラフである。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２を腫瘍接種の６日後、１２日後、１８日後および２４日後に投与した。２００μｇのノッチン−Ｆｃを腫瘍接種の６日後に開始して毎日または隔日で投与した。５００μｇのノッチン−Ｆｃを毎週レジメンでＭＳＡ／ＩＬ−２と同じ日に投与した。群当たりマウス５匹を用いた平均腫瘍面積をプロットし、エラーバーはＳＥＭを表す。

図１１は、ＭＣ３８腫瘍モデルにおける、ノッチン−ＦｃおよびＭＳＡ／ＩＬ−２の投薬スケジュールを比較した腫瘍成長制御を示す線グラフである。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２を腫瘍接種の６日後、１２日後、１８日後および２４日後に投与した。２００μｇのノッチン−Ｆｃを腫瘍接種の６日後に開始して毎日または隔日で投与した。５００μｇのノッチン−Ｆｃを毎週レジメンでＭＳＡ／ＩＬ−２と同じ日に投与した。群当たりマウス５匹を用いた平均腫瘍面積をプロットし、エラーバーはＳＥＭを表す。

図１２は、皮下Ｂ１６Ｆ１０腫瘍における腫瘍制御を示す線グラフである。融合の配置の有効性を比較するためにＦｃをＮ末端（ノッチン−Ｆｃ）またはＣ末端（Ｆｃ−ノッチン）のいずれかに融合した。さらに、ノッチンを無関連のＩｇＧの重鎖のＣ末端に融合した（ＩｇＧ−ノッチン）。マウスを、腫瘍接種の直後に開始して２日毎に８０μｇのノッチン−ＦｃもしくはＦｃ−ノッチンまたは２００μｇのＩｇＧ−ノッチンを用いて処置した。

図１３は、皮下ＭＣ３８腫瘍における腫瘍制御を示す線グラフである。融合の配置の有効性を比較するためにＦｃをＮ末端（ノッチン−Ｆｃ）またはＣ末端（Ｆｃ−ノッチン）のいずれかに融合した。さらに、ノッチンを無関連のＩｇＧの重鎖のＣ末端に融合した（ＩｇＧ−ノッチン）。マウスを、腫瘍接種の直後に開始して２日毎に２００μｇのノッチン−ＦｃまたはＦｃ−ノッチンを用いて処置した。

図１４Ａおよび１４Ｂは、ＭＣ３８腫瘍細胞を用いた二次腫瘍攻撃後の腫瘍制御を示す。以前に治癒したマウス（ＭＳＡ／ＩＬ−２およびノッチン−Ｆｃを用いて処置した）および年齢を釣り合わせたナイーブなマウスに、最初の腫瘍接種の１６〜２０週間後にＭＣ３８腫瘍細胞１×１０^６個を逆側の側腹部に接種した。さらなる処置は行わなかった。図１４Ａ）二次腫瘍攻撃後の、以前に治癒したマウスおよび年齢を釣り合わせたナイーブなマウスについての腫瘍面積のグラフ。図１４Ｂ）二次腫瘍攻撃に供したマウスのカプラン・マイヤープロット。

図１５Ａおよび１５Ｂは、樹立Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。Ｂ１６Ｆ１０細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２、５００μｇの、３種のインテグリンを標的化するノッチン−Ｆｃ（「２．５Ｆ＿ノッチン−Ｆｃ」）、および／または２種のインテグリンを標的化するノッチン−Ｆｃ（「２．５Ｄ＿ノッチン−Ｆｃ」）を腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。図１５Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図１５Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。

図１６Ａおよび１６Ｂは、樹立ＭＣ３８腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。ＭＣ３８細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２、５００μｇの、３種のインテグリンを標的化するノッチン−Ｆｃ（「２．５Ｆ＿ノッチン−Ｆｃ」）、および／または２種のインテグリンを標的化するノッチン−Ｆｃ（「２．５Ｄ＿ノッチン−Ｆｃ」）を腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。図１６Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図１６Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。

図１７Ａおよび１７Ｂは、樹立Ａｇ１０４Ａ血管肉腫腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。Ａｇ１０４Ａ細胞１×１０^６個をＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２、５００μｇの、３種のインテグリンを標的化するノッチン−Ｆｃ（「２．５Ｆ＿ノッチン−Ｆｃ」）、および／または２種のインテグリンを標的化するノッチン−Ｆｃ（「２．５Ｄ＿ノッチン−Ｆｃ」）を腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。図１７Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図１７Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。

図１８Ａおよび１８Ｂは、ノッチン−ＦｃおよびＭＳＡ／ＩＬ−２を用いて処置した樹立ＭＣ３８腫瘍を有するマウスの生存に対する免疫細胞枯渇の影響を示す。ＭＣ３８細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および５００μｇのノッチン−Ｆｃを腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。４００μｇの抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＮＫ１．１抗体、抗Ｌｙ６Ｇ抗体または抗ＣＤ１９抗体を、腫瘍接種の４日後に開始して４日毎に、合計６回の処置で投薬した。３００μｇの抗ＣＳＦ−１Ｒを、腫瘍接種の５日目に開始して２日毎に、合計１１回の処置で投薬した。３０μｇのコブラ毒因子（ＣＶＦ）を、腫瘍接種の５日後に開始して６日毎に、合計４回の処置で投与した。図１８Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図１８Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。図１８Ａおよび１８Ｂは、ノッチン−ＦｃおよびＭＳＡ／ＩＬ−２を用いて処置した樹立ＭＣ３８腫瘍を有するマウスの生存に対する免疫細胞枯渇の影響を示す。ＭＣ３８細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および５００μｇのノッチン−Ｆｃを腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。４００μｇの抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＮＫ１．１抗体、抗Ｌｙ６Ｇ抗体または抗ＣＤ１９抗体を、腫瘍接種の４日後に開始して４日毎に、合計６回の処置で投薬した。３００μｇの抗ＣＳＦ−１Ｒを、腫瘍接種の５日目に開始して２日毎に、合計１１回の処置で投薬した。３０μｇのコブラ毒因子（ＣＶＦ）を、腫瘍接種の５日後に開始して６日毎に、合計４回の処置で投与した。図１８Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図１８Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。

図１９Ａおよび１９Ｂは、樹立ＭＣ３８腫瘍を有するマウスの生存に対する樹状細胞枯渇の影響を示す。ＭＣ３８細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＢａｔｆ３−／−マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および５００μｇのノッチン−Ｆｃを腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。図１９Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図１９Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。

図２０Ａおよび２０Ｂは、樹立ＭＣ３８腫瘍を有するマウスでの、ＭＳＡ／ＩＬ−２およびノッチン−Ｆｃを用いた処置の有効性におけるＩＦＮγの役割を示す。ＭＣ３８細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および５００μｇのノッチン−Ｆｃを腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。２００μｇの抗ＩＦＮγ抗体を、腫瘍接種の５日後に開始して２日毎に、合計１１回の処置で投与した。図２０Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図２０Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。

図２１Ａおよび２１Ｂは、樹立ＭＣ３８腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。ＭＣ３８細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２、５００μｇのノッチン−Ｆｃ、および／または２００μｇの抗ＶＥＧＦ抗体を腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。図２１Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図２１Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。

図２２は、樹立ＭＣ３８腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す腫瘍面積のグラフを示す。ＭＣ３８細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２、５００μｇのノッチン−Ｆｃ、および／または２００μｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体を腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。

図２３Ａおよび２３Ｂは、樹立Ｂ１６Ｆ１０腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。Ｂ１６Ｆ１０細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２、５００μｇのノッチン−Ｆｃ、２００μｇの抗ＶＥＧＦ抗体および／または２００μｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体を腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で投与した。図２３Ａ）各処置についての腫瘍面積のグラフ。図２３Ｂ）カプラン・マイヤー生存プロット。

定義
特許請求の範囲および明細書において使用されている用語は、別段の指定がない限り下記の通り定義される。親仮特許出願において使用されている用語と直接矛盾する場合には、本明細書において使用されている用語に支配されるものとする。

「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸の類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によりコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸の類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基と結合した炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。アミノ酸は、本明細書では、それらの一般に公知の３文字記号によってか、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている１文字記号によって言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般に認められている１文字コードによって言及され得る。

「アミノ酸置換」とは、所定のアミノ酸配列（出発ポリペプチドのアミノ酸配列）内の少なくとも１つの既存のアミノ酸残基の、第２の、異なる「置き換え」アミノ酸残基での置き換えを指す。「アミノ酸挿入」とは、所定のアミノ酸配列への少なくとも１つの追加的なアミノ酸の組み入れを指す。挿入は通常は１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入からなるが、現行のより大きな「ペプチド挿入」、例えば、約３〜約５個またはさらには約１０個、１５個、または２０個までのアミノ酸残基の挿入を行うことができる。挿入される残基（複数可）は、上に開示されている通り天然に存在するものであっても天然には存在しないものであってもよい。「アミノ酸欠失」とは、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では、互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーにあてはまる。

「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかのそのポリマーを指す。特に限定がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。別段の指定のない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列ならびに明示された配列も暗黙のうちに包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１９巻：５０８１頁、１９９１年；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０巻：２６０５〜２６０８頁、１９８５年；およびＣａｓｓｏｌら、１９９２年；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８巻：９１〜９８頁、１９９４年）。アルギニンおよびロイシンに関しては、第２の塩基における修飾も保存的なものである。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡであっても修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成されるものであってよい。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより一般には二本鎖であるか一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であってよいＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子で構成されるものであってよい。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡかＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域で構成されるものであってよい。ポリヌクレオチドは、安定性のためにまたは他の理由で修飾された１つまたは複数の修飾塩基またはＤＮＡまたはＲＮＡ骨格も含有してよい。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの普通でない塩基が挙げられる。ＤＮＡおよびＲＮＡに種々の修飾を行うことができ、したがって、「ポリヌクレオチド」とは、化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾された形態を包含する。

本明細書で使用される場合、「インターロイキン（ＩＬ）−２」とは、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を活性化および誘導する多面的なサイトカインを指す。ＩＬ−２は、アルファサブユニット、ベータサブユニット、およびガンマサブユニットで構成されるその受容体ＩＬ−２Ｒに結合することによってシグナル伝達を行う。ＩＬ−２シグナル伝達により、抗原活性化Ｔ細胞の増殖が刺激される。

本明細書で使用される場合、「ＰＫ」という用語は、「薬物動態」の頭字語であり、例として、被験体による吸収、分布、代謝、および排除を含めた化合物の性質を包含する。本明細書で使用される場合、「ＰＫ延長基」とは、生物活性分子と融合または一緒に投与すると生物活性分子の循環半減期を増大させるタンパク質、ペプチド、または部分を指す。ＰＫ延長基の例としては、ＰＥＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合剤（米国特許出願公開第２００５／０２８７１５３号および同第２００７／０００３５４９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０８３８０４号および同第ＷＯ２００９／１３３２０８号に開示されている通り、およびＵＳ２０１２／０９４９０９に記載されているＳＡＢＡ分子）、ヒト血清アルブミン、ＦｃまたはＦｃ断片およびその改変体、ならびに糖（例えば、シアル酸）が挙げられる。他の例示的なＰＫ延長基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０１１年：２２巻：８６８〜８７６頁に開示されている。本明細書で使用される場合、「ＰＫ延長ＩＬ−２」とは、ＰＫ延長基と組み合わせたＩＬ−２部分を指す。一実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２は、ＩＬ−２部分がＰＫ延長基と連結または融合した融合タンパク質である。例示的な融合タンパク質は、１つまたは複数のＩＬ−２部分がＨＳＡと連結したＨＳＡ／ＩＬ−２融合物である。

「ＰＫ延長ＩＬ−２」という用語は、ＩＬ−２の、その受容体のうちの１つまたは複数、例えば、ＣＤ２５に対する親和性を増強する、１つまたは複数のアミノ酸残基の変異を有するＩＬ−２変異体も包含するものとする。一実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２のＩＬ−２部分は野生型ＩＬ−２である。別の実施形態では、ＩＬ−２部分は、ＣＤ２５に対する親和性が野生型ＩＬ−２よりも高い変異体ＩＬ−２である。ＨＳＡ−ＩＬ−２などの、特定の型のＰＫ延長基が示されている場合、これは、野生型ＩＬ−２部分と融合したＨＳＡまたはＭＳＡまたは変異体ＩＬ−２部分と融合したＨＳＡまたはＭＳＡの両方を包含することが理解されるべきである。

ある特定の態様では、記載されているＰＫ延長ＩＬ−２またはノッチン−Ｆｃには、１つまたは複数の「リンカードメイン」、例えばポリペプチドリンカーなどを使用することができる。本明細書で使用される場合、「リンカー」または「リンカードメイン」という用語は、２つまたはそれ超のドメイン（例えば、ＰＫ部分およびＩＬ−２）を直鎖状配列に接続する配列を指す。本明細書で使用される場合、「ポリペプチドリンカー」という用語は、２つまたはそれ超のドメインをポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列に接続するペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）を指す。例えば、ポリペプチドリンカーを使用して、ＩＬ−２部分またはインテグリン結合性ポリペプチドをＦｃドメインまたはＨＳＡなどの他のＰＫ延長剤（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）と接続することができる。一部の実施形態では、そのようなポリペプチドリンカーにより、ポリペプチド分子に可撓性をもたらすことができる。例示的なリンカーとしては、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「連結した」、「融合した」、または「融合」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、化学的なコンジュゲーションまたは組換え手段を含めた手段を問わず、２つまたはそれ超の要素または構成成分またはドメインを接合することを指す。化学的なコンジュゲーション（例えば、ヘテロ二官能性架橋剤を使用した）の方法は、当技術分野で公知である。

「インテグリン」という用語は、細胞接着に重要な膜貫通ヘテロ二量体タンパク質を意味する。インテグリンは、αサブユニットおよびβサブユニットを含む。これらのタンパク質は、細胞外マトリクス構成成分（例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンなど）に結合してシグナル伝達カスケードを誘導することによって応答する。インテグリンは、細胞外マトリクス構成成分に、ＲＧＤモチーフを認識することによって結合する。ある特定のインテグリンは、腫瘍細胞の表面上に見いだされ、したがって、有望な治療上の標的になる。ある特定の実施形態では、標的化されるインテグリンは、個別にまたは組み合わせて、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、およびα_５β_１である。

「インテグリン結合性ポリペプチド」という用語は、ノッチンポリペプチド足場内のインテグリン結合性ドメインまたはループを含むポリペプチドを指す。インテグリン結合性ドメインまたはループは、少なくとも１つのＲＧＤペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＲＧＤペプチドは、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、またはα_５β_１によって認識される。ある特定の実施形態では、ＲＧＤペプチドは、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、および／またはα_５β_１の組み合わせに結合する。これらの特定のインテグリンは、腫瘍細胞およびそれらの脈管構造上に見いだされ、したがって、目的の標的である。

「ループドメイン」という用語は、規則的な二次構造を有さず、一般にペプチドの表面上に存在する、ペプチド鎖内のアミノ酸部分配列を指す。「ループ」という用語は、当技術分野では、アルファヘリックス、ベータシートなどの形態にみられるように規則的ではない二次構造を指すものと理解される。

「インテグリン結合性ループ」という用語は、一般にはインテグリンと結合させるための定方向分子進化などの実験的方法によって非経験的に創出される約９〜１３アミノ酸の一次配列を指す。ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ループは、足場に独特であり、所望の結合特異性のアミノ酸間に位置するＲＧＤペプチド配列などを含む。ＲＧＤを含有するペプチドまたは同様のもの（ＲＹＤなど）は、一般に、公知のタンパク質の天然の結合性配列から単純には取得されない。インテグリン結合性ループをノッチンポリペプチド足場のシステイン残基間に挿入し、ループの長さは、システイン残基間の三次元間隔に応じて最適なインテグリン結合のために調整することが好ましい。例えば、ノッチン足場内の隣接するシステイン残基が互いと連結している場合、最適なループは、隣接するシステイン残基が一次配列では離れたシステイン残基と連結している場合よりも短くてよい。他の点では、より長いＲＧＤを含有するループを、高親和性インテグリン結合のために最適なコンフォメーションに制約するために、特定のアミノ酸置換を導入することができる。本明細書で使用されるノッチンポリペプチド足場は、ネイティブなノッチンを短縮する、またはループまたは不必要なシステイン残基またはジスルフィド結合を除去するある特定の修飾を含有してよい。

インテグリン結合性配列を分子（例えば、ノッチンポリペプチド）足場に組み入れることにより、直鎖状または環状ペプチドループよりも剛性かつ安定なリガンド提示のフレームワークがもたらされる。さらに、溶液中の小さなペプチドのコンフォメーションの可撓性は高く、結合に際して大きなエントロピーペナルティが生じる。インテグリン結合性配列をノッチンポリペプチド足場に組み入れることにより、高親和性インテグリン結合に必要なコンフォメーションの制約がもたらされる。さらに、足場により、親和性または安定性成熟化などのタンパク質工学研究を行うためのプラットフォームがもたらされる。

本明細書で使用される場合、「ノッチンタンパク質」という用語は、タンパク質、糖および脂質などの様々な分子標的に結合する小さなタンパク質、一般には２５〜４０アミノ酸の構造ファミリーを指す。それらの三次元構造は、基本的に、３つ〜５つのジスルフィド結合の独特の配置によって定義される。同じシスチンネットワークを有するいくつかの異なるマイクロタンパク質（ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）において見いだされた、１つのジスルフィド架橋が２つの他の鎖内ジスルフィド結合によって限定された大環状分子を交差する特徴的なノットトポロジー（ｋｎｏｔｔｅｄｔｏｐｏｌｏｇｙ）が、このクラスの生体分子の名称の由来である。それらの二次構造含量は一般に低いが、ノッチンは、ジスルフィド結合フレームワークによって安定化された小さな三本鎖逆平行のβ−シートを共有する。シスチンノットタンパク質とも称される、生化学的に明確に定義されたノッチンファミリーのメンバーとしては、Ｅｃｂａｌｌｉｕｍｅｌａｔｅｒｉｕｍ種子由来のトリプシン阻害剤ＥＥＴＩ−ＩＩ、捕食性イモガイＣｏｎｕｓｇｅｏｇｒａｐｈｕｓの毒液由来のニューロンＮ型Ｃａ２＋チャネル遮断薬ω−コノトキシン、アグーチ関連タンパク質（ＡｇＲＰ、Ｍｉｌｌｈａｕｓｅｒら、「ＬｏｏｐｓａｎｄＬｉｎｋｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＩｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｔｈｅＲｅｍａｒｋａｂｌｅＦｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｇｏｕｔｉ−ＲｅｌａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎ」、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、２００３年６月１日；９９４巻（１号）：２７〜３５頁を参照されたい）、オメガアガトキシンファミリーなどが挙げられる。適切なアガトキシン配列［配列番号４１］は、発明者が本出願と共通する米国特許第８，５３６，３０１号に示されている。本明細書に開示されている方法における使用に適した他のアガトキシン配列としては、オメガ−アガトキシン−Ａａ４ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ３７０４５）およびオメガ−アガトキシン−Ａａ３ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ８１７４４）が挙げられる。本明細書に開示されている方法における使用に適した他のノッチン配列としては、ノッチン［Ｂｅｍｉｓｉａｔａｂａｃｉ］（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ６０１２１８．１）、オメガ−リコトキシン（ｌｙｃｏｔｏｘｉｎ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ８５０７９）、ｍｕ−ＯコノトキシンＭｒＶＩＡ＝電位開口型ナトリウムチャネル阻害薬（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ３４９１７）およびＭｏｍｏｒｄｉｃａｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓトリプシン阻害剤Ｉ（ＭＣｏＴＩ−Ｉ）またはＩＩ（ＭｃｏＴＩ−ＩＩ）（それぞれＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ８２４０８およびＰ８２４０９）が挙げられる。

ノッチンタンパク質は、特徴的なジスルフィド連結構造を有する。この構造は、Ｇｅｌｌｙら、「ＴｈｅＫＮＯＴＴＩＮｗｅｂｓｉｔｅａｎｄｄａｔａｂａｓｅ：ａｎｅｗｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｄｅｄｉｃａｔｅｄｔｏｔｈｅｋｎｏｔｔｉｎｓｃａｆｆｏｌｄ」、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅｉｓｓｕｅ、Ｄ１５６〜Ｄ１５９頁にも例示されている。三本鎖β−シートは多くのノッチンに存在する。インテグリン結合性ループの分子トポロジーおよびコンフォメーションと同様に、システイン残基間の間隔が重要である。

「分子足場」という用語は、本明細書に記載のＲＧＤペプチド配列などのインテグリン結合性ループが組み込まれる予め定義された三次元構造を有するポリマーを意味する。「分子足場」という用語は、当技術分野で認められている意味（他の文脈で）を有し、それが本明細書でも意図されている。例えば、Ｓｋｅｒｒａ、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｃａｆｆｏｌｄｓｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２０００年；１３巻：１６７〜１８７頁による概説には、以下の足場：免疫グロブリンスーパーファミリーの抗体の単一ドメイン、プロテアーゼ阻害剤、ヘリックスバンドルタンパク質、ジスルフィドノットペプチドおよびリポカリンが記載されている。適切な分子足場の選択に関する手引きが示されている。

「ノッチンポリペプチド足場」という用語は、本明細書に記載の分子足場として使用するために適したノッチンタンパク質を指す。工学的操作のために望ましいノッチンポリペプチド足場の特性としては、１）ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおける安定性が高いこと、２）全体的なフォールディングを破壊することなく足場のアミノ酸領域を他の配列で置き換えることができること、３）分子の別々の領域を工学的に操作することによって多機能性または二特異性標的化を創出することができること、および４）所望であれば非天然アミノ酸の化学合成および組み入れが可能になる小さなサイズであることが挙げられる。毒性または免疫原性の懸念を低下させるために、治療への適用にはヒトタンパク質に由来する足場が好ましいが、これは必ずしも厳密な要件ではない。タンパク質設計に使用されている他の足場としては、フィブロネクチン（Ｋｏｉｄｅら、１９９８年）、リポカリン（Ｂｅｓｔｅら、１９９９年）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）（Ｈｕｆｔｏｎら、２０００年）、およびテンダミスタット（ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌおよびＨｏｅｓｓ、１９９５年；Ｌｉら、２００３年）が挙げられる。これらの足場は、タンパク質工学のための有用なフレームワークであることが証明されているが、ノッチンなどの分子足場には、サイズが小さく、安定性が高いという別個の利点がある。

本明細書で使用される場合、「ＥＥＴＩ」という用語は、ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋＥｎｔｒｙ（ＰＤＢ）２ＥＴＩを意味する。ノッチンデータベースでのそのエントリーはＥＥＴＩ−ＩＩである。これは、配列：
ＧＣＰＲＩＬＭＲＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号３９）
を有する。

本明細書で使用される場合、「ＡｇＲＰ」という用語は、ＰＤＢエントリー１ＨＹＫを意味する。ノッチンデータベースでのそのエントリーは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＡＧＲＰ＿ＨＵＭＡＮであり、そこでは１２９アミノ酸の全長配列を見ることができる。これは、アミノ酸８７で始まる配列を含む。この構築物には追加的なＧが付加される。これは、Ｊａｃｋｓｏｎら、２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１巻、７５６５頁に記載の通り、Ｃ１０５Ａ変異も包含する。

ループ４からの太字および下線が引かれている部分を本明細書に記載のＲＧＤ配列で置き換える。ループ１および３を以下の角括弧の間に示す：
ＧＣ［ＶＲＬＨＥＳ］ＣＬＧＱＱＶＰＣＣ［ＤＰＣＡＴ］ＣＹＣＲＦＦＮＡＦＣＹＣＲ−ＫＬＧＴＡＭＮＰＣＳＲＴ

本明細書で使用される場合、「インテグリン結合性Ｆｃ融合物」は、「ノッチン−Ｆｃ」と互換的に使用され、ノッチンポリペプチド足場内にインテグリン結合性アミノ酸配列を含み、Ｆｃドメインと作動可能に連結したインテグリン結合性ポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインをインテグリン結合性ポリペプチドのＮ末端と融合する。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインをインテグリン結合性ポリペプチドのＣ末端と融合する。一部の実施形態では、Ｆｃドメインを、リンカーを介してインテグリン結合性ポリペプチドと作動可能に連結する。

本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、ネイティブな免疫グロブリンの、２つの重鎖のそれぞれのＦｃドメイン（またはＦｃ部分）によって形成される一部分を指す。本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメイン」という用語は、単一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖の一部分を指し、ＦｃドメインはＦｖドメインを含まない。そのように、Ｆｃドメインは、「Ｉｇ」または「ＩｇＧ」と称することもできる。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、抗体のパパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まり、Ｃ末端で終わる。したがって、完全なＦｃドメインは、少なくとも、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジ（例えば、上部、中央部、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメインまたはその改変体、部分、もしくは断片の少なくとも１つを含む。他の実施形態では、Ｆｃドメインは、完全なＦｃドメイン（すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）と融合したヒンジドメイン（またはその一部）を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）と融合したＣＨ２ドメイン（またはその一部）を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその一部からなる。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメイン（またはその一部）からなる。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメインからなる。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ２ドメイン（またはその一部）からなる。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠く。本明細書では、Ｆｃドメインとは、一般に、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの全部または一部を含むポリペプチドを指す。これは、これだけに限定されないが、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメインの全体を含むポリペプチド、ならびに例えば、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインのみを含むそのようなペプチドの断片を含む。Ｆｃドメインは、これだけに限定されないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体を含めた、任意の種および／または任意の亜型の免疫グロブリンに由来するものであってよい。ヒトＩｇＧ１定常領域は、ＵｎｉｐｒｏｔＰ０１８５７および表２において見ることができる（すなわち、配列番号１）。ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、表２において見ることができる（すなわち、配列番号２）。上部ヒンジ領域が欠失したヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、表２において見ることができる（すなわち、配列番号３）。Ｆｃドメインは、ネイティブなＦｃおよびＦｃ改変体分子を含む。Ｆｃ改変体およびネイティブなＦｃと同様に、Ｆｃドメインという用語は、全抗体から消化されたものか他の手段によって作製されたものかにかかわらず、単量体形態または多量体（例えば、二量体）形態の分子を含む。Ｆｃドメインに対するアミノ酸残基番号の割り当てはＫａｂａｔの定義に従う。例えば、それぞれがあらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれる、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ（ＴａｂｌｅｏｆＣｏｎｔｅｎｔｓ、ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎおよびＣｏｎｓｔａｎｔＲｅｇｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓの項）、第５版、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ：ＮＩＨ、１巻：６４７〜７２３頁（１９９１年）；Ｋａｂａｔら、「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳＤｅｐｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、第５版、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ１巻：ｘｉｉｉ〜ｘｃｖｉ頁（１９９１年）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ３４２巻：８７８〜８８３頁（１９８９年）を参照されたい。

本明細書に記載の通り、任意のＦｃドメインのアミノ酸配列が天然に存在する免疫グロブリン分子のネイティブなＦｃドメインから変化するように任意のＦｃドメインを修飾することができることが当業者には理解されよう。ある特定の例示的な実施形態では、Ｆｃドメインは、エフェクター機能（例えば、ＦｃγＲ結合）が増大している。

本発明のポリペプチドのＦｃドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来するものであってよい。例えば、ポリペプチドのＦｃドメインは、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインおよびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含む。別の例では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１分子に一部由来し、ＩｇＧ３分子に一部由来するキメラヒンジ領域を含んでよい。別の例では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１分子に一部由来し、ＩｇＧ４分子に一部由来するキメラヒンジを含んでよい。

指定のポリペプチドまたはタンパク質に「由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、ポリペプチドの起源を指す。好ましくは、特定の配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その配列またはその一部分と基本的に同一であり、ここで一部分とは、少なくとも１０〜２０アミノ酸、好ましくは少なくとも２０〜３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも３０〜５０アミノ酸からなる、または当業者がその配列が起源であることを他の方法で同定可能であるアミノ酸配列を有する。別のペプチドに由来するポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して１つまたは複数の変異、例えば、別のアミノ酸残基で置換された、または１つもしくは複数のアミノ酸残基が挿入されたもしくは欠失した１つもしくは複数のアミノ酸残基を有してよい。

ポリペプチドは、天然には存在しないアミノ酸配列を含んでよい。そのような改変体は、ＩＬ−２またはノッチンタンパク質に関しては、出発ＩＬ−２またはノッチンタンパク質に対して１００％未満の配列同一性または類似性を必ず有する。好ましい実施形態では、改変体は、例えば、改変体分子の長さにわたって、出発ポリペプチドのアミノ酸配列に対して約７５％から１００％未満まで、より好ましくは約８０％から１００％未満まで、より好ましくは約８５％から１００％未満まで、より好ましくは約９０％から１００％未満まで（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）および最も好ましくは約９５％から１００％未満までのアミノ酸配列同一性または類似性であるアミノ酸配列を有する。

一実施形態では、出発ポリペプチド配列とそれに由来する配列の間には１アミノ酸の差異がある。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書では、配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入して最大のパーセント配列同一性を達成した後の、出発アミノ酸残基と同一（すなわち、同じ残基）である候補配列内のアミノ酸残基の百分率と定義される。

一実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２に使用するためのＩＬ−２を含むポリペプチドまたはその改変体は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５から選択されるアミノ酸配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含む。ある実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５から選択される連続したアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である連続したアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、２００個、３００個、４００個、または５００個（またはこれらの数の範囲内の任意の整数）の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。

ある実施形態では、ペプチドは、ヌクレオチド配列によりコードされる。ヌクレオチド配列は、クローニング、遺伝子療法、タンパク質の発現および精製、変異導入、それを必要とする宿主へのＤＮＡワクチン接種、例えば受動免疫化のための抗体生成、ＰＣＲ、プライマーおよびプローブ生成などを含めたいくつもの適用に有用であり得る。ある実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４から選択されるＩＬ−２のヌクレオチド配列またはその改変体を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。ある実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４に記載されているヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４に記載されている連続したヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である連続したヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４に記載されているヌクレオチド配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、２００個、３００個、４００個、または５００個（またはこれらの数の範囲内の任意の整数）の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、インテグリン結合性ペプチドを含むポリペプチドまたはその改変体は、配列番号６７〜１３３から選択されるアミノ酸配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含む。ある実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６７〜１３３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６７〜１３３から選択される連続したアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である連続したアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６７〜１３３から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、２００個、３００個、４００個、または５００個（またはこれらの数の範囲内の任意の整数）の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。

本明細書で使用されるＰＫ延長ＩＬ−２またはノッチン−Ｆｃ融合物は、それらが由来する天然に存在するまたはネイティブな配列から配列が変化するが、ネイティブな配列の望ましい活性は保持されるように変更できることも当業者には理解されよう。例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換により、「非必須」アミノ酸残基における保存的置換または変化を行うことができるようになる。変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発などの標準の技法によって導入することができる。

本明細書に記載のポリペプチド（例えば、ＩＬ−２、ＰＫ延長ＩＬ−２、ＰＫ部分、ノッチン、Ｆｃ、ノッチン−Ｆｃなど）は、１つまたは複数のアミノ酸残基、例えば、必須アミノ酸残基または非必須アミノ酸残基における保存的アミノ酸置換を含んでよい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられた置換である。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、それらとして、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、結合性ポリペプチド内の非必須アミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置き換えることが好ましい。別の実施形態では、アミノ酸の一続きを、側鎖ファミリーメンバーの、順序および／または組成が異なる構造的に類似した一続きで置き換えることができる。あるいは、別の実施形態では、飽和変異誘発によってなどでコード配列の全部または一部に沿ってランダムに変異を導入することができ、得られた変異体を本発明の結合性ポリペプチドに組み入れ、所望の標的に結合するそれらの能力についてスクリーニングすることができる。

「プログラム死（ＰｒｏｇｒａｍｍｅｄＤｅａｔｈ）−１（ＰＤ−１）」受容体とは、ＣＤ２８ファミリーに属する免疫抑制性受容体を指す。ＰＤ−１は、ｉｎｖｉｖｏにおいて以前に活性化されたＴ細胞上で主に発現し、２種のリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に結合する。「ＰＤ−１」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）、ｈＰＤ−１の改変体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＤ−１と共通のエピトープを少なくとも１つ有する類似体を含む。完全なｈＰＤ−１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ５１７７３（配列番号５２）の下に見いだすことができる。

「プログラム死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）」は、ＰＤ−１に結合するとＴ細胞活性化およびサイトカイン分泌を下方制御する、ＰＤ−１に対する２種の細胞表面糖タンパク質リガンドのうちの一方である（他方はＰＤ−Ｌ２である）。「ＰＤ−Ｌ１」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＰＤ−Ｌ１（ｈＰＤ−Ｌ１）、ｈＰＤ−Ｌ１の改変体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＤ−Ｌ１と共通のエピトープを少なくとも１つ有する類似体を含む。完全なｈＰＤ−Ｌ１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９ＮＺＱ７（配列番号５３）の下に見いだすことができる。

「細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）」は、Ｔ細胞表面分子であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。このタンパク質は、ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合することによって免疫系を下方制御する。「ＣＴＬＡ−４」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＣＴＬＡ−４（ｈＣＴＬＡ−４）、ｈＣＴＬＡ−４の改変体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＣＴＬＡ−４と共通のエピトープを少なくとも１つ有する類似体を含む。完全なｈＣＴＬＡ−４配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１６４１０（配列番号５４）の下に見いだすことができる。

「リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）」は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することによってリンパ球活性の阻害に関連する抑制性受容体である。この受容体は、Ｔｒｅｇ細胞の機能を増強し、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞機能を阻害する。「ＬＡＧ３」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＬＡＧ３（ｈＬＡＧ３）、ｈＬＡＧ３の改変体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに共通のエピトープを少なくとも１つ有する類似体を含む。完全なｈＬＡＧ３配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１８６２７（配列番号５５）の下に見いだすことができる。

「Ｔ細胞膜タンパク質−３（ＴＩＭ３）」は、Ｔ_Ｈ１細胞応答を阻害することによってリンパ球活性の阻害に関与する抑制性受容体である。そのリガンドは、ガレクチン９であり、これは、種々の型のがんにおいて上方制御される。「ＴＩＭ３」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＴＩＭ３（ｈＴＩＭ３）、ｈＴＩＭ３の改変体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに共通のエピトープを少なくとも１つ有する類似体を含む。完全なｈＴＩＭ３配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ８ＴＤＱｏ（配列番号５６）の下に見いだすことができる。

「Ｂ７ファミリー」とは、受容体が未定義である抑制性リガンドを指す。Ｂ７ファミリーは、Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４を包含し、これらはどちらも腫瘍細胞および腫瘍浸潤細胞において上方制御される。完全なｈＢ７−Ｈ３およびｈＢ７−Ｈ４配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ５ＺＰＲ３およびＡＡＺ１７４０６（配列番号５７および５８）の下に見いだすことができる。

「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）」は、内皮細胞を選択的に刺激して、全て新しい血管の形成のために必要なプロセスである増殖、移動、およびマトリクス分解酵素の産生を行わせる分泌型ジスルフィド連結ホモ二量体である。ＶＥＧＦは、唯一の公知の内皮細胞特異的マイトジェンであることに加えて、血管形成性増殖因子の中でも、高分子に血管浸透性の一過性の増大を誘導するその能力に関して独特なものである。「ＶＥＧＦ」または「ＶＥＧＦ−Ａ」という用語は、例えば、Ｌｅｕｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻：１３０６頁（１９８９年）、およびＨｏｕｃｋら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．、５巻：１８０６頁（１９９１年）に記載されている、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子および関連する１２１アミノ酸、１４５アミノ酸、１８９アミノ酸、および２０６アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子を、その天然に存在する対立遺伝子およびプロセシングされた形態と共に指すために使用される。ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、およびＰ１ＧＦを含めた遺伝子ファミリーの一部である。ＶＥＧＦ−Ａは、２種の高親和性受容体チロシンキナーゼ、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｉｔ−１）およびＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）に主に結合し、後者は、ＶＥＧＦ−Ａの血管内皮細胞分裂促進シグナルの主要なトランスミッターである。

本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント」とは、抗原のＴ細胞受容体による認識の大きさおよび質を調節する共刺激および抑制シグナルを指す。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイントは、抑制シグナルである。ある特定の実施形態では、抑制シグナルは、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用である。ある特定の実施形態では、抑制シグナルは、ＣＤ２８結合にとって代わるＣＴＬＡ−４とＣＤ８０またはＣＤ８６の相互作用である。ある特定の実施形態では、抑制シグナルは、ＬＡＧ３とＭＨＣクラスＩＩ分子の相互作用である。ある特定の実施形態では、抑制シグナルは、ＴＩＭ３とガレクチン９の相互作用である。

本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント遮断薬」とは、１つまたは複数のチェックポイントタンパク質を減少させる、阻害する、干渉する、または調節する分子を指す。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、免疫チェックポイントに関連する抑制シグナルを妨げるものである。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、免疫チェックポイントに関連する抑制シグナル伝達を破壊する抗体またはその断片である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、抑制シグナル伝達を破壊する小分子である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、チェックポイント遮断タンパク質間の相互作用を妨げる抗体、その断片、または抗体模倣体、例えば、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、ＣＴＬＡ−４とＣＤ８０またはＣＤ８６の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、ＬＡＧ３とＭＨＣクラスＩＩ分子の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、ＴＩＭ３とガレクチン９の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。チェックポイント遮断薬は、それらの可溶性形態の分子（またはその変異）の形態、例えば、可溶性ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ１融合物であってもよい。

「好転させること（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」という用語は、病態、例えば、がんの処置における、その予防、重症度もしくは進行の緩和、寛解、または治癒を含めた、あらゆる治療的に有益な結果を指す。

「ｉｎｖｉｖｏ」という用語は、生きている生物体で起こるプロセスを指す。

「哺乳動物」または「被験体」または「患者」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび非ヒトの両方を含み、それらとして、これだけに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、およびブタが挙げられる。

「パーセント同一性」という用語は、２つまたはそれ超の核酸またはポリペプチド配列に関しては、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮまたは当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用して、または目視検査によって測定したところ、最大の対応について比較し、アラインメントした場合に、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を特定の百分率で有する２つまたはそれ超の配列または部分配列を指す。適用に応じて、「パーセント同一性」は、比較される配列のある領域にわたって、例えば、機能性ドメインにわたって存在し得る、あるいは比較される２つの配列の全長にわたって存在する。

配列比較に関して、一般には、一方の配列は、試験配列を比較する参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータにインプットし、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムにより、指定されたプログラムパラメータに基づいて試験配列（複数可）の参照配列に対するパーセント配列同一性を算出する。

配列比較のための最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化による実行によって、または目視検査によって（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌら、下記を参照されたい）行うことができる。

パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの１つの例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトを通じて公的に入手可能である。

本明細書で使用される場合、「ｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカー」という用語は、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１３４）を含む。一実施形態では、ｎ＝１である。一実施形態では、ｎ＝２である。別の実施形態では、ｎ＝３、すなわち、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）３（配列番号１３５）である。別の実施形態では、ｎ＝４、すなわち、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）４（配列番号１３６）である。別の実施形態では、ｎ＝５である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６である。別の実施形態では、ｎ＝７である。さらに別の実施形態では、ｎ＝８である。別の実施形態では、ｎ＝９である。さらに別の実施形態では、ｎ＝１０である。別の例示的なｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１３７）を含む。一実施形態では、ｎ＝１である。一実施形態では、ｎ＝２である。好ましい実施形態では、ｎ＝３である。別の実施形態では、ｎ＝４である。別の実施形態では、ｎ＝５である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６である。別の例示的なｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１３８）を含む。一実施形態では、ｎ＝１である。一実施形態では、ｎ＝２である。好ましい実施形態では、ｎ＝３である。別の実施形態では、ｎ＝４である。別の実施形態では、ｎ＝５である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６である。

本明細書で使用される場合、「半減期」とは、ポリペプチドの血清中濃度または血漿中濃度が、ｉｎｖｉｖｏにおいて例えば天然の機構による分解および／またはクリアランスまたは隔離によって５０％低下するのにかかる時間を指す。本明細書で使用されるＰＫ延長ＩＬ−２は、例えば、分解および／またはクリアランスもしくは隔離に抵抗する、ＨＳＡ、ＭＳＡもしくはＦｃとの融合によって、ペグ化によって、または血清アルブミン分子（例えば、ヒト血清アルブミン）との結合によってｉｎｖｉｖｏにおいて安定化され、その半減期が増大したものである。半減期は、それ自体が公知の任意の様式で、例えば薬物動態解析によってなどで決定することができる。適切な技法は当業者には明らかであり、例えば、一般に、本発明のアミノ酸配列または化合物を被験体に適切な用量で適切に投与するステップ；定期的な間隔で前記被験体から血液試料または他の試料を採取するステップ；前記血液試料中の本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定するステップ；およびこのように得られたデータ（のプロット）から本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が投薬した際の最初のレベルと比較して５０％低下するまでの時間を算出するステップを伴い得る。さらなる詳細は、例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ａ．ら、ＣｈｅｍｉｃａｌＳｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ＡＨａｎｄｂｏｏｋｆｏｒＰｈａｒｍａｃｉｓｔｓおよびＰｅｔｅｒｓら、ＰｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（１９９６年）などの標準のハンドブックにおいて提供される。Ｇｉｂａｌｄｉ，Ｍ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ、改訂２版、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ（１９８２年）も参照する。

本明細書で使用される場合、「小分子」は、分子量が約５００ダルトン未満の分子である。

本明細書で使用される場合、「治療用タンパク質」とは、被験体に医薬として投与することができる任意のポリペプチド、タンパク質、タンパク質改変体、融合タンパク質および／またはその断片を指す。例示的な治療用タンパク質は、インターロイキン、例えば、ＩＬ−７である。

本明細書で使用される場合、「相乗作用」または「相乗効果」とは、２つまたはそれ超の個々の構成成分によって生じる効果に関しては、これらの構成成分を組み合わせて利用した場合の総効果が、各構成成分の単独で作用した個々の効果の合計よりも大きくなる現象を指す。

「十分な量（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔａｍｏｕｎｔ）」または「ために十分な量（ａｍｏｕｎｔｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｔｏ）」という用語は、所望の効果を生じさせるために十分な量、例えば、腫瘍のサイズを縮小するために十分な量を意味する。

「治療有効量」という用語は、疾患の症状を好転させるために有効な量である。治療有効量は、予防は療法とみなすことができるので、「予防的に有効な量」であり得る。

本明細書で使用される場合、「併用療法」とは、各薬剤または療法を、これらの薬剤または療法の実質的に同時の組み合わせおよび同時投与の有益な効果をもたらすレジメンで逐次的に投与することを包含する。併用療法は、個々の要素を違う時間に、かつ／または異なる経路によって投与することができるが、それらが組み合わさって作用して、併用療法の各薬剤または腫瘍処置手法の共同作用（ｃｏ−ａｃｔｉｏｎ）または薬物動態および薬力学効果によって有益な効果がもたらされるような組み合わせも包含する。

本明細書で使用される場合、「約」とは、当業者には理解され、それが使用される文脈に応じていくらかの程度まで変化する。用語が使用される文脈を考慮して当業者に明らかではないこの用語の使用が存在する場合、「約」は、特定の値のプラス１０％またはマイナス１０％までを意味する。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。

本明細書に記載の種々の態様を以下の小節においてさらに詳細に記載する。

ＩＬ−２およびＰＫ延長ＩＬ−２
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、抗原により活性化されるＴ細胞の増殖を誘導し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を刺激するサイトカインである。ＩＬ−２の生物学的活性は、細胞膜にまたがる３つのポリペプチドサブユニット：ｐ５５（ＩＬ−２Ｒα、アルファサブユニット、ヒトではＣＤ２５としても公知）、ｐ７５（ＩＬ−２ＲＰ、ベータサブユニット、ヒトではＣＤ１２２としても公知）およびｐ６４（ＩＬ−２Ｒｙ、ガンマサブユニット、ヒトではＣＤ１３２としても公知）の多サブユニットＩＬ−２受容体複合体（ＩＬ−２Ｒ）によって媒介される。ＩＬ−２に対するＴ細胞応答は、（１）ＩＬ−２の濃度；（２）細胞表面上のＩＬ−２Ｒ分子の数；および（３）ＩＬ−２が占めるＩＬ−２Ｒの数（すなわち、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒの結合相互作用の親和性（Ｓｍｉｔｈ、「ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｉｓＱｕａｎｔａｌ」ＩｎＲｅｃｅｐｔｏｒＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙＡｎｔｉｇｅｎｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，ａｎｄＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ７６６巻：２６３〜２７１頁、１９９５年））を含めた種々の因子に左右される。ＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒ複合体は、リガンドが結合すると内部移行し、異なる構成成分は示差的な選別を受ける。ＩＬ−２Ｒａは、細胞表面に再利用され、ＩＬ−２：ＩＬ−２Ｒｐγ複合体に付随するＩＬ−２はリソソームに送られ分解される。ＩＬ−２は、静脈内（ｉ．ｖ）ボーラスとして投与されると、迅速に全身クリアランスを受ける（最初のクリアランス相の半減期は１２．９分であり、その後、より遅いクリアランス相の半減期は８５分である）（Ｋｏｎｒａｄら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５０巻：２００９〜２０１７頁、１９９０年）。

したがって、一部の実施形態では、全身性ＩＬ−２などのＩＬ−２療法をインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬と組み合わせて有効量で被験体に投与する。

しかし、がん患者における全身性ＩＬ−２投与の転帰（ｏｕｔｃｏｍｅ）は、理想からは程遠い。患者の１５〜２０パーセントが客観的に高用量のＩＬ−２に応答するが、大多数は応答せず、また、多くが、悪心、錯乱、低血圧、および敗血症性ショックを含めた、重度の生命にかかわる副作用を被る。ＩＬ−２処置に伴う重度の毒性は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性に大きく起因する。ＮＫ細胞は、中間の親和性の受容体、ＩＬ−２Ｒｐγ_ｃを発現し、したがって、実際に高用量のＩＬ−２療法の間に患者血清にもたらされるナノモル濃度のＩＬ−２で刺激される。用量を減らすことおよび投薬レジメンを調整することによって血清中濃度を低下させ、したがってＩＬ−２ＲａＰγ_ｃ担持細胞を選択的に刺激するための試みがなされているが、毒性は低くなった一方、そのような処置はまた効果も低い。高用量ＩＬ−２がん療法に付随する毒性問題を考慮して、多数のグループが、治療用抗体を同時に投与することによってＩＬ−２の抗がん有効性を改善するための試みを行ってきた。それにもかかわらず、そのような試みは、だいたい成功しておらず、ＩＬ−２療法単独と比較して追加的な臨床的有用性は得られていないか、限定された臨床的有用性が得られている。したがって、種々のがんに対してより有効に闘うための新規のＩＬ−２療法が必要である。

出願人らは、ＩＬ−２の、種々のがんモデルにおいて腫瘍を制御する能力を、ＩＬ−２を薬物動態改変基に付加することによって実質的に増大させることができることを最近発見した。得られる分子は、以後「薬物動態（ＰＫ）延長ＩＬ−２」と称され、遊離のＩＬ−２と比較して長くなった循環半減期を有する。ＰＫ延長ＩＬ−２の長くなった循環半減期により、ｉｎｖｉｖｏにおける血清中ＩＬ−２濃度を治療的範囲内で維持し、それにより、Ｔ細胞を含めた多くの型の免疫細胞の活性化を増強することが可能になる。ＰＫ延長ＩＬ−２は、薬物動態プロファイルが好都合なものであるので、非修飾ＩＬ−２と比較してより低頻度でより長い期間にわたって投薬することが可能になる。ＰＫ延長ＩＬ−２は、２０１３年５月２１日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０４２０５７号に詳細に記載されており、上記出願は、２０１２年５月２２日出願の米国仮特許出願第６１／６５０，２７７号に対する優先権を主張している。前述の出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

Ａ．ＩＬ−２およびその変異体
ある特定の実施形態では、有効量のヒトＩＬ−２を全身投与する。一部の実施形態では、有効量のＰＫ延長ＩＬ−２を全身投与する。一実施形態では、ＩＬ−２は、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（アルデスロイキン）などのヒト組換えＩＬ−２である。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生されるヒト組換えインターロイキン２産物である。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は、ネイティブなインターロイキン２とは以下のように異なる：ａ）Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）はグリコシル化されていない；ｂ）Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）はＮ末端アラニンを有さない；およびｃ）Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）ではアミノ酸１２５位のシステインがセリンで置換されている。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は、生物学的に活性な、非共有結合により結合した微小凝集物として存在し、平均サイズは２７組換えインターロイキン２分子である。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（アルデスロイキン）は、静脈内注入によって投与するものである。一部の態様では、ＰＫ延長ＩＬ−２のＩＬ−２部分は、野生型ＩＬ−２（例えば、ヒトＩＬ−２の前駆型（配列番号３３）または成熟ＩＬ−２（配列番号３５））である。

ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２は、非修飾ＩＬ−２と比較してＩＬ−２Ｒアルファ受容体に対する親和性が変更されるように（例えば、親和性がより高くなるように）変異させたものである。

部位特異的変異誘発を使用して、ＣＤ２５、すなわちＩＬ−２Ｒαに対して野生型ＩＬ−２と比較して親和性の高い結合を示すＩＬ−２変異体を単離することができる。細胞表面におけるＩＬ−２Ｒαに対するＩＬ−２の親和性を増大させることにより、限られた範囲のＩＬ−２濃度での受容体占有率が上昇し、また、細胞表面においてＩＬ−２の局所的な濃度を上昇させる。

ある特定の実施形態では、本発明は、必ずしもではないが実質的に精製されていてよく、また、高親和性ＣＤ２５結合剤として機能し得るＩＬ−２変異体を特徴とする。ＩＬ−２は、抗原により活性化されるＴ細胞の増殖およびＮＫ細胞の刺激を誘導するＴ細胞増殖因子である。高親和性結合剤である例示的なＩＬ−２変異体としては、配列番号７、２３、２５、２７、２９、および３１に記載されているアミノ酸配列を有するものなどの、ＷＯ２０１３／１７７１８７Ａ２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。ＣＤ２５に対する親和性が増大した別の例示的なＩＬ−２変異体は、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ７，５６９，２１５に開示されている。一実施形態では、ＩＬ−２変異体は、ＣＤ２５に結合しない、例えば、配列番号９および１１に記載されているアミノ酸配列を有するものである。

ＩＬ−２変異体は、ＣＤ２５に結合する、配列番号３３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。例えば、ＩＬ−２変異体は、ＩＬ−２受容体のアルファサブユニットに対する親和性が野生型ＩＬ−２と比較して増大する少なくとも１つの変異（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれ超のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換）を有してよい。マウスＩＬ−２において同定される変異は、配列番号３２の全長ヒトＩＬ−２（核酸配列（受託：ＮＭ０００５８６）；配列番号３３のアミノ酸配列（受託：Ｐ６０５６８））またはシグナルペプチドを有さないヒトＩＬ−２（配列番号３４の核酸配列；配列番号３５のアミノ酸配列）の対応する残基においてなすことができることが理解されるべきである。したがって、ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２のＩＬ−２部分は、ヒトＩＬ−２である。他の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２のＩＬ−２部分は、変異体ヒトＩＬ−２である。

ＩＬ−２変異体は、野生型ＩＬ−２（その前駆型、好ましくは、成熟型）に対してアミノ酸配列が少なくともまたは約５０％、少なくともまたは約６５％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、または少なくともまたは約９９％同一であってよい。変異は、アミノ酸残基の数または含有量の変化からなっていてよい。例えば、ＩＬ−２変異体は、野生型ＩＬ−２よりもアミノ酸残基の数が多くても少なくてもよい。その代わりに、またはそれに加えて、ＩＬ−２変異体は、野生型ＩＬ−２に存在する１つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含有してよい。

例として、配列番号３３の参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、配列番号３３の参照アミノ酸の最大５つの変更を含む以外は参照配列と同一の配列を含むポリペプチドである。例えば、参照配列内のアミノ酸残基の最大５％が欠失しているか別のアミノ酸で置換されていてもよく、参照配列内の総アミノ酸残基の最大５％までのいくつかのアミノ酸が参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ（Ｎ−）末端位もしくはカルボキシ（Ｃ−）末端位に対して行ってもよく、それらの末端位の間のどこにでも、参照配列内の残基の間に個別に、または参照配列内の１つもしくは複数の連続した基で散在して行ってもよい。

置換アミノ酸残基（複数可）は、必ずしもではないが、一般には以下の群内での置換を含む保存的置換であってよい：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。これらの変異は、ＩＬ−２Ｒαと接触するアミノ酸残基におけるものであってよい。

一般に、本発明の実施において使用されるポリペプチドは、合成のもの、または組換え核酸分子の発現によって産生されたものである。ポリペプチドがＰＫ延長ＩＬ−２（例えば、少なくともＩＬ−２とヘキサ−ヒスチジンタグもしくは赤血球凝集素タグまたはＦｃ領域もしくはヒト血清アルブミンなどの異種ポリペプチドとを含有する融合タンパク質）である場合には、ポリペプチドは、ＩＬ−２をコードする１つの配列と異種ポリペプチドの全部または一部をコードする第２の配列を含有するハイブリッド核酸分子によりコードされるものであってよい。

ＩＬ−２変異体を作出するために必要な技法は、当技術分野において常套的なものであり、当業者が過度な実験に頼ることなく実施することができる。例えば、ＩＬ−２内のアミノ酸残基のうちの１つまたは複数の置換からなる変異は、ＰＣＲにより補助される変異誘発技法（例えば、当技術分野で公知であり、かつ／またはＩＬ−２変異体の創出に関して本明細書に記載されている）を使用して創出することができる。ＩＬ−２ポリペプチドに対するアミノ酸残基の欠失または付加からなる変異も標準の組換え技法を用いて作出することができる。欠失または付加の場合には、ＩＬ−２をコードする核酸分子を、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて単に消化する。得られた断片は直接発現させることもでき、例えば、第２の断片とライゲーションすることによってさらに操作することもできる。ライゲーションは、核酸分子の２つの末端が互いと重なる相補的なヌクレオチドを含有する場合に容易になり得るが、平滑末端の断片もライゲーションすることができる。ＰＣＲにより生成された核酸を種々の変異体の配列を生成するために使用することもできる。

組換え分子生物学的技法によって変更された核酸分子の発現によってＩＬ−２変異体を生成することに加えて、ＩＬ−２変異体は、化学的に合成することもできる。化学的に合成されたポリペプチドは、当業者により常套的に生成される。

上記の通り、ＩＬ−２は、ＩＬ−２と異種ポリペプチド（すなわち、ＩＬ−２ではないポリペプチド）とを含む融合またはキメラポリペプチドとして調製することもできる。異種ポリペプチドにより、ｉｎｖｉｖｏにおけるキメラポリペプチドの循環半減期を増大させることができ、したがって、ＩＬ−２の性質をさらに増強することができる。以下でさらに詳細に考察されている通り、循環半減期を増大させるポリペプチドは、ヒトまたはマウス血清アルブミンなどの血清アルブミンであってよい。

他の実施形態では、キメラポリペプチドは、ＩＬ−２と、ＦＬＡＧ配列などの抗原性タグとして機能するポリペプチドとを含んでよい。ＦＬＡＧ配列は、本明細書に記載の通り、ビオチン化された高度に特異的な抗ＦＬＡＧ抗体によって認識される（Ｂｌａｎａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６巻：１０１４頁、１９９２年；ＬｅＣｌａｉｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９巻：８１４５頁、１９９２年も参照されたい）。ある特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、Ｃ末端ｃ−ｍｙｃエピトープタグをさらに含む。

キメラポリペプチドは、当業者の実施する能力の範囲内に十分に入る従来の分子生物学的技法だけを使用して構築することができる。

ａ．ＩＬ−２をコードする核酸分子
ＩＬ−２は、単独でまたは本明細書に記載のものなどのキメラポリペプチドの一部として、核酸分子の発現によって得ることができる。したがって、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４に記載されている核酸配列を有するものなどの、ＩＬ−２またはＩＬ−２変異体を含有するポリペプチドをコードする核酸分子は本発明の範囲内に入るとみなされる。単にＩＬ−２変異体はそれらと野生型ＩＬ−２との同一性に関して記載することができるので、ＩＬ−２変異体をコードする核酸分子は、野生型ＩＬ−２をコードする核酸分子に対してある特定の同一性を必ず有する。例えば、ＩＬ−２変異体をコードする核酸分子は、全長野生型ＩＬ−２（例えば、配列番号３２）またはシグナルペプチドを有さない野生型ＩＬ−２（例えば、配列番号３４）をコードする核酸と少なくとも５０％、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、および最も好ましくは少なくとも９５％（例えば、９９％）同一であってよい。

本発明の核酸分子は、天然に存在する配列、または天然に存在するものとは異なるが、遺伝暗号の縮重に起因して同じポリペプチドをコードする配列を含有してよい。これらの核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはホスホルアミダイトに基づく合成によって作製されるものなどの合成ＤＮＡ）、またはこれらの型の核酸内のヌクレオチドの組み合わせもしくは修飾からなっていてよい。さらに、核酸分子は、二本鎖であっても一本鎖（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか）であってもよい。

核酸分子は、ポリペプチドをコードする配列に限定されず、コード配列（例えば、ＩＬ−２のコード配列）の上流または下流にある非コード配列の一部または全部も含んでよい。分子生物学の当業者は、核酸分子を単離するための常套的な手順に詳しい。核酸分子は、例えば、ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで処理することによって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することによって生成することができる。核酸分子がリボ核酸（ＲＮＡ）である場合では、分子は、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏ転写によって作製することができる。

単離された核酸分子は、天然の状態ではそのようには見いだされない断片を含み得る。したがって、本発明は、核酸配列（例えば、ＩＬ−２変異体をコードする配列）がベクター（例えば、プラスミドもしくはウイルスベクター）または異種細胞のゲノム（または同種の細胞のゲノムの、天然の染色体上の位置以外の位置）に組み入れられた組換え分子の使用を包含する。

上記の通り、本発明のＩＬ−２変異体は、キメラポリペプチドの一部として存在してよい。上記の異種ポリペプチドに加えて、またはその代わりに、本発明の核酸分子は、「マーカー」または「レポーター」をコードする配列を含有してよい。マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子の例としては、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ、Ｇ４１８^ｒ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃｚ（β−ガラクトシダーゼをコードする）、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。本発明の実施に関連する標準の手順の多くと同様に、追加的な有用な試薬、例えば、マーカーまたはレポーターとしての機能を果たし得る追加的な配列は、当業者には分かるであろう。

本発明の核酸分子は、哺乳動物の細胞などの任意の生物細胞から得たＩＬ−２をコードするＤＮＡに変異を導入することによって得ることができる。したがって、本明細書で使用される核酸（およびそれらにコードされるポリペプチド）は、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、サル、ヒヒ、イヌ、またはネコのものであってよい。一般には、核酸分子は、ヒトの核酸分子である。

Ｂ．ＰＫ延長基
上記の通り、ＩＬ−２または変異体ＩＬ−２を、循環半減期を増大させるＰＫ延長基と融合する。ＰＫ延長基の非限定的な例は下に記載されている。ＩＬ−２またはその改変体の循環半減期を増大させる他のＰＫ基もＰＫ延長ＩＬ−２に適用可能であることが理解されるべきである。

ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２の血清中半減期は、単独のＩＬ−２（すなわち、ＰＫ延長基と融合していないＩＬ−２）と比較して増大している。ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２の血清中半減期は、単独のＩＬ−２の血清中半減期と比較して少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、４００％、６００％、８００％、または１０００％長い。他の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２の血清中半減期は、単独のＩＬ−２の血清中半減期の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍、または５０倍である。ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２の血清中半減期は、少なくとも１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間、または２００時間である。

ａ．血清アルブミンおよび血清アルブミン結合性タンパク質
ある特定の実施形態では、ＰＫ延長基は、血清アルブミンまたはその断片である。血清アルブミンとタンパク質を融合する方法は、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０１４４５９９、ＵＳ２００７／００４８２８２、およびＵＳ２０１１／００２０３４５に開示されている。ある特定の実施形態では、ＰＫ延長基は、ＵＳ５，８７６，９６９、ＷＯ２０１１／１２４７１８、ＷＯ２０１３／０７５０６６、およびＷＯ２０１１／０５１４７８９に開示されているものなどのＨＳＡまたはその改変体もしくは断片である。

ある特定の実施形態では、ＰＫ延長基は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００５／０２８７１５３、ＵＳ２００７／０００３５４９、ＵＳ２００７／０１７８０８２、ＵＳ２００７／０２６９４２２、ＵＳ２０１０／０１１３３３９、ＷＯ２００９／０８３８０４、およびＷＯ２００９／１３３２０８に記載されているものなどの血清アルブミン結合性タンパク質である。

ｂ．ペグ化
ある特定の実施形態では、本明細書で使用されるＰＫ延長ＩＬ−２は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ドメインを含む。ペグ化により、タンパク質に循環半減期の増大が付与されることが当技術分野において周知である。ペグ化の方法は周知であり、例えば、その全てが参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ７，６１０，１５６、ＵＳ７，８４７，０６２に開示されている。

ＰＥＧは、市販もされており、当技術分野で周知の方法に従ってエチレングリコールを開環重合させることによって調製することもできる、周知の水溶性ポリマーである（ＳａｎｄｌｅｒおよびＫａｒｏ、ＰｏｌｙｍｅｒＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、３巻、１３８〜１６１頁）。「ＰＥＧ」という用語は、サイズまたはＰＥＧの末端における修飾については問わず、任意のポリエチレングリコール分子を包含するように広範に使用され、式：Ｘ−０（ＣＨ_２ＣＨ_２０）_ｎ−１ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ（式中、ｎは２０〜２３００であり、ＸはＨまたは末端修飾、例えば、Ｃ_１〜４アルキルである）で表される。一実施形態では、本発明のＰＥＧは一方の末端がヒドロキシまたはメトキシで終わる、すなわち、ＸがＨまたはＣＨ_３である（「メトキシＰＥＧ」）。ＰＥＧは、結合反応に必要な別の化学基；分子の化学合成に起因する別の化学基；または分子の部分の最適な距離のためのスペーサーである別の化学基を含有してよい。さらに、そのようなＰＥＧは、連結した１つまたは複数のＰＥＧ側鎖からなっていてよい。ＰＥＧ鎖を１つ超有するＰＥＧは、マルチアームまたは分枝ＰＥＧと称される。分枝ＰＥＧは、例えば、グリセロール、ペンタエリスリトール（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｏｌ）、およびソルビトールを含めた種々のポリオールにポリエチレンオキシドを付加することによって調製することができる。例えば、４アーム分枝ＰＥＧは、ペンタエリスリトールおよびエチレンオキシドから調製することができる。分枝ＰＥＧは、例えば、ＥＰ−Ａ０４７３０８４およびＵＳ５，９３２，４６２に記載されており、どちらも参照により本明細書に組み込まれる。ＰＥＧの１つの形態は、リシンの第一級アミノ基を介して連結した２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）を含む（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉら、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ１９９５年：６巻：６２〜９頁）。

一実施形態では、ペグ化ＩＬ−２は、部位特異的ペグ化によって、特に、ＰＥＧをＮ末端またはＣ末端のシステイン部分とコンジュゲーションすることによって作製する。ＰＥＧ部分は、アミンとのコンジュゲーションを含めた、他の化学反応によって付加することもできる。

ペプチドまたはタンパク質へのＰＥＧのコンジュゲーションは、一般に、ＰＥＧを活性化し、活性化ＰＥＧ中間体を標的タンパク質／ペプチドと直接カップリングすること、またはリンカーとカップリングし、その後それを活性化し、標的タンパク質／ペプチドとカップリングすることを伴う（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、ＪＢＣ１９７７年；２５２巻：３５７１頁およびＪＢＣ１９７７年；２５２巻：３５８２頁、およびＨａｒｒｉｓら、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ編）ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ：ＮｅｗＹｏｒｋ、１９９２年；第２１章および第２２章を参照されたい）。

種々の分子量の形態、例えば、約１，０００ダルトン（Ｄａ）から１００，０００Ｄａまで（ｎ＝２０〜２３００）のＰＥＧをＩＬ−２とコンジュゲートするために選択することができる。ＰＥＧ中の反復単位「ｎ」の数は、ダルトン単位で記載される分子量に関して概算される。活性化リンカー上のＰＥＧの合計分子量は、医薬用途に適するものであることが好ましい。したがって、一実施形態では、ＰＥＧ分子の分子量は、１００，０００Ｄａを超えない。例えば、３つのＰＥＧ分子がリンカーに付加されており、各ＰＥＧ分子が同じ分子量１２，０００Ｄａ（各ｎ＝約２７０）を有する場合、リンカー上のＰＥＧの総分子量は、約３６，０００Ｄａ（総ｎ＝約８２０）である。リンカーに付加したＰＥＧの分子量は異なってもよく、例えば、リンカー上の３分子のうちの２つのＰＥＧ分子がそれぞれ５，０００Ｄａ（各ｎ＝約１１０）であってよく、１つのＰＥＧ分子が１２，０００Ｄａ（ｎ＝約２７０）であってよい。

当業者は、ＰＥＧの適切な分子量を、例えば、ペグ化ＩＬ−２を治療上でどのように使用するか、所望の投与量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性、免疫原性、および他の検討事項に基づいて選択することができる。ＰＥＧおよびタンパク質の性質を増強するためのその使用の考察に関しては、Ｎ．Ｖ．Ｋａｔｒｅ、ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ１９９３年：１０巻：９１〜１１４頁を参照されたい。

本発明の一実施形態では、ＰＥＧ分子をＩＬ−２のアミノ基、例えばリシンなどと反応するように活性化することができる（ＢｅｎｃｈａｍＣ．Ｏ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３１巻、２５頁（１９８３年）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１巻、１４１頁（１９８５年）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら、ＰｏｌｙｍｅｒｉｃＤｒｕｇｓａｎｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ、ａｄｒｓ９−１１０ＡＣＳＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ４６９巻（１９９９年）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら、Ｅｕｒｏｐ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．、１９巻、１１７７〜１１８３頁（１９８３年）；Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｃ．ら、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１２巻、１１９〜１２８頁（１９９０年））。

一実施形態では、ＰＥＧの炭酸エステルを使用してＰＥＧ−ＩＬ−２コンジュゲートを形成する。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）をＰＥＧとの反応に使用して活性な混合ＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネートを形成することができ、その後それをリンカーの求核基またはＩＬ−２のアミノ基と反応させることができる（米国特許第５，２８１，６９８号および米国特許第５，９３２，４６２号を参照されたい）。同じような型の反応では、１，１’−（ジベンゾトリアゾリル）カーボネートおよびジ−（２−ピリジル）カーボネートをＰＥＧと反応させて、それぞれＰＥＧ−ベンゾトリアゾリルおよびＰＥＧ−ピリジル混合カーボネート（米国特許第５，３８２，６５７号）を形成することができる。

ＩＬ−２のペグ化は、最先端の方法に従って、例えば、ＩＬ−２と求電子的に活性なＰＥＧ（ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＣｏｒｐ．、ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｓｈｅａｒｗａｔｅｒｃｏｒｐ．ｃｏｍ）を反応させることによって実施することができる。好ましいＰＥＧ試薬は、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオネート（ＰＥＧ−ＳＰＡ）、ブタノエート（ＰＥＧ−ＳＢＡ）、ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネートまたはｍＰＥＧ２−ＮＨＳなどの分枝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃら、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．６巻（１９９５年）６２〜６９頁）。

別の実施形態では、ＰＥＧ分子をＩＬ−２上のスルフヒドリル基とカップリングすることができる（Ｓａｒｔｏｒｅ，Ｌ．ら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２７巻、４５頁（１９９１年）；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ｂｉｏｃｏｎ．Ｃｈｅｍ．、７巻、３６３〜３６８頁（１９９６年）；Ｇｏｏｄｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０年）８巻、３４３頁；ＵＳ５，７６６，８９７）。ＵＳ６，６１０，２８１およびＵＳ５，７６６，８９７には、スルフヒドリル基とカップリングすることができる例示的な反応性ＰＥＧ種が記載されている。

ＰＥＧ分子をＩＬ−２上のシステイン残基とコンジュゲートするある特定の実施形態では、システイン残基はＩＬ−２に対してネイティブなものであり、他の実施形態では、１つまたは複数のシステイン残基をＩＬ−２内に工学的に操作する。ＩＬ−２のコード配列に変異を導入してシステイン残基を生成することができる。これは、例えば、１つまたは複数のアミノ酸残基をシステインに変異させることによって達成することができる。システイン残基に変異させるのに好ましいアミノ酸としては、セリン、トレオニン、アラニンおよび他の親水性の残基が挙げられる。システインに変異させる残基は、表面に露出した残基であることが好ましい。残基の表面接近可能性を一次配列またはタンパク質に基づいて予測するためのアルゴリズムが当技術分野で周知である。

別の実施形態では、ペグ化ＩＬ−２は、リンカーに共有結合により付加された１つまたは複数のＰＥＧ分子を含む。

一実施形態では、ＩＬ−２をＣ末端においてペグ化する。特定の実施形態では、Ｃ末端アジド−メチオニンを導入し、その後、メチル−ＰＥＧ−トリアリールホスフィン化合物をシュタウディンガー反応によってコンジュゲートすることによって、タンパク質をＣ末端においてペグ化する。このＣ末端コンジュゲーション方法は、Ｃａｚａｌｉｓら、Ｃ−ＴｅｒｍｉｎａｌＳｉｔｅ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＰＥＧｙｌａｔｉｏｎｏｆａＴｒｕｎｃａｔｅｄＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎＭｕｔａｎｔｗｉｔｈＲｅｔｅｎｔｉｏｎｏｆＦｕｌｌＢｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ．２００４年；１５巻（５号）：１００５〜１００９頁に記載されている。

ＩＬ−２のモノペグ化（ｍｏｎｏｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、ＷＯ９４／０１４５１に記載されている一般的な方法に従って実現することもできる。ＷＯ９４／０１４５１には、修飾末端アミノ酸アルファ炭素反応性基を用いて組換えポリペプチドを調製するための方法が記載されている。方法のステップは、組換えポリペプチドを形成し、Ｎ末端アルファ−アミンおよびＣ末端アルファ−カルボキシルにおいて、それを１つまたは複数の生物学的に付加される保護基で保護することを伴う。次いで、ポリペプチドを化学保護剤と反応させて反応性側鎖基を選択的に保護し、それにより、側鎖基が修飾されるのを防ぐ。次いで、ポリペプチドを生物学的保護基に特異的な切断試薬を用いて切断して、保護されていない末端アミノ酸アルファ炭素反応性基を形成する。保護されていない末端アミノ酸アルファ炭素反応性基を化学修飾剤を用いて修飾する。次いで、側鎖が保護され末端が修飾された単一コピーポリペプチドを側鎖基において脱保護して、末端が修飾された組換え単一コピーポリペプチドを形成する。方法におけるステップの数および順序は、ポリペプチドのＮ末端アミノ酸および／またはＣ末端アミノ酸における選択的な修飾を達成するために変化させることができる。

コンジュゲーション反応におけるＩＬ−２の活性化ＰＥＧに対する比は、約１：０．５から１：５０まで、約１：１から１：３０まで、または約１：５から１：１５までであってよい。種々の水性緩衝液を使用して、ＩＬ−２またはその改変体へのＰＥＧの共有結合性の付加を触媒することができる。一実施形態では、使用する緩衝液のｐＨは、約７．０から９．０までである。別の実施形態では、ｐＨは、わずかに塩基性の範囲内、例えば、約７．５から８．５までである。ｐＫａが中性付近のｐＨ範囲である緩衝液、例えば、リン酸緩衝液を使用することができる。

サイズ排除（例えば、ゲル濾過）およびイオン交換クロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の従来の分離および精製技法を使用してペグ化ＩＬ−２を精製することができる。産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離することもできる。分離することができる産物としては、モノペグ化ＩＬ−２、ジペグ化ＩＬ−２、トリペグ化ＩＬ−２、ポリペグ化ＩＬ−２およびペグ化されていないＩＬ−２ならびに遊離のＰＥＧが挙げられる。モノＰＥＧコンジュゲートの百分率は、溶出ピーク付近のより広範な画分をプールして組成物中のモノＰＥＧの百分率を上昇させることによって制御することができる。

一実施形態では、本発明のペグ化ＩＬ−２は、１つ、２つまたはそれ超のＰＥＧ部分を含有する。一実施形態では、ＰＥＧ部分（複数可）は、タンパク質の表面上にあるアミノ酸残基に結合しており、かつ／またはＣＤ２５と接触する表面から離れている。一実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−２中のＰＥＧの合計分子量または総分子量は、約３，０００Ｄａから６０，０００Ｄａまで、場合によって約１０，０００Ｄａから３６，０００Ｄａまでである。一実施形態では、ペグ化ＩＬ−２中のＰＥＧは、実質的に直線状の直鎖ＰＥＧである。

一実施形態では、本発明のペグ化ＩＬ−２は、非修飾タンパク質に付随する生物学的活性の少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を保持することが好ましい。一実施形態では、生物学的活性とは、ＣＤ２５に結合する能力を指す。ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の血清クリアランス速度は、非修飾ＩＬ−２のクリアランス速度と比較して約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはさらには９０％低下し得る。ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の循環半減期は、非修飾ＩＬ−２の半減期と比較して増強され得る。ＰＥＧ−ＩＬ−２またはその改変体の半減期は、非修飾ＩＬ−２の半減期と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％または５００％、またはさらには１０００％増強され得る。ある特定の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、例えば、緩衝食塩溶液中または血清中などでタンパク質半減期を決定する。他の実施形態では、タンパク質半減期は、動物の血清または他の体液中でのタンパク質の半減期などのｉｎｖｉｖｏにおける循環半減期である。

ｃ．他のＰＫ延長基
ある特定の実施形態では、ＰＫ延長基は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ７，１７６，２７８およびＵＳ８，１５８，５７９に開示されているトランスフェリンである。

ある特定の実施形態では、ＰＫ延長基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００７／０１７８０８２に開示されているものなどの血清免疫グロブリン結合性タンパク質である。

ある特定の実施形態では、ＰＫ延長基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１２／００９４９０９に開示されているものなどの、血清アルブミンに結合するフィブロネクチン（Ｆｎ）に基づく足場ドメインタンパク質である。フィブロネクチンに基づく足場ドメインタンパク質を作出する方法もＵＳ２０１２／００９４９０９に開示されている。Ｆｎ３に基づくＰＫ延長基の非限定的な例は、Ｆｎ３（ＨＳＡ）、すなわち、ヒト血清アルブミンに結合するＦｎ３タンパク質である。

ｄ．Ｆｃドメイン
ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２は、ＷＯ２０１３１７７１８７に記載されているＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、抗原に結合する可変領域を含有しない。本明細書に記載のＰＫ延長ＩＬ−２を作製するために有用なＦｃドメインは、いくつもの異なる供給源から得ることができる。ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２のＦｃドメインは、ヒト免疫グロブリンに由来する。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号１）に由来する。ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、配列番号２に記載されている。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、上部ヒンジ領域（配列番号３）を有さない。しかし、Ｆｃドメインは、例えば、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク）種を含めた別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来するものであってよいことが理解される。さらに、Ｆｃドメインまたはその一部は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含めた任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含めた任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来するものであってよい。

一部の態様では、ＰＫ延長ＩＬ−２は、変異体Ｆｃドメインを含む。一部の態様では、ＰＫ延長ＩＬ−２は、変異体ＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む。一部の態様では、変異体Ｆｃドメインは、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメインに１つまたは複数の変異を含む。一部の態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｄ２６５Ａ変異を含む。

一実施形態では、本発明のＰＫ延長ＩＬ−２は、完全なＦｃ領域の１つまたは複数の定常領域ドメインを欠く、すなわち、それらが部分的にまたは完全に欠失している。ある特定の実施形態では、本発明のＰＫ延長ＩＬ−２は、ＣＨ２ドメイン全体を欠く。ある特定の実施形態では、本発明のＰＫ延長ＩＬ−２は、ＩｇＧ１ヒト定常領域ドメインをコードするベクター（例えば、ＩＤＥＣＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ）に由来する、ＣＨ２ドメインが欠失したＦｃ領域を含む（例えば、ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２を参照されたい）。この例示的なベクターは、ＣＨ２ドメインが欠失し、ドメインが欠失したＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターがもたらされるように工学的に操作されたものである。これらの例示的な構築物は、結合性ＣＨ３ドメインとそれぞれのＦｃドメインのヒンジ領域が直接融合するように工学的に操作されることが好ましいことに留意されたい。

インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質
インテグリンは、固形腫瘍の開始、進行および転移に極めて重要な一連の多様な細胞機能を調節する細胞外マトリクス接着受容体のファミリーである。腫瘍の進行における重要性により、インテグリンはがん療法の魅力的な標的となっており、また、種々のがんの型の処置を可能とする。がん性細胞上に存在するインテグリンとしては、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、およびα_５β_１が挙げられる。

ノッチンタンパク質は、熱およびタンパク質分解に対する安定性が高く、変異誘発を許容する小さく緻密なペプチドであり、そのことにより、良好な分子足場になる。これらのペプチドは、「ノット」コアを形成する少なくとも３つのジスルフィド結合を含有する。これらは、表面に露出したいくつかのループも含有し、これらのループが標的に結合することが可能になっている。これらのループは、特異的な標的に高親和性で結合するように工学的に操作することができ、これにより、療法のための有用なツールになる。

本発明は、治療的利益を付与する、Ｆｃドナーと融合した、インテグリンに結合することが可能なＲＧＤ配列を有する工学的に操作されたノッチンポリペプチド足場（「ノッチン−Ｆｃ」とも称される）の使用を伴う。上記の通り、半減期を延長するためにＦｃ断片がタンパク質および／または治療薬に付加されている。本明細書で使用されるノッチン−Ｆｃに関しては、Ｆｃのエフェクター機能は、ＰＫ延長ＩＬ−２などの全身性ＩＬ−２と合わせて使用した場合、様々ながんの処置に寄与する。ある特定の実施形態では、２種のインテグリンに同時に結合するノッチン−Ｆｃを使用する（２．５Ｄ、配列番号９３または９５）。ある特定の実施形態では、表１に反映されている、３種のインテグリンに同時に結合するノッチン−Ｆｃを使用する（２．５Ｆ、配列番号９４または９６）。

Ａ．ノッチンポリペプチド足場を工学的に操作する方法
特異的なインテグリン結合を付与するために、ノッチンポリペプチド足場を使用してインテグリン結合性配列を好ましくはループの形態で挿入する。インテグリン結合は、ノッチンポリペプチド足場内に、ＲＧＤペプチドなどのインテグリン結合性ペプチド配列を挿入することによって工学的に操作されることが好ましい。一部の実施形態では、インテグリン結合性ペプチド配列の挿入により、ネイティブなノッチンタンパク質の部分が置き換えられる。例えば、一実施形態では、ＲＧＤペプチド配列をネイティブな溶媒露出ループに、ループの全部または一部を、１つまたは複数のインテグリンへの結合に関して選択されたＲＧＤを含有するペプチド配列（例えば、５〜１２アミノ酸配列）で置き換えることによって挿入する。溶媒露出ループ（すなわち、表面上にある）は、一般に、ネイティブなノッチンタンパク質配列内のジスルフィド連結したシステイン残基によって係留されている。インテグリン結合性置き換えアミノ酸配列は、ループ部分のコドンをランダム化し、工学的に操作されたペプチドを発現させ、所定のリガンドへの結合性が最も高い変異体を選択することによって得ることができる。この選択ステップを、以前のステップから最も密接に結合するタンパク質を取得し、ループを再度ランダム化して、数回繰り返すことができる。

インテグリン結合性ポリペプチドは、いくつものやり方で修飾することができる。例えば、ポリペプチドを内部でさらに架橋させることもでき、互いと架橋させることもでき、ＲＧＤループを他の架橋した分子足場に移植することもできる。タンパク質またはペプチドバイオコンジュゲートを調製するための市販の架橋結合試薬がいくつも存在する。これらの架橋剤の多くは、タンパク質の側鎖内の遊離のアミン基またはスルフヒドリル基を通じた生体分子の二量体ホモコンジュゲーションまたはヘテロコンジュゲーションを可能にするものである。つい最近、炭水化物基とヒドラジド部分のカップリングを伴う他の架橋結合方法が開発された。これらの試薬により、バイオコンジュゲートの調製における化学的経験が少ないまたはない研究者に都合のよい容易な架橋結合戦略がもたらされている。

ＥＥＴＩ−ＩＩノッチンタンパク質（配列番号３９）は、ジスルフィドノットトポロジーを含有し、変異誘発に適した多数の溶媒露出ループを有する。好ましい実施形態ではＥＥＴＩ−ＩＩを分子足場として使用する。

分子足場として使用することができるノッチンタンパク質の別の例は、ＡｇＲＰまたはアガトキシンである。ＡｇＲＰのアミノ酸配列（配列番号４０）とアガトキシンのアミノ酸配列（配列番号４１）は異なるが、それらの構造は同一である。例示的なＡｇＲＰノッチンは表１に見いだされる。

ＡｇＲＰの工学的に操作されたさらなるノッチンは、上で参照したＣｏｃｈｒａｎらに対するＵＳ２００９／０２５７９５２（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の通り作出することができる。ＡｇＲＰノッチン融合物は、上に例示されている通りＡｇＲＰループ１、２および３、ならびにループ４を使用して調製することができる。

本ポリペプチドは、組換えＤＮＡによって作製することもでき、ペプチド合成機を使用して固相で合成することもでき、これは、本明細書に記載の３つ全ての足場のペプチドに対して行われている。本ポリペプチドは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）または他の標識との反応によってＮ末端にさらにキャップ形成することもでき、さらに、追加的な架橋結合反応のために選択されたアミノ酸残基を用いて合成することもできる。切断時にＣ末端アミドを生じさせるためにＴｅｎｔａＧｅｌＳＲＡＭＦｍｏｃ樹脂（ＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍＴｅｃｈ）を使用することができる。ペプチド脱保護の間のチアゾリドン形成およびフルオレセイン放出を防止するためにＢ−アラニンをＮ末端アミノ酸として使用する（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６年）。ペプチドを樹脂から切断し、８％トリフルオロ酢酸、２％トリイソプロピルシラン、５％ジチオスレイトールを用いて側鎖を脱保護し、最終産物をエーテル沈殿によって回収する。ペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸中アセトニトリル勾配およびＣ４またはＣ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）を使用して逆相ＨＰＬＣによって精製し、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）またはエレクトロスプレーイオン化−質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を使用して検証する。

本ペプチドを組換えＤＮＡによって作製する場合、選択されたペプチドをコードする発現ベクターを適切な宿主に形質転換する。宿主は、上記の通り適切なペプチドフォールディングおよびジスルフィド結合の形成が確実になるように選択するべきである。ＥＥＴＩ−ＩＩなどのある特定のペプチドは、細菌などの原核生物宿主において発現させると適正にフォールディングされ得る。

本ペプチドの二量体複合体、三量体複合体、および四量体複合体は、上記配列の遺伝子操作によって、または合成架橋剤と、例えばペプチドのＣ末端にシステイン残基が導入された工学的に操作されたペプチドの反応によって形成することができる。これらのオリゴマーペプチド複合体は、ゲル濾過によって精製することができる。本ペプチドのオリゴマーは、多数のペプチド配列を端から端までコードするベクターを調製することによって調製することができる。また、多量体は、例えば、米国特許第６，２６５，５３９号に記載のように、ペプチドを複合体化することによって調製することができる。そこでは、活性なＨＩＶペプチドを、ペプチドのアミノ末端残基を変更することによって多量体形態に調製し、したがって、アミノ末端リシル残基およびグリシル残基などの１つ〜約５つのアミノ酸残基を含有するスペーサーペプチドとペプチド結合させて複合ポリペプチドを形成する。あるいは、各ペプチドを、アミノ末端およびカルボキシ末端のそれぞれにシステイン（Ｃｙｓ）残基が含有されるように合成する。次いで、得られた、ジ−システインが末端をなす（ジ−Ｃｙｓ）ペプチドを酸化してジ−Ｃｙｓペプチド単量体をポリマーまたは環状ペプチド多量体に重合させる。多量体は、リシンコアマトリクスを利用して固相ペプチド合成によって調製することもできる。本ペプチドは、ナノ粒子として調製することもできる。「ＭｕｌｔｉｖａｌｅｎｔＥｆｆｅｃｔｓｏｆＲＧＤＰｅｐｔｉｄｅｓＯｂｔａｉｎｅｄｂｙＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅＤｉｓｐｌａｙ」、Ｍｏｎｔｅｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．；２００６年；４９巻（２０号）６０８７〜６０９３頁を参照されたい。ＥＥＴＩ二量体化は、本ＥＥＴＩ−ＩＩペプチドを用いて、ＥＥＴＩ−ＩＩ二量体化の論文である、「Ｇｒａｆｔｉｎｇｏｆｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｍｉｍｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓｉｎｔｏｃｙｓｔｉｎｅｋｎｏｔｍｉｎｉｐｒｏｔｅｉｎｓｙｉｅｌｄｓｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎａｎｔａｇｏｎｉｓｔａｎｄａｇｏｎｉｓｔｓ」、Ｋｒａｕｓｅら、ＦＥＢＳＪｏｕｒｎａｌ；２００６年；２７４巻、８６〜９５頁に従って行うことができる。これは、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６５６１０においてさらに記載されている。

インテグリン結合の増強に関するフィブロネクチンおよび他の接着タンパク質上の相乗的な部位が同定されている（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６年；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９４年；Ａｏｔａら、１９９４年；Ｈｅａｌｙら、１９９５年）。異なるインテグリン特異的モチーフを１つの可溶性分子に組み入れることができることは、治療薬開発に重要な影響を及ぼすと思われる。相乗的な結合効果を有するインテグリン結合性タンパク質を創出するために、ヘテロ官能的な特異性（ｈｅｔｅｒｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有する架橋剤を使用することができる。さらに、これらの同じ架橋剤は、二特異性標的化分子を創出するために、または治療への適用のために放射性核種もしくは毒性薬剤を送達するためのビヒクルとして容易に使用することができる。

Ｂ．インテグリン結合性ペプチド
Ｆｃ融合物に使用するためのインテグリン結合性ポリペプチドとしては、インテグリン結合性ループ（例えば、ＲＧＤペプチド配列）およびノッチンポリペプチド足場が挙げられる。そのようなインテグリン結合性ポリペプチドは、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５３６，３０１号に記載されている。米国特許第８，５３６，３０１号に記載の通り、インテグリン結合性ポリペプチドは、結合特異性および効力に影響を及ぼすことなく、非ＲＧＤ残基をある特定の程度まで変化させることができる。例えば、１１残基のうちの３を変化させた場合、２．５Ｄに対して約７０％の同一性を有することになる。表１に、本発明の範囲に入る例示的なインテグリン結合性ポリペプチド、およびそれらの特異的なノッチンポリペプチド足場（例えば、ＥＥＴＩ−ＩＩまたはＡｇＲＰ）が示されている。Ｆｃ融合物に使用するための好ましいインテグリン結合性ポリペプチドは、ペプチド２．５Ｄおよび２．５Ｆである。

ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、またはα_５β_１に別々に結合する。

ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、α_ｖβ_３およびα_ｖβ_５に同時に結合する。

ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、およびα_５β_１に同時に結合する。

ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ループは、工学的に操作されたＥＥＴＩ−ＩＩ足場内にある。ある特定の実施形態では、ＥＥＴＩ−ＩＩ足場の１５位のリシンがセリンで置き換えられている。ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、配列番号４２または４３に記載のアミノ酸配列を含み、Ｘ_１は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｈ、Ｄ、およびＮからなる群より選択され；Ｘ_２は、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｅ、およびＱからなる群より選択され；Ｘ_３は、Ｇ、Ａ、およびＰからなる群より選択され；Ｘ_７は、ＷおよびＮからなる群より選択され；Ｘ_８は、Ａ、Ｐ、およびＳからなる群より選択され；Ｘ_９は、ＰおよびＲからなる群より選択され；Ｘ_１０は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、およびＥからなる群より選択され；Ｘ_１１は、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、およびＥからなる群より選択される。さらなる実施形態では、インテグリン結合性Ｆｃ融合物は、配列番号２または３に記載されているヒトＩｇＧＦｃドメインと作動可能に連結した、配列番号４２または４３に記載されているインテグリン結合性ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ループは、工学的に操作されたＡｇＲＰまたはアガトキシン足場内にある。

ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、表１に開示されている２．５Ｄおよび２．５Ｆである。表１のインテグリン結合性ポリペプチドのいずれも本明細書に記載のＦｃ融合物に使用することができる。

本ポリペプチドは、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、およびいくつかの場合には、α_５β_１インテグリン受容体を標的化する。本ポリペプチドは、親和性がわずかであるかまたは全くない、α_ｉｉｂβ_３などの試験した他のインテグリンには結合しない。したがって、これらの工学的に操作されたインテグリン結合性ポリペプチドには、上に挙げられたインテグリンを特異的に過剰発現する種々のヒトのがんにおける広範な診断および治療への適用がある。下記の通り、これらのポリペプチドは、界面活性剤で可溶化されたインテグリン受容体と腫瘍細胞表面インテグリン受容体のいずれにも高親和性で結合する。

α_ｖβ_３（およびα_ｖβ_５）インテグリンは、骨肉腫、神経芽細胞腫、肺、乳房、前立腺、および膀胱の癌腫、神経膠芽腫、ならびに浸潤性メラノーマを含めた多くの腫瘍細胞上にも高度に発現する。α_ｖβ_３インテグリンは、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、および結腸癌の腫瘍細胞および／または脈管構造上には発現するが、正常な成体組織または血管上には発現しないことが示されている。同様に、α_５β_１インテグリンも、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、および結腸癌の腫瘍細胞および／または脈管構造上には発現するが、正常な成体組織または血管上には発現しないことが示されている。したがって、小さな、コンフォメーション的に制約された本ポリペプチド（約３３アミノ酸）は、分子内結合によって制約される。例えば、ＥＥＴＩ−ＩＩは、３つのジスルフィド結合を有する。これにより、ＥＥＴＩ−ＩＩがｉｎｖｉｖｏにおいてより安定なものになる。これらのペプチドは、α_ｖインテグリン単独、またはα_ｖインテグリンとα_５β_１インテグリンの両方を標的化する。これまでに、α_ｖβ_３インテグリン、α_ｖβ_５インテグリン、およびα_５β_１インテグリンに高い親和性および特異性で結合することが可能な単一の薬剤の開発は達成されていないと考えられる。これらのインテグリンの３種全てが腫瘍上に発現し、血管新生および転移の媒介に関与するので、広範なスペクトルの標的化薬剤（すなわち、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、およびα_５β_１）が診断および治療への適用により有効である可能性がある。

この工学的に操作されたノッチン−Ｆｃ融合物には、以前に同定されたインテグリンを標的化する化合物に対していくつかの有利な点がある。この工学的に操作されたノッチン−Ｆｃ融合物は、タンパク質分解抵抗性および例外的なｉｎｖｉｖｏにおける安定性を付与する、緻密な、ジスルフィド結合したコアを有する。

本発明者らの研究により、マウス血清中でのインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質の半減期は９０時間を超えることが示されている。ＲＧＤに基づく環状ペプチドと比較してサイズが大きく（約３〜４ｋＤａ）、親和性が増強されていることにより、分子イメージングおよび治療への適用のための薬物動態および体内分布の増強が付与される。これらのノッチン−Ｆｃタンパク質は、イメージングプローブ、放射性同位元素、または化学療法剤の化学合成および部位特異的コンジュゲーションを可能にするのに十分に小さい。さらに、これらのノッチン−Ｆｃタンパク質は、必要であれば、容易に化学修飾してｉｎｖｉｖｏにおける性質をさらに改善することができる。

Ｃ．ノッチン−Ｆｃ融合物
本明細書およびその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１４／００７３５１８号に記載されているノッチン−Ｆｃ融合物は、工学的に操作されたインテグリン結合性ポリペプチド（ノッチン足場内）と、ＦｃγＲに結合してＡＤＣＣを誘導することが可能なＦｃドメインまたは抗体様構築物を組み合わせたものである。

抗体のＦｃ部分は、免疫グロブリン分子を構成する２つの重鎖の２つのカルボキシ末端ドメインによって形成される。ＩｇＧ分子は、２つの重鎖（それぞれ約５０ｋＤａ）および２つの軽鎖（それぞれ約２５ｋＤａ）を含有する。全ての抗体の一般的な構造は非常に類似しており、当該タンパク質の先端の小さな領域は非常に可変性であり、それにより、先端構造がわずかに異なる数百万の抗体が存在することが可能になる。この領域は、超可変領域（Ｆａｂ）として公知である。他の断片は、抗原結合活性を含有しないが、容易に結晶化することが最初に観察され、このような理由で、結晶化可能な断片としてＦｃ断片と名付けられた。この断片は、対合したＣＨ_２ドメインおよびＣＨ_３ドメインに対応し、エフェクター分子および細胞と相互作用する抗体分子の一部である。重鎖アイソタイプ間の機能的な差は、主にＦｃ断片にある。抗体分子のＦｃ部分とＦａｂ部分を連結するヒンジ領域は、剛性のヒンジではなく、実際には可撓性のテザーであり、これにより、２つのＦａｂアームの独立した動きが可能になる。これは、ハプテンと結合した抗体の電子顕微鏡観察によって実証されている。したがって、本融合タンパク質は、一方が抗体断片の各アーム上にある、２つのノッチンペプチドを含有するように作出することができる。

Ｆｃ部分は、抗体クラス（およびサブクラス）間では変化するが、そのクラス内では同一である。重鎖のＣ末端がＦｃ領域を形成する。Ｆｃ領域は、受容体結合性部分として重要な役割を果たす。抗体のＦｃ部分は、２つの異なる様式でＦｃ受容体に結合する。例えば、ＩｇＧおよびＩｇＭがＦａｂ部分によって病原体に結合した後、それらのＦｃ部分は、食作用性細胞（マクロファージのような）上の受容体に結合して食作用を誘導することができる。

本ノッチン−Ｆｃ融合物は、Ｆｃ部分が、二重の結合能をもたらすため、かつ／または半減期を延長するため、発現レベルを改善するためなどに使用されるように成すことができる。ノッチン−ＦｃのＦｃ断片は、例えば、マウスＩｇＧ２ａに由来するものまたはヒトＩｇＧ１に由来するものであってよい。場合によって、ノッチンとＦｃ部分を接続するためにリンカーを使用することができる。リンカーは、ノッチン−ＦｃのインテグリンまたはＦｃ受容体に対する結合親和性に影響を及ぼさないものであることが好ましい。種々のＦｃドメイン遺伝子配列（例えば、マウス定常領域遺伝子配列およびヒト定常領域遺伝子配列）が公的に利用できる寄託物の形態で利用可能である。

ａ．Ｆｃ−ドメイン
種々のＦｃドメイン遺伝子配列（例えば、マウスおよびヒト定常領域遺伝子配列）が公的に利用できる寄託物の形態で利用可能である。Ｆｃドメイン配列を含む定常領域ドメインは、特定のエフェクター機能を欠き、かつ／または免疫原性を低下させる特定の修飾を有するように選択することができる。抗体および抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公開されており、適切なＦｃドメイン配列（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３配列、またはその一部）は、これらの配列から当技術分野において認められている技法を使用して得ることができる。次いで、前述の方法のいずれかを使用して得られた遺伝物質を変更または合成して、本明細書で使用されるポリペプチドを得ることができる。さらに、定常領域ＤＮＡ配列の対立遺伝子、改変体および変異が本明細書に開示されている方法における使用に適することが理解されよう。

本明細書に開示されている方法における使用に適したノッチン−Ｆｃは、１つまたは複数のＦｃドメイン（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超のＦｃドメイン）を含んでよい。一実施形態では、Ｆｃドメインは、異なる型のものであってよい。一実施形態では、ノッチン−Ｆｃに存在する少なくとも１つのＦｃドメインは、ヒンジドメインまたはその一部を含む。別の実施形態では、ノッチン−Ｆｃは、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部を含むＦｃドメインを少なくとも１つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Ｆｃは、少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部を含むＦｃドメインを少なくとも１つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Ｆｃは、少なくとも１つのＣＨ４ドメインまたはその一部を含むＦｃドメインを少なくとも１つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Ｆｃは、少なくとも１つのヒンジドメインまたはその一部および少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部を含む（例えば、ヒンジ−ＣＨ２配向で）Ｆｃドメインを少なくとも１つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Ｆｃは、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部および少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部を含む（例えば、ＣＨ２−ＣＨ３配向で）Ｆｃドメインを少なくとも１つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Ｆｃは、少なくとも１つのヒンジドメインまたはその一部、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部、および少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部を、例えば、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ヒンジ−ＣＨ３−ＣＨ２、またはＣＨ２−ＣＨ３−ヒンジの配向で含むＦｃドメインを少なくとも１つ含む。

ある特定の実施形態では、ノッチン−Ｆｃは、１つまたは複数の免疫グロブリン重鎖に由来する完全なＦｃ領域（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含めたＦｃドメインであるが、これらは同じ抗体に由来するものである必要はない）を少なくとも１つ含む。他の実施形態では、ノッチン−Ｆｃは、１つまたは複数の免疫グロブリン重鎖に由来する完全なＦｃドメインを少なくとも２つ含む。ある特定の実施形態では、完全なＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ免疫グロブリン重鎖（例えば、ヒトＩｇＧ１）に由来する。

別の実施形態では、ノッチン−Ｆｃは、完全なＣＨ３ドメインを含むＦｃドメインを少なくとも１つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Ｆｃは、完全なＣＨ２ドメインを含むＦｃドメインを少なくとも１つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Ｆｃは、少なくとも１つのＣＨ３ドメイン、ならびにヒンジ領域およびＣＨ２ドメインのうちの少なくとも１つを含むＦｃドメインを少なくとも１つ含む。一実施形態では、ノッチン−Ｆｃは、ヒンジおよびＣＨ３ドメインを含むＦｃドメインを少なくとも１つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Ｆｃは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含むＦｃドメインを少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ免疫グロブリン重鎖（例えば、ヒトＩｇＧ１）に由来する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のヒンジ領域のシステイン残基を除去または置換するためにヒンジ領域の変異、置換、または欠失を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを使用する。

ノッチン−ＦｃのＦｃドメインを構成する定常領域ドメインまたはその一部は、異なる免疫グロブリン分子に由来するものであってよい。例えば、本発明において使用されるポリペプチドは、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２ドメインまたはその一部およびＩｇＧ３分子に由来するＣＨ３領域またはその一部を含んでよい。別の例では、ノッチン−Ｆｃは、ＩｇＧ１分子に一部由来し、ＩｇＧ３分子に一部由来するヒンジドメインを含むＦｃドメインを含んでよい。本明細書に記載の通り、Ｆｃドメインは、天然に存在する抗体分子からアミノ酸配列が変化するように変更することができることが当業者には理解されよう。

他の構築物では、１つまたは複数の構成要素Ｆｃドメインの間にペプチドスペーサーをもたらすことが望ましい。例えば、ペプチドスペーサーをヒンジ領域とＣＨ２ドメインの間および／またはＣＨ２とＣＨ３ドメインの間に配置することができる。例えば、ＣＨ２ドメインを欠失させ、残りのＣＨ３ドメイン（合成または非合成）をヒンジ領域に１〜２０アミノ酸、１〜１０アミノ酸、または１〜５アミノ酸ペプチドスペーサーを用いて接合した適合する構築物を発現させることができる。そのようなペプチドスペーサーは、例えば、定常領域ドメインの調節要素が遊離したままで接近可能であること、またはヒンジ領域が可撓性のままであることを確実にするために付加することができる。本発明に適合する任意のリンカーペプチドは、比較的非免疫原性であり、Ｆｃの適切なフォールディングを妨げないものであることが好ましい。

ｂ．Ｆｃアミノ酸への変化
ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインを、例えば、アミノ酸変異（例えば、付加、欠失、または置換）によって変更または修飾する。本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメイン改変体」という用語は、Ｆｃドメインが由来する野生型Ｆｃと比較してアミノ酸置換などの少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するＦｃドメインを指す。例えば、ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１抗体に由来する場合、改変体は、野生型アミノ酸と比較して、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、置換）を含む。

ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインのヒンジ領域をアミノ酸置換または欠失によって変更して、３つのヒンジ領域システイン残基（ＥＵ番号付けによる残基２２０、２２６、および２２９に位置する）のうちの１つまたは複数を変異させるまたは除去する。一部の態様では、上部ヒンジ領域を欠失させて、軽鎖と対合するシステインを除去する。例えば、配列番号３に記載の通り、上部ヒンジ領域内のアミノ酸「ＥＰＫＳＣ」を欠失させる。他の態様では、３つのヒンジ領域システインのうちの１つまたは複数を変異させる（例えば、セリンに）。ある特定の実施形態では、システイン２２０をセリンに変異させる。

ある特定の実施形態では、Ｆｃ改変体は、ヒンジドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位に置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃ改変体は、ＣＨ２ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位に置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃ改変体は、ＣＨ３ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位に置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃ改変体は、ＣＨ４ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位に置換を含む。

ある特定の実施形態では、ノッチン−Ｆｃ融合物は、１つ超のアミノ酸置換を含むＦｃ改変体を含む。本明細書に記載の方法において使用されるノッチン−Ｆｃ融合物は、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ超のアミノ酸置換を含んでよい。アミノ酸置換は、互いから少なくとも１アミノ酸位またはそれ超、例えば、少なくとも２アミノ酸位、３アミノ酸位、４アミノ酸位、５アミノ酸位、６アミノ酸位、７アミノ酸位、８アミノ酸位、９アミノ酸位、または１０アミノ酸位またはそれ超の間隔で空間的に位置させることが好ましい。工学的に操作されたアミノ酸は、互いから少なくとも５アミノ酸位、１０アミノ酸位、１５アミノ酸位、２０アミノ酸位、または２５アミノ酸位またはそれ超の間隔をあけて空間的に位置させることがより好ましい。

ある特定の実施形態では、ノッチン−Ｆｃ融合物は、ポリペプチドの抗原に依存しないエフェクター機能、特にポリペプチドの循環半減期を変更させる、Ｆｃドメインに対するアミノ酸置換を含む。

一実施形態では、ノッチン−Ｆｃは、活性化しているＦｃγＲ（例えば、Ｆｃγ１、Ｆｃγ１ａ、またはＦｃγＲＩＩＩａ）に対して結合の増強を示す。ＦｃＲまたは補体結合活性が変更された例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０６３８１５に開示されている。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、以下の変異：Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｌ２６１Ａ、Ｈ２６８Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ａ３３０Ｈ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｑ、Ｋ３３４Ｖ、Ａ３７８Ｆ、Ａ３７８Ｋ、Ａ３７８Ｗ、Ａ３７８Ｙ、Ｈ４３５Ｓ、またはＨ４３５Ｇの少なくとも１つを含有する。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、以下の変異：Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｉ３３２ＤまたはＩ３３２ＥまたはＨ２６８Ｄの少なくとも１つを含有する。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、以下の変異：Ｉ３３２ＤまたはＩ３３２ＥまたはＨ２６８Ｄの少なくとも１つを含有する。

本明細書で使用されるノッチン−Ｆｃは、ノッチン−Ｆｃのグリコシル化を変更させるアミノ酸置換も含んでよい。例えば、ノッチン−ＦｃのＦｃドメインは、グリコシル化（例えば、Ｎ結合グリコシル化またはＯ結合グリコシル化）の低下を導く変異を有するＦｃドメインを含んでもよく、野生型Ｆｃドメインの変更されたグリコフォーム（例えば、低フコースまたはフコースを含まないグリカン）を含んでもよい。別の実施形態では、ノッチン−Ｆｃは、グリコシル化モチーフ、例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含有するＮ結合グリコシル化モチーフの付近またはその内部にアミノ酸置換を有する。グリコシル化を低下または変更させる例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０５／０１８５７２およびＵＳ２００７／０１１１２８１に開示されている。他の実施形態では、本明細書で使用されるノッチン−Ｆｃは、溶媒露出表面に位置する工学的に操作されたシステイン残基またはその類似体を有するＦｃドメインを少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、本明細書で使用されるノッチン−Ｆｃは、第２のシステイン残基とのジスルフィド結合を実質的に含まない工学的に操作された遊離のシステイン残基またはその類似体を少なくとも１つ含むＦｃドメインを含む。上記の工学的に操作されたシステイン残基またはその類似体はいずれも、その後、当技術分野で認められている技法を使用して機能性ドメインとコンジュゲートすること（例えば、チオール−反応性ヘテロ二官能性リンカーを用いてコンジュゲートすること）ができる。

一実施形態では、本明細書で使用されるノッチン−Ｆｃは、それぞれ独立に本明細書に記載のＦｃドメインから選択されるその構成要素のＦｃドメインのうちの２つまたはそれ超を有する遺伝子融合したＦｃドメインを含んでよい。一実施形態では、Ｆｃドメインは同じものである。別の実施形態では、Ｆｃドメインの少なくとも２つは異なるものである。例えば、本明細書で使用されるノッチン−ＦｃのＦｃドメインは、同じ数のアミノ酸残基を含む、または１つもしくは複数のアミノ酸残基（例えば、約５アミノ酸残基（例えば、１、２、３、４、または５アミノ酸残基）、約１０残基、約１５残基、約２０残基、約３０残基、約４０残基、または約５０残基）だけ長さが異なるものであってよい。さらに他の実施形態では、本明細書で使用されるノッチン−ＦｃのＦｃドメインは、１つまたは複数のアミノ酸位で配列が異なるものであってよい。例えば、Ｆｃドメインの少なくとも２つは、約５アミノ酸位（例えば、１、２、３、４、または５アミノ酸位）、約１０位、約１５位、約２０位、約３０位、約４０位、または約５０位）で異なるものであってよい。

免疫チェックポイント遮断薬
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬を本明細書に記載の他の治療剤と組み合わせて使用する（例えば、ＰＫ延長ＩＬ−２およびインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質）。Ｔ細胞活性化およびエフェクター機能は、「免疫チェックポイント」と称される共刺激および抑制シグナルによってバランスを保つ。Ｔ細胞エフェクター機能を調節する抑制性リガンドおよび受容体は、腫瘍細胞上に過剰発現する。その後、共刺激受容体のアゴニストまたは抑制シグナルのアンタゴニストにより、抗原特異的Ｔ細胞応答の増幅がもたらされる。腫瘍細胞を直接標的化する治療用抗体とは対照的に、免疫チェックポイント遮断薬は、内在性抗腫瘍活性を増強するものである。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法における使用に適した免疫チェックポイント遮断薬は、抑制シグナルのアンタゴニスト、例えば、例えばＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、およびＴＩＭ３を標的化する抗体である。これらのリガンドおよび受容体は、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．、Ｎａｔｕｒｅ．１２巻：２５２〜２６４頁、２０１２年に概説されている。

本明細書には、がんなどの疾患を患っている被験体を処置するための方法であって、被験体に、免疫チェックポイントを遮断する分子、およびインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質を治療有効量で含む組成物を投与するステップを含む方法が開示されている。ある特定の実施形態では、がんなどの疾患を患っている被験体を処置するための方法であって、被験体に、免疫チェックポイントを遮断する分子、インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質、およびＩＬ−２（例えば、ＰＫ延長ＩＬ−２）を治療有効量で含む組成物を投与するステップを含む方法。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、抑制性免疫調節薬からのシグナル伝達を破壊または阻害する抗体またはその抗原結合性部分である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、抑制性免疫調節薬からのシグナル伝達を破壊または阻害する小分子である。

ある特定の実施形態では、抑制性免疫調節薬（免疫チェックポイント遮断薬）は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路の構成成分である。したがって、ある特定の実施形態では、がんを患っている被験体に対する免疫療法の方法であって、被験体に、ＰＤ−１受容体とそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１の相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合性部分を治療有効量で投与するステップを含む方法が提供される。ＰＤ−１に結合してＰＤ−１とそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１の相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する当技術分野で公知の抗体が、本明細書に開示されている方法における使用に適する。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性部分は、ＰＤ−１に特異的に結合する。例えば、ＰＤ−１を標的化する抗体として、例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）およびペムブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５、Ｍｅｒｃｋ）が挙げられる。本明細書に開示されている方法における使用に適した他の抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，００８，４４９号に開示されている抗ＰＤ−１抗体である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性部分は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合してＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１との相互作用を阻害し、それにより、免疫活性を増大させるものである。ＰＤ−Ｌ１に結合してＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する当技術分野で公知の抗体が、本明細書に開示されている方法における使用に適する。例えば、ＰＤ−Ｌ１を標的化し、臨床試験中の抗体として、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）およびＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）が挙げられる。ＰＤ−Ｌ１を標的化する他の適切な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９４３，７４３号に開示されている。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を破壊し、かつ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に開示されている方法における使用に適することが当業者には理解されよう。

ある特定の実施形態では、抑制性免疫調節薬は、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路の構成成分である。したがって、ある特定の実施形態では、がんを患っている被験体に対する免疫療法の方法であって、被験体に、ＣＴＬＡ−４を標的化し、ＣＴＬＡ−４のＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合性部分を治療有効量で投与するステップを含む方法が提供される。ＣＴＬＡ−４を標的化する抗体の例としては、ＦＤＡの認可を受けているイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）、および現在ヒト試験が行われているトレメリムマブ（チシリムマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）、ＣＰ−６７５、２０６、Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。ＣＴＬＡ−４を標的化する他の適切な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１２／１２０１２５、米国特許第６，９８４７２０号、同第６，６８２，７３６８号、および米国特許出願第２００２／００３９５８１号、同第２００２／００８６０１４号、および同第２００５／０２０１９９４号に開示されている。ＣＴＬＡ−４に結合し、ＣＴＬＡ−４のＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用を破壊し、かつ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に開示されている方法における使用に適することが当業者には理解されよう。

ある特定の実施形態では、抑制性免疫調節薬は、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）シグナル伝達経路の構成成分である。したがって、ある特定の実施形態では、がんを患っている被験体に対する免疫療法の方法であって、被験体に、ＬＡＧ３を標的化し、ＬＡＧ３のＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合性部分を治療有効量で投与するステップを含む方法が提供される。ＬＡＧ３を標的化する抗体の例は、現在ヒト試験が行われているＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）である。ＬＡＧ３を標的化する他の適切な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１１／０１５０８９２号に開示されている。ＬＡＧ３に結合し、ＬＡＧ３のＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を破壊し、かつ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に開示されている方法における使用に適することが当業者には理解されよう。

ある特定の実施形態では、抑制性免疫調節薬は、Ｂ７ファミリーシグナル伝達経路の構成成分である。ある特定の実施形態では、Ｂ７ファミリーメンバーは、Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４である。したがって、ある特定の実施形態では、がんを患っている被験体に対する免疫療法の方法であって、被験体に、Ｂ７−Ｈ３またはＢ７−Ｈ４を標的化する抗体またはその抗原結合性部分を治療有効量で投与するステップを含む方法が提供される。Ｂ７ファミリーは、いかなる定義済みの受容体も有さないが、これらのリガンドは、腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞において上方制御される。前臨床的なマウスモデルにより、これらのリガンドを遮断することにより抗腫瘍免疫を増強できることが示されている。Ｂ７−Ｈ３を標的化する抗体の例は、現在ヒト試験が行われているＭＧＡ２７１（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）である。Ｂ７ファミリーメンバーを標的化する他の適切な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１３／０１４９２３６号に開示されている。Ｂ７−Ｈ３またはＢ７−Ｈ４に結合し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に開示されている方法における使用に適することが当業者には理解されよう。

ある特定の実施形態では、抑制性免疫調節薬は、ＴＩＭ３（Ｔ細胞膜タンパク質３）シグナル伝達経路の構成成分である。したがって、ある特定の実施形態では、がんを患っている被験体に対する免疫療法の方法であって、被験体に、ＴＩＭ３を標的化し、ＴＩＭ３のガレクチン９との相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合性部分を治療有効量で投与するステップを含む方法が提供される。ＴＩＭ３を標的化する適切な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１３／００２２６２３号に開示されている。ＴＩＭ３に結合し、ＴＩＭ３のガレクチン９との相互作用を破壊し、かつ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に開示されている方法における使用に適することが当業者には理解されよう。

本明細書に開示されている方法における使用に適した、免疫チェックポイントを標的化する抗体は、上記のものに限定されないことが理解されるべきである。さらに、他の免疫チェックポイント標的も、それを標的化することにより、例えば、Ｔ細胞増殖の増大、Ｔ細胞活性化の増強、および／またはサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２）の増大に反映される、抗腫瘍免疫応答の刺激がもたらされるのであれば、本明細書に記載の方法においてアンタゴニストまたは抗体によって標的化することができることが当業者には理解されよう。

免疫チェックポイント遮断薬に対する代替物
ある特定の実施形態では、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のアンタゴニストを免疫チェックポイント遮断薬の代わりに使用する。ＶＥＧＦは、免疫抑制において役割を果たすことが最近実証されており（Ｌｉａｎｇ，Ｗ．−Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００６年）２８１巻：９５１〜９６１頁；Ｖｏｒｏｎ，Ｔ．ら、ＦｒｏｎｔＯｎｃｏｌ（２０１４年）４巻：Ａｒｔｉｃｌｅ７０；Ｔｅｒｍｅ，Ｍ．ら、ＣｌｉｎＤｅｖＩｍｍｕｎｏｌ（２０１２年）２０１２巻：ＡｒｔｉｃｌｅＩＤ４９２９２０；Ｋａｎｄａｌａｆｔ，Ｅ．ら，ＣｕｒｒＴｏｐＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌ（２０１１年）３４４巻：１２９〜４８頁）、したがって、免疫チェックポイント遮断薬と同様に、その活性を遮断することにより、免疫応答が増強されると思われる。「ＶＥＧＦアンタゴニスト」とは、１つまたは複数のＶＥＧＦ受容体への結合を含めた、ＶＥＧＦ活性を中和する、遮断する、阻害する、抑止する、低下させるまたはそれに干渉することが可能な分子を指す。ＶＥＧＦアンタゴニストの非限定的な例としては、ＶＥＧＦに特異的に結合し、それにより、ＶＥＧＦと１つまたは複数の受容体（例えば、ＶＥＧＦ受容体）との結合を隔離する抗ＶＥＧＦ抗体およびその抗原結合性断片、受容体分子および誘導体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子阻害剤などのＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、またはドミナントネガティブＶＥＧＦが挙げられる。

ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗体である。「抗ＶＥＧＦ抗体」は、ＶＥＧＦに十分な親和性および特異性で結合する抗体である。抗ＶＥＧＦ抗体の非限定的な例は、米国特許第６，８８４，８７９号、同第７，０６０，２６９号、同第６，５８２，９５９号、同第６，７０３，０３０号、同第６，０５４，２９７号、米国特許出願第２００６００９３６０号、同第２００５０１８６２０８号、同第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、同第２００５０１１２１２６号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ９８／４５３３２号、同第９６／３００４６号、同第９４／１０２０２号、同第０５／０４４８５３号、同第１３／１８１４５２号に記載されている。これらの特許および特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）またはラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）である。

ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦ受容体に結合する。ＶＥＧＦに特異的に結合するＶＥＧＦ受容体またはその断片を使用して、ＶＥＧＦタンパク質に結合させてＶＥＧＦタンパク質を隔離し、それにより、ＶＥＧＦタンパク質により下流のシグナル伝達が活性化されるのを防止することができる。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦ受容体、またはそのＶＥＧＦ結合性断片は、ｓＦｌｔ−１などの可溶性ＶＥＧＦ受容体である。当該受容体の可溶性の形態は、ＶＥＧＦに結合することによってＶＥＧＦの生物学的活性に対する抑制効果を発揮し、それにより、ＶＥＧＦが標的細胞の表面上に存在するその天然の受容体に結合するのを防止する。ＶＥＧＦ受容体に結合するＶＥＧＦアンタゴニストの非限定的な例は、ＰＣＴ出願第９７／４４４５３号、同第０５／０００８９５号および米国特許出願第２０１４００５７８５１号に開示されている。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７４１，８３９号に記載の通り、インテグリンにより認識されるＲＧＤ配列を有するループを含む修飾ＶＥＧＦを含む二機能性単鎖拮抗性ヒトＶＥＧＦ改変体を有するポリペプチドである。

リンカー
ある特定の実施形態では、ＰＫ延長基を、場合によってリンカーを介してＩＬ−２と融合する。ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドを、リンカーを介してＦｃ断片と融合する。適切なリンカーは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１０／０２１０５１１ＵＳ２０１０／０１７９０９４、およびＵＳ２０１２／００９４９０９に開示されているものなど、当技術分野で周知である。例示的なリンカーとしては、ｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカー、グリシン−プロリンポリペプチドリンカー、およびプロリン−アラニンポリペプチドリンカーが挙げられる。ある特定の実施形態では、リンカーは、ｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカー、すなわち、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドである。

例示的なｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１３４）である。一実施形態では、ｎ＝１である。一実施形態では、ｎ＝２である。別の実施形態では、ｎ＝３、すなわち、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）３（配列番号１３５）である。別の実施形態では、ｎ＝４、すなわち、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）４（配列番号１３６）である。別の実施形態では、ｎ＝５である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６である。別の実施形態では、ｎ＝７である。さらに別の実施形態では、ｎ＝８である。別の実施形態では、ｎ＝９である。さらに別の実施形態では、ｎ＝１０である。別の例示的なｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１３７）を含む。一実施形態では、ｎ＝１である。一実施形態では、ｎ＝２である。ある特定の実施形態では、ｎ＝３である。別の実施形態では、ｎ＝４である。別の実施形態では、ｎ＝５である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６である。別の例示的なｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１３８）を含む。一実施形態では、ｎ＝１である。一実施形態では、ｎ＝２である。ある特定の実施形態では、ｎ＝３である。別の実施形態では、ｎ＝４である。別の実施形態では、ｎ＝５である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６である。

他の治療剤
本明細書に開示されている方法における使用に適したインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質は、１つまたは複数の治療剤と併せて使用することができる。一実施形態では、治療剤は、治療用抗体である。別の実施形態では、治療剤は、治療用タンパク質である。別の実施形態では、治療剤は、小分子である。別の実施形態では、治療剤は、抗原である。別の実施形態では、治療剤は、細胞の集団である。

工学的に操作された融合分子
本明細書では、本明細書に記載のＩＬ−２、および抗体（例えば、治療用抗体、免疫チェックポイント遮断薬、もしくはＶＥＧＦと拮抗する抗体）または抗体断片のうちの２つまたはそれ超を含む工学的に操作された分子も提供される。そのような工学的に操作された分子により、本明細書に記載の方法において被験体（例えば、がん患者）に投与される構成成分の数を有効に減少させることができる。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、他の構成成分（例えば、ＩＬ−２）とのコンジュゲーションのための足場としての機能を果たす。

したがって、ある特定の実施形態では、工学的に操作された分子は、ＩＬ−２および抗体または抗体断片を含む。特定の実施形態では、工学的に操作されたタンパク質に使用するための抗体は、二重特異性抗体であり、一方の構成成分は治療用抗体であり、他方の構成成分は、免疫チェックポイント遮断薬に結合する抗体またはＶＥＧＦ活性と拮抗する抗体である。二重特異性抗体を生成するための方法は、当技術分野で公知である。

したがって、ある特定の実施形態では、工学的に操作された分子は、ＩＬ−２および治療上の標的および免疫チェックポイント遮断薬に結合する二重特異性抗体またはＶＥＧＦと拮抗する抗体を含む。

ある特定の実施形態では、工学的に操作されたタンパク質に使用するためのＩＬ−２構成成分は、薬物動態部分を欠くＩＬ−２（すなわち、非ＰＫ延長ＩＬ−２）である。他の実施形態では、ＩＬ−２は、薬物動態部分（ＰＫ延長ＩＬ−２）を含む。

ある特定の実施形態では、工学的に操作された分子の構成成分を、リンカーを用いてまたは用いずに抗体または二重特異性抗体とコンジュゲートする。コンジュゲーションに適したリンカーは本明細書に記載されており、また、当技術分野において広範囲にわたって記載されている。

工学的に操作された分子のポリペプチドに基づく構成成分（例えば、ＩＬ−２）を、リンカーを用いてまたは用いずに抗体へ融合することができる領域は、一般に、当技術分野で公知であり、それらとして、例えば、抗体重鎖のＣ末端、および抗体軽鎖のＣ末端が挙げられる。

ある特定の実施形態では、工学的に操作された分子の構成成分は、他の構成成分の機能に干渉しない。例として、工学的に操作されたタンパク質が治療用抗体およびＩＬ−２を含む場合、ＩＬ−２と治療用抗体を、抗体の抗原結合機能が保持され、ＩＬ−２のその受容体と相互作用する能力が保持されるように融合する。工学的に操作されたタンパク質の構成成分のそれぞれの機能が保持されているかどうかは、本明細書、例えば実施例に記載の方法を使用して決定することができる。

ポリペプチドを作出する方法
一部の態様では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、ＰＫ延長ＩＬ−２などのＩＬ−２、およびノッチン−Ｆｃ）は、形質転換された宿主細胞において、組換えＤＮＡ技法を使用して作出する。これを行うために、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を調製する。そのようなＤＮＡ分子を調製する方法は当技術分野で周知である。例えば、適切な制限酵素を使用して、ペプチドをコードする配列をＤＮＡから切り出すことができる。あるいは、ホスホルアミデート法などの化学合成技法を使用してＤＮＡ分子を合成することができる。また、これらの技法の組み合わせも使用することができる。

ポリペプチドを作出する方法としては、適切な宿主においてペプチドを発現させることが可能なベクターも挙げられる。ベクターは、適切な発現制御配列と作動可能に連結したペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子をベクターに挿入する前またはその後にこの作動可能な連結をもたらす方法は周知である。発現制御配列としては、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソームヌクレアーゼドメイン、開始シグナル、終止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルが挙げられる。

得られる、ＤＮＡ分子を有するベクターを使用して適切な宿主を形質転換する。この形質転換は、当技術分野で周知の方法を使用して実施することができる。

多数の入手可能な周知の宿主細胞はいずれも本発明の実施に使用することができる。特定の宿主の選択は、当技術分野で理解されているいくつもの因子に左右される。これらとしては、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によりコードされるペプチドの毒性、形質転換の率、ペプチドの回収のしやすさ、発現特性、バイオセーフティーおよび費用が挙げられる。全ての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に対して同等に有効であるとは限らないことを理解してこれらの因子のバランスを取らなければならない。これらの一般的なガイドラインでは、有用な微生物宿主として、培養物中の細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉｓｐ．など）細胞、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｐなど）の細胞および他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞（ヒトを含む）、または当技術分野で公知の他の宿主が挙げられる。

次に、形質転換された宿主を培養し、精製する。宿主細胞は、所望の化合物が発現されるように、従来の発酵条件下で培養することができる。そのような発酵条件は当技術分野で周知である。最後に、当技術分野で周知の方法によって培養物からペプチドを精製する。

化合物は、合成方法によって作出することもできる。例えば、固相合成技法を使用することができる。適切な技法は当技術分野で周知であり、それらとしては、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３年）、Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ、３３５〜６１頁（ＫａｔｓｏｙａｎｎｉｓおよびＰａｎａｙｏｔｉｓ編）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５巻：２１４９頁；Ｄａｖｉｓら（１９８５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０巻：３９４〜４１４頁；ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（１９６９年）、ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉｎｎら（１９７６年）、ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ（第３版）２巻：１０５〜２５３頁；およびＥｒｉｃｋｓｏｎら（１９７６年）、ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ（第３版）２巻：２５７〜５２７頁に記載されているものが挙げられる。固相合成は、小さなペプチドを作出する最も対費用効果が大きい方法であるので、個々のペプチド作出の好ましい技法である。誘導体化ペプチドを含有する化合物または非ペプチド基を含有する化合物は、周知の有機化学技法によって合成することができる。

分子の発現／合成の他の方法は、一般に、当技術分野で当業者に公知である。

ポリペプチドの発現
上記の核酸分子は、例えばベクターを用いて形質導入した細胞において、それらの発現を導くことが可能なベクター内に含有されてよい。したがって、ＰＫ延長ＩＬ−２およびノッチン−Ｆｃ変異体に加えて、ＰＫ延長ＩＬ−２またはノッチン−Ｆｃ変異体をコードする核酸分子を含有する発現ベクターおよびこれらのベクターをトランスフェクトした細胞がある特定の実施形態の中に入る。

使用に適したベクターとしては、細菌における使用のためのＴ７に基づくベクター（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ５６巻：１２５頁、１９８７年を参照されたい）、哺乳動物細胞における使用のためのｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（ＬｅｅおよびＮａｔｈａｎｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３巻：３５２１頁、１９８８年）、および昆虫細胞における使用のためのバキュロウイルス由来ベクター（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、Ｃａｌｉｆからの発現ベクターｐＢａｃＰＡＫＳ）が挙げられる。そのようなベクター内の目的のポリペプチドをコードする核酸挿入断片は、例えば発現させようとする細胞型に基づいて選択されるプロモーターと作動可能に連結していてよい。例えば、細菌ではＴ７プロモーターを使用することができ、昆虫細胞ではポリヘドリンプロモーターを使用することができ、哺乳動物細胞ではサイトメガロウイルスまたはメタロチオネインプロモーターを使用することができる。また、高等真核生物の場合では、組織特異的プロモーターおよび細胞型特異的プロモーターが広範に入手可能である。したがって、これらのプロモーターの名称は体内の所与の組織または細胞型における核酸分子の発現を導くそれらの能力に由来する。核酸の発現を導くために使用することができる多数のプロモーターおよび他の調節エレメントは当業者にはよく知られている。

挿入された核酸分子の転写を容易にする配列に加えて、ベクターは、複製開始点、および選択マーカーをコードする他の遺伝子を含有してよい。例えば、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ^ｒ）遺伝子により、それが発現する細胞にＧ４１８抵抗性が付与され、したがって、トランスフェクトされた細胞の表現型を選択することが可能になる。所与の調節エレメントまたは選択マーカーが特定の実験の状況における使用に適しているかどうかは、当業者が容易に決定することができる。

本発明において使用することができるウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ベクター、ヘルペスウイルスベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ベクター、およびウシパピローマウイルスベクターが挙げられる（例えば、Ｇｌｕｚｍａｎ（編）、ＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ、ＣＳＨＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙを参照されたい）。

ＰＫ延長ＩＬ−２またはノッチン−Ｆｃ変異体をコードする核酸分子を含有し、それを発現する原核細胞または真核細胞も本発明の特徴である。本発明の細胞は、トランスフェクトされた細胞、すなわち、核酸分子、例えばＰＫ延長ＩＬ−２変異体またはノッチン−Ｆｃをコードする核酸分子が組換えＤＮＡ技法によって導入された細胞である。そのような細胞の子孫も本発明の範囲内に入るとみなされる。

発現系の正確な構成成分は重大ではない。例えば、ＰＫ延長ＩＬ−２またはノッチン−Ｆｃ変異体は、細菌Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物宿主、または昆虫細胞（例えば、Ｓｆ２１細胞）もしくは哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、またはＨｅＬａ細胞）などの真核生物宿主、において産生させることができる。これらの細胞は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ）を含めた多くの供給源から入手可能である。発現系の選択においては、構成成分が互いと適合するものであることのみが重要である。当業者はそのような決定を行うことができる。さらに、発現系の選択の手引きが必要である場合には、当業者は、Ａｕｓｕｂｅｌら（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９９３年）およびＰｏｕｗｅｌｓら（ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、１９８５年、補遺１９８７年）で調べることができる。

発現させたポリペプチドは、本明細書に記載の通り、常套的な生化学的手順を使用して発現系から精製することができ、そして、例えば治療剤として使用することができる。

医薬組成物および投与形式
ある特定の実施形態では、ＩＬ−２をノッチン−Ｆｃと一緒に（同時にまたは逐次的に）投与する。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２をノッチン−Ｆｃの投与前に投与する。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２をノッチン−Ｆｃの投与と同時に投与する。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２をノッチン−Ｆｃの投与の後に投与する。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２およびノッチン−Ｆｃを同時に投与する。他の実施形態では、ＩＬ−２およびノッチン−Ｆｃを逐次的に投与する。さらに他の実施形態では、ＩＬ−２およびノッチン−Ｆｃを互いと１日以内、２日以内、または３日以内に投与する。

ある特定の実施形態では、ＩＬ−２およびノッチン−Ｆｃを免疫チェックポイント遮断薬と一緒に投与する。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、抗ＰＤ−１抗体である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、抗ＣＴＬＡ−４抗体である。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦのアンタゴニストを免疫チェックポイント遮断薬の代わりに使用する。

本発明の医薬組成物は、併用療法として、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与することができる。薬剤としては、これだけに限定されないが、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて合成により調製された化学組成物、抗体、抗原結合性領域、ならびにその組み合わせおよびコンジュゲートが挙げられる。ある特定の実施形態では、薬剤は、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリックモジュレーター、または毒素としての機能を果たし得る。

ある特定の実施形態では、本発明は、ＰＫ延長ＩＬ−２を薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントと共に含む別々の医薬組成物、ならびにノッチン−Ｆｃを薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントと共に含む別の医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、さらに、免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントと共に含む別々の医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、ＰＫ延長ＩＬ−２とノッチン−Ｆｃの両方を薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントと共に含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントと共に含む。

ある特定の実施形態では、本発明は、ＰＫ延長ＩＬ−２を薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントと一緒に含む医薬組成物、ならびにノッチン−Ｆｃを薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントと一緒に含む別の医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、免疫チェックポイント遮断薬を薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントと一緒に含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、薬剤、例えば、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）のそれぞれを別々の組成物として製剤化することができる。ある特定の実施形態では、許容される製剤材料は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。ある特定の実施形態では、製剤材料（複数可）は、ｓ．ｃ．投与および／またはＩ．Ｖ．投与用のものである。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、質量オスモル濃度、粘度、清澄性、色、等張性、匂い、滅菌、安定性、溶解または放出の速度、吸着または透過の速度を改変、維持または保存するための製剤材料を含有してよい。ある特定の実施形態では、適切な製剤材料としては、これだけに限定されないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなど）；抗菌薬；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝液（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸など）；増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシンなど）；キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇａｇｅｎｔ）（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖；二糖；および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；着色剤、矯味矯臭剤および希釈剤；乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇａｇｅｎｔ）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成性対イオン（例えば、ナトリウムなど）；防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性物質または湿潤剤（例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など）；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトールなど）；張度増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または医薬アジュバントが挙げられる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ（１９９５年）。ある特定の実施形態では、製剤は、ＰＢＳ；２０ｍＭのＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２、５０ｍＭのＮａＣｌ；および／または１０ｍＭのＮＡＯＡＣ、ｐＨ５．２、９％スクロースを含む。ある特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、当業者により、例えば、意図された投与経路、送達形式および所望の投与量に応じて決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、上記を参照されたい。ある特定の実施形態では、そのような組成物は、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）の物理的状態、安定性、ｉｎｖｉｖｏ放出の速度およびｉｎｖｉｖｏクリアランスの速度に影響を及ぼす可能性がある。

ある特定の実施形態では、医薬組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、水性であっても非水性であってもよい。例えば、ある特定の実施形態では、適切なビヒクルまたは担体は、場合によって非経口投与用の組成物に一般的な他の材料を補充した注射用水、生理的食塩溶液または人工脳脊髄液であってよい。ある特定の実施形態では、食塩水は、等張性リン酸緩衝食塩水を含む。ある特定の実施形態では、別の例示的なビヒクルは、中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した食塩水である。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、したがって、これは、ソルビトールまたは適切な代用物をさらに含んでよい。ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含む組成物は、所望の程度の純度の選択された組成物と任意選択の製剤用薬剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎａｇｅｎｔ）（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、上記）を混合して凍結乾燥したケーキまたは水溶液の形態にすることによって、保管用に調製することができる。さらに、ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含む組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｅ）として製剤化することができる。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達用に選択することができる。ある特定の実施形態では、組成物は、吸入または消化管を通じた送達、例えば経口的なものなどのために選択することができる。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の能力の範囲内である。

ある特定の実施形態では、製剤構成成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。ある特定の実施形態では、緩衝液を使用して組成物を生理的なｐＨまたはわずかに低いｐＨ、一般には、約５から約８までのｐＨ範囲内に維持する。

ある特定の実施形態では、非経口投与が意図されている場合、治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望のＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含む、発熱物質を含まない非経口的に許容される水溶液の形態であってよい。ある特定の実施形態では、非経口的注射用のビヒクルは、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）が、適正に保存される滅菌等張性溶液として製剤化される滅菌蒸留水である。ある特定の実施形態では、調製は、所望の分子を、その後デポ注射によって送達することができる産物の制御放出または持続放出を提供し得る薬剤、例えば、注射可能なマイクロスフェア、生体内分解性（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどと共に製剤化することを伴う。ある特定の実施形態では、ヒアルロン酸を使用することもでき、これには、循環中の長期持続時間を促進する効果がある。ある特定の実施形態では、埋め込み型の薬物送達デバイスを使用して所望の分子を導入することができる。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、吸入用に製剤化することができる。ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）は、吸入用の乾燥粉末として製剤化することができる。ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含む吸入溶液は、エアロゾル送達用に噴霧体と共に製剤化することができる。ある特定の実施形態では、溶液を噴霧化することができる。肺投与は、化学修飾されたタンパク質の肺送達について記載されているＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号においてさらに記載されている。

ある特定の実施形態では、製剤を経口的に投与することができることが意図されている。ある特定の実施形態では、このように投与されるＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）は、錠剤およびカプセル剤などの固体剤形の配合において習慣的に使用されている担体を用いてまたは用いずに製剤化することができる。ある特定の実施形態では、カプセル剤は、生物学的利用能が最大化され、かつ前全身性（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ）分解が最小化される、胃腸管内における段階（ｐｏｉｎｔ）で製剤の活性部分が放出されるように設計することができる。ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）の吸収を容易にするために、少なくとも１種の追加的な薬剤を含めることができる。ある特定の実施形態では、希釈剤、香味剤（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ）、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）も使用することができる。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、有効な量のＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を、錠剤の製造に適した無毒性賦形剤との混合物中に含んでよい。ある特定の実施形態では、錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解させることにより、溶液を単位剤形に調製することができる。ある特定の実施形態では、適切な賦形剤としては、これだけに限定されないが、不活性な希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウムなど；または結合剤（ｂｉｎｄｉｎｇａｇｅｎｔ）、例えば、デンプン、ゼラチン、もしくはアラビアゴムなど；または潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇａｇｅｎｔ）、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクなどが挙げられる。

追加的な医薬組成物は、持続送達製剤または制御送達製剤中のＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含む製剤を含め、当業者には明らかである。ある特定の実施形態では、リポソーム担体、生体内分解性微小粒子または多孔質ビーズおよびデポ注射などの種々の他の持続送達手段または制御送達手段を製剤化するための技法も当業者には公知である。例えば、医薬組成物を送達するための多孔質ポリマー微小粒子の制御放出について記載されているＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照されたい。ある特定の実施形態では、持続放出調製物は、半透性ポリマーマトリクスを造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態で含んでよい。持続放出マトリクスとしては、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号およびＥＰ０５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２巻：５４７〜５５６頁（１９８３年））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、１５巻：１６７〜２７７頁（１９８１年）およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．、１２巻：９８〜１０５頁（１９８２年））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、上記）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。ある特定の実施形態では、持続放出組成物は、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームを含んでもよい。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻：３６８８〜３６９２頁（１９８５年）；ＥＰ０３６，６７６；ＥＰ０８８，０４６およびＥＰ１４３，９４９を参照されたい。

ｉｎｖｉｖｏ投与のために使用する医薬組成物は、一般には、滅菌されたものである。ある特定の実施形態では、これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって達成することができる。組成物を凍結乾燥するある特定の実施形態では、この方法を使用した滅菌を、凍結乾燥および再構成の前に行うこともその後に行うこともできる。ある特定の実施形態では、非経口投与用の組成物は、凍結乾燥した形態でまたは溶液として保管することができる。ある特定の実施形態では、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で穴をあけることができる止め栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に入れる。

ある特定の実施形態では、医薬組成物を製剤化したら、それを、溶液、懸濁物、ゲル、エマルション、固体、または脱水もしくは凍結乾燥した粉末として滅菌バイアル中で保管する。ある特定の実施形態では、そのような製剤は、すぐに使える形態で保管することもでき、投与する前に再構成する形態（例えば、凍結乾燥した形態）で保管することもできる。

ある特定の実施形態では、単回用量投与単位を作製するためのキットが提供される。ある特定の実施形態では、キットは、乾燥したタンパク質を有する第１の容器と水性製剤を有する第２の容器の両方を含有してよい。ある特定の実施形態では、単一チャンバーおよび多チャンバーの充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジ（ｌｉｑｕｉｄｓｙｒｉｎｇｅ）および分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットが含まれる。

ある特定の実施形態では、治療に使用される、ＰＫ延長ＩＬ−２を含む医薬組成物および／またはノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含む１つもしくは複数の医薬組成物の有効量は、例えば、治療の状況および目的に左右される。したがって、ある特定の実施形態によると、処置に適した投与量レベルは、送達される分子、使用されるＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）の適応、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表または器官のサイズ）および／または状態（年齢および全体的な健康）に一部応じて変動することが当業者には理解されよう。ある特定の実施形態では、臨床医が、最適な治療効果が得られるように投与量を用量設定（ｔｉｔｅｒ）し、投与経路を改変することができる。ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２およびノッチン−Ｆｃの典型的な投与量は、それぞれ、上記の因子に応じて、約０．１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ超までにわたり得る。ある特定の実施形態では、投与量は、０．１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇまで；または１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇまでにわたり得る。

ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬の典型的な投与量は、上記の因子に応じて、約０．１ｍｇ／ｋｇから最大約３００ｍｇ／ｋｇまたはそれ超までにわたり得る。ある特定の実施形態では、投与量は、１ｍｇ／ｋｇから最大約３００ｍｇ／ｋｇまで；または５ｍｇ／ｋｇから最大約３００ｍｇ／ｋｇまで；または１０ｍｇ／ｋｇから最大約３００ｍｇ／ｋｇまでにわたり得る。

ある特定の実施形態では、投薬の頻度は、使用する製剤中のＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）の薬物動態パラメータを考慮に入れる。ある特定の実施形態では、所望の効果が達成される投与量に達するまで組成物が臨床医により投与される。ある特定の実施形態では、したがって、組成物を、単回用量として、または２回もしくはそれ超の用量として（所望の分子を同じ量で含有してもしなくてもよい）時間をわたって、または埋め込みデバイスまたはカテーテルを介した持続注入として、投与することができる。適切な投与量のさらなる精密化は当業者により常套的に行われ、当業者により常套的に実施される課題の範囲内である。ある特定の実施形態では、適切な投与量は、適切な用量反応データを使用することによって確認することができる。下の実施例に記載の通り、投薬は、毎日、隔日、または毎週行うことができ、全てに同様の抗腫瘍応答が伴う。

ある特定の実施形態では、医薬組成物の投与経路は、公知の方法に従う、例えば、経口、注射を通じた静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内経路によるもの；持続放出系によるものまたは埋め込みデバイスによるものである。ある特定の実施形態では、組成物は、ボーラス注射によって、または注入によって継続的に、または埋め込みデバイスによって投与することができる。ある特定の実施形態では、併用療法の個々の要素を異なる経路によって投与することができる。

ある特定の実施形態では、組成物は、所望の分子を吸収させたまたは封入した膜、スポンジまたは別の適切な材料を埋め込むことによって局所的に投与することができる。埋め込みデバイスを使用するある特定の実施形態では、デバイスを任意の適切な組織または器官に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、適時放出（ｔｉｍｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）ボーラス、または継続的な投与によるものであってよい。ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含む医薬組成物をｅｘｖｉｖｏ様式で使用することが望ましい場合がある。そのような例では、患者から取り出した細胞、組織および／または器官を、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含む医薬組成物に曝露させ、その後、細胞、組織および／または器官を患者に移植し戻す。

ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）は、本明細書に記載のものなどの方法を使用して、ポリペプチドを発現し、分泌するように遺伝子操作されたある特定の細胞を移植することによって送達することができる。ある特定の実施形態では、そのような細胞は、動物細胞であってもヒト細胞であってもよく、また、自己由来であっても、異種のもの（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であっても異種のもの（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であってもよい。ある特定の実施形態では、細胞は、不死化細胞であってよい。ある特定の実施形態では、免疫学的応答の機会を減少させるために、細胞を封入して周囲の組織の浸潤を回避することができる。ある特定の実施形態では、封入材料は、一般には、タンパク質産物（複数可）の放出を可能にするが、患者の免疫系によるまたは周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊は防止する生体適合性、半透性ポリマーの囲いまたは膜である。

処置方法
本明細書に記載のＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）、ならびに／またはそれらを発現する核酸は、異常なアポトーシスまたは分化プロセスに関連する障害（例えば、がんなどの細胞増殖性障害または細胞分化性障害）を処置するために有用である。本発明の方法による処置に適したがんの非限定的な例が下に記載されている。

細胞増殖性障害および／または分化性障害の例としては、がん（例えば、癌腫、肉腫、転移性障害または造血新生物障害、例えば、白血病）が挙げられる。転移性腫瘍は、これだけに限定されないが、前立腺、結腸、肺、乳房および肝臓のものを含めた多数の原発腫瘍型から生じ得る。したがって、例えば、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含む本明細書で使用される組成物を、がんを有する患者に投与することができる。

本明細書で使用される場合、「がん」（または「がん性」）、「過剰増殖性」および「新生物性」という用語は、自律的成長の能力を有する（すなわち、急速に増殖する細胞成長によって特徴付けられる異常な状況または状態の）細胞を指すために使用することができる。過剰増殖および新生物の病態は、病理的である（すなわち、病態を特徴付けるまたは構成する）とカテゴリー化することができる、または非病理的である（すなわち、正常からは逸脱しているが、病態に付随するものではない）とカテゴリー化することができる。この用語は、病理組織学的な型または侵襲性の段階には関係なく、全ての型のがん性成長もしくは発がん性プロセス、転移性組織または悪性に形質転換した細胞、組織もしくは器官を含むものとする。「病理的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍成長を特徴とする病態において生じる。非病理的過剰増殖性細胞の例としては、創傷修復に付随する細胞の増殖が挙げられる。

「がん」または「新生物」という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ腺およびリンパ組織、胃腸器官、および泌尿生殖器に影響を及ぼすものを含めた種々の器官系の悪性疾患、ならびに一般に、大多数の結腸がん、腎細胞癌、前立腺がんおよび／または精巣腫瘍、非小細胞肺癌、小腸のがんおよび食道のがんなどの悪性疾患を含むとみなされる腺癌を指すために使用される。

「癌腫」という用語は、当技術分野において理解されており、呼吸器系癌、胃腸系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、およびメラノーマを含めた、上皮または内分泌組織の悪性疾患を指す。腎癌もしくはメラノーマを含めた任意の型のがん、または任意のウイルス性疾患を有する、それを有する疑いがある、またはそれが発生するリスクが高い患者を処置するために、変異体ＩＬ−２ポリペプチドを使用することができる。例示的な癌腫としては、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成されるものが挙げられる。この用語は、がん性および肉腫様組織で構成される悪性腫瘍を含む癌肉腫も包含する。「腺癌」とは、腺組織に由来する癌腫または認識できる腺構造を形成する腫瘍細胞を指す。

増殖性障害のさらなる例としては、造血新生物障害が挙げられる。本明細書で使用される場合、「造血新生物障害」という用語は、例えば、骨髄系列、リンパ系列もしくは赤血球系列から生じる造血起源の過形成性／新生物細胞、またはその前駆細胞を伴う疾患を含む。疾患は、低分化型急性白血病（例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病）から生じるものであることが好ましい。追加的な例示的な骨髄障害としては、これだけに限定されないが、急性前骨髄性白血病（ａｃｕｔｅｐｒｏｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられる（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１年）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎＯｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１巻：２６７〜９７頁に概説されている）；リンパ系悪性疾患としては、これだけに限定されないが、Ｂ系列ＡＬＬおよびＴ系列ＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ｐｒｏｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられる。悪性リンパ腫の追加的な形態としては、これだけに限定されないが、非ホジキンリンパ腫およびその変形、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリード・シュテルンベルク病が挙げられる。

腫瘍の成長およびサイズを低下させるために十分な、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）のそれぞれの量、または治療有効量は、選択される特定の化合物または組成物に応じてだけでなく、投与経路、処置される状態の性質、ならびに患者の年齢および状態に応じても変動し、最終的には患者の医師または薬剤師の自由裁量になることが当業者には理解されよう。本方法において使用される化合物を与える時間の長さは個体ごとに変動する。

本明細書で使用されるＢ１６メラノーマモデルは、固形腫瘍の一般化されたモデルであることが当業者には理解されよう。すなわち、このモデルにおける処置の有効性から、他の非メラノーマ性固形腫瘍における処置の有効性も予測される。例えば、Ｂａｉｒｄら（ＪＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２０１３年；１９０巻：４６９〜７８頁；Ｅｐｕｂ、２０１２年１２月７日）に記載の通り、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍に対する抗腫瘍免疫の媒介における、適応免疫応答を誘導する寄生生物株であるｃｐｓの有効性を、肺癌および卵巣がんのモデルを含めた他の固形腫瘍に一般化できることが見いだされた。別の例では、ＶＥＧＦ標的化リンパ球に関する一連の研究の結果からも、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍における結果を、研究した他の腫瘍型に一般化できることが示された（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙら、ＪＣＩ２０１０年：１２０巻：３９５３〜６８頁；Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙら、ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ２０１２年：１８巻：１６７２〜８３頁）。さらに別の例では、ＬＡＧ−３およびＰＤ−１を伴う免疫療法により、腫瘍量の減少が導かれ、結果は線維肉腫および結腸腺癌細胞株に一般化できる（Ｗｏｏら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２０１２年：７２巻：９１７〜２７頁）。

ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を使用してがんを処置する。

ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を使用して、メラノーマ、白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸がん、腎癌、および脳がんを処置する。

ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃおよび場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）により、腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害する。

ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）により、腫瘍サイズを縮小させる。

ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）により、原発腫瘍の転移を阻害する。

ある特定の実施形態では、ＩＬ−２を伴ってまたは伴わずに、ノッチン−Ｆｃおよび免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）により、腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害する。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２を伴ってまたは伴わずに、ノッチン−Ｆｃおよび免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）により、腫瘍サイズを縮小させる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２を伴ってまたは伴わずに、ノッチン−Ｆｃおよび免疫チェックポイント遮断薬により、原発腫瘍の転移を阻害する。

本明細書における処置への言及は、予防法ならびに示されたがんおよび症状の処置に拡大することが当業者には理解されよう。

キット
キットは、本明細書に開示されているＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）、ならびに使用説明書を含んでよい。キットは、適切な容器中に、ＰＫ延長ＩＬ−２、インテグリン結合性ノッチン−Ｆｃ、場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）、１つまたは複数の対照、ならびに種々の緩衝液、試薬、酵素および当技術分野で周知の他の標準の成分を含んでよい。ある特定の実施形態では、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を同じバイアル中に伴うキットが含まれる。ある特定の実施形態では、キットは、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を別々のバイアル中に含む。

容器は、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を入れること、およびいくつかの場合には、適切に分注することができる、少なくとも１つのバイアル、ウェル、試験管、フラスコ、ビン、シリンジ、または他の容器手段を含んでよい。追加的な構成成分が提供される場合、キットは、この構成成分を入れることができる追加的な容器を含有してよい。キットは、ＰＫ延長ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）ならびに任意の他の試薬容器を商業販売のために密封して含めるための手段も含んでよい。そのような容器は、所望のバイアルが保持された射出成形または吹込み成形されたプラスチック容器を含んでよい。容器および／またはキットは、使用説明書および／または警告を伴うラベルを含んでよい。

以下の実施例によって本開示をさらに例示するが、これは、さらに限定するものと解釈されるべきではない。全ての図ならびに本出願全体を通して引用されている全ての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開特許出願の内容は、明白に参照により本明細書に組み込まれる。特に、ＰＣＴ公開ＷＯ１３／１７７１８７、米国特許第８，５３６，３０１号、および米国特許出願公開第２０１４／００７３５１８号の開示は、明白に参照により本明細書に組み込まれる。

以下は、本明細書に記載の方法を実行するための特定の実施形態の例である。実施例は、単に例示的な目的で提供されており、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関しては正確さを確実にするための試みが行われているが、いくらかの実験誤差および偏差は当然許容されるべきである。本発明の実施では、別段の指定のない限り、当技術分野の技術の範囲内に入るタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技法および薬理学の従来の方法を使用する。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、１９９３年）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＷｏｒｔｈＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、最新版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、１９９０年）；ＣａｒｅｙおよびＳｕｎｄｂｅｒｇ、ＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ）Ａ巻およびＢ巻（１９９２年）を参照されたい。

さらに、下記の実施例ではマウス起源のＰＫ延長ＩＬ−２（すなわち、ＰＫ延長基（マウス血清アルブミン）とＩＬ−２の両方がマウス起源のものである）、およびインテグリン結合性ノッチンと融合したマウスＦｃを使用しているが、対応するヒトＰＫ延長ＩＬ−２（すなわち、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトＩＬ−２、ならびにその改変体）、およびインテグリン結合性ヒト−Ｆｃ（すなわち、ノッチンと融合したヒトＩｇＧ１由来のＦｃ）を当業者が上記の方法を使用して容易に生成できること、および本明細書に開示されている方法において使用できることが理解されるべきである。

（実施例１）
Ｂ１６Ｆ１０腫瘍においてノッチン−Ｆｃ処置はＴＡ９９処置と同様に有効である
一般的な腫瘍関連抗原の欠如に取り組むために、ノッチン−Ｆｃタンパク質を工学的に操作した。ノッチン−Ｆｃタンパク質は、１）腫瘍関連αｖβ３、αｖβ５、およびα５β１インテグリン受容体に高い親和性で結合する、工学的に操作されたシスチンノット（ノッチン）ペプチド（具体的には２．５Ｆ、配列番号９４または９６）、および２）ｉｎｖｉｖｏにおける免疫エフェクター機能を媒介する抗体Ｆｃドメインの２つの部分を含む。使用するノッチン−Ｆｃは、別段の指定のない限り、Ｋ１５Ｓ置換を伴う、マウスＩｇＧ２ａＦｃドメインと融合した２．５Ｆ、配列番号４５である。

腫瘍の成長に対するノッチン−Ｆｃの効果を決定するために、Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞２．５×１０^５個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に皮下注射した。８０μｇのノッチン−Ｆｃ、８０μｇのノッチン−Ｄ２６５Ａ（マウスＩｇＧ２ａＦｃドメインにおけるＤ２６５Ａ変異は、ＦｃγＲおよび補体への結合を排除する）、または２００μｇのＴＡ９９を、腫瘍接種日に開始して２日毎に、合計で１０回の処置で腹腔内投与する予防的処置を行った。ＴＡ９９は、ＴＹＲＰ−１（メラノーマ細胞で見いだされる抗原）に結合し、メラノーマ腫瘍の成長を阻害する抗体である。

腫瘍面積を測定し、プロットした（図２）。カリパスを使用して腫瘍面積を測定した。まず任意の方向で腫瘍の最長寸法を測定し、その後、最長の垂直寸法を測定した。次いで、２つの値を掛け算して腫瘍面積を平方ミリメートル単位で定量化した。

ＴＡ９９処置およびノッチン−Ｆｃ処置のいずれによっても、腫瘍の成長が同程度に制御された。ノッチン−Ｄ２６５Ａでは腫瘍の成長を妨げることができなかったことにより、ノッチン−Ｆｃによる腫瘍制御がＦｃのエフェクター機能によって媒介されることが示される。

（実施例２）
ノッチン−ＦｃおよびＰＫ延長ＩＬ−２により、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の腫瘍成長が相乗的に制御される
ノッチン−Ｆｃ処置にＭＳＡ／ＩＬ−２を加えることの効果を調査するために、治療研究を行った。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮下にＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞１×１０^６個を注射することによって腫瘍を樹立した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および／または５００μｇのノッチン−Ｆｃを、腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で腹腔内投与した。

腫瘍面積を測定し、プロットした（図３Ａ）。ＭＳＡ／ＩＬ−２単独およびノッチン−Ｆｃ単独では腫瘍の成長に対する効果がなかったが、ＭＳＡ／ＩＬ−２とノッチン−Ｆｃの組み合わせでは、腫瘍の成長が有効に制御された。カプラン・マイヤー生存プロットにより、ＭＳＡ／ＩＬ−２とノッチン−Ｆｃの組み合わせにより、これらのマウスの生存が延長されるが、単独療法には有意な効果がないことが明らかになった（図３Ｂ）。

（実施例３）
ノッチン−ＦｃおよびＰＫ延長ＩＬ−２により、ＭＣ３８腫瘍の腫瘍成長が相乗的に制御される
標的にできる抗原が報告されていない腫瘍型におけるノッチン−Ｆｃの有効性に対するＭＳＡ／ＩＬ−２の効果を調査するために、別の治療研究を行った。ＭＣ３８マウス結腸癌細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ−ＩＬ−２および／または５００μｇのノッチン−Ｆｃを、腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で腹腔内投与した。

腫瘍の成長は、ＭＳＡ／ＩＬ−２とノッチン−Ｆｃの組み合わせを用いると制御されたが、各構成成分を単独療法として投与した場合には制御されなかった（図４Ａ）。カプラン・マイヤー生存プロットにより、ＭＳＡ／ＩＬ−２とノッチン−Ｆｃの組み合わせを用いて処置したマウスにおいて、各構成成分を単独療法として投与した場合と比較して生存が増加したことが示される（図４Ｂ）。

（実施例４）
ノッチン−ＦｃおよびＰＫ延長ＩＬ−２により、Ａｇ１０４Ａ腫瘍の腫瘍成長が相乗的に制御される
異なる腫瘍型におけるノッチン−Ｆｃの有効性に対するＭＳＡ／ＩＬ−２の効果を調査するために、追加の研究を行った。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスの側腹部にＡｇ１０４Ａ細胞１．０×１０^６個を注射することによってＡｇ１０４Ａ線維肉腫腫瘍を樹立した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および／または５００μｇのノッチン−Ｆｃを腫瘍接種の６日後から開始して、その後６日毎に腹腔内投与した。

腫瘍の成長は、ＭＳＡ／ＩＬ−２とノッチン−Ｆｃの組み合わせを用いると制御されたが、各構成成分を単独療法として投与した場合には制御されなかった（図５Ａ）。カプラン・マイヤー生存プロットにより、ＭＳＡ／ＩＬ−２とノッチン−Ｆｃの組み合わせを用いて処置したマウスにおいて、各構成成分を単独で投与した場合と比較して生存が増加することが示された（図５Ｂ）。

（実施例５）
相乗的な腫瘍制御にはエフェクター機能が必要である
実施例１の結果は、ノッチン−Ｆｃによる腫瘍制御にはエフェクター機能が必要であることを示すものである。ＭＳＡ／ＩＬ−２を用いた相乗的処置による腫瘍制御におけるエフェクター機能の役割を決定するために、Ｂ１６Ｆ１０細胞とＭＣ３８細胞の両方を使用してさらなる研究を行った。１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０細胞（図６Ａおよび６Ｂ）またはＭＣ３８細胞（図７Ａおよび７Ｂ）をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ−ＩＬ−２を、腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で腹腔内投与した。５００μｇのノッチン−Ｆｃまたはノッチン−Ｄ２６５ＡＦｃ（マウスＩｇＧ２ａＦｃドメインにおけるＤ２６５Ａ変異は、ＦｃγＲおよび補体への結合を排除する）を、腫瘍接種の６日後、およびその後６日毎に、合計４回の処置で腹腔内投与した。

個々の腫瘍サイズ測定値（図６Ａおよび７Ａ）および生存プロット（図６Ｂおよび７Ｂ）から、ノッチン−Ｆｃによる腫瘍制御にはＦｃのエフェクター機能が必要であることが示される。

（実施例６）
治療用抗体および免疫チェックポイント遮断薬により、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍におけるノッチン−ＦｃおよびＰＫ延長ＩＬ−２の有効性が増強される
ノッチン−ＦｃおよびＰＫ延長ＩＬ−２による相乗的な腫瘍制御に対する抗体の影響を決定するために、Ｂ１６Ｆ１０細胞を使用して追加の研究を行った。Ｂ１６Ｆ１０細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２を腫瘍接種の６日後に開始して６日毎に、合計５回の処置で投与し、２００μｇのノッチン−Ｆｃを腫瘍接種の６日後から３０日後まで毎日投与した。ＴＹＲＰ−１に対する抗体（ＴＡ９９）をマウス当たり１００μｇでＢ１６Ｆ１０腫瘍接種の６日後に開始して６日毎に投与した。ＰＤ−１に対する抗体を、マウス当たり２００μｇで、腫瘍接種の６日後に開始して６日毎に投与した。

個々の腫瘍サイズ測定値（図８Ａ）および生存プロット（図８Ｂ）から、抗体により、ノッチン−ＦｃおよびＭＳＡ／ＩＬ−２を介する腫瘍制御が増強されたことが示された。しかし、これは、抗体が腫瘍細胞上に存在する抗原を標的化する場合にのみ有効である。ノッチン−ＦｃおよびＭＳＡ／ＩＬ−２を治療用抗体または免疫チェックポイント遮断薬と組み合わせることにより、腫瘍制御および生存改善の有効性が増大した。

（実施例７）
免疫チェックポイント遮断薬により、ＭＣ３８腫瘍におけるノッチン−ＦｃおよびＰＫ延長ＩＬ−２の有効性が増強される
ノッチン−ＦｃおよびＰＫ延長ＩＬ−２による相乗的な腫瘍制御に対する抗体の影響を決定するために、ＭＣ３８細胞を使用して追加の研究を行った。ＭＣ３８細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および５００μｇのノッチン−Ｆｃを、腫瘍接種の６日後に開始して６日毎に、合計４回の処置で投与した。ＰＤ−１に対する抗体を、マウス当たり２００μｇで、腫瘍接種の６日後に開始して６日毎に投与した。

個々の腫瘍サイズ測定値（図９Ａ）および生存プロット（図９Ｂ）から、抗体によりノッチン−ＦｃおよびＭＳＡ／ＩＬ−２を介する腫瘍制御が増強されたことが示される。しかし、これは、抗体が腫瘍細胞上に存在する抗原を標的化する場合にのみ有効である。最も有効な処置は、ノッチン−ＦｃおよびＭＳＡ／ＩＬ−２と免疫チェックポイント遮断（抗ＰＤ−１）抗体を組み合わせることであった。

（実施例８）
ノッチン−Ｆｃは、隔日または毎週投与した場合に有効である
抗腫瘍応答の最小の投薬要件を決定するために、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマおよびＭＣ３８結腸癌腫瘍モデルを使用し、ノッチン−Ｆｃを、毎日、隔日、または毎週投与した。Ｂ１６Ｆ１０細胞１×１０^６個（図１０）またはＭＣ３８細胞１×１０^６個（図１１）をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２を、腫瘍接種の６日後、１２日後、１８日後、および２４日後に投与した。２００μｇのノッチン−Ｆｃを、６日目に開始し、２８日目に終了して、毎日または隔日で投与した。５００μｇのノッチン−Ｆｃを、毎週レジメンで６日目、１２日目、１８日目、および２４日目に投与した。どちらのモデルにおいても、ＭＳＡ／ＩＬ−２と合わせてノッチン−Ｆｃを隔日でまたは６日毎に投与することは、毎日投与することと同等であった。

（実施例９）
ノッチン−ＦｃおよびＦｃ−ノッチン構築物により腫瘍成長が制御される
抗腫瘍応答のために最適な、ノッチンと融合するＦｃの配置を決定するために、ＦｃをＮ末端（ノッチン−Ｆｃ）またはＣ末端（Ｆｃ−ノッチン）に融合した。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞２．５×１０^５個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。８０μｇのノッチン−Ｆｃ、８０μｇのＦｃ−ノッチン、または２００μｇのＩｇＧ−ノッチンを、腫瘍接種の直後、およびその後２日毎に、合計１０回の処置で投与した。腫瘍面積を測定した（図１２）。異なるノッチン−Ｆｃ融合タンパク質の間で有効性の差異は基本的になかった。

この所見を検証するために、別のマウス腫瘍モデルを利用した。ＭＣ３８結腸癌細胞１×１０^６個をアルビノＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。２００μｇのノッチン−ＦｃまたはＦｃ−ノッチンを、腫瘍接種の直後、およびその後２日毎に、合計１０回の処置で投与した。腫瘍面積を測定した（図１３）。ノッチン−ＦｃとＦｃ−ノッチンの間で有効性の差異は基本的になかった。これらのマウス腫瘍モデルからの結果のいずれによっても、ノッチン−Ｆｃ融合タンパク質におけるＦｃの配置は、抗腫瘍応答の有効性に影響を及ぼさないことが示される。

最適なインテグリン結合性ノッチン−Ｆｃ構築物を決定するために、ノッチンとＦｃドメインの間に（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを含有する融合タンパク質を作出した。リンカーを含有しないインテグリン結合性ノッチン−Ｆｃと比較して、Ｕ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞に対するインテグリン結合親和性に差異は観察されなかった（データは示していない）。

（実施例１０）
ノッチン−ＦｃとＩＬ−２の組み合わせにより、二次腫瘍攻撃から保護される
ノッチン−ＦｃとＭＳＡ／ＩＬ−２の組み合わせにより、処置したマウスが二次攻撃から保護されるかどうかを決定するために、ＭＣ３８腫瘍モデルを使用した。ＭＣ３８細胞１×１０^６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射し、３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２と５００μｇのノッチン−Ｆｃの両方を、腫瘍接種の６日後に開始して６日毎に、合計４回の処置で投与した。以前に治癒したマウスまたは年齢を釣り合わせたナイーブなマウスに、最初の腫瘍接種の１６〜２０週間後に、逆側の側腹部にＭＣ３８細胞１×１０^６個を接種した。さらなる処置は行わなかった。

個々の腫瘍サイズ測定値（図１４Ａ）および生存プロット（図１４Ｂ）から、ノッチン−ＦｃおよびＭＳＡ／ＩＬ−２により、以前に処置したマウスが二次腫瘍攻撃から保護されることが示され、これにより、腫瘍に対する強力かつ持続的な免疫応答が実証される。

（実施例１１）
３種のインテグリンの全てを標的化するノッチン−Ｆｃにより、腫瘍の成長が最も有効に制御される
腫瘍の成長の制御における、３種のインテグリンの全てを標的化するノッチン−Ｆｃ（すなわち、αｖβ３、αｖβ５、およびα５β１、「２．５Ｆ＿ノッチン−Ｆｃ」配列番号４５）の有効性を、２種のインテグリンのみを標的化するノッチン−Ｆｃ（すなわち、αｖβ３およびαｖβ５、「２．５Ｄ＿ノッチン−Ｆｃ」配列番号４７）と比較して評価するために、３種の異なる腫瘍モデル（すなわち、Ｂ１６Ｆ１０、ＭＣ３８、およびＡｇ１０４Ａ）を使用して実験を行った。１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０細胞（図１５Ａおよび１５Ｂ）またはＭＣ３８細胞（図１６Ａおよび１６Ｂ）をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。Ａｇ１０４Ａ細胞１．０×１０^６個（図１７Ａおよび１７Ｂ）をＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２、５００μｇの２．５Ｆ＿ノッチン−Ｆｃおよび／または２．５Ｄ＿ノッチン−Ｆｃを腫瘍接種の６日後に開始して６日毎に、合計４回の処置で投与した。

個々の腫瘍サイズ測定値（図１５Ａ、１６Ａおよび１７Ａ）および生存プロット（図１５Ｂ、１６Ｂおよび１７Ｂ）から、３種のインテグリンの全てを標的化するノッチン−Ｆｃは、２種のインテグリンのみを標的化するノッチン−Ｆｃよりも有効に腫瘍の成長を制御することが示される。

（実施例１２）
腫瘍を担持するマウスにおける、生存に重要な免疫細胞集団
ノッチン−ＦｃおよびＭＳＡ／ＩＬ−２を用いて処置したＭＣ３８腫瘍を有するマウスの生存の改善における種々の免疫細胞集団の役割を評価するために、枯渇実験を行った。４００μｇの抗ＣＤ８、抗ＣＤ４、抗ＮＫ１．１、抗Ｌｙ６Ｇまたは抗ＣＤ１９抗体を、腫瘍接種の４日後に開始して４日毎に、合計６回の処置で投与した。３００μｇの抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を、腫瘍接種の４日目に開始して２日毎に、合計１１回の処置で投与した。３０μｇのコブラ毒因子（ＣＶＦ）を、腫瘍接種の５日後に開始して６日毎に、合計４回の処置で投与した。抗ＣＤ８はＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させるものであり、抗ＣＤ４はＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇させるものであり、抗ＮＫ１．１はナチュラルキラー細胞を枯渇させるものであり、抗Ｌｙ６Ｇは好中球を枯渇させるものであり、抗ＣＤ１９はＢ細胞を枯渇させるものであり、抗ＣＳＦ−１Ｒは組織常在性／腫瘍常在性マクロファージを枯渇させるものである。ＣＶＦは補体活性を阻害するものである。

個々の腫瘍サイズ測定値（図１８Ａ）および生存プロット（図１８Ｂ）から、腫瘍制御に対するノッチン−ＦｃとＭＳＡ／ＩＬ−２の相乗効果には、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびマクロファージが特に重要であることが示される。

免疫細胞枯渇に加えて、Ｂａｔｆ３−／−マウスを使用して、交差提示性ＣＤ８＋樹状細胞の役割を評価した。Ｂａｔｆ３−／−マウスは、基本的なロイシンジッパー転写因子であるＡＴＦ様３の機能を欠く。Ｂａｔｆ３の欠失により、ＭＨＣクラスＩ上の外因性抗原の交差提示に重要であるＣＤ８＋樹状細胞の発生が妨げられることが示されている。

処置したＣ５７ＢＬ／６マウス（すなわち、「対照」）およびＢａｔｆ３−／−マウスの腫瘍面積を測定し、プロットし（図１９Ａ）、ＭＳＡ／ＩＬ−２およびノッチン−Ｆｃを用いて処置したＢａｔｆ３−／−マウスにおける腫瘍制御が低いことが実証された。カプラン・マイヤー生存プロットも作成し、それにより、ノッチン−ＦｃおよびＭＳＡ／ＩＬ−２を用いて処置したＢａｔｆ３−／−マウスの生存がＣ５７ＢＬ／６マウスと比較して有意に減少することが明らかになった（図１９Ｂ）。これにより、樹状細胞による交差提示が、ＭＣ３８腫瘍の成長を制御することに対する併用療法の有効性に寄与する因子であり得ることが示された。

ノッチン−ＦｃとＭＳＡ−ＩＬ−２の組み合わせの有効性にはＣＤ８＋Ｔ細胞が重大であることが見いだされ、また、ＭＳＡ−ＩＬ−２と治療用抗体の組み合わせの有効性にはＩＦＮγが重要であることが以前報告されているので（Ｚｈｕら、ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ（２０１５年）２７巻：４８９〜５０１頁）、ＩＦＮγの役割をＭＣ３８腫瘍モデルにおいて調査した。１×１０^６個のＭＣ３８をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２および５００μｇのノッチン−Ｆｃを腫瘍接種の６日後に開始して６日毎に、合計４回の処置で投与した。２００μｇの抗ＩＮＦγ抗体を、腫瘍接種の５日後に開始して２日毎に、合計１１回の処置で投与した。

図２０Ａおよび２０Ｂに示されている通り、ＩＦＮγ枯渇は、ＭＣ３８腫瘍を有するマウスの腫瘍制御または生存に有意な影響を及ぼさなかった。

（実施例１３）
免疫抑制との拮抗により腫瘍を担持するマウスの生存が改善される
免疫系のサプレッサーを阻害することによって腫瘍制御の有効性を増強できるかどうかを決定するために、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のアンタゴニストまたは細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）のアンタゴニストを、ＭＣ３８またはＢ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスに投与した。１×１０^６個のＭＣ３８細胞（図２１Ａ、２１Ｂおよび２２）またはＢ１６Ｆ１０（図２３Ａおよび２３Ｂ）をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射した。３０μｇのＭＳＡ／ＩＬ−２、５００μｇのノッチン−Ｆｃ、および２００μｇの抗ＶＥＧＦ抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体を腫瘍接種の６日後に開始して６日毎に、合計４回の処置で投与した。

抗ＶＥＧＦ抗体（クローンＢ２０−４．１．１）（Ｂａｇｒｉら、Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（２０１０年）１６巻：３８８７〜９００頁）および抗ＣＴＬＡ−４抗体（９Ｄ９）（Ｓｅｌｂｙら、ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．（２０１３年）１巻：３２〜４２頁）の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする合成遺伝子を、哺乳動物細胞（ＧｅｎｅＡｒｔ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）における発現についてコドン最適化した。Ｂ２０−４．１．１抗体構築物は、ＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするＤＮＡ挿入断片をＰＣＲ増幅し、ＣＭＶプロモーター、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、ならびにマウスＩｇＧ２ａ重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）または軽鎖定常領域（ＣＬ）（以下のＢ２０−４．１．１についての配列１および２を参照されたい）のいずれかをコードするＤＮＡ配列を含有する別々のｇＷｉｚ発現ベクター（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）にＧｉｂｓｏｎａｓｓｅｍｂｌｙによってクローニングすることによって生成した。９Ｄ９抗体構築物を、ＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするＤＮＡ挿入断片をＰＣＲ増幅し、ＣＭＶプロモーター、アンピシリン抗生物質耐性遺伝子、およびマウスＩｇＧ２ａ重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）または軽鎖定常領域（ＣＬ）の両方を含有する２重カセットｐ２ＭＰＴ発現ベクター（ＥＰＦＬＰｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｒｅｆａｃｉｌｉｔｙ、ｈｔｔｐ：／／ｐｅｃｆ．ｅｐｆｌ．ｃｈ）に、それぞれ、制限部位ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩを介してサブクローニングすることによって生成した。全ての構築物をＤＮＡ配列決定（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）によって検証した。

抗ＶＥＧＦ抗体Ｂ２０−４．１．１は、以前に記載されている通り、一過性にトランスフェクトしたヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３−Ｆ）細胞において、Ｆｒｅｅ−Ｓｔｙｌｅ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して発現させたものであった（Ｚｈｕら、ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ（２０１５年）２７巻：４８９〜５０１頁）。抗体９Ｄ９は、一過性にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現させたものであり、ＥＰＦＬＰｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｒｅｆａｃｉｌｉｔｙ（ｈｔｔｐ：／／ｐｅｃｆ．ｅｐｆｌ．ｃｈ）により提供された。発現の７日後に、細胞を、遠心分離することによって取り出し（４℃、１５，０００×ｇで３０分）、濾過（０．２２μｍのＰＥＳ膜フィルター）し、上清中のタンパク質を、プロテインＡクロマトグラフィーによって製造者（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）の説明書に従って精製した。溶出した抗体をさらに脱塩し、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒｓｙｓｔｅｍに接続し、緩衝液１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて平衡化したＨｉＬｏａｄＳｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／６００サイズ排除カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。精製された抗体を３００００ＮＭＷＬＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｆｉｌｔｅｒデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を４℃、４０００ｇで使用して濃縮し、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量化した。分子量を還元および非還元ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって確認した。純度をＦＰＬＣによって評価した。タンパク質試料を、ＭＯＰＳ緩衝液中ＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＧｅｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した変性および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後のクーマシー染色によって分析した。濃縮後の抗体のネイティブなサイズおよびオリゴマー形成状況も、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒｓｙｓｔｅｍに接続し、緩衝液１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。

腫瘍面積を測定し、プロットし（図２１Ａ、２２および２３Ａ）、生存プロットを作成した（図２１Ｂおよび２３Ｂ）。三重の組み合わせ（すなわち、ＭＳＡ／ＩＬ−２＋ノッチン−Ｆｃ＋抗ＶＥＧＦおよびＭＳＡ／ＩＬ−２＋ノッチン−Ｆｃ＋抗ＣＴＬＡ−４）は、２重の組み合わせ（すなわち、ＭＳＡ／ＩＬ−２＋抗ＶＥＧＦおよびノッチン−Ｆｃ＋抗ＶＥＧＦまたはＭＳＡ／ＩＬ−２＋抗ＣＴＬＡ−４およびノッチン−Ｆｃ＋抗ＣＴＬＡ−４）と比較して、腫瘍の成長を有意に制御し、生存を改善した。これは、抗ＰＤ−１抗体をＭＳＡ／ＩＬ−２とノッチン−Ｆｃの組み合わせに加えた場合に観察された結果と同様であり、これにより、ＭＳＡ／ＩＬ−２＋ノッチン−Ｆｃの組み合わせの有効性を改善するために免疫系の他のサプレッサーを阻害することができることが示された。抗ＶＥＧＦ抗体を加えることによる治療有効性の改善は、ＲＥＮＣＡ（腎腺癌）およびＬＬＣ（Ｌｅｗｉｓ肺癌）腫瘍モデルにおいても観察された（データは示していない）。

均等物
当業者は、常套的な実験だけを使用して、本明細書に記載されている本明細書に記載の特定の実施形態の多くの均等物を理解するまたは確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。

Claims

被験体における腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための、有効量のインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質を含む組成物であって、前記被験体に免疫チェックポイント遮断薬がさらに投与されることを特徴とし、前記免疫チェックポイント遮断薬は、ＰＤ−１を標的化する抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ−Ｌ１を標的化する抗体またはその抗原結合断片、ならびにＣＴＬＡ４を標的化する抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択され、前記インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質は、（ｉ）インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインを含み、前記インテグリン結合性ポリペプチドが前記Ｆｃドメインと作動可能に連結しており、前記インテグリン結合性ループは、ＲＧＤペプチド配列を含む、組成物。
被験体における腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための、有効量の免疫チェックポイント遮断薬を含む組成物であって、前記免疫チェックポイント遮断薬は、ＰＤ−１を標的化する抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ−Ｌ１を標的化する抗体またはその抗原結合断片、ならびにＣＴＬＡ４を標的化する抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択され、前記被験体にインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質がさらに投与されることを特徴とし、前記インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質は、（ｉ）インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインを含み、前記インテグリン結合性ポリペプチドが前記Ｆｃドメインと作動可能に連結しており、前記インテグリン結合性ループは、ＲＧＤペプチド配列を含む、組成物。
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、およびα_５β_１からなる群より選択される腫瘍関連インテグリンまたはその組み合わせに結合する、請求項１または請求項２に記載の組成物。
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、およびα_５β_１に結合する、請求項１または請求項２に記載の組成物。
前記ノッチンポリペプチド足場が、少なくとも３つのシステインジスルフィド結合または架橋結合したシステイン残基を含み、前記インテグリン結合性ループが、前記ノッチンポリペプチド足場のシステイン残基に近接している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
前記ノッチンポリペプチド足場が、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＡｇＲＰ、およびアガトキシンからなる群より選択されるノッチンタンパク質に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
前記ノッチンタンパク質が、ＥＥＴＩ−ＩＩである、請求項６に記載の組成物。
前記インテグリン結合性ループが、ネイティブなＥＥＴＩ−ＩＩ配列内の第１のシステインの後に挿入されている、請求項７に記載の組成物。
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、配列番号４２（ＧＣＸ _１Ｘ _２Ｘ _３ＲＧＤＸ _７Ｘ _８Ｘ _９Ｘ _１０Ｘ _１１ＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ）または配列番号４３（ＧＣＸ _１Ｘ _２Ｘ _３ＲＧＤＸ _７Ｘ _８Ｘ _９Ｘ _１０Ｘ _１１ＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ）に記載されているアミノ酸配列を含み、ここでＸ_１が、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｈ、Ｄ、およびＮからなる群より選択され；Ｘ_２が、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｅ、およびＱからなる群より選択され；Ｘ_３が、Ｇ、Ａ、およびＰからなる群より選択され；Ｘ_７が、ＷおよびＮからなる群より選択され；Ｘ_８が、Ａ、Ｐ、およびＳからなる群より選択され；Ｘ_９が、ＰおよびＲからなる群より選択され；Ｘ_１０が、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、およびＥからなる群より選択され；Ｘ_１１が、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、およびＥからなる群より選択される、請求項１または請求項２に記載の組成物。
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、配列番号６７〜１３３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、配列番号９４または９６のアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
前記ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、リンカーを伴ってまたは伴わずに、前記Ｆｃドメインと作動可能に連結している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、前記ＦｃドメインのＮ末端と作動可能に連結している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、前記ＦｃドメインのＣ末端と作動可能に連結している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
前記インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号４８、４９、５０、または５１のアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
前記免疫チェックポイント遮断薬が、ＰＤ−１を標的化する抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
前記免疫チェックポイント遮断薬が、ＣＴＬＡ４を標的化する抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
前記免疫チェックポイント遮断薬が、ＰＤ−Ｌ１を標的化する抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
前記被験体にＶＥＧＦのアンタゴニストがさらに投与されることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
前記ＶＥＧＦのアンタゴニストが、ＶＥＧＦに結合する抗体もしくはその抗原結合断片、ＶＥＧＦ受容体に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤、ドミナントネガティブＶＥＧＦ、またはＶＥＧＦ受容体である、請求項２０に記載の組成物。
前記被験体に薬物動態延長インターロイキン（ＩＬ）−２がさらに投与されることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
前記がんが、メラノーマ、白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸がん、腎細胞癌、膵がん、子宮頸がん、および脳がんからなる群より選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。