JP6800141B2 - Il−2およびインテグリン結合性fc融合タンパク質による相乗的な腫瘍処置 - Google Patents

Il−2およびインテグリン結合性fc融合タンパク質による相乗的な腫瘍処置 Download PDF

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Description

関連出願
この出願は、2014年8月12日に出願された米国仮出願第62/036554号の優先権の利益を主張する。この仮出願の内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
政府の資金供与
この発明は、National Institutes of Healthによって付与された契約CA174795の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
インターロイキン2(IL−2)は、T細胞およびNK細胞の増殖を活性化および誘導する多面的なサイトカインである。IL−2は、FDAによる認可を受けた療法であるが、全身性のIL−2処置には著しい毒性があり、したがって、患者の奏効率は25%未満である。半減期が延長されたIL−2と、腫瘍特異的抗原に対する抗体との組み合わせにより、処置に関する有望な結果が示されている。しかし、抗体に基づく療法は、多くの場合、多くの腫瘍には公知の腫瘍関連抗原がないという事実が問題となっている。
インテグリンは、固形腫瘍の開始、進行および転移に極めて重要な一連の多様な細胞機能を調節する細胞外マトリクス接着受容体のファミリーである。腫瘍の進行における重要性により、インテグリンはがん療法の魅力的な標的となっており、また、種々のがんの型の処置が可能になる。がん性細胞上に存在するインテグリンとしては、αβ、αβ、およびαβが挙げられる。抗体、直鎖状ペプチド、環状ペプチド、およびペプチド模倣薬を含めた、がんに関連する個々のインテグリンを標的化する種々の治療薬が開発されてきた。しかし、小さな、構造化されたペプチド足場が利用されたことも、または2種超のインテグリンが同時に標的化されたこともない。さらに、現行のインテグリン標的化薬物は、単独療法として提供されている。種々のがんに対してより有効に闘うためには新規の併用療法が必要である。
本発明は、薬物動態改変基に付加したIL−2(以降、「薬物動態(PK)延長IL−2」と称される)およびインテグリン結合性Fc融合タンパク質を投与することにより、相乗的な腫瘍制御がもたらされ、いずれかの薬剤単独での単独療法と比較して生存が延長されるという発見に一部基づく。インテグリン結合性Fc融合タンパク質は、(i)インテグリン結合性ループおよびノッチン(knottin)ポリペプチド足場を有するインテグリン結合性ポリペプチドならびに(ii)免疫グロブリンFcドメインを含み、インテグリン結合性ポリペプチドはFcドメインと作動可能に連結している。有効量のIL−2およびインテグリン結合性Fc融合タンパク質の併用投与を伴う、改善されたがん療法が提供される。
したがって、一態様では、本発明は、被験体におけるがんを処置するための方法であって、被験体に、インターロイキン(IL)−2と、(i)インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに(ii)免疫グロブリンFcドメインを含むインテグリン結合性Fc融合タンパク質であって、インテグリン結合性ポリペプチドがFcドメインと作動可能に連結しているインテグリン結合性Fc融合タンパク質とを有効量で投与するステップを含む方法を提供する。
前述の態様の一実施形態では、IL−2は、IL−2融合タンパク質などのPK延長IL−2の形態である。一実施形態では、融合タンパク質は、IL−2部分と、免疫グロブリン断片、ヒト血清アルブミン、およびFn3からなる群より選択される部分とを含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリンFcドメインと作動可能に連結したIL−2部分を含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、ヒト血清アルブミンと作動可能に連結したIL−2部分を含む。別の実施形態では、PK延長IL−2は、非タンパク質ポリマーとコンジュゲートしたIL−2部分を含む。一実施形態では、非タンパク質ポリマーは、ポリエチレングリコールである。
前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性Fc融合タンパク質は、αβ、αβ、およびαβからなる群より選択される腫瘍関連インテグリンまたはその組み合わせに結合するインテグリン結合性ポリペプチドを含む。一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、αβ、αβ、およびαβに結合する。
前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、ノッチンポリペプチド足場内にインテグリン結合性ループを含む。一部の実施形態では、ノッチンポリペプチド足場は、少なくとも3つのシステインジスルフィド結合または架橋結合したシステイン残基を含み、インテグリン結合性ループはノッチンポリペプチド足場のシステイン残基に近接している。一実施形態では、インテグリン結合性ループは、RGDペプチド配列を含む。別の実施形態では、ノッチンポリペプチド足場は、EETI−II、AgRP、およびアガトキシンからなる群より選択されるノッチンタンパク質に由来する。一実施形態では、ノッチンタンパク質はEETI−IIである。
前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、RGDペプチド配列を含むインテグリン結合性ループを含み、ノッチンポリペプチド足場は、EETI−IIに由来する。
前述の態様の一実施形態では、ノッチンポリペプチド足場は、EETI−IIに由来するものであり、インテグリン結合性ループは、配列XRGDX1011を含み、各Xは任意のアミノ酸を表し、当該ループは、EETI−II配列内の2つのシステイン残基の間に挿入され、ネイティブなEETI−II配列を置き換えている。別の実施形態では、インテグリン結合性ループは、ネイティブなEETI−II配列内の第1のシステインの後に挿入されている。
前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、配列番号42または43に記載のアミノ酸配列を含み、Xは、A、V、L、P、F、Y、S、H、D、およびNからなる群より選択され;Xは、G、V、L、P、R、E、およびQからなる群より選択され;Xは、G、A、およびPからなる群より選択され;Xは、WおよびNからなる群より選択され;Xは、A、P、およびSからなる群より選択され;Xは、PおよびRからなる群より選択され;X10は、A、V、L、P、S、T、およびEからなる群より選択され;X11は、G、A、W、S、T、K、およびEからなる群より選択される。さらなる実施形態では、インテグリン結合性Fc融合物は、配列番号2または3に記載されているヒトIgG Fcドメインと作動可能に連結した、配列番号42または43に記載されているインテグリン結合性ポリペプチドを含む。
前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、表1に記載されているアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、配列番号67133からなる群からのアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、表1に記載されているインテグリン結合性ポリペプチドは、配列番号2または3に記載されているヒトIgG1 Fcドメインと作動可能に連結している。
前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、配列番号939495または96のアミノ酸配列を含む。
前述の態様の一実施形態では、Fcドメインは、ヒトIgG1 Fcドメインである。
前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、リンカーを伴ってまたは伴わずに、Fcドメインと作動可能に連結している。一部の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、リンカーを伴わずにFcドメインのN末端またはC末端と連結している。他の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、Gly−Serリンカーなどのリンカーを伴って、FcドナーのN末端またはC末端と連結している。
前述の態様の一実施形態では、インテグリン結合性Fc融合タンパク質は、配列番号48、49、50または51のアミノ酸配列を含む。
前述の態様のいずれかでは、方法は、IL−2およびインテグリン結合性Fc融合タンパク質を、薬学的に許容される担体を伴う医薬組成物の形態で投与するステップを含む。
一部の実施形態では、インテグリン結合性Fc融合タンパク質は、二量体の形態である。
前述の態様のいずれかでは、方法は、IL−2およびインテグリン結合性Fc融合タンパク質を同時にまたは逐次的に投与するステップを含む。
前述の態様のいずれかでは、方法は、PD−1、PD−L1、CTLA−4、TIM3、LAG3、またはB7ファミリーのメンバーを標的化する抗体または抗体断片などの免疫チェックポイント遮断薬を投与するステップをさらに含む。一実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、PD−1を標的化する抗体またはその抗体断片である。別の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、CTLA4を標的化する抗体または抗体断片である。
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬の代わりにVEGFのアンタゴニストを投与する。さらなる実施形態では、VEGFのアンタゴニストは、VEGFに結合する抗体もしくはその抗体断片、VEGF受容体に結合する抗体もしくはその抗体断片、VEGF受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤、ドミナントネガティブVEGF、またはVEGF受容体である。
前述の態様の一実施形態では、方法は、インテグリン結合性Fc融合タンパク質および免疫チェックポイント遮断薬を、IL−2を伴ってまたは伴わずに投与するステップを含む。
前述の態様のいずれかでは、がんは、メラノーマ、白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸がん、腎細胞癌、膵がん、子宮頸がん(cervical cancer)、および脳がんからなる群より選択される。一部の実施形態では、がんは、メラノーマである。他の実施形態では、がんは、髄芽腫(medullablastoma)などの脳がんである。他の実施形態では、がんは結腸がんである。
別の態様では、本発明は、被験体における腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害するための方法であって、被験体に、薬物動態(PK)延長インターロイキン(IL)−2と、(i)インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに(ii)免疫グロブリンFcドメインを含むインテグリン結合性Fc融合タンパク質であって、インテグリン結合性ポリペプチドがFcドメインと作動可能に連結しているインテグリン結合性Fc融合タンパク質とを有効量で投与するステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、被験体における腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害するための方法であって、被験体に、(i)インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに(ii)免疫グロブリンFcドメインを含むインテグリン結合性Fc融合タンパク質であって、インテグリン結合性ポリペプチドがFcドメインと作動可能に連結しているインテグリン結合性Fc融合タンパク質と、免疫チェックポイント遮断薬とを有効量で投与するステップを含む方法を提供する。さらなる実施形態では、有効量のIL−2も投与する。
前述の態様の一実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、PD−1を標的化する抗体または抗体断片である。別の態様では、免疫チェックポイント遮断薬は、CTLA−4を標的化する抗体または抗体断片である。
別の態様では、本発明は、被験体における腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害するための方法であって、被験体に、(i)インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに(ii)免疫グロブリンFcドメインを含むインテグリン結合性Fc融合タンパク質であって、インテグリン結合性ポリペプチドがFcドメインと作動可能に連結しているインテグリン結合性Fc融合タンパク質と、VEGFのアンタゴニストとを有効量で投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、VEGFのアンタゴニストは、VEGFに結合する抗体もしくはその抗体断片、VEGF受容体に結合する抗体もしくはその抗体断片、VEGF受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤、ドミナントネガティブVEGF、またはVEGF受容体である。
例えば、本発明の実施形態の例として以下の項目が挙げられる。
(項目1)
被験体におけるがんを処置するための方法であって、前記被験体に、インターロイキン(IL)−2と、(i)インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに(ii)免疫グロブリンFcドメインを含むインテグリン結合性Fc融合タンパク質であって、前記インテグリン結合性ポリペプチドが前記Fcドメインと作動可能に連結している、インテグリン結合性Fc融合タンパク質とを有効量で投与するステップを含む、方法。
(項目2)
IL−2が、薬物動態(PK)延長IL−2である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記PK延長IL−2が、融合タンパク質を含む、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記融合タンパク質が、IL−2部分と、免疫グロブリン断片、ヒト血清アルブミン、およびFn3からなる群より選択される部分とを含む、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記融合タンパク質が、免疫グロブリンFcドメインと作動可能に連結したIL−2部分を含む、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記融合タンパク質が、ヒト血清アルブミンと作動可能に連結したIL−2部分を含む、項目4に記載の方法。
(項目7)
前記PK延長IL−2が、非タンパク質ポリマーとコンジュゲートしたIL−2部分を含む、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記非タンパク質ポリマーがポリエチレングリコールである、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、α β 、α β 、およびα β からなる群より選択される腫瘍関連インテグリンまたはその組み合わせに結合する、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、α β 、α β 、およびα β に結合する、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記ノッチンポリペプチド足場が、少なくとも3つのシステインジスルフィド結合または架橋結合したシステイン残基を含み、前記インテグリン結合性ループが、前記ノッチンポリペプチド足場のシステイン残基に近接している、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記インテグリン結合性ループが、RGDペプチド配列を含む、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記ノッチンポリペプチド足場が、EETI−II、AgRP、およびアガトキシンからなる群より選択されるノッチンタンパク質に由来する、項目11に記載の方法。
(項目14)
前記ノッチンタンパク質が、EETI−IIである、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記インテグリン結合性ループが、RGDペプチド配列を含み、前記ノッチンポリペプチド足場が、EETI−IIに由来する、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記ノッチンポリペプチド足場が、EETI−IIに由来するものであり、前記インテグリン結合性ループが、配列X RGDX 10 11 を含み、ここで各Xは任意のアミノ酸を表し、前記ループが、EETI−II配列内の2つのシステイン残基の間に挿入され、ネイティブなEETI−II配列を置き換えている、項目1に記載の方法。
(項目17)
前記インテグリン結合性ループが、ネイティブなEETI−II配列内の第1のシステインの後に挿入されている、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、配列番号42または43に記載されているアミノ酸配列を含み、ここでX が、A、V、L、P、F、Y、S、H、D、およびNからなる群より選択され;X が、G、V、L、P、R、E、およびQからなる群より選択され;X が、G、A、およびPからなる群より選択され;X が、WおよびNからなる群より選択され;X が、A、P、およびSからなる群より選択され;X が、PおよびRからなる群より選択され;X 10 が、A、V、L、P、S、T、およびEからなる群より選択され;X 11 が、G、A、W、S、T、K、およびEからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、配列番号67〜133からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目20)
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、配列番号94または96のアミノ酸配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目21)
前記FcドメインがヒトIgG1 Fcドメインである、項目1に記載の方法。
(項目22)
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、リンカーを伴ってまたは伴わずに、前記Fcドメインと作動可能に連結している、項目1に記載の方法。
(項目23)
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、前記FcドメインのN末端と作動可能に連結している、項目1に記載の方法。
(項目24)
前記インテグリン結合性ポリペプチドが、前記FcドメインのC末端と作動可能に連結している、項目1に記載の方法。
(項目25)
前記インテグリン結合性Fc融合タンパク質が、配列番号48、49、50、または51のアミノ酸配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目26)
前記PK延長IL−2および前記インテグリン結合性Fc融合タンパク質を同時にまたは逐次的に投与する、項目1から25までのいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
免疫チェックポイント遮断薬を投与するステップをさらに含む、項目1から25までのいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記免疫チェックポイント遮断薬が、PD−1、PD−L1、CTLA4、TIM3、LAG3、およびB7ファミリーのメンバーからなる群より選択されるタンパク質を標的化する抗体または抗体断片である、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記免疫チェックポイント遮断薬が、PD−1を標的化する抗体または抗体断片である、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記免疫チェックポイント遮断薬が、CTLA4を標的化する抗体または抗体断片である、項目28に記載の方法。
(項目31)
VEGFのアンタゴニストを投与するステップをさらに含む、項目1から25までのいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記VEGFのアンタゴニストが、VEGFに結合する抗体もしくはその抗体断片、VEGF受容体に結合する抗体もしくはその抗体断片、VEGF受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤、ドミナントネガティブVEGF、またはVEGF受容体である、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記がんが、メラノーマ、白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸がん、腎細胞癌、膵がん、子宮頸がん、および脳がんからなる群より選択される、項目1から32までのいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
被験体における腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害するための方法であって、前記被験体に、薬物動態(PK)延長インターロイキン(IL)−2と、(i)インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに(ii)免疫グロブリンFcドメインを含むインテグリン結合性Fc融合タンパク質であって、前記インテグリン結合性ポリペプチドが前記Fcドメインと作動可能に連結している、インテグリン結合性Fc融合タンパク質とを有効量で投与するステップを含む、方法。
(項目35)
被験体における腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害するための方法であって、前記被験体に、(i)インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに(ii)免疫グロブリンFcドメインを含むインテグリン結合性Fc融合タンパク質であって、前記インテグリン結合性ポリペプチドが前記Fcドメインと作動可能に連結している、インテグリン結合性Fc融合タンパク質と、免疫チェックポイント遮断薬とを有効量で投与するステップを含む、方法。
(項目36)
前記免疫チェックポイント遮断薬が、PD−1、PD−L1、CTLA4、TIM3、LAG3、およびB7ファミリーのメンバーからなる群より選択されるタンパク質を標的化する抗体または抗体断片である、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記免疫チェックポイント遮断薬が、PD−1を標的化する抗体または抗体断片である、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記免疫チェックポイント遮断薬が、CTLA4を標的化する抗体または抗体断片である、項目36に記載の方法。
(項目39)
被験体における腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害するための方法であって、前記被験体に、(i)インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに(ii)免疫グロブリンFcドメインを含むインテグリン結合性Fc融合タンパク質であって、前記インテグリン結合性ポリペプチドが前記Fcドメインと作動可能に連結している、インテグリン結合性Fc融合タンパク質と、VEGFのアンタゴニストとを有効量で投与するステップを含む、方法。
(項目40)
前記VEGFのアンタゴニストが、VEGFに結合する抗体もしくはその抗体断片、VEGF受容体に結合する抗体もしくはその抗体断片、VEGF受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤、ドミナントネガティブVEGF、またはVEGF受容体である、項目39に記載の方法。
本発明のこれらのおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明、および添付図に関してよりよく理解されよう。
図1は、ノッチンタンパク質EETI−II(配列番号39)、AgRP(配列番号40)およびオメガアガトキシン4B(配列番号41)の配列内のCys−Cysジスルフィド結合の位置を示す。システイン残基は、この工学的に操作されたペプチドでは角括弧内に入ったRGD模倣ループのすぐ隣に見ることができる。例えば、AgRPではRGD配列に隣接するシステインが互いと連結するが、EETIではRGD配列に隣接するシステインは互いと連結しないことを見ることができる。移植される配列のサイズは、分子フレームワーク構造に左右され、したがって、ループがフレームワーク内の連結したシステインに近接する場合には、より短いものであることが好ましい。他のノッチンタンパク質に関するジスルフィド結合は、ノッチンデータベースに記載されている。図1の出典はBiochemistry、40巻、15520〜15527頁(2001年)およびJ. Biol. Chem.、2003年、278巻:6314〜6322頁である。
図2は、皮下B16F10メラノーマ腫瘍におけるTA99を用いた腫瘍制御およびインテグリン結合性ノッチン−Fc(配列番号45)を用いた腫瘍制御を比較したグラフである。TA99は、メラノーマ細胞上で過剰発現する抗原であるTYRP−1に対する抗体である。B16F10細胞2.5×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射することによって腫瘍を樹立した。80μgのノッチン−Fc、80μgのノッチン−Fc D265A、または200μgのTA99を、腫瘍接種日に開始し、その後2日毎に投与した。エラーバーは、平均値の標準誤差(SEM)を表す。
図3Aおよび3Bは、樹立B16F10メラノーマ腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。B16F10細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2および/または500μgのノッチン−Fcを、腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。図3A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図3B)カプラン・マイヤー生存プロット。 図3Aおよび3Bは、樹立B16F10メラノーマ腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。B16F10細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2および/または500μgのノッチン−Fcを、腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。図3A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図3B)カプラン・マイヤー生存プロット。
図4Aおよび4Bは、樹立MC38結腸腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。MC38細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射し、30μgのMSA/IL−2および/または500μgのノッチン−Fcを、腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。図4A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図4B)カプラン・マイヤー生存プロット。 図4Aおよび4Bは、樹立MC38結腸腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。MC38細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射し、30μgのMSA/IL−2および/または500μgのノッチン−Fcを、腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。図4A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図4B)カプラン・マイヤー生存プロット。
図5Aおよび5Bは、樹立Ag104A線維肉腫腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。Ag104A細胞1×10個をC3H/HeNマウスの側腹部に注射した。12.5μgのMSA/IL−2および/または500μgのノッチン−Fcを、腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。図5A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図5B)カプラン・マイヤー生存プロット。 図5Aおよび5Bは、樹立Ag104A線維肉腫腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。Ag104A細胞1×10個をC3H/HeNマウスの側腹部に注射した。12.5μgのMSA/IL−2および/または500μgのノッチン−Fcを、腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。図5A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図5B)カプラン・マイヤー生存プロット。
図6Aおよび6Bは、樹立B16F10メラノーマ腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。B16F10細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2および500μgのノッチン−Fcまたはノッチン−Fc D265Aを、腫瘍接種の6日後、およびその後毎日、合計4回の処置で投与した。図6A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図6B)カプラン・マイヤー生存プロット。
図7Aおよび7Bは、樹立MC38腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。MC38細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射し、30μgのMSA/IL−2および500μgのノッチン−Fcまたはノッチン−Fc D265Aを、腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。図7A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図7B)カプラン・マイヤー生存プロット。
図8Aおよび8Bは、樹立B16F10腫瘍における抗体を用いた相乗的な腫瘍制御を示す。B16F10細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2を、腫瘍接種の6日後に開始して6日毎に、合計5回の処置で投与した。200μgのノッチン−Fcを腫瘍接種の6日後から30日後まで毎日投与した。TYRP−1に対する抗体(TA99)をマウス当たり100μgで腫瘍接種の6日後に開始して6日毎に投与した。PD−1に対する抗体(免疫チェックポイント遮断用)をマウス当たり200μgで腫瘍接種の6日後に開始して6日毎に投与した。図8A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図8B)カプラン・マイヤー生存プロット。 図8Aおよび8Bは、樹立B16F10腫瘍における抗体を用いた相乗的な腫瘍制御を示す。B16F10細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2を、腫瘍接種の6日後に開始して6日毎に、合計5回の処置で投与した。200μgのノッチン−Fcを腫瘍接種の6日後から30日後まで毎日投与した。TYRP−1に対する抗体(TA99)をマウス当たり100μgで腫瘍接種の6日後に開始して6日毎に投与した。PD−1に対する抗体(免疫チェックポイント遮断用)をマウス当たり200μgで腫瘍接種の6日後に開始して6日毎に投与した。図8A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図8B)カプラン・マイヤー生存プロット。
図9Aおよび9Bは、樹立MC38腫瘍における抗体を用いた相乗的な腫瘍制御を示す。MC38細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2、500μgのノッチン−Fc、および/または200μgの抗PD−1抗体を腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。図9A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図9B)カプラン・マイヤー生存プロット。 図9Aおよび9Bは、樹立MC38腫瘍における抗体を用いた相乗的な腫瘍制御を示す。MC38細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2、500μgのノッチン−Fc、および/または200μgの抗PD−1抗体を腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。図9A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図9B)カプラン・マイヤー生存プロット。
図10は、B16F10腫瘍モデルにおける、ノッチン−FcおよびMSA−IL−2の投薬スケジュールを比較した腫瘍成長制御を示す線グラフである。30μgのMSA/IL−2を腫瘍接種の6日後、12日後、18日後および24日後に投与した。200μgのノッチン−Fcを腫瘍接種の6日後に開始して毎日または隔日で投与した。500μgのノッチン−Fcを毎週レジメンでMSA/IL−2と同じ日に投与した。群当たりマウス5匹を用いた平均腫瘍面積をプロットし、エラーバーはSEMを表す。
図11は、MC38腫瘍モデルにおける、ノッチン−FcおよびMSA/IL−2の投薬スケジュールを比較した腫瘍成長制御を示す線グラフである。30μgのMSA/IL−2を腫瘍接種の6日後、12日後、18日後および24日後に投与した。200μgのノッチン−Fcを腫瘍接種の6日後に開始して毎日または隔日で投与した。500μgのノッチン−Fcを毎週レジメンでMSA/IL−2と同じ日に投与した。群当たりマウス5匹を用いた平均腫瘍面積をプロットし、エラーバーはSEMを表す。
図12は、皮下B16F10腫瘍における腫瘍制御を示す線グラフである。融合の配置の有効性を比較するためにFcをN末端(ノッチン−Fc)またはC末端(Fc−ノッチン)のいずれかに融合した。さらに、ノッチンを無関連のIgGの重鎖のC末端に融合した(IgG−ノッチン)。マウスを、腫瘍接種の直後に開始して2日毎に80μgのノッチン−FcもしくはFc−ノッチンまたは200μgのIgG−ノッチンを用いて処置した。
図13は、皮下MC38腫瘍における腫瘍制御を示す線グラフである。融合の配置の有効性を比較するためにFcをN末端(ノッチン−Fc)またはC末端(Fc−ノッチン)のいずれかに融合した。さらに、ノッチンを無関連のIgGの重鎖のC末端に融合した(IgG−ノッチン)。マウスを、腫瘍接種の直後に開始して2日毎に200μgのノッチン−FcまたはFc−ノッチンを用いて処置した。
図14Aおよび14Bは、MC38腫瘍細胞を用いた二次腫瘍攻撃後の腫瘍制御を示す。以前に治癒したマウス(MSA/IL−2およびノッチン−Fcを用いて処置した)および年齢を釣り合わせたナイーブなマウスに、最初の腫瘍接種の16〜20週間後にMC38腫瘍細胞1×10個を逆側の側腹部に接種した。さらなる処置は行わなかった。図14A)二次腫瘍攻撃後の、以前に治癒したマウスおよび年齢を釣り合わせたナイーブなマウスについての腫瘍面積のグラフ。図14B)二次腫瘍攻撃に供したマウスのカプラン・マイヤープロット。
図15Aおよび15Bは、樹立B16F10メラノーマ腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。B16F10細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2、500μgの、3種のインテグリンを標的化するノッチン−Fc(「2.5F_ノッチン−Fc」)、および/または2種のインテグリンを標的化するノッチン−Fc(「2.5D_ノッチン−Fc」)を腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。図15A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図15B)カプラン・マイヤー生存プロット。
図16Aおよび16Bは、樹立MC38腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。MC38細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2、500μgの、3種のインテグリンを標的化するノッチン−Fc(「2.5F_ノッチン−Fc」)、および/または2種のインテグリンを標的化するノッチン−Fc(「2.5D_ノッチン−Fc」)を腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。図16A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図16B)カプラン・マイヤー生存プロット。
図17Aおよび17Bは、樹立Ag104A血管肉腫腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。Ag104A細胞1×10個をC3H/HeNマウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2、500μgの、3種のインテグリンを標的化するノッチン−Fc(「2.5F_ノッチン−Fc」)、および/または2種のインテグリンを標的化するノッチン−Fc(「2.5D_ノッチン−Fc」)を腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。図17A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図17B)カプラン・マイヤー生存プロット。
図18Aおよび18Bは、ノッチン−FcおよびMSA/IL−2を用いて処置した樹立MC38腫瘍を有するマウスの生存に対する免疫細胞枯渇の影響を示す。MC38細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2および500μgのノッチン−Fcを腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。400μgの抗CD8抗体、抗CD4抗体、抗NK1.1抗体、抗Ly6G抗体または抗CD19抗体を、腫瘍接種の4日後に開始して4日毎に、合計6回の処置で投薬した。300μgの抗CSF−1Rを、腫瘍接種の5日目に開始して2日毎に、合計11回の処置で投薬した。30μgのコブラ毒因子(CVF)を、腫瘍接種の5日後に開始して6日毎に、合計4回の処置で投与した。図18A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図18B)カプラン・マイヤー生存プロット。 図18Aおよび18Bは、ノッチン−FcおよびMSA/IL−2を用いて処置した樹立MC38腫瘍を有するマウスの生存に対する免疫細胞枯渇の影響を示す。MC38細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2および500μgのノッチン−Fcを腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。400μgの抗CD8抗体、抗CD4抗体、抗NK1.1抗体、抗Ly6G抗体または抗CD19抗体を、腫瘍接種の4日後に開始して4日毎に、合計6回の処置で投薬した。300μgの抗CSF−1Rを、腫瘍接種の5日目に開始して2日毎に、合計11回の処置で投薬した。30μgのコブラ毒因子(CVF)を、腫瘍接種の5日後に開始して6日毎に、合計4回の処置で投与した。図18A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図18B)カプラン・マイヤー生存プロット。
図19Aおよび19Bは、樹立MC38腫瘍を有するマウスの生存に対する樹状細胞枯渇の影響を示す。MC38細胞1×10個をC57BL/6マウスまたはBatf3−/−マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2および500μgのノッチン−Fcを腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。図19A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図19B)カプラン・マイヤー生存プロット。
図20Aおよび20Bは、樹立MC38腫瘍を有するマウスでの、MSA/IL−2およびノッチン−Fcを用いた処置の有効性におけるIFNγの役割を示す。MC38細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2および500μgのノッチン−Fcを腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。200μgの抗IFNγ抗体を、腫瘍接種の5日後に開始して2日毎に、合計11回の処置で投与した。図20A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図20B)カプラン・マイヤー生存プロット。
図21Aおよび21Bは、樹立MC38腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。MC38細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2、500μgのノッチン−Fc、および/または200μgの抗VEGF抗体を腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。図21A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図21B)カプラン・マイヤー生存プロット。
図22は、樹立MC38腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す腫瘍面積のグラフを示す。MC38細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2、500μgのノッチン−Fc、および/または200μgの抗CTLA−4抗体を腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。
図23Aおよび23Bは、樹立B16F10腫瘍における相乗的な腫瘍制御を示す。B16F10細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2、500μgのノッチン−Fc、200μgの抗VEGF抗体および/または200μgの抗CTLA−4抗体を腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で投与した。図23A)各処置についての腫瘍面積のグラフ。図23B)カプラン・マイヤー生存プロット。
定義
特許請求の範囲および明細書において使用されている用語は、別段の指定がない限り下記の通り定義される。親仮特許出願において使用されている用語と直接矛盾する場合には、本明細書において使用されている用語に支配されるものとする。
「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸の類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によりコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびO−ホスホセリンである。アミノ酸の類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基と結合した炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。アミノ酸は、本明細書では、それらの一般に公知の3文字記号によってか、またはIUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨されている1文字記号によって言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般に認められている1文字コードによって言及され得る。
「アミノ酸置換」とは、所定のアミノ酸配列(出発ポリペプチドのアミノ酸配列)内の少なくとも1つの既存のアミノ酸残基の、第2の、異なる「置き換え」アミノ酸残基での置き換えを指す。「アミノ酸挿入」とは、所定のアミノ酸配列への少なくとも1つの追加的なアミノ酸の組み入れを指す。挿入は通常は1つまたは2つのアミノ酸残基の挿入からなるが、現行のより大きな「ペプチド挿入」、例えば、約3〜約5個またはさらには約10個、15個、または20個までのアミノ酸残基の挿入を行うことができる。挿入される残基(複数可)は、上に開示されている通り天然に存在するものであっても天然には存在しないものであってもよい。「アミノ酸欠失」とは、所定のアミノ酸配列からの少なくとも1つのアミノ酸残基の除去を指す。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では、互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーにあてはまる。
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかのそのポリマーを指す。特に限定がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。別段の指定のない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその改変体(例えば、縮重コドン置換)および相補配列ならびに明示された配列も暗黙のうちに包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された(または全ての)コドンの第3の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成することができる(Batzerら、Nucleic Acid Res. 19巻:5081頁、1991年;Ohtsukaら、Biol. Chem. 260巻:2605〜2608頁、1985年;およびCassolら、1992年;Rossoliniら、Mol. Cell. Probes 8巻:91〜98頁、1994年)。アルギニンおよびロイシンに関しては、第2の塩基における修飾も保存的なものである。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、および遺伝子によりコードされるmRNAと互換的に使用される。本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、修飾されていないRNAまたはDNAであっても修飾されたRNAまたはDNAであってもよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成されるものであってよい。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖、またはより一般には二本鎖であるか一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であってよいDNAとRNAを含むハイブリッド分子で構成されるものであってよい。さらに、ポリヌクレオチドは、RNAかDNA、またはRNAとDNAの両方を含む三本鎖領域で構成されるものであってよい。ポリヌクレオチドは、安定性のためにまたは他の理由で修飾された1つまたは複数の修飾塩基またはDNAまたはRNA骨格も含有してよい。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの普通でない塩基が挙げられる。DNAおよびRNAに種々の修飾を行うことができ、したがって、「ポリヌクレオチド」とは、化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾された形態を包含する。
本明細書で使用される場合、「インターロイキン(IL)−2」とは、T細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞の増殖を活性化および誘導する多面的なサイトカインを指す。IL−2は、アルファサブユニット、ベータサブユニット、およびガンマサブユニットで構成されるその受容体IL−2Rに結合することによってシグナル伝達を行う。IL−2シグナル伝達により、抗原活性化T細胞の増殖が刺激される。
本明細書で使用される場合、「PK」という用語は、「薬物動態」の頭字語であり、例として、被験体による吸収、分布、代謝、および排除を含めた化合物の性質を包含する。本明細書で使用される場合、「PK延長基」とは、生物活性分子と融合または一緒に投与すると生物活性分子の循環半減期を増大させるタンパク質、ペプチド、または部分を指す。PK延長基の例としては、PEG、ヒト血清アルブミン(HSA)結合剤(米国特許出願公開第2005/0287153号および同第2007/0003549号、PCT公開第WO2009/083804号および同第WO2009/133208号に開示されている通り、およびUS2012/094909に記載されているSABA分子)、ヒト血清アルブミン、FcまたはFc断片およびその改変体、ならびに糖(例えば、シアル酸)が挙げられる。他の例示的なPK延長基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kontermannら、Current Opinion in Biotechnology 2011年:22巻:868〜876頁に開示されている。本明細書で使用される場合、「PK延長IL−2」とは、PK延長基と組み合わせたIL−2部分を指す。一実施形態では、PK延長IL−2は、IL−2部分がPK延長基と連結または融合した融合タンパク質である。例示的な融合タンパク質は、1つまたは複数のIL−2部分がHSAと連結したHSA/IL−2融合物である。
「PK延長IL−2」という用語は、IL−2の、その受容体のうちの1つまたは複数、例えば、CD25に対する親和性を増強する、1つまたは複数のアミノ酸残基の変異を有するIL−2変異体も包含するものとする。一実施形態では、PK延長IL−2のIL−2部分は野生型IL−2である。別の実施形態では、IL−2部分は、CD25に対する親和性が野生型IL−2よりも高い変異体IL−2である。HSA−IL−2などの、特定の型のPK延長基が示されている場合、これは、野生型IL−2部分と融合したHSAまたはMSAまたは変異体IL−2部分と融合したHSAまたはMSAの両方を包含することが理解されるべきである。
ある特定の態様では、記載されているPK延長IL−2またはノッチン−Fcには、1つまたは複数の「リンカードメイン」、例えばポリペプチドリンカーなどを使用することができる。本明細書で使用される場合、「リンカー」または「リンカードメイン」という用語は、2つまたはそれ超のドメイン(例えば、PK部分およびIL−2)を直鎖状配列に接続する配列を指す。本明細書で使用される場合、「ポリペプチドリンカー」という用語は、2つまたはそれ超のドメインをポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列に接続するペプチドまたはポリペプチド配列(例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列)を指す。例えば、ポリペプチドリンカーを使用して、IL−2部分またはインテグリン結合性ポリペプチドをFcドメインまたはHSAなどの他のPK延長剤(extender)と接続することができる。一部の実施形態では、そのようなポリペプチドリンカーにより、ポリペプチド分子に可撓性をもたらすことができる。例示的なリンカーとしては、Gly−Serリンカーが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「連結した」、「融合した」、または「融合」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、化学的なコンジュゲーションまたは組換え手段を含めた手段を問わず、2つまたはそれ超の要素または構成成分またはドメインを接合することを指す。化学的なコンジュゲーション(例えば、ヘテロ二官能性架橋剤を使用した)の方法は、当技術分野で公知である。
「インテグリン」という用語は、細胞接着に重要な膜貫通ヘテロ二量体タンパク質を意味する。インテグリンは、αサブユニットおよびβサブユニットを含む。これらのタンパク質は、細胞外マトリクス構成成分(例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンなど)に結合してシグナル伝達カスケードを誘導することによって応答する。インテグリンは、細胞外マトリクス構成成分に、RGDモチーフを認識することによって結合する。ある特定のインテグリンは、腫瘍細胞の表面上に見いだされ、したがって、有望な治療上の標的になる。ある特定の実施形態では、標的化されるインテグリンは、個別にまたは組み合わせて、αβ、αβ、およびαβである。
「インテグリン結合性ポリペプチド」という用語は、ノッチンポリペプチド足場内のインテグリン結合性ドメインまたはループを含むポリペプチドを指す。インテグリン結合性ドメインまたはループは、少なくとも1つのRGDペプチドを含む。ある特定の実施形態では、RGDペプチドは、αβ、αβ、またはαβによって認識される。ある特定の実施形態では、RGDペプチドは、αβ、αβ、および/またはαβの組み合わせに結合する。これらの特定のインテグリンは、腫瘍細胞およびそれらの脈管構造上に見いだされ、したがって、目的の標的である。
「ループドメイン」という用語は、規則的な二次構造を有さず、一般にペプチドの表面上に存在する、ペプチド鎖内のアミノ酸部分配列を指す。「ループ」という用語は、当技術分野では、アルファヘリックス、ベータシートなどの形態にみられるように規則的ではない二次構造を指すものと理解される。
「インテグリン結合性ループ」という用語は、一般にはインテグリンと結合させるための定方向分子進化などの実験的方法によって非経験的に創出される約9〜13アミノ酸の一次配列を指す。ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ループは、足場に独特であり、所望の結合特異性のアミノ酸間に位置するRGDペプチド配列などを含む。RGDを含有するペプチドまたは同様のもの(RYDなど)は、一般に、公知のタンパク質の天然の結合性配列から単純には取得されない。インテグリン結合性ループをノッチンポリペプチド足場のシステイン残基間に挿入し、ループの長さは、システイン残基間の三次元間隔に応じて最適なインテグリン結合のために調整することが好ましい。例えば、ノッチン足場内の隣接するシステイン残基が互いと連結している場合、最適なループは、隣接するシステイン残基が一次配列では離れたシステイン残基と連結している場合よりも短くてよい。他の点では、より長いRGDを含有するループを、高親和性インテグリン結合のために最適なコンフォメーションに制約するために、特定のアミノ酸置換を導入することができる。本明細書で使用されるノッチンポリペプチド足場は、ネイティブなノッチンを短縮する、またはループまたは不必要なシステイン残基またはジスルフィド結合を除去するある特定の修飾を含有してよい。
インテグリン結合性配列を分子(例えば、ノッチンポリペプチド)足場に組み入れることにより、直鎖状または環状ペプチドループよりも剛性かつ安定なリガンド提示のフレームワークがもたらされる。さらに、溶液中の小さなペプチドのコンフォメーションの可撓性は高く、結合に際して大きなエントロピーペナルティが生じる。インテグリン結合性配列をノッチンポリペプチド足場に組み入れることにより、高親和性インテグリン結合に必要なコンフォメーションの制約がもたらされる。さらに、足場により、親和性または安定性成熟化などのタンパク質工学研究を行うためのプラットフォームがもたらされる。
本明細書で使用される場合、「ノッチンタンパク質」という用語は、タンパク質、糖および脂質などの様々な分子標的に結合する小さなタンパク質、一般には25〜40アミノ酸の構造ファミリーを指す。それらの三次元構造は、基本的に、3つ〜5つのジスルフィド結合の独特の配置によって定義される。同じシスチンネットワークを有するいくつかの異なるマイクロタンパク質(microprotein)において見いだされた、1つのジスルフィド架橋が2つの他の鎖内ジスルフィド結合によって限定された大環状分子を交差する特徴的なノットトポロジー(knotted topology)が、このクラスの生体分子の名称の由来である。それらの二次構造含量は一般に低いが、ノッチンは、ジスルフィド結合フレームワークによって安定化された小さな三本鎖逆平行のβ−シートを共有する。シスチンノットタンパク質とも称される、生化学的に明確に定義されたノッチンファミリーのメンバーとしては、Ecballium elaterium種子由来のトリプシン阻害剤EETI−II、捕食性イモガイConus geographusの毒液由来のニューロンN型Ca2+チャネル遮断薬ω−コノトキシン、アグーチ関連タンパク質(AgRP、Millhauserら、「Loops and Links: Structural Insights into the Remarkable Function of the Agouti−Related Protein」、Ann. N.Y. Acad. Sci.、2003年6月1日;994巻(1号):27〜35頁を参照されたい)、オメガアガトキシンファミリーなどが挙げられる。適切なアガトキシン配列[配列番号41]は、発明者が本出願と共通する米国特許第8,536,301号に示されている。本明細書に開示されている方法における使用に適した他のアガトキシン配列としては、オメガ−アガトキシン−Aa4b(GenBank受託番号P37045)およびオメガ−アガトキシン−Aa3b(GenBank受託番号P81744)が挙げられる。本明細書に開示されている方法における使用に適した他のノッチン配列としては、ノッチン[Bemisia tabaci](GenBank受託番号FJ601218.1)、オメガ−リコトキシン(lycotoxin)(GenBank受託番号P85079)、mu−OコノトキシンMrVIA=電位開口型ナトリウムチャネル阻害薬(GenBank受託番号AAB34917)およびMomordica cochinchinensisトリプシン阻害剤I(MCoTI−I)またはII(McoTI−II)(それぞれUniprot受託番号P82408およびP82409)が挙げられる。
ノッチンタンパク質は、特徴的なジスルフィド連結構造を有する。この構造は、Gellyら、「The KNOTTIN website and database: a new information system dedicated to the knottin scaffold」、Nucleic Acids Research、2004年、32巻、Database issue、D156〜D159頁にも例示されている。三本鎖β−シートは多くのノッチンに存在する。インテグリン結合性ループの分子トポロジーおよびコンフォメーションと同様に、システイン残基間の間隔が重要である。
「分子足場」という用語は、本明細書に記載のRGDペプチド配列などのインテグリン結合性ループが組み込まれる予め定義された三次元構造を有するポリマーを意味する。「分子足場」という用語は、当技術分野で認められている意味(他の文脈で)を有し、それが本明細書でも意図されている。例えば、Skerra、「Engineered protein scaffolds for molecular recognition」、J. Mol. Recognit. 2000年;13巻:167〜187頁による概説には、以下の足場:免疫グロブリンスーパーファミリーの抗体の単一ドメイン、プロテアーゼ阻害剤、ヘリックスバンドルタンパク質、ジスルフィドノットペプチドおよびリポカリンが記載されている。適切な分子足場の選択に関する手引きが示されている。
「ノッチンポリペプチド足場」という用語は、本明細書に記載の分子足場として使用するために適したノッチンタンパク質を指す。工学的操作のために望ましいノッチンポリペプチド足場の特性としては、1)in vitroおよびin vivoにおける安定性が高いこと、2)全体的なフォールディングを破壊することなく足場のアミノ酸領域を他の配列で置き換えることができること、3)分子の別々の領域を工学的に操作することによって多機能性または二特異性標的化を創出することができること、および4)所望であれば非天然アミノ酸の化学合成および組み入れが可能になる小さなサイズであることが挙げられる。毒性または免疫原性の懸念を低下させるために、治療への適用にはヒトタンパク質に由来する足場が好ましいが、これは必ずしも厳密な要件ではない。タンパク質設計に使用されている他の足場としては、フィブロネクチン(Koideら、1998年)、リポカリン(Besteら、1999年)、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA−4)(Huftonら、2000年)、およびテンダミスタット(tendamistat)(McConnellおよびHoess、1995年;Liら、2003年)が挙げられる。これらの足場は、タンパク質工学のための有用なフレームワークであることが証明されているが、ノッチンなどの分子足場には、サイズが小さく、安定性が高いという別個の利点がある。
本明細書で使用される場合、「EETI」という用語は、Protein Data Bank Entry(PDB)2ETIを意味する。ノッチンデータベースでのそのエントリーはEETI−IIである。これは、配列:
GC PRILMRCKQDSDCLAGCVCGPNGFCG(配列番号39)
を有する。
本明細書で使用される場合、「AgRP」という用語は、PDBエントリー1HYKを意味する。ノッチンデータベースでのそのエントリーは、SwissProt AGRP_HUMANであり、そこでは129アミノ酸の全長配列を見ることができる。これは、アミノ酸87で始まる配列を含む。この構築物には追加的なGが付加される。これは、Jacksonら、2002年、Biochemistry、41巻、7565頁に記載の通り、C105A変異も包含する。
ループ4からの太字および下線が引かれている部分を本明細書に記載のRGD配列で置き換える。ループ1および3を以下の角括弧の間に示す:
GC[VRLHES]CLGQQVPCC[DPCAT]CYCRFFNAFCYCR−KLGTAMNPCSRT
本明細書で使用される場合、「インテグリン結合性Fc融合物」は、「ノッチン−Fc」と互換的に使用され、ノッチンポリペプチド足場内にインテグリン結合性アミノ酸配列を含み、Fcドメインと作動可能に連結したインテグリン結合性ポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、Fcドメインをインテグリン結合性ポリペプチドのN末端と融合する。ある特定の実施形態では、Fcドメインをインテグリン結合性ポリペプチドのC末端と融合する。一部の実施形態では、Fcドメインを、リンカーを介してインテグリン結合性ポリペプチドと作動可能に連結する。
本明細書で使用される場合、「Fc領域」という用語は、ネイティブな免疫グロブリンの、2つの重鎖のそれぞれのFcドメイン(またはFc部分)によって形成される一部分を指す。本明細書で使用される場合、「Fcドメイン」という用語は、単一の免疫グロブリン(Ig)重鎖の一部分を指し、FcドメインはFvドメインを含まない。そのように、Fcドメインは、「Ig」または「IgG」と称することもできる。ある特定の実施形態では、Fcドメインは、抗体のパパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まり、C末端で終わる。したがって、完全なFcドメインは、少なくとも、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む。ある特定の実施形態では、Fcドメインは、ヒンジ(例えば、上部、中央部、および/または下部ヒンジ領域)ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメインまたはその改変体、部分、もしくは断片の少なくとも1つを含む。他の実施形態では、Fcドメインは、完全なFcドメイン(すなわち、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメイン)を含む。一実施形態では、Fcドメインは、CH3ドメイン(またはその一部)と融合したヒンジドメイン(またはその一部)を含む。別の実施形態では、Fcドメインは、CH3ドメイン(またはその一部)と融合したCH2ドメイン(またはその一部)を含む。別の実施形態では、Fcドメインは、CH3ドメインまたはその一部からなる。別の実施形態では、Fcドメインは、ヒンジドメイン(またはその一部)およびCH3ドメイン(またはその一部)からなる。別の実施形態では、Fcドメインは、CH2ドメイン(またはその一部)およびCH3ドメインからなる。別の実施形態では、Fcドメインは、ヒンジドメイン(またはその一部)およびCH2ドメイン(またはその一部)からなる。一実施形態では、Fcドメインは、CH2ドメインの少なくとも一部分(例えば、CH2ドメインの全部または一部)を欠く。本明細書では、Fcドメインとは、一般に、免疫グロブリン重鎖のFcドメインの全部または一部を含むポリペプチドを指す。これは、これだけに限定されないが、CH1、ヒンジ、CH2、および/またはCH3ドメインの全体を含むポリペプチド、ならびに例えば、ヒンジ、CH2、およびCH3ドメインのみを含むそのようなペプチドの断片を含む。Fcドメインは、これだけに限定されないが、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、またはIgM抗体を含めた、任意の種および/または任意の亜型の免疫グロブリンに由来するものであってよい。ヒトIgG1定常領域は、Uniprot P01857および表2において見ることができる(すなわち、配列番号1)。ヒトIgG1のFcドメインは、表2において見ることができる(すなわち、配列番号2)。上部ヒンジ領域が欠失したヒトIgG1のFcドメインは、表2において見ることができる(すなわち、配列番号3)。Fcドメインは、ネイティブなFcおよびFc改変体分子を含む。Fc改変体およびネイティブなFcと同様に、Fcドメインという用語は、全抗体から消化されたものか他の手段によって作製されたものかにかかわらず、単量体形態または多量体(例えば、二量体)形態の分子を含む。Fcドメインに対するアミノ酸残基番号の割り当てはKabatの定義に従う。例えば、それぞれがあらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれる、Sequences of Proteins of Immunological Interest (Table of Contents、IntroductionおよびConstant Region Sequencesの項)、第5版、Bethesda、MD:NIH、1巻:647〜723頁(1991年);Kabatら、「Introduction」Sequences of Proteins of Immunological Interest、US Dept of Health and Human Services、NIH、第5版、Bethesda、MD 1巻:xiii〜xcvi頁(1991年);ChothiaおよびLesk、J. Mol. Biol. 196巻:901〜917頁(1987年);Chothiaら、Nature 342巻:878〜883頁(1989年)を参照されたい。
本明細書に記載の通り、任意のFcドメインのアミノ酸配列が天然に存在する免疫グロブリン分子のネイティブなFcドメインから変化するように任意のFcドメインを修飾することができることが当業者には理解されよう。ある特定の例示的な実施形態では、Fcドメインは、エフェクター機能(例えば、FcγR結合)が増大している。
本発明のポリペプチドのFcドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来するものであってよい。例えば、ポリペプチドのFcドメインは、IgG1分子由来のCH2および/またはCH3ドメインおよびIgG3分子に由来するヒンジ領域を含む。別の例では、Fcドメインは、IgG1分子に一部由来し、IgG3分子に一部由来するキメラヒンジ領域を含んでよい。別の例では、Fcドメインは、IgG1分子に一部由来し、IgG4分子に一部由来するキメラヒンジを含んでよい。
指定のポリペプチドまたはタンパク質に「由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、ポリペプチドの起源を指す。好ましくは、特定の配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その配列またはその一部分と基本的に同一であり、ここで一部分とは、少なくとも10〜20アミノ酸、好ましくは少なくとも20〜30アミノ酸、より好ましくは少なくとも30〜50アミノ酸からなる、または当業者がその配列が起源であることを他の方法で同定可能であるアミノ酸配列を有する。別のペプチドに由来するポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して1つまたは複数の変異、例えば、別のアミノ酸残基で置換された、または1つもしくは複数のアミノ酸残基が挿入されたもしくは欠失した1つもしくは複数のアミノ酸残基を有してよい。
ポリペプチドは、天然には存在しないアミノ酸配列を含んでよい。そのような改変体は、IL−2またはノッチンタンパク質に関しては、出発IL−2またはノッチンタンパク質に対して100%未満の配列同一性または類似性を必ず有する。好ましい実施形態では、改変体は、例えば、改変体分子の長さにわたって、出発ポリペプチドのアミノ酸配列に対して約75%から100%未満まで、より好ましくは約80%から100%未満まで、より好ましくは約85%から100%未満まで、より好ましくは約90%から100%未満まで(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)および最も好ましくは約95%から100%未満までのアミノ酸配列同一性または類似性であるアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、出発ポリペプチド配列とそれに由来する配列の間には1アミノ酸の差異がある。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書では、配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入して最大のパーセント配列同一性を達成した後の、出発アミノ酸残基と同一(すなわち、同じ残基)である候補配列内のアミノ酸残基の百分率と定義される。
一実施形態では、PK延長IL−2に使用するためのIL−2を含むポリペプチドまたはその改変体は、配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、および35から選択されるアミノ酸配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含む。ある実施形態では、ポリペプチドは、配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、および35から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ポリペプチドは、配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、および35から選択される連続したアミノ酸配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である連続したアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ポリペプチドは、配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、および35から選択されるアミノ酸配列の少なくとも10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、200個、300個、400個、または500個(またはこれらの数の範囲内の任意の整数)の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、ペプチドは、ヌクレオチド配列によりコードされる。ヌクレオチド配列は、クローニング、遺伝子療法、タンパク質の発現および精製、変異導入、それを必要とする宿主へのDNAワクチン接種、例えば受動免疫化のための抗体生成、PCR、プライマーおよびプローブ生成などを含めたいくつもの適用に有用であり得る。ある実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、および34から選択されるIL−2のヌクレオチド配列またはその改変体を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。ある実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、および34に記載されているヌクレオチド配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、および34に記載されている連続したヌクレオチド配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である連続したヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、および34に記載されているヌクレオチド配列の少なくとも10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、200個、300個、400個、または500個(またはこれらの数の範囲内の任意の整数)の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、インテグリン結合性ペプチドを含むポリペプチドまたはその改変体は、配列番号67133から選択されるアミノ酸配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含む。ある実施形態では、ポリペプチドは、配列番号67133から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ポリペプチドは、配列番号67133から選択される連続したアミノ酸配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である連続したアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ポリペプチドは、配列番号67133から選択されるアミノ酸配列の少なくとも10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、200個、300個、400個、または500個(またはこれらの数の範囲内の任意の整数)の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用されるPK延長IL−2またはノッチン−Fc融合物は、それらが由来する天然に存在するまたはネイティブな配列から配列が変化するが、ネイティブな配列の望ましい活性は保持されるように変更できることも当業者には理解されよう。例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換により、「非必須」アミノ酸残基における保存的置換または変化を行うことができるようになる。変異は、部位特異的変異誘発およびPCR媒介性変異誘発などの標準の技法によって導入することができる。
本明細書に記載のポリペプチド(例えば、IL−2、PK延長IL−2、PK部分、ノッチン、Fc、ノッチン−Fcなど)は、1つまたは複数のアミノ酸残基、例えば、必須アミノ酸残基または非必須アミノ酸残基における保存的アミノ酸置換を含んでよい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられた置換である。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、それらとして、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が挙げられる。したがって、結合性ポリペプチド内の非必須アミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置き換えることが好ましい。別の実施形態では、アミノ酸の一続きを、側鎖ファミリーメンバーの、順序および/または組成が異なる構造的に類似した一続きで置き換えることができる。あるいは、別の実施形態では、飽和変異誘発によってなどでコード配列の全部または一部に沿ってランダムに変異を導入することができ、得られた変異体を本発明の結合性ポリペプチドに組み入れ、所望の標的に結合するそれらの能力についてスクリーニングすることができる。
「プログラム死(Programmed Death)−1(PD−1)」受容体とは、CD28ファミリーに属する免疫抑制性受容体を指す。PD−1は、in vivoにおいて以前に活性化されたT細胞上で主に発現し、2種のリガンド、PD−L1およびPD−L2に結合する。「PD−1」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトPD−1(hPD−1)、hPD−1の改変体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにhPD−1と共通のエピトープを少なくとも1つ有する類似体を含む。完全なhPD−1配列は、GenBank受託番号AAC51773(配列番号52)の下に見いだすことができる。
「プログラム死リガンド−1(PD−L1)」は、PD−1に結合するとT細胞活性化およびサイトカイン分泌を下方制御する、PD−1に対する2種の細胞表面糖タンパク質リガンドのうちの一方である(他方はPD−L2である)。「PD−L1」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトPD−L1(hPD−L1)、hPD−L1の改変体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにhPD−L1と共通のエピトープを少なくとも1つ有する類似体を含む。完全なhPD−L1配列は、GenBank受託番号Q9NZQ7(配列番号53)の下に見いだすことができる。
「細胞傷害性Tリンパ球関連抗原−4(CTLA−4)」は、T細胞表面分子であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。このタンパク質は、CD80およびCD86に結合することによって免疫系を下方制御する。「CTLA−4」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトCTLA−4(hCTLA−4)、hCTLA−4の改変体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにhCTLA−4と共通のエピトープを少なくとも1つ有する類似体を含む。完全なhCTLA−4配列は、GenBank受託番号P16410(配列番号54)の下に見いだすことができる。
「リンパ球活性化遺伝子−3(LAG3)」は、MHCクラスII分子に結合することによってリンパ球活性の阻害に関連する抑制性受容体である。この受容体は、Treg細胞の機能を増強し、CD8+エフェクターT細胞機能を阻害する。「LAG3」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトLAG3(hLAG3)、hLAG3の改変体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに共通のエピトープを少なくとも1つ有する類似体を含む。完全なhLAG3配列は、GenBank受託番号P18627(配列番号55)の下に見いだすことができる。
「T細胞膜タンパク質−3(TIM3)」は、T1細胞応答を阻害することによってリンパ球活性の阻害に関与する抑制性受容体である。そのリガンドは、ガレクチン9であり、これは、種々の型のがんにおいて上方制御される。「TIM3」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトTIM3(hTIM3)、hTIM3の改変体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに共通のエピトープを少なくとも1つ有する類似体を含む。完全なhTIM3配列は、GenBank受託番号Q8TDQo(配列番号56)の下に見いだすことができる。
「B7ファミリー」とは、受容体が未定義である抑制性リガンドを指す。B7ファミリーは、B7−H3およびB7−H4を包含し、これらはどちらも腫瘍細胞および腫瘍浸潤細胞において上方制御される。完全なhB7−H3およびhB7−H4配列は、それぞれGenBank受託番号Q5ZPR3およびAAZ17406(配列番号57および58)の下に見いだすことができる。
「血管内皮増殖因子(VEGF)」は、内皮細胞を選択的に刺激して、全て新しい血管の形成のために必要なプロセスである増殖、移動、およびマトリクス分解酵素の産生を行わせる分泌型ジスルフィド連結ホモ二量体である。VEGFは、唯一の公知の内皮細胞特異的マイトジェンであることに加えて、血管形成性増殖因子の中でも、高分子に血管浸透性の一過性の増大を誘導するその能力に関して独特なものである。「VEGF」または「VEGF−A」という用語は、例えば、Leungら、Science、246巻:1306頁(1989年)、およびHouckら、Mol. Endocrin.、5巻:1806頁(1991年)に記載されている、165アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子および関連する121アミノ酸、145アミノ酸、189アミノ酸、および206アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子を、その天然に存在する対立遺伝子およびプロセシングされた形態と共に指すために使用される。VEGF−Aは、VEGF−B、VEGF−C、VEGF−D、VEGF−E、VEGF−F、およびP1GFを含めた遺伝子ファミリーの一部である。VEGF−Aは、2種の高親和性受容体チロシンキナーゼ、VEGFR−1(Fit−1)およびVEGFR−2(Flk−1/KDR)に主に結合し、後者は、VEGF−Aの血管内皮細胞分裂促進シグナルの主要なトランスミッターである。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント」とは、抗原のT細胞受容体による認識の大きさおよび質を調節する共刺激および抑制シグナルを指す。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイントは、抑制シグナルである。ある特定の実施形態では、抑制シグナルは、PD−1とPD−L1の相互作用である。ある特定の実施形態では、抑制シグナルは、CD28結合にとって代わるCTLA−4とCD80またはCD86の相互作用である。ある特定の実施形態では、抑制シグナルは、LAG3とMHCクラスII分子の相互作用である。ある特定の実施形態では、抑制シグナルは、TIM3とガレクチン9の相互作用である。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント遮断薬」とは、1つまたは複数のチェックポイントタンパク質を減少させる、阻害する、干渉する、または調節する分子を指す。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、免疫チェックポイントに関連する抑制シグナルを妨げるものである。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、免疫チェックポイントに関連する抑制シグナル伝達を破壊する抗体またはその断片である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、抑制シグナル伝達を破壊する小分子である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、チェックポイント遮断タンパク質間の相互作用を妨げる抗体、その断片、または抗体模倣体、例えば、PD−1とPD−L1の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、CTLA−4とCD80またはCD86の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、LAG3とMHCクラスII分子の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、TIM3とガレクチン9の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。チェックポイント遮断薬は、それらの可溶性形態の分子(またはその変異)の形態、例えば、可溶性PD−L1またはPD−L1融合物であってもよい。
「好転させること(ameliorating)」という用語は、病態、例えば、がんの処置における、その予防、重症度もしくは進行の緩和、寛解、または治癒を含めた、あらゆる治療的に有益な結果を指す。
「in vivo」という用語は、生きている生物体で起こるプロセスを指す。
「哺乳動物」または「被験体」または「患者」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび非ヒトの両方を含み、それらとして、これだけに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、およびブタが挙げられる。
「パーセント同一性」という用語は、2つまたはそれ超の核酸またはポリペプチド配列に関しては、下記の配列比較アルゴリズム(例えば、BLASTPおよびBLASTNまたは当業者が利用可能な他のアルゴリズム)のうちの1つを使用して、または目視検査によって測定したところ、最大の対応について比較し、アラインメントした場合に、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を特定の百分率で有する2つまたはそれ超の配列または部分配列を指す。適用に応じて、「パーセント同一性」は、比較される配列のある領域にわたって、例えば、機能性ドメインにわたって存在し得る、あるいは比較される2つの配列の全長にわたって存在する。
配列比較に関して、一般には、一方の配列は、試験配列を比較する参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータにインプットし、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムにより、指定されたプログラムパラメータに基づいて試験配列(複数可)の参照配列に対するパーセント配列同一性を算出する。
配列比較のための最適なアラインメントは、例えば、SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math. 2巻:482頁(1981年)の局所相同性アルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48巻:443頁(1970年)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman、Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85巻:2444頁(1988年)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、Wis.中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)のコンピュータ化による実行によって、または目視検査によって(一般に、Ausubelら、下記を参照されたい)行うことができる。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの1つの例はBLASTアルゴリズムであり、これは、Altschulら、J. Mol. Biol. 215巻:403〜410頁(1990年)に記載されている。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationウェブサイトを通じて公的に入手可能である。
本明細書で使用される場合、「gly−serポリペプチドリンカー」という用語は、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なgly−serポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ser(GlySer)n(配列番号134)を含む。一実施形態では、n=1である。一実施形態では、n=2である。別の実施形態では、n=3、すなわち、Ser(GlySer)3(配列番号135)である。別の実施形態では、n=4、すなわち、Ser(GlySer)4(配列番号136)である。別の実施形態では、n=5である。さらに別の実施形態では、n=6である。別の実施形態では、n=7である。さらに別の実施形態では、n=8である。別の実施形態では、n=9である。さらに別の実施形態では、n=10である。別の例示的なgly−serポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列(GlySer)n(配列番号137)を含む。一実施形態では、n=1である。一実施形態では、n=2である。好ましい実施形態では、n=3である。別の実施形態では、n=4である。別の実施形態では、n=5である。さらに別の実施形態では、n=6である。別の例示的なgly−serポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列(GlySer)n(配列番号138)を含む。一実施形態では、n=1である。一実施形態では、n=2である。好ましい実施形態では、n=3である。別の実施形態では、n=4である。別の実施形態では、n=5である。さらに別の実施形態では、n=6である。
本明細書で使用される場合、「半減期」とは、ポリペプチドの血清中濃度または血漿中濃度が、in vivoにおいて例えば天然の機構による分解および/またはクリアランスまたは隔離によって50%低下するのにかかる時間を指す。本明細書で使用されるPK延長IL−2は、例えば、分解および/またはクリアランスもしくは隔離に抵抗する、HSA、MSAもしくはFcとの融合によって、ペグ化によって、または血清アルブミン分子(例えば、ヒト血清アルブミン)との結合によってin vivoにおいて安定化され、その半減期が増大したものである。半減期は、それ自体が公知の任意の様式で、例えば薬物動態解析によってなどで決定することができる。適切な技法は当業者には明らかであり、例えば、一般に、本発明のアミノ酸配列または化合物を被験体に適切な用量で適切に投与するステップ;定期的な間隔で前記被験体から血液試料または他の試料を採取するステップ;前記血液試料中の本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定するステップ;およびこのように得られたデータ(のプロット)から本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が投薬した際の最初のレベルと比較して50%低下するまでの時間を算出するステップを伴い得る。さらなる詳細は、例えば、Kenneth, A.ら、Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPetersら、Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach(1996年)などの標準のハンドブックにおいて提供される。Gibaldi, M.ら、Pharmacokinetics、改訂2版、Marcel Dekker(1982年)も参照する。
本明細書で使用される場合、「小分子」は、分子量が約500ダルトン未満の分子である。
本明細書で使用される場合、「治療用タンパク質」とは、被験体に医薬として投与することができる任意のポリペプチド、タンパク質、タンパク質改変体、融合タンパク質および/またはその断片を指す。例示的な治療用タンパク質は、インターロイキン、例えば、IL−7である。
本明細書で使用される場合、「相乗作用」または「相乗効果」とは、2つまたはそれ超の個々の構成成分によって生じる効果に関しては、これらの構成成分を組み合わせて利用した場合の総効果が、各構成成分の単独で作用した個々の効果の合計よりも大きくなる現象を指す。
「十分な量(sufficient amount)」または「ために十分な量(amount sufficient to)」という用語は、所望の効果を生じさせるために十分な量、例えば、腫瘍のサイズを縮小するために十分な量を意味する。
「治療有効量」という用語は、疾患の症状を好転させるために有効な量である。治療有効量は、予防は療法とみなすことができるので、「予防的に有効な量」であり得る。
本明細書で使用される場合、「併用療法」とは、各薬剤または療法を、これらの薬剤または療法の実質的に同時の組み合わせおよび同時投与の有益な効果をもたらすレジメンで逐次的に投与することを包含する。併用療法は、個々の要素を違う時間に、かつ/または異なる経路によって投与することができるが、それらが組み合わさって作用して、併用療法の各薬剤または腫瘍処置手法の共同作用(co−action)または薬物動態および薬力学効果によって有益な効果がもたらされるような組み合わせも包含する。
本明細書で使用される場合、「約」とは、当業者には理解され、それが使用される文脈に応じていくらかの程度まで変化する。用語が使用される文脈を考慮して当業者に明らかではないこの用語の使用が存在する場合、「約」は、特定の値のプラス10%またはマイナス10%までを意味する。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a(1つの)」、「an(1つの)」および「the(その)」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。
本明細書に記載の種々の態様を以下の小節においてさらに詳細に記載する。
IL−2およびPK延長IL−2
インターロイキン2(IL−2)は、抗原により活性化されるT細胞の増殖を誘導し、ナチュラルキラー(NK)細胞を刺激するサイトカインである。IL−2の生物学的活性は、細胞膜にまたがる3つのポリペプチドサブユニット:p55(IL−2Rα、アルファサブユニット、ヒトではCD25としても公知)、p75(IL−2RP、ベータサブユニット、ヒトではCD122としても公知)およびp64(IL−2Ry、ガンマサブユニット、ヒトではCD132としても公知)の多サブユニットIL−2受容体複合体(IL−2R)によって媒介される。IL−2に対するT細胞応答は、(1)IL−2の濃度;(2)細胞表面上のIL−2R分子の数;および(3)IL−2が占めるIL−2Rの数(すなわち、IL−2とIL−2Rの結合相互作用の親和性(Smith、「Cell Growth Signal Transduction is Quantal」In Receptor Activation by Antigens, Cytokines, Hormones, and Growth Factors 766巻:263〜271頁、1995年))を含めた種々の因子に左右される。IL−2:IL−2R複合体は、リガンドが結合すると内部移行し、異なる構成成分は示差的な選別を受ける。IL−2Raは、細胞表面に再利用され、IL−2:IL−2Rpγ複合体に付随するIL−2はリソソームに送られ分解される。IL−2は、静脈内(i.v)ボーラスとして投与されると、迅速に全身クリアランスを受ける(最初のクリアランス相の半減期は12.9分であり、その後、より遅いクリアランス相の半減期は85分である)(Konradら、Cancer Res. 50巻:2009〜2017頁、1990年)。
したがって、一部の実施形態では、全身性IL−2などのIL−2療法をインテグリン結合性Fc融合タンパク質、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬と組み合わせて有効量で被験体に投与する。
しかし、がん患者における全身性IL−2投与の転帰(outcome)は、理想からは程遠い。患者の15〜20パーセントが客観的に高用量のIL−2に応答するが、大多数は応答せず、また、多くが、悪心、錯乱、低血圧、および敗血症性ショックを含めた、重度の生命にかかわる副作用を被る。IL−2処置に伴う重度の毒性は、ナチュラルキラー(NK)細胞の活性に大きく起因する。NK細胞は、中間の親和性の受容体、IL−2Rpγを発現し、したがって、実際に高用量のIL−2療法の間に患者血清にもたらされるナノモル濃度のIL−2で刺激される。用量を減らすことおよび投薬レジメンを調整することによって血清中濃度を低下させ、したがってIL−2RaPγ担持細胞を選択的に刺激するための試みがなされているが、毒性は低くなった一方、そのような処置はまた効果も低い。高用量IL−2がん療法に付随する毒性問題を考慮して、多数のグループが、治療用抗体を同時に投与することによってIL−2の抗がん有効性を改善するための試みを行ってきた。それにもかかわらず、そのような試みは、だいたい成功しておらず、IL−2療法単独と比較して追加的な臨床的有用性は得られていないか、限定された臨床的有用性が得られている。したがって、種々のがんに対してより有効に闘うための新規のIL−2療法が必要である。
出願人らは、IL−2の、種々のがんモデルにおいて腫瘍を制御する能力を、IL−2を薬物動態改変基に付加することによって実質的に増大させることができることを最近発見した。得られる分子は、以後「薬物動態(PK)延長IL−2」と称され、遊離のIL−2と比較して長くなった循環半減期を有する。PK延長IL−2の長くなった循環半減期により、in vivoにおける血清中IL−2濃度を治療的範囲内で維持し、それにより、T細胞を含めた多くの型の免疫細胞の活性化を増強することが可能になる。PK延長IL−2は、薬物動態プロファイルが好都合なものであるので、非修飾IL−2と比較してより低頻度でより長い期間にわたって投薬することが可能になる。PK延長IL−2は、2013年5月21日出願の国際特許出願第PCT/US2013/042057号に詳細に記載されており、上記出願は、2012年5月22日出願の米国仮特許出願第61/650,277号に対する優先権を主張している。前述の出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
A.IL−2およびその変異体
ある特定の実施形態では、有効量のヒトIL−2を全身投与する。一部の実施形態では、有効量のPK延長IL−2を全身投与する。一実施形態では、IL−2は、Proleukin(登録商標)(アルデスロイキン)などのヒト組換えIL−2である。Proleukin(登録商標)は、E.coliにおいて産生されるヒト組換えインターロイキン2産物である。Proleukin(登録商標)は、ネイティブなインターロイキン2とは以下のように異なる:a)Proleukin(登録商標)はグリコシル化されていない;b)Proleukin(登録商標)はN末端アラニンを有さない;およびc)Proleukin(登録商標)ではアミノ酸125位のシステインがセリンで置換されている。Proleukin(登録商標)は、生物学的に活性な、非共有結合により結合した微小凝集物として存在し、平均サイズは27組換えインターロイキン2分子である。Proleukin(登録商標)(アルデスロイキン)は、静脈内注入によって投与するものである。一部の態様では、PK延長IL−2のIL−2部分は、野生型IL−2(例えば、ヒトIL−2の前駆型(配列番号33)または成熟IL−2(配列番号35))である。
ある特定の実施形態では、PK延長IL−2は、非修飾IL−2と比較してIL−2Rアルファ受容体に対する親和性が変更されるように(例えば、親和性がより高くなるように)変異させたものである。
部位特異的変異誘発を使用して、CD25、すなわちIL−2Rαに対して野生型IL−2と比較して親和性の高い結合を示すIL−2変異体を単離することができる。細胞表面におけるIL−2Rαに対するIL−2の親和性を増大させることにより、限られた範囲のIL−2濃度での受容体占有率が上昇し、また、細胞表面においてIL−2の局所的な濃度を上昇させる。
ある特定の実施形態では、本発明は、必ずしもではないが実質的に精製されていてよく、また、高親和性CD25結合剤として機能し得るIL−2変異体を特徴とする。IL−2は、抗原により活性化されるT細胞の増殖およびNK細胞の刺激を誘導するT細胞増殖因子である。高親和性結合剤である例示的なIL−2変異体としては、配列番号7、23、25、27、29、および31に記載されているアミノ酸配列を有するものなどの、WO2013/177187A2(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているものが挙げられる。CD25に対する親和性が増大した別の例示的なIL−2変異体は、その内容が参照により本明細書に組み込まれるUS7,569,215に開示されている。一実施形態では、IL−2変異体は、CD25に結合しない、例えば、配列番号9および11に記載されているアミノ酸配列を有するものである。
IL−2変異体は、CD25に結合する、配列番号33と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む。例えば、IL−2変異体は、IL−2受容体のアルファサブユニットに対する親和性が野生型IL−2と比較して増大する少なくとも1つの変異(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれ超のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換)を有してよい。マウスIL−2において同定される変異は、配列番号32の全長ヒトIL−2(核酸配列(受託:NM000586);配列番号33のアミノ酸配列(受託:P60568))またはシグナルペプチドを有さないヒトIL−2(配列番号34の核酸配列;配列番号35のアミノ酸配列)の対応する残基においてなすことができることが理解されるべきである。したがって、ある特定の実施形態では、PK延長IL−2のIL−2部分は、ヒトIL−2である。他の実施形態では、PK延長IL−2のIL−2部分は、変異体ヒトIL−2である。
IL−2変異体は、野生型IL−2(その前駆型、好ましくは、成熟型)に対してアミノ酸配列が少なくともまたは約50%、少なくともまたは約65%、少なくともまたは約70%、少なくともまたは約80%、少なくともまたは約85%、少なくともまたは約87%、少なくともまたは約90%、少なくともまたは約95%、少なくともまたは約97%、少なくともまたは約98%、または少なくともまたは約99%同一であってよい。変異は、アミノ酸残基の数または含有量の変化からなっていてよい。例えば、IL−2変異体は、野生型IL−2よりもアミノ酸残基の数が多くても少なくてもよい。その代わりに、またはそれに加えて、IL−2変異体は、野生型IL−2に存在する1つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含有してよい。
例として、配列番号33の参照アミノ酸配列と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、配列番号33の参照アミノ酸の最大5つの変更を含む以外は参照配列と同一の配列を含むポリペプチドである。例えば、参照配列内のアミノ酸残基の最大5%が欠失しているか別のアミノ酸で置換されていてもよく、参照配列内の総アミノ酸残基の最大5%までのいくつかのアミノ酸が参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ(N−)末端位もしくはカルボキシ(C−)末端位に対して行ってもよく、それらの末端位の間のどこにでも、参照配列内の残基の間に個別に、または参照配列内の1つもしくは複数の連続した基で散在して行ってもよい。
置換アミノ酸残基(複数可)は、必ずしもではないが、一般には以下の群内での置換を含む保存的置換であってよい:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸;アスパラギン、グルタミン;セリン、トレオニン;リシン、アルギニン;およびフェニルアラニン、チロシン。これらの変異は、IL−2Rαと接触するアミノ酸残基におけるものであってよい。
一般に、本発明の実施において使用されるポリペプチドは、合成のもの、または組換え核酸分子の発現によって産生されたものである。ポリペプチドがPK延長IL−2(例えば、少なくともIL−2とヘキサ−ヒスチジンタグもしくは赤血球凝集素タグまたはFc領域もしくはヒト血清アルブミンなどの異種ポリペプチドとを含有する融合タンパク質)である場合には、ポリペプチドは、IL−2をコードする1つの配列と異種ポリペプチドの全部または一部をコードする第2の配列を含有するハイブリッド核酸分子によりコードされるものであってよい。
IL−2変異体を作出するために必要な技法は、当技術分野において常套的なものであり、当業者が過度な実験に頼ることなく実施することができる。例えば、IL−2内のアミノ酸残基のうちの1つまたは複数の置換からなる変異は、PCRにより補助される変異誘発技法(例えば、当技術分野で公知であり、かつ/またはIL−2変異体の創出に関して本明細書に記載されている)を使用して創出することができる。IL−2ポリペプチドに対するアミノ酸残基の欠失または付加からなる変異も標準の組換え技法を用いて作出することができる。欠失または付加の場合には、IL−2をコードする核酸分子を、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて単に消化する。得られた断片は直接発現させることもでき、例えば、第2の断片とライゲーションすることによってさらに操作することもできる。ライゲーションは、核酸分子の2つの末端が互いと重なる相補的なヌクレオチドを含有する場合に容易になり得るが、平滑末端の断片もライゲーションすることができる。PCRにより生成された核酸を種々の変異体の配列を生成するために使用することもできる。
組換え分子生物学的技法によって変更された核酸分子の発現によってIL−2変異体を生成することに加えて、IL−2変異体は、化学的に合成することもできる。化学的に合成されたポリペプチドは、当業者により常套的に生成される。
上記の通り、IL−2は、IL−2と異種ポリペプチド(すなわち、IL−2ではないポリペプチド)とを含む融合またはキメラポリペプチドとして調製することもできる。異種ポリペプチドにより、in vivoにおけるキメラポリペプチドの循環半減期を増大させることができ、したがって、IL−2の性質をさらに増強することができる。以下でさらに詳細に考察されている通り、循環半減期を増大させるポリペプチドは、ヒトまたはマウス血清アルブミンなどの血清アルブミンであってよい。
他の実施形態では、キメラポリペプチドは、IL−2と、FLAG配列などの抗原性タグとして機能するポリペプチドとを含んでよい。FLAG配列は、本明細書に記載の通り、ビオチン化された高度に特異的な抗FLAG抗体によって認識される(Blanarら、Science 256巻:1014頁、1992年;LeClairら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89巻:8145頁、1992年も参照されたい)。ある特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、C末端c−mycエピトープタグをさらに含む。
キメラポリペプチドは、当業者の実施する能力の範囲内に十分に入る従来の分子生物学的技法だけを使用して構築することができる。
a.IL−2をコードする核酸分子
IL−2は、単独でまたは本明細書に記載のものなどのキメラポリペプチドの一部として、核酸分子の発現によって得ることができる。したがって、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、および34に記載されている核酸配列を有するものなどの、IL−2またはIL−2変異体を含有するポリペプチドをコードする核酸分子は本発明の範囲内に入るとみなされる。単にIL−2変異体はそれらと野生型IL−2との同一性に関して記載することができるので、IL−2変異体をコードする核酸分子は、野生型IL−2をコードする核酸分子に対してある特定の同一性を必ず有する。例えば、IL−2変異体をコードする核酸分子は、全長野生型IL−2(例えば、配列番号32)またはシグナルペプチドを有さない野生型IL−2(例えば、配列番号34)をコードする核酸と少なくとも50%、少なくとも65%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも85%、および最も好ましくは少なくとも95%(例えば、99%)同一であってよい。
本発明の核酸分子は、天然に存在する配列、または天然に存在するものとは異なるが、遺伝暗号の縮重に起因して同じポリペプチドをコードする配列を含有してよい。これらの核酸分子は、RNAまたはDNA(例えば、ゲノムDNA、cDNA、またはホスホルアミダイトに基づく合成によって作製されるものなどの合成DNA)、またはこれらの型の核酸内のヌクレオチドの組み合わせもしくは修飾からなっていてよい。さらに、核酸分子は、二本鎖であっても一本鎖(すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか)であってもよい。
核酸分子は、ポリペプチドをコードする配列に限定されず、コード配列(例えば、IL−2のコード配列)の上流または下流にある非コード配列の一部または全部も含んでよい。分子生物学の当業者は、核酸分子を単離するための常套的な手順に詳しい。核酸分子は、例えば、ゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼで処理することによって、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施することによって生成することができる。核酸分子がリボ核酸(RNA)である場合では、分子は、例えば、in vitro転写によって作製することができる。
単離された核酸分子は、天然の状態ではそのようには見いだされない断片を含み得る。したがって、本発明は、核酸配列(例えば、IL−2変異体をコードする配列)がベクター(例えば、プラスミドもしくはウイルスベクター)または異種細胞のゲノム(または同種の細胞のゲノムの、天然の染色体上の位置以外の位置)に組み入れられた組換え分子の使用を包含する。
上記の通り、本発明のIL−2変異体は、キメラポリペプチドの一部として存在してよい。上記の異種ポリペプチドに加えて、またはその代わりに、本発明の核酸分子は、「マーカー」または「レポーター」をコードする配列を含有してよい。マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子の例としては、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(neo、G418)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、ハイグロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ(HPH)、チミジンキナーゼ(TK)、lacz(β−ガラクトシダーゼをコードする)、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT)が挙げられる。本発明の実施に関連する標準の手順の多くと同様に、追加的な有用な試薬、例えば、マーカーまたはレポーターとしての機能を果たし得る追加的な配列は、当業者には分かるであろう。
本発明の核酸分子は、哺乳動物の細胞などの任意の生物細胞から得たIL−2をコードするDNAに変異を導入することによって得ることができる。したがって、本明細書で使用される核酸(およびそれらにコードされるポリペプチド)は、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、サル、ヒヒ、イヌ、またはネコのものであってよい。一般には、核酸分子は、ヒトの核酸分子である。
B.PK延長基
上記の通り、IL−2または変異体IL−2を、循環半減期を増大させるPK延長基と融合する。PK延長基の非限定的な例は下に記載されている。IL−2またはその改変体の循環半減期を増大させる他のPK基もPK延長IL−2に適用可能であることが理解されるべきである。
ある特定の実施形態では、PK延長IL−2の血清中半減期は、単独のIL−2(すなわち、PK延長基と融合していないIL−2)と比較して増大している。ある特定の実施形態では、PK延長IL−2の血清中半減期は、単独のIL−2の血清中半減期と比較して少なくとも20%、40%、60%、80%、100%、120%、150%、180%、200%、400%、600%、800%、または1000%長い。他の実施形態では、PK延長IL−2の血清中半減期は、単独のIL−2の血清中半減期の少なくとも1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍、または50倍である。ある特定の実施形態では、PK延長IL−2の血清中半減期は、少なくとも10時間、15時間、20時間、25時間、30時間、35時間、40時間、50時間、60時間、70時間、80時間、90時間、100時間、110時間、120時間、130時間、135時間、140時間、150時間、160時間、または200時間である。
a.血清アルブミンおよび血清アルブミン結合性タンパク質
ある特定の実施形態では、PK延長基は、血清アルブミンまたはその断片である。血清アルブミンとタンパク質を融合する方法は、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、US2010/0144599、US2007/0048282、およびUS2011/0020345に開示されている。ある特定の実施形態では、PK延長基は、US5,876,969、WO2011/124718、WO2013/075066、およびWO2011/0514789に開示されているものなどのHSAまたはその改変体もしくは断片である。
ある特定の実施形態では、PK延長基は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、US2005/0287153、US2007/0003549、US2007/0178082、US2007/0269422、US2010/0113339、WO2009/083804、およびWO2009/133208に記載されているものなどの血清アルブミン結合性タンパク質である。
b.ペグ化
ある特定の実施形態では、本明細書で使用されるPK延長IL−2は、ポリエチレングリコール(PEG)ドメインを含む。ペグ化により、タンパク質に循環半減期の増大が付与されることが当技術分野において周知である。ペグ化の方法は周知であり、例えば、その全てが参照により本明細書に組み込まれる、US7,610,156、US7,847,062に開示されている。
PEGは、市販もされており、当技術分野で周知の方法に従ってエチレングリコールを開環重合させることによって調製することもできる、周知の水溶性ポリマーである(SandlerおよびKaro、Polymer Synthesis、Academic Press、New York、3巻、138〜161頁)。「PEG」という用語は、サイズまたはPEGの末端における修飾については問わず、任意のポリエチレングリコール分子を包含するように広範に使用され、式:X−0(CHCH0)n−1CHCHOH(式中、nは20〜2300であり、XはHまたは末端修飾、例えば、C1〜4アルキルである)で表される。一実施形態では、本発明のPEGは一方の末端がヒドロキシまたはメトキシで終わる、すなわち、XがHまたはCHである(「メトキシPEG」)。PEGは、結合反応に必要な別の化学基;分子の化学合成に起因する別の化学基;または分子の部分の最適な距離のためのスペーサーである別の化学基を含有してよい。さらに、そのようなPEGは、連結した1つまたは複数のPEG側鎖からなっていてよい。PEG鎖を1つ超有するPEGは、マルチアームまたは分枝PEGと称される。分枝PEGは、例えば、グリセロール、ペンタエリスリトール(pentaerythriol)、およびソルビトールを含めた種々のポリオールにポリエチレンオキシドを付加することによって調製することができる。例えば、4アーム分枝PEGは、ペンタエリスリトールおよびエチレンオキシドから調製することができる。分枝PEGは、例えば、EP−A 0 473 084およびUS5,932,462に記載されており、どちらも参照により本明細書に組み込まれる。PEGの1つの形態は、リシンの第一級アミノ基を介して連結した2つのPEG側鎖(PEG2)を含む(Monfardiniら、Bioconjugate Chem 1995年:6巻:62〜9頁)。
一実施形態では、ペグ化IL−2は、部位特異的ペグ化によって、特に、PEGをN末端またはC末端のシステイン部分とコンジュゲーションすることによって作製する。PEG部分は、アミンとのコンジュゲーションを含めた、他の化学反応によって付加することもできる。
ペプチドまたはタンパク質へのPEGのコンジュゲーションは、一般に、PEGを活性化し、活性化PEG中間体を標的タンパク質/ペプチドと直接カップリングすること、またはリンカーとカップリングし、その後それを活性化し、標的タンパク質/ペプチドとカップリングすることを伴う(Abuchowskiら、JBC 1977年;252巻:3571頁およびJBC 1977年;252巻:3582頁、およびHarrisら、Poly (ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications;(J. M. Harris編)Plenum Press:New York、1992年;第21章および第22章を参照されたい)。
種々の分子量の形態、例えば、約1,000ダルトン(Da)から100,000Daまで(n=20〜2300)のPEGをIL−2とコンジュゲートするために選択することができる。PEG中の反復単位「n」の数は、ダルトン単位で記載される分子量に関して概算される。活性化リンカー上のPEGの合計分子量は、医薬用途に適するものであることが好ましい。したがって、一実施形態では、PEG分子の分子量は、100,000Daを超えない。例えば、3つのPEG分子がリンカーに付加されており、各PEG分子が同じ分子量12,000Da(各n=約270)を有する場合、リンカー上のPEGの総分子量は、約36,000Da(総n=約820)である。リンカーに付加したPEGの分子量は異なってもよく、例えば、リンカー上の3分子のうちの2つのPEG分子がそれぞれ5,000Da(各n=約110)であってよく、1つのPEG分子が12,000Da(n=約270)であってよい。
当業者は、PEGの適切な分子量を、例えば、ペグ化IL−2を治療上でどのように使用するか、所望の投与量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性、免疫原性、および他の検討事項に基づいて選択することができる。PEGおよびタンパク質の性質を増強するためのその使用の考察に関しては、N. V. Katre、Advanced Drug Delivery Reviews 1993年:10巻:91〜114頁を参照されたい。
本発明の一実施形態では、PEG分子をIL−2のアミノ基、例えばリシンなどと反応するように活性化することができる(Bencham C. O.ら、Anal. Biochem.、131巻、25頁(1983年);Veronese, F. M.ら、Appl. Biochem.、11巻、141頁(1985年);Zalipsky, S.ら、Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems、adrs9−110 ACS Symposium Series 469巻(1999年);Zalipsky, S.ら、Europ. Polym. J.、19巻、1177〜1183頁(1983年);Delgado, C.ら、Biotechnology and Applied Biochemistry、12巻、119〜128頁(1990年))。
一実施形態では、PEGの炭酸エステルを使用してPEG−IL−2コンジュゲートを形成する。N,N’−ジスクシンイミジルカーボネート(DSC)をPEGとの反応に使用して活性な混合PEG−スクシンイミジルカーボネートを形成することができ、その後それをリンカーの求核基またはIL−2のアミノ基と反応させることができる(米国特許第5,281,698号および米国特許第5,932,462号を参照されたい)。同じような型の反応では、1,1’−(ジベンゾトリアゾリル)カーボネートおよびジ−(2−ピリジル)カーボネートをPEGと反応させて、それぞれPEG−ベンゾトリアゾリルおよびPEG−ピリジル混合カーボネート(米国特許第5,382,657号)を形成することができる。
IL−2のペグ化は、最先端の方法に従って、例えば、IL−2と求電子的に活性なPEG(Shearwater Corp.、USA、www.shearwatercorp.com)を反応させることによって実施することができる。好ましいPEG試薬は、例えば、N−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオネート(PEG−SPA)、ブタノエート(PEG−SBA)、PEG−スクシンイミジルプロピオネートまたはmPEG2−NHSなどの分枝N−ヒドロキシスクシンイミドである(Monfardini, Cら、Bioconjugate Chem. 6巻(1995年)62〜69頁)。
別の実施形態では、PEG分子をIL−2上のスルフヒドリル基とカップリングすることができる(Sartore, L.ら、Appl. Biochem. Biotechnol.、27巻、45頁(1991年);Morpurgoら、Biocon. Chem.、7巻、363〜368頁(1996年);Goodsonら、Bio/Technology(1990年)8巻、343頁;US5,766,897)。US6,610,281およびUS5,766,897には、スルフヒドリル基とカップリングすることができる例示的な反応性PEG種が記載されている。
PEG分子をIL−2上のシステイン残基とコンジュゲートするある特定の実施形態では、システイン残基はIL−2に対してネイティブなものであり、他の実施形態では、1つまたは複数のシステイン残基をIL−2内に工学的に操作する。IL−2のコード配列に変異を導入してシステイン残基を生成することができる。これは、例えば、1つまたは複数のアミノ酸残基をシステインに変異させることによって達成することができる。システイン残基に変異させるのに好ましいアミノ酸としては、セリン、トレオニン、アラニンおよび他の親水性の残基が挙げられる。システインに変異させる残基は、表面に露出した残基であることが好ましい。残基の表面接近可能性を一次配列またはタンパク質に基づいて予測するためのアルゴリズムが当技術分野で周知である。
別の実施形態では、ペグ化IL−2は、リンカーに共有結合により付加された1つまたは複数のPEG分子を含む。
一実施形態では、IL−2をC末端においてペグ化する。特定の実施形態では、C末端アジド−メチオニンを導入し、その後、メチル−PEG−トリアリールホスフィン化合物をシュタウディンガー反応によってコンジュゲートすることによって、タンパク質をC末端においてペグ化する。このC末端コンジュゲーション方法は、Cazalisら、C−Terminal Site−Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity、Bioconjug Chem. 2004年;15巻(5号):1005〜1009頁に記載されている。
IL−2のモノペグ化(monopegylation)は、WO94/01451に記載されている一般的な方法に従って実現することもできる。WO94/01451には、修飾末端アミノ酸アルファ炭素反応性基を用いて組換えポリペプチドを調製するための方法が記載されている。方法のステップは、組換えポリペプチドを形成し、N末端アルファ−アミンおよびC末端アルファ−カルボキシルにおいて、それを1つまたは複数の生物学的に付加される保護基で保護することを伴う。次いで、ポリペプチドを化学保護剤と反応させて反応性側鎖基を選択的に保護し、それにより、側鎖基が修飾されるのを防ぐ。次いで、ポリペプチドを生物学的保護基に特異的な切断試薬を用いて切断して、保護されていない末端アミノ酸アルファ炭素反応性基を形成する。保護されていない末端アミノ酸アルファ炭素反応性基を化学修飾剤を用いて修飾する。次いで、側鎖が保護され末端が修飾された単一コピーポリペプチドを側鎖基において脱保護して、末端が修飾された組換え単一コピーポリペプチドを形成する。方法におけるステップの数および順序は、ポリペプチドのN末端アミノ酸および/またはC末端アミノ酸における選択的な修飾を達成するために変化させることができる。
コンジュゲーション反応におけるIL−2の活性化PEGに対する比は、約1:0.5から1:50まで、約1:1から1:30まで、または約1:5から1:15までであってよい。種々の水性緩衝液を使用して、IL−2またはその改変体へのPEGの共有結合性の付加を触媒することができる。一実施形態では、使用する緩衝液のpHは、約7.0から9.0までである。別の実施形態では、pHは、わずかに塩基性の範囲内、例えば、約7.5から8.5までである。pKaが中性付近のpH範囲である緩衝液、例えば、リン酸緩衝液を使用することができる。
サイズ排除(例えば、ゲル濾過)およびイオン交換クロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の従来の分離および精製技法を使用してペグ化IL−2を精製することができる。産物は、SDS−PAGEを使用して分離することもできる。分離することができる産物としては、モノペグ化IL−2、ジペグ化IL−2、トリペグ化IL−2、ポリペグ化IL−2およびペグ化されていないIL−2ならびに遊離のPEGが挙げられる。モノPEGコンジュゲートの百分率は、溶出ピーク付近のより広範な画分をプールして組成物中のモノPEGの百分率を上昇させることによって制御することができる。
一実施形態では、本発明のペグ化IL−2は、1つ、2つまたはそれ超のPEG部分を含有する。一実施形態では、PEG部分(複数可)は、タンパク質の表面上にあるアミノ酸残基に結合しており、かつ/またはCD25と接触する表面から離れている。一実施形態では、PEG−IL−2中のPEGの合計分子量または総分子量は、約3,000Daから60,000Daまで、場合によって約10,000Daから36,000Daまでである。一実施形態では、ペグ化IL−2中のPEGは、実質的に直線状の直鎖PEGである。
一実施形態では、本発明のペグ化IL−2は、非修飾タンパク質に付随する生物学的活性の少なくとも25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%または100%を保持することが好ましい。一実施形態では、生物学的活性とは、CD25に結合する能力を指す。PEG修飾IL−2の血清クリアランス速度は、非修飾IL−2のクリアランス速度と比較して約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、またはさらには90%低下し得る。PEG修飾IL−2の循環半減期は、非修飾IL−2の半減期と比較して増強され得る。PEG−IL−2またはその改変体の半減期は、非修飾IL−2の半減期と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%または500%、またはさらには1000%増強され得る。ある特定の実施形態では、in vitroにおいて、例えば、緩衝食塩溶液中または血清中などでタンパク質半減期を決定する。他の実施形態では、タンパク質半減期は、動物の血清または他の体液中でのタンパク質の半減期などのin vivoにおける循環半減期である。
c.他のPK延長基
ある特定の実施形態では、PK延長基は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるUS7,176,278およびUS8,158,579に開示されているトランスフェリンである。
ある特定の実施形態では、PK延長基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるUS2007/0178082に開示されているものなどの血清免疫グロブリン結合性タンパク質である。
ある特定の実施形態では、PK延長基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるUS2012/0094909に開示されているものなどの、血清アルブミンに結合するフィブロネクチン(Fn)に基づく足場ドメインタンパク質である。フィブロネクチンに基づく足場ドメインタンパク質を作出する方法もUS2012/0094909に開示されている。Fn3に基づくPK延長基の非限定的な例は、Fn3(HSA)、すなわち、ヒト血清アルブミンに結合するFn3タンパク質である。
d.Fcドメイン
ある特定の実施形態では、PK延長IL−2は、WO2013177187に記載されているFcドメインを含む。Fcドメインは、抗原に結合する可変領域を含有しない。本明細書に記載のPK延長IL−2を作製するために有用なFcドメインは、いくつもの異なる供給源から得ることができる。ある特定の実施形態では、PK延長IL−2のFcドメインは、ヒト免疫グロブリンに由来する。ある特定の実施形態では、Fcドメインは、ヒトIgG1定常領域(配列番号1)に由来する。ヒトIgG1のFcドメインは、配列番号2に記載されている。ある特定の実施形態では、ヒトIgG1のFcドメインは、上部ヒンジ領域(配列番号3)を有さない。しかし、Fcドメインは、例えば、齧歯類(例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット)または非ヒト霊長類(例えば、チンパンジー、マカク)種を含めた別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来するものであってよいことが理解される。さらに、Fcドメインまたはその一部は、IgM、IgG、IgD、IgA、およびIgEを含めた任意の免疫グロブリンクラス、ならびにIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含めた任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来するものであってよい。
一部の態様では、PK延長IL−2は、変異体Fcドメインを含む。一部の態様では、PK延長IL−2は、変異体IgG1 Fcドメインを含む。一部の態様では、変異体Fcドメインは、ヒンジ、CH2、および/またはCH3ドメインに1つまたは複数の変異を含む。一部の態様では、変異体Fcドメインは、D265A変異を含む。
一実施形態では、本発明のPK延長IL−2は、完全なFc領域の1つまたは複数の定常領域ドメインを欠く、すなわち、それらが部分的にまたは完全に欠失している。ある特定の実施形態では、本発明のPK延長IL−2は、CH2ドメイン全体を欠く。ある特定の実施形態では、本発明のPK延長IL−2は、IgG1ヒト定常領域ドメインをコードするベクター(例えば、IDEC Pharmaceuticals、San Diego)に由来する、CH2ドメインが欠失したFc領域を含む(例えば、WO02/060955A2およびWO02/096948A2を参照されたい)。この例示的なベクターは、CH2ドメインが欠失し、ドメインが欠失したIgG1定常領域を発現する合成ベクターがもたらされるように工学的に操作されたものである。これらの例示的な構築物は、結合性CH3ドメインとそれぞれのFcドメインのヒンジ領域が直接融合するように工学的に操作されることが好ましいことに留意されたい。
インテグリン結合性Fc融合タンパク質
インテグリンは、固形腫瘍の開始、進行および転移に極めて重要な一連の多様な細胞機能を調節する細胞外マトリクス接着受容体のファミリーである。腫瘍の進行における重要性により、インテグリンはがん療法の魅力的な標的となっており、また、種々のがんの型の処置を可能とする。がん性細胞上に存在するインテグリンとしては、αβ、αβ、およびαβが挙げられる。
ノッチンタンパク質は、熱およびタンパク質分解に対する安定性が高く、変異誘発を許容する小さく緻密なペプチドであり、そのことにより、良好な分子足場になる。これらのペプチドは、「ノット」コアを形成する少なくとも3つのジスルフィド結合を含有する。これらは、表面に露出したいくつかのループも含有し、これらのループが標的に結合することが可能になっている。これらのループは、特異的な標的に高親和性で結合するように工学的に操作することができ、これにより、療法のための有用なツールになる。
本発明は、治療的利益を付与する、Fcドナーと融合した、インテグリンに結合することが可能なRGD配列を有する工学的に操作されたノッチンポリペプチド足場(「ノッチン−Fc」とも称される)の使用を伴う。上記の通り、半減期を延長するためにFc断片がタンパク質および/または治療薬に付加されている。本明細書で使用されるノッチン−Fcに関しては、Fcのエフェクター機能は、PK延長IL−2などの全身性IL−2と合わせて使用した場合、様々ながんの処置に寄与する。ある特定の実施形態では、2種のインテグリンに同時に結合するノッチン−Fcを使用する(2.5D、配列番号93または95)。ある特定の実施形態では、表1に反映されている、3種のインテグリンに同時に結合するノッチン−Fcを使用する(2.5F、配列番号94または96)。
A.ノッチンポリペプチド足場を工学的に操作する方法
特異的なインテグリン結合を付与するために、ノッチンポリペプチド足場を使用してインテグリン結合性配列を好ましくはループの形態で挿入する。インテグリン結合は、ノッチンポリペプチド足場内に、RGDペプチドなどのインテグリン結合性ペプチド配列を挿入することによって工学的に操作されることが好ましい。一部の実施形態では、インテグリン結合性ペプチド配列の挿入により、ネイティブなノッチンタンパク質の部分が置き換えられる。例えば、一実施形態では、RGDペプチド配列をネイティブな溶媒露出ループに、ループの全部または一部を、1つまたは複数のインテグリンへの結合に関して選択されたRGDを含有するペプチド配列(例えば、5〜12アミノ酸配列)で置き換えることによって挿入する。溶媒露出ループ(すなわち、表面上にある)は、一般に、ネイティブなノッチンタンパク質配列内のジスルフィド連結したシステイン残基によって係留されている。インテグリン結合性置き換えアミノ酸配列は、ループ部分のコドンをランダム化し、工学的に操作されたペプチドを発現させ、所定のリガンドへの結合性が最も高い変異体を選択することによって得ることができる。この選択ステップを、以前のステップから最も密接に結合するタンパク質を取得し、ループを再度ランダム化して、数回繰り返すことができる。
インテグリン結合性ポリペプチドは、いくつものやり方で修飾することができる。例えば、ポリペプチドを内部でさらに架橋させることもでき、互いと架橋させることもでき、RGDループを他の架橋した分子足場に移植することもできる。タンパク質またはペプチドバイオコンジュゲートを調製するための市販の架橋結合試薬がいくつも存在する。これらの架橋剤の多くは、タンパク質の側鎖内の遊離のアミン基またはスルフヒドリル基を通じた生体分子の二量体ホモコンジュゲーションまたはヘテロコンジュゲーションを可能にするものである。つい最近、炭水化物基とヒドラジド部分のカップリングを伴う他の架橋結合方法が開発された。これらの試薬により、バイオコンジュゲートの調製における化学的経験が少ないまたはない研究者に都合のよい容易な架橋結合戦略がもたらされている。
EETI−IIノッチンタンパク質(配列番号39)は、ジスルフィドノットトポロジーを含有し、変異誘発に適した多数の溶媒露出ループを有する。好ましい実施形態ではEETI−IIを分子足場として使用する。
分子足場として使用することができるノッチンタンパク質の別の例は、AgRPまたはアガトキシンである。AgRPのアミノ酸配列(配列番号40)とアガトキシンのアミノ酸配列(配列番号41)は異なるが、それらの構造は同一である。例示的なAgRPノッチンは表1に見いだされる。
AgRPの工学的に操作されたさらなるノッチンは、上で参照したCochranらに対するUS2009/0257952(その内容が参照により本明細書に組み込まれる)に記載の通り作出することができる。AgRPノッチン融合物は、上に例示されている通りAgRPループ1、2および3、ならびにループ4を使用して調製することができる。
本ポリペプチドは、組換えDNAによって作製することもでき、ペプチド合成機を使用して固相で合成することもでき、これは、本明細書に記載の3つ全ての足場のペプチドに対して行われている。本ポリペプチドは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)または他の標識との反応によってN末端にさらにキャップ形成することもでき、さらに、追加的な架橋結合反応のために選択されたアミノ酸残基を用いて合成することもできる。切断時にC末端アミドを生じさせるためにTentaGel S RAM Fmoc樹脂(Advanced ChemTech)を使用することができる。ペプチド脱保護の間のチアゾリドン形成およびフルオレセイン放出を防止するためにB−アラニンをN末端アミノ酸として使用する(Hermanson、1996年)。ペプチドを樹脂から切断し、8%トリフルオロ酢酸、2%トリイソプロピルシラン、5%ジチオスレイトールを用いて側鎖を脱保護し、最終産物をエーテル沈殿によって回収する。ペプチドを、0.1%トリフルオロ酢酸中アセトニトリル勾配およびC4またはC18カラム(Vydac)を使用して逆相HPLCによって精製し、マトリクス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI−TOF)またはエレクトロスプレーイオン化−質量分析(ESI−MS)を使用して検証する。
本ペプチドを組換えDNAによって作製する場合、選択されたペプチドをコードする発現ベクターを適切な宿主に形質転換する。宿主は、上記の通り適切なペプチドフォールディングおよびジスルフィド結合の形成が確実になるように選択するべきである。EETI−IIなどのある特定のペプチドは、細菌などの原核生物宿主において発現させると適正にフォールディングされ得る。
本ペプチドの二量体複合体、三量体複合体、および四量体複合体は、上記配列の遺伝子操作によって、または合成架橋剤と、例えばペプチドのC末端にシステイン残基が導入された工学的に操作されたペプチドの反応によって形成することができる。これらのオリゴマーペプチド複合体は、ゲル濾過によって精製することができる。本ペプチドのオリゴマーは、多数のペプチド配列を端から端までコードするベクターを調製することによって調製することができる。また、多量体は、例えば、米国特許第6,265,539号に記載のように、ペプチドを複合体化することによって調製することができる。そこでは、活性なHIVペプチドを、ペプチドのアミノ末端残基を変更することによって多量体形態に調製し、したがって、アミノ末端リシル残基およびグリシル残基などの1つ〜約5つのアミノ酸残基を含有するスペーサーペプチドとペプチド結合させて複合ポリペプチドを形成する。あるいは、各ペプチドを、アミノ末端およびカルボキシ末端のそれぞれにシステイン(Cys)残基が含有されるように合成する。次いで、得られた、ジ−システインが末端をなす(ジ−Cys)ペプチドを酸化してジ−Cysペプチド単量体をポリマーまたは環状ペプチド多量体に重合させる。多量体は、リシンコアマトリクスを利用して固相ペプチド合成によって調製することもできる。本ペプチドは、ナノ粒子として調製することもできる。「Multivalent Effects of RGD Peptides Obtained by Nanoparticle Display」、Montetら、J. Med. Chem.;2006年;49巻(20号)6087〜6093頁を参照されたい。EETI二量体化は、本EETI−IIペプチドを用いて、EETI−II二量体化の論文である、「Grafting of thrombopoietin−mimetic peptides into cystine knot miniproteins yields high−affinity thrombopoietin antagonist and agonists」、Krauseら、FEBS Journal;2006年;274巻、86〜95頁に従って行うことができる。これは、参照により本明細書に組み込まれるPCT出願番号第PCT/US2013/065610においてさらに記載されている。
インテグリン結合の増強に関するフィブロネクチンおよび他の接着タンパク質上の相乗的な部位が同定されている(Ruoslahti、1996年;Koivunenら、1994年;Aotaら、1994年;Healyら、1995年)。異なるインテグリン特異的モチーフを1つの可溶性分子に組み入れることができることは、治療薬開発に重要な影響を及ぼすと思われる。相乗的な結合効果を有するインテグリン結合性タンパク質を創出するために、ヘテロ官能的な特異性(heterofunctional specificity)を有する架橋剤を使用することができる。さらに、これらの同じ架橋剤は、二特異性標的化分子を創出するために、または治療への適用のために放射性核種もしくは毒性薬剤を送達するためのビヒクルとして容易に使用することができる。
B.インテグリン結合性ペプチド
Fc融合物に使用するためのインテグリン結合性ポリペプチドとしては、インテグリン結合性ループ(例えば、RGDペプチド配列)およびノッチンポリペプチド足場が挙げられる。そのようなインテグリン結合性ポリペプチドは、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,536,301号に記載されている。米国特許第8,536,301号に記載の通り、インテグリン結合性ポリペプチドは、結合特異性および効力に影響を及ぼすことなく、非RGD残基をある特定の程度まで変化させることができる。例えば、11残基のうちの3を変化させた場合、2.5Dに対して約70%の同一性を有することになる。表1に、本発明の範囲に入る例示的なインテグリン結合性ポリペプチド、およびそれらの特異的なノッチンポリペプチド足場(例えば、EETI−IIまたはAgRP)が示されている。Fc融合物に使用するための好ましいインテグリン結合性ポリペプチドは、ペプチド2.5Dおよび2.5Fである。
ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、αβ、αβ、またはαβに別々に結合する。
ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、αβおよびαβに同時に結合する。
ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、αβ、αβ、およびαβに同時に結合する。
ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ループは、工学的に操作されたEETI−II足場内にある。ある特定の実施形態では、EETI−II足場の15位のリシンがセリンで置き換えられている。ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、配列番号42または43に記載のアミノ酸配列を含み、Xは、A、V、L、P、F、Y、S、H、D、およびNからなる群より選択され;Xは、G、V、L、P、R、E、およびQからなる群より選択され;Xは、G、A、およびPからなる群より選択され;Xは、WおよびNからなる群より選択され;Xは、A、P、およびSからなる群より選択され;Xは、PおよびRからなる群より選択され;X10は、A、V、L、P、S、T、およびEからなる群より選択され;X11は、G、A、W、S、T、K、およびEからなる群より選択される。さらなる実施形態では、インテグリン結合性Fc融合物は、配列番号2または3に記載されているヒトIgG Fcドメインと作動可能に連結した、配列番号42または43に記載されているインテグリン結合性ポリペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ループは、工学的に操作されたAgRPまたはアガトキシン足場内にある。
ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、表1に開示されている2.5Dおよび2.5Fである。表1のインテグリン結合性ポリペプチドのいずれも本明細書に記載のFc融合物に使用することができる。
本ポリペプチドは、αβ、αβ、およびいくつかの場合には、αβインテグリン受容体を標的化する。本ポリペプチドは、親和性がわずかであるかまたは全くない、αiibβなどの試験した他のインテグリンには結合しない。したがって、これらの工学的に操作されたインテグリン結合性ポリペプチドには、上に挙げられたインテグリンを特異的に過剰発現する種々のヒトのがんにおける広範な診断および治療への適用がある。下記の通り、これらのポリペプチドは、界面活性剤で可溶化されたインテグリン受容体と腫瘍細胞表面インテグリン受容体のいずれにも高親和性で結合する。
αβ(およびαβ)インテグリンは、骨肉腫、神経芽細胞腫、肺、乳房、前立腺、および膀胱の癌腫、神経膠芽腫、ならびに浸潤性メラノーマを含めた多くの腫瘍細胞上にも高度に発現する。αβインテグリンは、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、および結腸癌の腫瘍細胞および/または脈管構造上には発現するが、正常な成体組織または血管上には発現しないことが示されている。同様に、αβインテグリンも、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、および結腸癌の腫瘍細胞および/または脈管構造上には発現するが、正常な成体組織または血管上には発現しないことが示されている。したがって、小さな、コンフォメーション的に制約された本ポリペプチド(約33アミノ酸)は、分子内結合によって制約される。例えば、EETI−IIは、3つのジスルフィド結合を有する。これにより、EETI−IIがin vivoにおいてより安定なものになる。これらのペプチドは、αインテグリン単独、またはαインテグリンとαβインテグリンの両方を標的化する。これまでに、αβインテグリン、αβインテグリン、およびαβインテグリンに高い親和性および特異性で結合することが可能な単一の薬剤の開発は達成されていないと考えられる。これらのインテグリンの3種全てが腫瘍上に発現し、血管新生および転移の媒介に関与するので、広範なスペクトルの標的化薬剤(すなわち、αβ、αβ、およびαβ)が診断および治療への適用により有効である可能性がある。
この工学的に操作されたノッチン−Fc融合物には、以前に同定されたインテグリンを標的化する化合物に対していくつかの有利な点がある。この工学的に操作されたノッチン−Fc融合物は、タンパク質分解抵抗性および例外的なin vivoにおける安定性を付与する、緻密な、ジスルフィド結合したコアを有する。
本発明者らの研究により、マウス血清中でのインテグリン結合性Fc融合タンパク質の半減期は90時間を超えることが示されている。RGDに基づく環状ペプチドと比較してサイズが大きく(約3〜4kDa)、親和性が増強されていることにより、分子イメージングおよび治療への適用のための薬物動態および体内分布の増強が付与される。これらのノッチン−Fcタンパク質は、イメージングプローブ、放射性同位元素、または化学療法剤の化学合成および部位特異的コンジュゲーションを可能にするのに十分に小さい。さらに、これらのノッチン−Fcタンパク質は、必要であれば、容易に化学修飾してin vivoにおける性質をさらに改善することができる。
C.ノッチン−Fc融合物
本明細書およびその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第2014/0073518号に記載されているノッチン−Fc融合物は、工学的に操作されたインテグリン結合性ポリペプチド(ノッチン足場内)と、FcγRに結合してADCCを誘導することが可能なFcドメインまたは抗体様構築物を組み合わせたものである。
抗体のFc部分は、免疫グロブリン分子を構成する2つの重鎖の2つのカルボキシ末端ドメインによって形成される。IgG分子は、2つの重鎖(それぞれ約50kDa)および2つの軽鎖(それぞれ約25kDa)を含有する。全ての抗体の一般的な構造は非常に類似しており、当該タンパク質の先端の小さな領域は非常に可変性であり、それにより、先端構造がわずかに異なる数百万の抗体が存在することが可能になる。この領域は、超可変領域(Fab)として公知である。他の断片は、抗原結合活性を含有しないが、容易に結晶化することが最初に観察され、このような理由で、結晶化可能な断片としてFc断片と名付けられた。この断片は、対合したCHドメインおよびCHドメインに対応し、エフェクター分子および細胞と相互作用する抗体分子の一部である。重鎖アイソタイプ間の機能的な差は、主にFc断片にある。抗体分子のFc部分とFab部分を連結するヒンジ領域は、剛性のヒンジではなく、実際には可撓性のテザーであり、これにより、2つのFabアームの独立した動きが可能になる。これは、ハプテンと結合した抗体の電子顕微鏡観察によって実証されている。したがって、本融合タンパク質は、一方が抗体断片の各アーム上にある、2つのノッチンペプチドを含有するように作出することができる。
Fc部分は、抗体クラス(およびサブクラス)間では変化するが、そのクラス内では同一である。重鎖のC末端がFc領域を形成する。Fc領域は、受容体結合性部分として重要な役割を果たす。抗体のFc部分は、2つの異なる様式でFc受容体に結合する。例えば、IgGおよびIgMがFab部分によって病原体に結合した後、それらのFc部分は、食作用性細胞(マクロファージのような)上の受容体に結合して食作用を誘導することができる。
本ノッチン−Fc融合物は、Fc部分が、二重の結合能をもたらすため、かつ/または半減期を延長するため、発現レベルを改善するためなどに使用されるように成すことができる。ノッチン−FcのFc断片は、例えば、マウスIgG2aに由来するものまたはヒトIgG1に由来するものであってよい。場合によって、ノッチンとFc部分を接続するためにリンカーを使用することができる。リンカーは、ノッチン−FcのインテグリンまたはFc受容体に対する結合親和性に影響を及ぼさないものであることが好ましい。種々のFcドメイン遺伝子配列(例えば、マウス定常領域遺伝子配列およびヒト定常領域遺伝子配列)が公的に利用できる寄託物の形態で利用可能である。
a.Fc−ドメイン
種々のFcドメイン遺伝子配列(例えば、マウスおよびヒト定常領域遺伝子配列)が公的に利用できる寄託物の形態で利用可能である。Fcドメイン配列を含む定常領域ドメインは、特定のエフェクター機能を欠き、かつ/または免疫原性を低下させる特定の修飾を有するように選択することができる。抗体および抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公開されており、適切なFcドメイン配列(例えば、ヒンジ、CH2、および/またはCH3配列、またはその一部)は、これらの配列から当技術分野において認められている技法を使用して得ることができる。次いで、前述の方法のいずれかを使用して得られた遺伝物質を変更または合成して、本明細書で使用されるポリペプチドを得ることができる。さらに、定常領域DNA配列の対立遺伝子、改変体および変異が本明細書に開示されている方法における使用に適することが理解されよう。
本明細書に開示されている方法における使用に適したノッチン−Fcは、1つまたは複数のFcドメイン(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ超のFcドメイン)を含んでよい。一実施形態では、Fcドメインは、異なる型のものであってよい。一実施形態では、ノッチン−Fcに存在する少なくとも1つのFcドメインは、ヒンジドメインまたはその一部を含む。別の実施形態では、ノッチン−Fcは、少なくとも1つのCH2ドメインまたはその一部を含むFcドメインを少なくとも1つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Fcは、少なくとも1つのCH3ドメインまたはその一部を含むFcドメインを少なくとも1つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Fcは、少なくとも1つのCH4ドメインまたはその一部を含むFcドメインを少なくとも1つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Fcは、少なくとも1つのヒンジドメインまたはその一部および少なくとも1つのCH2ドメインまたはその一部を含む(例えば、ヒンジ−CH2配向で)Fcドメインを少なくとも1つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Fcは、少なくとも1つのCH2ドメインまたはその一部および少なくとも1つのCH3ドメインまたはその一部を含む(例えば、CH2−CH3配向で)Fcドメインを少なくとも1つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Fcは、少なくとも1つのヒンジドメインまたはその一部、少なくとも1つのCH2ドメインまたはその一部、および少なくとも1つのCH3ドメインまたはその一部を、例えば、ヒンジ−CH2−CH3、ヒンジ−CH3−CH2、またはCH2−CH3−ヒンジの配向で含むFcドメインを少なくとも1つ含む。
ある特定の実施形態では、ノッチン−Fcは、1つまたは複数の免疫グロブリン重鎖に由来する完全なFc領域(例えば、ヒンジ、CH2、およびCH3ドメインを含めたFcドメインであるが、これらは同じ抗体に由来するものである必要はない)を少なくとも1つ含む。他の実施形態では、ノッチン−Fcは、1つまたは複数の免疫グロブリン重鎖に由来する完全なFcドメインを少なくとも2つ含む。ある特定の実施形態では、完全なFcドメインは、ヒトIgG免疫グロブリン重鎖(例えば、ヒトIgG1)に由来する。
別の実施形態では、ノッチン−Fcは、完全なCH3ドメインを含むFcドメインを少なくとも1つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Fcは、完全なCH2ドメインを含むFcドメインを少なくとも1つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Fcは、少なくとも1つのCH3ドメイン、ならびにヒンジ領域およびCH2ドメインのうちの少なくとも1つを含むFcドメインを少なくとも1つ含む。一実施形態では、ノッチン−Fcは、ヒンジおよびCH3ドメインを含むFcドメインを少なくとも1つ含む。別の実施形態では、ノッチン−Fcは、ヒンジ、CH2、およびCH3ドメインを含むFcドメインを少なくとも1つ含む。ある特定の実施形態では、Fcドメインは、ヒトIgG免疫グロブリン重鎖(例えば、ヒトIgG1)に由来する。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のヒンジ領域のシステイン残基を除去または置換するためにヒンジ領域の変異、置換、または欠失を有するヒトIgG1 Fcドメインを使用する。
ノッチン−FcのFcドメインを構成する定常領域ドメインまたはその一部は、異なる免疫グロブリン分子に由来するものであってよい。例えば、本発明において使用されるポリペプチドは、IgG1分子に由来するCH2ドメインまたはその一部およびIgG3分子に由来するCH3領域またはその一部を含んでよい。別の例では、ノッチン−Fcは、IgG1分子に一部由来し、IgG3分子に一部由来するヒンジドメインを含むFcドメインを含んでよい。本明細書に記載の通り、Fcドメインは、天然に存在する抗体分子からアミノ酸配列が変化するように変更することができることが当業者には理解されよう。
他の構築物では、1つまたは複数の構成要素Fcドメインの間にペプチドスペーサーをもたらすことが望ましい。例えば、ペプチドスペーサーをヒンジ領域とCH2ドメインの間および/またはCH2とCH3ドメインの間に配置することができる。例えば、CH2ドメインを欠失させ、残りのCH3ドメイン(合成または非合成)をヒンジ領域に1〜20アミノ酸、1〜10アミノ酸、または1〜5アミノ酸ペプチドスペーサーを用いて接合した適合する構築物を発現させることができる。そのようなペプチドスペーサーは、例えば、定常領域ドメインの調節要素が遊離したままで接近可能であること、またはヒンジ領域が可撓性のままであることを確実にするために付加することができる。本発明に適合する任意のリンカーペプチドは、比較的非免疫原性であり、Fcの適切なフォールディングを妨げないものであることが好ましい。
b.Fcアミノ酸への変化
ある特定の実施形態では、Fcドメインを、例えば、アミノ酸変異(例えば、付加、欠失、または置換)によって変更または修飾する。本明細書で使用される場合、「Fcドメイン改変体」という用語は、Fcドメインが由来する野生型Fcと比較してアミノ酸置換などの少なくとも1つのアミノ酸修飾を有するFcドメインを指す。例えば、FcドメインがヒトIgG1抗体に由来する場合、改変体は、野生型アミノ酸と比較して、ヒトIgG1 Fc領域の対応する位置に少なくとも1つのアミノ酸変異(例えば、置換)を含む。
ある特定の実施形態では、ヒトIgG1 Fcドメインのヒンジ領域をアミノ酸置換または欠失によって変更して、3つのヒンジ領域システイン残基(EU番号付けによる残基220、226、および229に位置する)のうちの1つまたは複数を変異させるまたは除去する。一部の態様では、上部ヒンジ領域を欠失させて、軽鎖と対合するシステインを除去する。例えば、配列番号3に記載の通り、上部ヒンジ領域内のアミノ酸「EPKSC」を欠失させる。他の態様では、3つのヒンジ領域システインのうちの1つまたは複数を変異させる(例えば、セリンに)。ある特定の実施形態では、システイン220をセリンに変異させる。
ある特定の実施形態では、Fc改変体は、ヒンジドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位に置換を含む。別の実施形態では、Fc改変体は、CH2ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位に置換を含む。別の実施形態では、Fc改変体は、CH3ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位に置換を含む。別の実施形態では、Fc改変体は、CH4ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位に置換を含む。
ある特定の実施形態では、ノッチン−Fc融合物は、1つ超のアミノ酸置換を含むFc改変体を含む。本明細書に記載の方法において使用されるノッチン−Fc融合物は、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ超のアミノ酸置換を含んでよい。アミノ酸置換は、互いから少なくとも1アミノ酸位またはそれ超、例えば、少なくとも2アミノ酸位、3アミノ酸位、4アミノ酸位、5アミノ酸位、6アミノ酸位、7アミノ酸位、8アミノ酸位、9アミノ酸位、または10アミノ酸位またはそれ超の間隔で空間的に位置させることが好ましい。工学的に操作されたアミノ酸は、互いから少なくとも5アミノ酸位、10アミノ酸位、15アミノ酸位、20アミノ酸位、または25アミノ酸位またはそれ超の間隔をあけて空間的に位置させることがより好ましい。
ある特定の実施形態では、ノッチン−Fc融合物は、ポリペプチドの抗原に依存しないエフェクター機能、特にポリペプチドの循環半減期を変更させる、Fcドメインに対するアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、ノッチン−Fcは、活性化しているFcγR(例えば、Fcγ1、Fcγ1a、またはFcγRIIIa)に対して結合の増強を示す。FcRまたは補体結合活性が変更された例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み込まれる国際PCT公開第WO2005/063815に開示されている。ある特定の実施形態では、Fc領域は、以下の変異:S239D、S239E、L261A、H268D、S298A、A330H、A330L、I332D、I332E、I332Q、K334V、A378F、A378K、A378W、A378Y、H435S、またはH435Gの少なくとも1つを含有する。ある特定の実施形態では、Fc領域は、以下の変異:S239D、S239E、I332DまたはI332EまたはH268Dの少なくとも1つを含有する。ある特定の実施形態では、Fc領域は、以下の変異:I332DまたはI332EまたはH268Dの少なくとも1つを含有する。
本明細書で使用されるノッチン−Fcは、ノッチン−Fcのグリコシル化を変更させるアミノ酸置換も含んでよい。例えば、ノッチン−FcのFcドメインは、グリコシル化(例えば、N結合グリコシル化またはO結合グリコシル化)の低下を導く変異を有するFcドメインを含んでもよく、野生型Fcドメインの変更されたグリコフォーム(例えば、低フコースまたはフコースを含まないグリカン)を含んでもよい。別の実施形態では、ノッチン−Fcは、グリコシル化モチーフ、例えば、アミノ酸配列NXTまたはNXSを含有するN結合グリコシル化モチーフの付近またはその内部にアミノ酸置換を有する。グリコシル化を低下または変更させる例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み込まれるWO05/018572およびUS2007/0111281に開示されている。他の実施形態では、本明細書で使用されるノッチン−Fcは、溶媒露出表面に位置する工学的に操作されたシステイン残基またはその類似体を有するFcドメインを少なくとも1つ含む。ある特定の実施形態では、本明細書で使用されるノッチン−Fcは、第2のシステイン残基とのジスルフィド結合を実質的に含まない工学的に操作された遊離のシステイン残基またはその類似体を少なくとも1つ含むFcドメインを含む。上記の工学的に操作されたシステイン残基またはその類似体はいずれも、その後、当技術分野で認められている技法を使用して機能性ドメインとコンジュゲートすること(例えば、チオール−反応性ヘテロ二官能性リンカーを用いてコンジュゲートすること)ができる。
一実施形態では、本明細書で使用されるノッチン−Fcは、それぞれ独立に本明細書に記載のFcドメインから選択されるその構成要素のFcドメインのうちの2つまたはそれ超を有する遺伝子融合したFcドメインを含んでよい。一実施形態では、Fcドメインは同じものである。別の実施形態では、Fcドメインの少なくとも2つは異なるものである。例えば、本明細書で使用されるノッチン−FcのFcドメインは、同じ数のアミノ酸残基を含む、または1つもしくは複数のアミノ酸残基(例えば、約5アミノ酸残基(例えば、1、2、3、4、または5アミノ酸残基)、約10残基、約15残基、約20残基、約30残基、約40残基、または約50残基)だけ長さが異なるものであってよい。さらに他の実施形態では、本明細書で使用されるノッチン−FcのFcドメインは、1つまたは複数のアミノ酸位で配列が異なるものであってよい。例えば、Fcドメインの少なくとも2つは、約5アミノ酸位(例えば、1、2、3、4、または5アミノ酸位)、約10位、約15位、約20位、約30位、約40位、または約50位)で異なるものであってよい。
免疫チェックポイント遮断薬
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬を本明細書に記載の他の治療剤と組み合わせて使用する(例えば、PK延長IL−2およびインテグリン結合性Fc融合タンパク質)。T細胞活性化およびエフェクター機能は、「免疫チェックポイント」と称される共刺激および抑制シグナルによってバランスを保つ。T細胞エフェクター機能を調節する抑制性リガンドおよび受容体は、腫瘍細胞上に過剰発現する。その後、共刺激受容体のアゴニストまたは抑制シグナルのアンタゴニストにより、抗原特異的T細胞応答の増幅がもたらされる。腫瘍細胞を直接標的化する治療用抗体とは対照的に、免疫チェックポイント遮断薬は、内在性抗腫瘍活性を増強するものである。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法における使用に適した免疫チェックポイント遮断薬は、抑制シグナルのアンタゴニスト、例えば、例えばPD−1、PD−L1、CTLA−4、LAG3、B7−H3、B7−H4、およびTIM3を標的化する抗体である。これらのリガンドおよび受容体は、Pardoll, D.、Nature. 12巻:252〜264頁、2012年に概説されている。
本明細書には、がんなどの疾患を患っている被験体を処置するための方法であって、被験体に、免疫チェックポイントを遮断する分子、およびインテグリン結合性Fc融合タンパク質を治療有効量で含む組成物を投与するステップを含む方法が開示されている。ある特定の実施形態では、がんなどの疾患を患っている被験体を処置するための方法であって、被験体に、免疫チェックポイントを遮断する分子、インテグリン結合性Fc融合タンパク質、およびIL−2(例えば、PK延長IL−2)を治療有効量で含む組成物を投与するステップを含む方法。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、抑制性免疫調節薬からのシグナル伝達を破壊または阻害する抗体またはその抗原結合性部分である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、抑制性免疫調節薬からのシグナル伝達を破壊または阻害する小分子である。
ある特定の実施形態では、抑制性免疫調節薬(免疫チェックポイント遮断薬)は、PD−1/PD−L1シグナル伝達経路の構成成分である。したがって、ある特定の実施形態では、がんを患っている被験体に対する免疫療法の方法であって、被験体に、PD−1受容体とそのリガンドであるPD−L1の相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合性部分を治療有効量で投与するステップを含む方法が提供される。PD−1に結合してPD−1とそのリガンドであるPD−L1の相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する当技術分野で公知の抗体が、本明細書に開示されている方法における使用に適する。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性部分は、PD−1に特異的に結合する。例えば、PD−1を標的化する抗体として、例えば、ニボルマブ(BMS−936558、Bristol−Myers Squibb)およびペムブロリズマブ(ランブロリズマブ、MK03475、Merck)が挙げられる。本明細書に開示されている方法における使用に適した他の抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,008,449号に開示されている抗PD−1抗体である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性部分は、PD−L1に特異的に結合してPD−L1のPD−1との相互作用を阻害し、それにより、免疫活性を増大させるものである。PD−L1に結合してPD−1とPD−L1の相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する当技術分野で公知の抗体が、本明細書に開示されている方法における使用に適する。例えば、PD−L1を標的化し、臨床試験中の抗体として、BMS−936559(Bristol−Myers Squibb)およびMPDL3280A(Genetech)が挙げられる。PD−L1を標的化する他の適切な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,943,743号に開示されている。PD−1またはPD−L1に結合し、PD−1/PD−L1相互作用を破壊し、かつ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に開示されている方法における使用に適することが当業者には理解されよう。
ある特定の実施形態では、抑制性免疫調節薬は、CTLA−4シグナル伝達経路の構成成分である。したがって、ある特定の実施形態では、がんを患っている被験体に対する免疫療法の方法であって、被験体に、CTLA−4を標的化し、CTLA−4のCD80およびCD86との相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合性部分を治療有効量で投与するステップを含む方法が提供される。CTLA−4を標的化する抗体の例としては、FDAの認可を受けているイピリムマブ(MDX−010、MDX−101、Bristol−Myers Squibb)、および現在ヒト試験が行われているトレメリムマブ(チシリムマブ(ticilimumab)、CP−675、206、Pfizer)が挙げられる。CTLA−4を標的化する他の適切な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる、WO2012/120125、米国特許第6,984720号、同第6,682,7368号、および米国特許出願第2002/0039581号、同第2002/0086014号、および同第2005/0201994号に開示されている。CTLA−4に結合し、CTLA−4のCD80およびCD86との相互作用を破壊し、かつ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に開示されている方法における使用に適することが当業者には理解されよう。
ある特定の実施形態では、抑制性免疫調節薬は、LAG3(リンパ球活性化遺伝子3)シグナル伝達経路の構成成分である。したがって、ある特定の実施形態では、がんを患っている被験体に対する免疫療法の方法であって、被験体に、LAG3を標的化し、LAG3のMHCクラスII分子との相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合性部分を治療有効量で投与するステップを含む方法が提供される。LAG3を標的化する抗体の例は、現在ヒト試験が行われているIMP321(Immutep)である。LAG3を標的化する他の適切な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第2011/0150892号に開示されている。LAG3に結合し、LAG3のMHCクラスII分子との相互作用を破壊し、かつ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に開示されている方法における使用に適することが当業者には理解されよう。
ある特定の実施形態では、抑制性免疫調節薬は、B7ファミリーシグナル伝達経路の構成成分である。ある特定の実施形態では、B7ファミリーメンバーは、B7−H3およびB7−H4である。したがって、ある特定の実施形態では、がんを患っている被験体に対する免疫療法の方法であって、被験体に、B7−H3またはB7−H4を標的化する抗体またはその抗原結合性部分を治療有効量で投与するステップを含む方法が提供される。B7ファミリーは、いかなる定義済みの受容体も有さないが、これらのリガンドは、腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞において上方制御される。前臨床的なマウスモデルにより、これらのリガンドを遮断することにより抗腫瘍免疫を増強できることが示されている。B7−H3を標的化する抗体の例は、現在ヒト試験が行われているMGA271(Macrogenics)である。B7ファミリーメンバーを標的化する他の適切な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第2013/0149236号に開示されている。B7−H3またはB7−H4に結合し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に開示されている方法における使用に適することが当業者には理解されよう。
ある特定の実施形態では、抑制性免疫調節薬は、TIM3(T細胞膜タンパク質3)シグナル伝達経路の構成成分である。したがって、ある特定の実施形態では、がんを患っている被験体に対する免疫療法の方法であって、被験体に、TIM3を標的化し、TIM3のガレクチン9との相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合性部分を治療有効量で投与するステップを含む方法が提供される。TIM3を標的化する適切な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第2013/0022623号に開示されている。TIM3に結合し、TIM3のガレクチン9との相互作用を破壊し、かつ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に開示されている方法における使用に適することが当業者には理解されよう。
本明細書に開示されている方法における使用に適した、免疫チェックポイントを標的化する抗体は、上記のものに限定されないことが理解されるべきである。さらに、他の免疫チェックポイント標的も、それを標的化することにより、例えば、T細胞増殖の増大、T細胞活性化の増強、および/またはサイトカイン産生(例えば、IFN−γ、IL−2)の増大に反映される、抗腫瘍免疫応答の刺激がもたらされるのであれば、本明細書に記載の方法においてアンタゴニストまたは抗体によって標的化することができることが当業者には理解されよう。
免疫チェックポイント遮断薬に対する代替物
ある特定の実施形態では、血管内皮増殖因子(VEGF)のアンタゴニストを免疫チェックポイント遮断薬の代わりに使用する。VEGFは、免疫抑制において役割を果たすことが最近実証されており(Liang, W.−C.ら、J. Biol. Chem.(2006年)281巻:951〜961頁;Voron, T.ら、Front Oncol(2014年)4巻:Article 70;Terme, M.ら、Clin Dev Immunol(2012年)2012巻:Article ID 492920;Kandalaft, E.ら,Curr Top Microbiol Immunol(2011年)344巻:129〜48頁)、したがって、免疫チェックポイント遮断薬と同様に、その活性を遮断することにより、免疫応答が増強されると思われる。「VEGFアンタゴニスト」とは、1つまたは複数のVEGF受容体への結合を含めた、VEGF活性を中和する、遮断する、阻害する、抑止する、低下させるまたはそれに干渉することが可能な分子を指す。VEGFアンタゴニストの非限定的な例としては、VEGFに特異的に結合し、それにより、VEGFと1つまたは複数の受容体(例えば、VEGF受容体)との結合を隔離する抗VEGF抗体およびその抗原結合性断片、受容体分子および誘導体、抗VEGF受容体抗体、VEGFRチロシンキナーゼの小分子阻害剤などのVEGF受容体アンタゴニスト、またはドミナントネガティブVEGFが挙げられる。
ある特定の実施形態では、VEGFアンタゴニストは、抗体である。「抗VEGF抗体」は、VEGFに十分な親和性および特異性で結合する抗体である。抗VEGF抗体の非限定的な例は、米国特許第6,884,879号、同第7,060,269号、同第6,582,959号、同第6,703,030号、同第6,054,297号、米国特許出願第2006009360号、同第20050186208号、同第20030206899号、同第20030190317号、同第20030203409号、同第20050112126号、およびPCT公開第WO98/45332号、同第96/30046号、同第94/10202号、同第05/044853号、同第13/181452号に記載されている。これらの特許および特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、VEGF抗体は、ベバシズマブ(Avastin(登録商標)Genentech/Roche)またはラニビズマブ(Lucentis(登録商標)Genentech/Roche)である。
ある特定の実施形態では、VEGFアンタゴニストは、VEGF受容体に結合する。VEGFに特異的に結合するVEGF受容体またはその断片を使用して、VEGFタンパク質に結合させてVEGFタンパク質を隔離し、それにより、VEGFタンパク質により下流のシグナル伝達が活性化されるのを防止することができる。ある特定の実施形態では、VEGF受容体、またはそのVEGF結合性断片は、sFlt−1などの可溶性VEGF受容体である。当該受容体の可溶性の形態は、VEGFに結合することによってVEGFの生物学的活性に対する抑制効果を発揮し、それにより、VEGFが標的細胞の表面上に存在するその天然の受容体に結合するのを防止する。VEGF受容体に結合するVEGFアンタゴニストの非限定的な例は、PCT出願第97/44453号、同第05/000895号および米国特許出願第20140057851号に開示されている。ある特定の実施形態では、VEGFアンタゴニストは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,741,839号に記載の通り、インテグリンにより認識されるRGD配列を有するループを含む修飾VEGFを含む二機能性単鎖拮抗性ヒトVEGF改変体を有するポリペプチドである。
リンカー
ある特定の実施形態では、PK延長基を、場合によってリンカーを介してIL−2と融合する。ある特定の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドを、リンカーを介してFc断片と融合する。適切なリンカーは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるUS2010/0210511 US2010/0179094、およびUS2012/0094909に開示されているものなど、当技術分野で周知である。例示的なリンカーとしては、gly−serポリペプチドリンカー、グリシン−プロリンポリペプチドリンカー、およびプロリン−アラニンポリペプチドリンカーが挙げられる。ある特定の実施形態では、リンカーは、gly−serポリペプチドリンカー、すなわち、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドである。
例示的なgly−serポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ser(GlySer)n(配列番号134)である。一実施形態では、n=1である。一実施形態では、n=2である。別の実施形態では、n=3、すなわち、Ser(GlySer)3(配列番号135)である。別の実施形態では、n=4、すなわち、Ser(GlySer)4(配列番号136)である。別の実施形態では、n=5である。さらに別の実施形態では、n=6である。別の実施形態では、n=7である。さらに別の実施形態では、n=8である。別の実施形態では、n=9である。さらに別の実施形態では、n=10である。別の例示的なgly−serポリペプチドリンカーは、(GlySer)n(配列番号137)を含む。一実施形態では、n=1である。一実施形態では、n=2である。ある特定の実施形態では、n=3である。別の実施形態では、n=4である。別の実施形態では、n=5である。さらに別の実施形態では、n=6である。別の例示的なgly−serポリペプチドリンカーは、(GlySer)n(配列番号138)を含む。一実施形態では、n=1である。一実施形態では、n=2である。ある特定の実施形態では、n=3である。別の実施形態では、n=4である。別の実施形態では、n=5である。さらに別の実施形態では、n=6である。
他の治療剤
本明細書に開示されている方法における使用に適したインテグリン結合性Fc融合タンパク質は、1つまたは複数の治療剤と併せて使用することができる。一実施形態では、治療剤は、治療用抗体である。別の実施形態では、治療剤は、治療用タンパク質である。別の実施形態では、治療剤は、小分子である。別の実施形態では、治療剤は、抗原である。別の実施形態では、治療剤は、細胞の集団である。
工学的に操作された融合分子
本明細書では、本明細書に記載のIL−2、および抗体(例えば、治療用抗体、免疫チェックポイント遮断薬、もしくはVEGFと拮抗する抗体)または抗体断片のうちの2つまたはそれ超を含む工学的に操作された分子も提供される。そのような工学的に操作された分子により、本明細書に記載の方法において被験体(例えば、がん患者)に投与される構成成分の数を有効に減少させることができる。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、他の構成成分(例えば、IL−2)とのコンジュゲーションのための足場としての機能を果たす。
したがって、ある特定の実施形態では、工学的に操作された分子は、IL−2および抗体または抗体断片を含む。特定の実施形態では、工学的に操作されたタンパク質に使用するための抗体は、二重特異性抗体であり、一方の構成成分は治療用抗体であり、他方の構成成分は、免疫チェックポイント遮断薬に結合する抗体またはVEGF活性と拮抗する抗体である。二重特異性抗体を生成するための方法は、当技術分野で公知である。
したがって、ある特定の実施形態では、工学的に操作された分子は、IL−2および治療上の標的および免疫チェックポイント遮断薬に結合する二重特異性抗体またはVEGFと拮抗する抗体を含む。
ある特定の実施形態では、工学的に操作されたタンパク質に使用するためのIL−2構成成分は、薬物動態部分を欠くIL−2(すなわち、非PK延長IL−2)である。他の実施形態では、IL−2は、薬物動態部分(PK延長IL−2)を含む。
ある特定の実施形態では、工学的に操作された分子の構成成分を、リンカーを用いてまたは用いずに抗体または二重特異性抗体とコンジュゲートする。コンジュゲーションに適したリンカーは本明細書に記載されており、また、当技術分野において広範囲にわたって記載されている。
工学的に操作された分子のポリペプチドに基づく構成成分(例えば、IL−2)を、リンカーを用いてまたは用いずに抗体へ融合することができる領域は、一般に、当技術分野で公知であり、それらとして、例えば、抗体重鎖のC末端、および抗体軽鎖のC末端が挙げられる。
ある特定の実施形態では、工学的に操作された分子の構成成分は、他の構成成分の機能に干渉しない。例として、工学的に操作されたタンパク質が治療用抗体およびIL−2を含む場合、IL−2と治療用抗体を、抗体の抗原結合機能が保持され、IL−2のその受容体と相互作用する能力が保持されるように融合する。工学的に操作されたタンパク質の構成成分のそれぞれの機能が保持されているかどうかは、本明細書、例えば実施例に記載の方法を使用して決定することができる。
ポリペプチドを作出する方法
一部の態様では、本明細書に記載のポリペプチド(例えば、PK延長IL−2などのIL−2、およびノッチン−Fc)は、形質転換された宿主細胞において、組換えDNA技法を使用して作出する。これを行うために、ペプチドをコードする組換えDNA分子を調製する。そのようなDNA分子を調製する方法は当技術分野で周知である。例えば、適切な制限酵素を使用して、ペプチドをコードする配列をDNAから切り出すことができる。あるいは、ホスホルアミデート法などの化学合成技法を使用してDNA分子を合成することができる。また、これらの技法の組み合わせも使用することができる。
ポリペプチドを作出する方法としては、適切な宿主においてペプチドを発現させることが可能なベクターも挙げられる。ベクターは、適切な発現制御配列と作動可能に連結したペプチドをコードするDNA分子を含む。DNA分子をベクターに挿入する前またはその後にこの作動可能な連結をもたらす方法は周知である。発現制御配列としては、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソームヌクレアーゼドメイン、開始シグナル、終止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルが挙げられる。
得られる、DNA分子を有するベクターを使用して適切な宿主を形質転換する。この形質転換は、当技術分野で周知の方法を使用して実施することができる。
多数の入手可能な周知の宿主細胞はいずれも本発明の実施に使用することができる。特定の宿主の選択は、当技術分野で理解されているいくつもの因子に左右される。これらとしては、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、DNA分子によりコードされるペプチドの毒性、形質転換の率、ペプチドの回収のしやすさ、発現特性、バイオセーフティーおよび費用が挙げられる。全ての宿主が特定のDNA配列の発現に対して同等に有効であるとは限らないことを理解してこれらの因子のバランスを取らなければならない。これらの一般的なガイドラインでは、有用な微生物宿主として、培養物中の細菌(例えば、E.coli sp.など)細胞、酵母(例えば、Saccharomyces spなど)の細胞および他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞(ヒトを含む)、または当技術分野で公知の他の宿主が挙げられる。
次に、形質転換された宿主を培養し、精製する。宿主細胞は、所望の化合物が発現されるように、従来の発酵条件下で培養することができる。そのような発酵条件は当技術分野で周知である。最後に、当技術分野で周知の方法によって培養物からペプチドを精製する。
化合物は、合成方法によって作出することもできる。例えば、固相合成技法を使用することができる。適切な技法は当技術分野で周知であり、それらとしては、Merrifield(1973年)、Chem. Polypeptides、335〜61頁(KatsoyannisおよびPanayotis編);Merrifield(1963年)、J. Am. Chem. Soc. 85巻:2149頁;Davisら(1985年)、Biochem. Intl. 10巻:394〜414頁;StewartおよびYoung(1969年)、Solid Phase Peptide Synthesis;米国特許第3,941,763号;Finnら(1976年)、The Proteins(第3版)2巻:105〜253頁;およびEricksonら(1976年)、The Proteins(第3版)2巻:257〜527頁に記載されているものが挙げられる。固相合成は、小さなペプチドを作出する最も対費用効果が大きい方法であるので、個々のペプチド作出の好ましい技法である。誘導体化ペプチドを含有する化合物または非ペプチド基を含有する化合物は、周知の有機化学技法によって合成することができる。
分子の発現/合成の他の方法は、一般に、当技術分野で当業者に公知である。
ポリペプチドの発現
上記の核酸分子は、例えばベクターを用いて形質導入した細胞において、それらの発現を導くことが可能なベクター内に含有されてよい。したがって、PK延長IL−2およびノッチン−Fc変異体に加えて、PK延長IL−2またはノッチン−Fc変異体をコードする核酸分子を含有する発現ベクターおよびこれらのベクターをトランスフェクトした細胞がある特定の実施形態の中に入る。
使用に適したベクターとしては、細菌における使用のためのT7に基づくベクター(例えば、Rosenbergら、Gene 56巻:125頁、1987年を参照されたい)、哺乳動物細胞における使用のためのpMSXND発現ベクター(LeeおよびNathans、J. Biol. Chem. 263巻:3521頁、1988年)、および昆虫細胞における使用のためのバキュロウイルス由来ベクター(例えば、Clontech、Palo Alto、Califからの発現ベクターpBacPAKS)が挙げられる。そのようなベクター内の目的のポリペプチドをコードする核酸挿入断片は、例えば発現させようとする細胞型に基づいて選択されるプロモーターと作動可能に連結していてよい。例えば、細菌ではT7プロモーターを使用することができ、昆虫細胞ではポリヘドリンプロモーターを使用することができ、哺乳動物細胞ではサイトメガロウイルスまたはメタロチオネインプロモーターを使用することができる。また、高等真核生物の場合では、組織特異的プロモーターおよび細胞型特異的プロモーターが広範に入手可能である。したがって、これらのプロモーターの名称は体内の所与の組織または細胞型における核酸分子の発現を導くそれらの能力に由来する。核酸の発現を導くために使用することができる多数のプロモーターおよび他の調節エレメントは当業者にはよく知られている。
挿入された核酸分子の転写を容易にする配列に加えて、ベクターは、複製開始点、および選択マーカーをコードする他の遺伝子を含有してよい。例えば、ネオマイシン耐性(neo)遺伝子により、それが発現する細胞にG418抵抗性が付与され、したがって、トランスフェクトされた細胞の表現型を選択することが可能になる。所与の調節エレメントまたは選択マーカーが特定の実験の状況における使用に適しているかどうかは、当業者が容易に決定することができる。
本発明において使用することができるウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ベクター、ヘルペスウイルスベクター、シミアンウイルス40(SV40)ベクター、およびウシパピローマウイルスベクターが挙げられる(例えば、Gluzman(編)、Eukaryotic Viral Vectors、CSH Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Yを参照されたい)。
PK延長IL−2またはノッチン−Fc変異体をコードする核酸分子を含有し、それを発現する原核細胞または真核細胞も本発明の特徴である。本発明の細胞は、トランスフェクトされた細胞、すなわち、核酸分子、例えばPK延長IL−2変異体またはノッチン−Fcをコードする核酸分子が組換えDNA技法によって導入された細胞である。そのような細胞の子孫も本発明の範囲内に入るとみなされる。
発現系の正確な構成成分は重大ではない。例えば、PK延長IL−2またはノッチン−Fc変異体は、細菌E.coliなどの原核生物宿主、または昆虫細胞(例えば、Sf21細胞)もしくは哺乳動物細胞(例えば、COS細胞、NIH 3T3細胞、またはHeLa細胞)などの真核生物宿主、において産生させることができる。これらの細胞は、American Type Culture Collection(Manassas、Va)を含めた多くの供給源から入手可能である。発現系の選択においては、構成成分が互いと適合するものであることのみが重要である。当業者はそのような決定を行うことができる。さらに、発現系の選択の手引きが必要である場合には、当業者は、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、New York、N.Y.、1993年)およびPouwelsら(Cloning Vectors: A Laboratory Manual、1985年、補遺1987年)で調べることができる。
発現させたポリペプチドは、本明細書に記載の通り、常套的な生化学的手順を使用して発現系から精製することができ、そして、例えば治療剤として使用することができる。
医薬組成物および投与形式
ある特定の実施形態では、IL−2をノッチン−Fcと一緒に(同時にまたは逐次的に)投与する。ある特定の実施形態では、IL−2をノッチン−Fcの投与前に投与する。ある特定の実施形態では、IL−2をノッチン−Fcの投与と同時に投与する。ある特定の実施形態では、IL−2をノッチン−Fcの投与の後に投与する。ある特定の実施形態では、IL−2およびノッチン−Fcを同時に投与する。他の実施形態では、IL−2およびノッチン−Fcを逐次的に投与する。さらに他の実施形態では、IL−2およびノッチン−Fcを互いと1日以内、2日以内、または3日以内に投与する。
ある特定の実施形態では、IL−2およびノッチン−Fcを免疫チェックポイント遮断薬と一緒に投与する。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、抗PD−1抗体である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、抗CTLA−4抗体である。ある特定の実施形態では、VEGFのアンタゴニストを免疫チェックポイント遮断薬の代わりに使用する。
本発明の医薬組成物は、併用療法として、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与することができる。薬剤としては、これだけに限定されないが、in vitroにおいて合成により調製された化学組成物、抗体、抗原結合性領域、ならびにその組み合わせおよびコンジュゲートが挙げられる。ある特定の実施形態では、薬剤は、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリックモジュレーター、または毒素としての機能を果たし得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、PK延長IL−2を薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および/またはアジュバントと共に含む別々の医薬組成物、ならびにノッチン−Fcを薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および/またはアジュバントと共に含む別の医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、さらに、免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および/またはアジュバントと共に含む別々の医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、PK延長IL−2とノッチン−Fcの両方を薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および/またはアジュバントと共に含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および/またはアジュバントと共に含む。
ある特定の実施形態では、本発明は、PK延長IL−2を薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および/またはアジュバントと一緒に含む医薬組成物、ならびにノッチン−Fcを薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および/またはアジュバントと一緒に含む別の医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、免疫チェックポイント遮断薬を薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および/またはアジュバントと一緒に含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、薬剤、例えば、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)のそれぞれを別々の組成物として製剤化することができる。ある特定の実施形態では、許容される製剤材料は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。ある特定の実施形態では、製剤材料(複数可)は、s.c.投与および/またはI.V.投与用のものである。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のpH、質量オスモル濃度、粘度、清澄性、色、等張性、匂い、滅菌、安定性、溶解または放出の速度、吸着または透過の速度を改変、維持または保存するための製剤材料を含有してよい。ある特定の実施形態では、適切な製剤材料としては、これだけに限定されないが、アミノ酸(例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなど);抗菌薬;抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど);緩衝液(例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス−HCl、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸など);増量剤(例えば、マンニトールまたはグリシンなど);キレート化剤(例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)など);錯化剤(complexing agent)(例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど);充填剤;単糖;二糖;および他の炭水化物(例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリンなど);タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど);着色剤、矯味矯臭剤および希釈剤;乳化剤(emulsifying agent);親水性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドンなど);低分子量ポリペプチド;塩形成性対イオン(例えば、ナトリウムなど);防腐剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など);溶媒(例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど);糖アルコール(例えば、マンニトールまたはソルビトールなど);懸濁化剤;界面活性物質または湿潤剤(例えば、プルロニック、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート20、ポリソルベート80などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール(tyloxapal)など);安定性増強剤(例えば、スクロースまたはソルビトールなど);張度増強剤(例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトールなど);送達ビヒクル;希釈剤;賦形剤および/または医薬アジュバントが挙げられる(Remington’s Pharmaceutical Sciences、第18版、A. R. Gennaro編、Mack Publishing Company(1995年)。ある特定の実施形態では、製剤は、PBS;20mMのNaOAC、pH5.2、50mMのNaCl;および/または10mMのNAOAC、pH5.2、9%スクロースを含む。ある特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、当業者により、例えば、意図された投与経路、送達形式および所望の投与量に応じて決定される。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、上記を参照されたい。ある特定の実施形態では、そのような組成物は、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)の物理的状態、安定性、in vivo放出の速度およびin vivoクリアランスの速度に影響を及ぼす可能性がある。
ある特定の実施形態では、医薬組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、水性であっても非水性であってもよい。例えば、ある特定の実施形態では、適切なビヒクルまたは担体は、場合によって非経口投与用の組成物に一般的な他の材料を補充した注射用水、生理的食塩溶液または人工脳脊髄液であってよい。ある特定の実施形態では、食塩水は、等張性リン酸緩衝食塩水を含む。ある特定の実施形態では、別の例示的なビヒクルは、中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した食塩水である。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約pH7.0〜8.5のトリス緩衝液、または約pH4.0〜5.5の酢酸緩衝液を含み、したがって、これは、ソルビトールまたは適切な代用物をさらに含んでよい。ある特定の実施形態では、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を含む組成物は、所望の程度の純度の選択された組成物と任意選択の製剤用薬剤(formulation agent)(Remington’s Pharmaceutical Sciences、上記)を混合して凍結乾燥したケーキまたは水溶液の形態にすることによって、保管用に調製することができる。さらに、ある特定の実施形態では、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を含む組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物(lyophilizate)として製剤化することができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達用に選択することができる。ある特定の実施形態では、組成物は、吸入または消化管を通じた送達、例えば経口的なものなどのために選択することができる。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の能力の範囲内である。
ある特定の実施形態では、製剤構成成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。ある特定の実施形態では、緩衝液を使用して組成物を生理的なpHまたはわずかに低いpH、一般には、約5から約8までのpH範囲内に維持する。
ある特定の実施形態では、非経口投与が意図されている場合、治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望のPK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を含む、発熱物質を含まない非経口的に許容される水溶液の形態であってよい。ある特定の実施形態では、非経口的注射用のビヒクルは、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)が、適正に保存される滅菌等張性溶液として製剤化される滅菌蒸留水である。ある特定の実施形態では、調製は、所望の分子を、その後デポ注射によって送達することができる産物の制御放出または持続放出を提供し得る薬剤、例えば、注射可能なマイクロスフェア、生体内分解性(bio−erodible)粒子、ポリマー化合物(例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸など)、ビーズまたはリポソームなどと共に製剤化することを伴う。ある特定の実施形態では、ヒアルロン酸を使用することもでき、これには、循環中の長期持続時間を促進する効果がある。ある特定の実施形態では、埋め込み型の薬物送達デバイスを使用して所望の分子を導入することができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、吸入用に製剤化することができる。ある特定の実施形態では、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)は、吸入用の乾燥粉末として製剤化することができる。ある特定の実施形態では、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を含む吸入溶液は、エアロゾル送達用に噴霧体と共に製剤化することができる。ある特定の実施形態では、溶液を噴霧化することができる。肺投与は、化学修飾されたタンパク質の肺送達について記載されているPCT出願第PCT/US94/001875号においてさらに記載されている。
ある特定の実施形態では、製剤を経口的に投与することができることが意図されている。ある特定の実施形態では、このように投与されるPK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)は、錠剤およびカプセル剤などの固体剤形の配合において習慣的に使用されている担体を用いてまたは用いずに製剤化することができる。ある特定の実施形態では、カプセル剤は、生物学的利用能が最大化され、かつ前全身性(pre−systemic)分解が最小化される、胃腸管内における段階(point)で製剤の活性部分が放出されるように設計することができる。ある特定の実施形態では、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)の吸収を容易にするために、少なくとも1種の追加的な薬剤を含めることができる。ある特定の実施形態では、希釈剤、香味剤(flavoring)、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤(binder)も使用することができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、有効な量のPK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を、錠剤の製造に適した無毒性賦形剤との混合物中に含んでよい。ある特定の実施形態では、錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解させることにより、溶液を単位剤形に調製することができる。ある特定の実施形態では、適切な賦形剤としては、これだけに限定されないが、不活性な希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウムなど;または結合剤(binding agent)、例えば、デンプン、ゼラチン、もしくはアラビアゴムなど;または潤滑剤(lubricating agent)、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクなどが挙げられる。
追加的な医薬組成物は、持続送達製剤または制御送達製剤中のPK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を含む製剤を含め、当業者には明らかである。ある特定の実施形態では、リポソーム担体、生体内分解性微小粒子または多孔質ビーズおよびデポ注射などの種々の他の持続送達手段または制御送達手段を製剤化するための技法も当業者には公知である。例えば、医薬組成物を送達するための多孔質ポリマー微小粒子の制御放出について記載されているPCT出願第PCT/US93/00829号を参照されたい。ある特定の実施形態では、持続放出調製物は、半透性ポリマーマトリクスを造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態で含んでよい。持続放出マトリクスとしては、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号およびEP058,481)、L−グルタミン酸とガンマエチル−L−グルタメートの共重合体(Sidmanら、Biopolymers、22巻:547〜556頁(1983年))、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)(Langerら、J. Biomed. Mater. Res.、15巻:167〜277頁(1981年)およびLanger、Chem. Tech.、12巻:98〜105頁(1982年))、エチレン酢酸ビニル(Langerら、上記)またはポリ−D(−)−3−ヒドロキシ酪酸(EP133,988)が挙げられる。ある特定の実施形態では、持続放出組成物は、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームを含んでもよい。例えば、Eppsteinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82巻:3688〜3692頁(1985年);EP036,676;EP088,046およびEP143,949を参照されたい。
in vivo投与のために使用する医薬組成物は、一般には、滅菌されたものである。ある特定の実施形態では、これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって達成することができる。組成物を凍結乾燥するある特定の実施形態では、この方法を使用した滅菌を、凍結乾燥および再構成の前に行うこともその後に行うこともできる。ある特定の実施形態では、非経口投与用の組成物は、凍結乾燥した形態でまたは溶液として保管することができる。ある特定の実施形態では、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で穴をあけることができる止め栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に入れる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物を製剤化したら、それを、溶液、懸濁物、ゲル、エマルション、固体、または脱水もしくは凍結乾燥した粉末として滅菌バイアル中で保管する。ある特定の実施形態では、そのような製剤は、すぐに使える形態で保管することもでき、投与する前に再構成する形態(例えば、凍結乾燥した形態)で保管することもできる。
ある特定の実施形態では、単回用量投与単位を作製するためのキットが提供される。ある特定の実施形態では、キットは、乾燥したタンパク質を有する第1の容器と水性製剤を有する第2の容器の両方を含有してよい。ある特定の実施形態では、単一チャンバーおよび多チャンバーの充填済みシリンジ(例えば、液体シリンジ(liquid syringe)および分散シリンジ(lyosyringe))を含有するキットが含まれる。
ある特定の実施形態では、治療に使用される、PK延長IL−2を含む医薬組成物および/またはノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を含む1つもしくは複数の医薬組成物の有効量は、例えば、治療の状況および目的に左右される。したがって、ある特定の実施形態によると、処置に適した投与量レベルは、送達される分子、使用されるPK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)の適応、投与経路、ならびに患者のサイズ(体重、体表または器官のサイズ)および/または状態(年齢および全体的な健康)に一部応じて変動することが当業者には理解されよう。ある特定の実施形態では、臨床医が、最適な治療効果が得られるように投与量を用量設定(titer)し、投与経路を改変することができる。ある特定の実施形態では、PK延長IL−2およびノッチン−Fcの典型的な投与量は、それぞれ、上記の因子に応じて、約0.1μg/kgから最大約100mg/kgまたはそれ超までにわたり得る。ある特定の実施形態では、投与量は、0.1μg/kgから最大約100mg/kgまで;または1μg/kgから最大約100mg/kgまで;または5μg/kgから最大約100mg/kgまでにわたり得る。
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬の典型的な投与量は、上記の因子に応じて、約0.1mg/kgから最大約300mg/kgまたはそれ超までにわたり得る。ある特定の実施形態では、投与量は、1mg/kgから最大約300mg/kgまで;または5mg/kgから最大約300mg/kgまで;または10mg/kgから最大約300mg/kgまでにわたり得る。
ある特定の実施形態では、投薬の頻度は、使用する製剤中のPK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)の薬物動態パラメータを考慮に入れる。ある特定の実施形態では、所望の効果が達成される投与量に達するまで組成物が臨床医により投与される。ある特定の実施形態では、したがって、組成物を、単回用量として、または2回もしくはそれ超の用量として(所望の分子を同じ量で含有してもしなくてもよい)時間をわたって、または埋め込みデバイスまたはカテーテルを介した持続注入として、投与することができる。適切な投与量のさらなる精密化は当業者により常套的に行われ、当業者により常套的に実施される課題の範囲内である。ある特定の実施形態では、適切な投与量は、適切な用量反応データを使用することによって確認することができる。下の実施例に記載の通り、投薬は、毎日、隔日、または毎週行うことができ、全てに同様の抗腫瘍応答が伴う。
ある特定の実施形態では、医薬組成物の投与経路は、公知の方法に従う、例えば、経口、注射を通じた静脈内、腹腔内、脳内(実質内)、脳室内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内経路によるもの;持続放出系によるものまたは埋め込みデバイスによるものである。ある特定の実施形態では、組成物は、ボーラス注射によって、または注入によって継続的に、または埋め込みデバイスによって投与することができる。ある特定の実施形態では、併用療法の個々の要素を異なる経路によって投与することができる。
ある特定の実施形態では、組成物は、所望の分子を吸収させたまたは封入した膜、スポンジまたは別の適切な材料を埋め込むことによって局所的に投与することができる。埋め込みデバイスを使用するある特定の実施形態では、デバイスを任意の適切な組織または器官に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、適時放出(timed−release)ボーラス、または継続的な投与によるものであってよい。ある特定の実施形態では、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を含む医薬組成物をex vivo様式で使用することが望ましい場合がある。そのような例では、患者から取り出した細胞、組織および/または器官を、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を含む医薬組成物に曝露させ、その後、細胞、組織および/または器官を患者に移植し戻す。
ある特定の実施形態では、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)は、本明細書に記載のものなどの方法を使用して、ポリペプチドを発現し、分泌するように遺伝子操作されたある特定の細胞を移植することによって送達することができる。ある特定の実施形態では、そのような細胞は、動物細胞であってもヒト細胞であってもよく、また、自己由来であっても、異種のもの(heterologous)であっても異種のもの(xenogeneic)であってもよい。ある特定の実施形態では、細胞は、不死化細胞であってよい。ある特定の実施形態では、免疫学的応答の機会を減少させるために、細胞を封入して周囲の組織の浸潤を回避することができる。ある特定の実施形態では、封入材料は、一般には、タンパク質産物(複数可)の放出を可能にするが、患者の免疫系によるまたは周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊は防止する生体適合性、半透性ポリマーの囲いまたは膜である。
処置方法
本明細書に記載のPK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)、ならびに/またはそれらを発現する核酸は、異常なアポトーシスまたは分化プロセスに関連する障害(例えば、がんなどの細胞増殖性障害または細胞分化性障害)を処置するために有用である。本発明の方法による処置に適したがんの非限定的な例が下に記載されている。
細胞増殖性障害および/または分化性障害の例としては、がん(例えば、癌腫、肉腫、転移性障害または造血新生物障害、例えば、白血病)が挙げられる。転移性腫瘍は、これだけに限定されないが、前立腺、結腸、肺、乳房および肝臓のものを含めた多数の原発腫瘍型から生じ得る。したがって、例えば、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を含む本明細書で使用される組成物を、がんを有する患者に投与することができる。
本明細書で使用される場合、「がん」(または「がん性」)、「過剰増殖性」および「新生物性」という用語は、自律的成長の能力を有する(すなわち、急速に増殖する細胞成長によって特徴付けられる異常な状況または状態の)細胞を指すために使用することができる。過剰増殖および新生物の病態は、病理的である(すなわち、病態を特徴付けるまたは構成する)とカテゴリー化することができる、または非病理的である(すなわち、正常からは逸脱しているが、病態に付随するものではない)とカテゴリー化することができる。この用語は、病理組織学的な型または侵襲性の段階には関係なく、全ての型のがん性成長もしくは発がん性プロセス、転移性組織または悪性に形質転換した細胞、組織もしくは器官を含むものとする。「病理的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍成長を特徴とする病態において生じる。非病理的過剰増殖性細胞の例としては、創傷修復に付随する細胞の増殖が挙げられる。
「がん」または「新生物」という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ腺およびリンパ組織、胃腸器官、および泌尿生殖器に影響を及ぼすものを含めた種々の器官系の悪性疾患、ならびに一般に、大多数の結腸がん、腎細胞癌、前立腺がんおよび/または精巣腫瘍、非小細胞肺癌、小腸のがんおよび食道のがんなどの悪性疾患を含むとみなされる腺癌を指すために使用される。
「癌腫」という用語は、当技術分野において理解されており、呼吸器系癌、胃腸系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、およびメラノーマを含めた、上皮または内分泌組織の悪性疾患を指す。腎癌もしくはメラノーマを含めた任意の型のがん、または任意のウイルス性疾患を有する、それを有する疑いがある、またはそれが発生するリスクが高い患者を処置するために、変異体IL−2ポリペプチドを使用することができる。例示的な癌腫としては、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成されるものが挙げられる。この用語は、がん性および肉腫様組織で構成される悪性腫瘍を含む癌肉腫も包含する。「腺癌」とは、腺組織に由来する癌腫または認識できる腺構造を形成する腫瘍細胞を指す。
増殖性障害のさらなる例としては、造血新生物障害が挙げられる。本明細書で使用される場合、「造血新生物障害」という用語は、例えば、骨髄系列、リンパ系列もしくは赤血球系列から生じる造血起源の過形成性/新生物細胞、またはその前駆細胞を伴う疾患を含む。疾患は、低分化型急性白血病(例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病)から生じるものであることが好ましい。追加的な例示的な骨髄障害としては、これだけに限定されないが、急性前骨髄性白血病(acute promyeloid leukemia)(APML)、急性骨髄性白血病(AML)および慢性骨髄性白血病(CML)が挙げられる(Vaickus, L.(1991年)Crit. Rev. in Oncol./Hemotol. 11巻:267〜97頁に概説されている);リンパ系悪性疾患としては、これだけに限定されないが、B系列ALLおよびT系列ALLを含む急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病(prolymphocytic leukemia)(PLL)、ヘアリー細胞白血病(HLL)およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症(WM)が挙げられる。悪性リンパ腫の追加的な形態としては、これだけに限定されないが、非ホジキンリンパ腫およびその変形、末梢性T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、大顆粒リンパ球性白血病(LGF)、ホジキン病およびリード・シュテルンベルク病が挙げられる。
腫瘍の成長およびサイズを低下させるために十分な、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)のそれぞれの量、または治療有効量は、選択される特定の化合物または組成物に応じてだけでなく、投与経路、処置される状態の性質、ならびに患者の年齢および状態に応じても変動し、最終的には患者の医師または薬剤師の自由裁量になることが当業者には理解されよう。本方法において使用される化合物を与える時間の長さは個体ごとに変動する。
本明細書で使用されるB16メラノーマモデルは、固形腫瘍の一般化されたモデルであることが当業者には理解されよう。すなわち、このモデルにおける処置の有効性から、他の非メラノーマ性固形腫瘍における処置の有効性も予測される。例えば、Bairdら(J Immunology 2013年;190巻:469〜78頁;Epub、2012年12月7日)に記載の通り、B16F10腫瘍に対する抗腫瘍免疫の媒介における、適応免疫応答を誘導する寄生生物株であるcpsの有効性を、肺癌および卵巣がんのモデルを含めた他の固形腫瘍に一般化できることが見いだされた。別の例では、VEGF標的化リンパ球に関する一連の研究の結果からも、B16F10腫瘍における結果を、研究した他の腫瘍型に一般化できることが示された(Chinnasamyら、JCI 2010年:120巻:3953〜68頁;Chinnasamyら、Clin Cancer Res 2012年:18巻:1672〜83頁)。さらに別の例では、LAG−3およびPD−1を伴う免疫療法により、腫瘍量の減少が導かれ、結果は線維肉腫および結腸腺癌細胞株に一般化できる(Wooら、Cancer Res 2012年:72巻:917〜27頁)。
ある特定の実施形態では、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を使用してがんを処置する。
ある特定の実施形態では、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を使用して、メラノーマ、白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸がん、腎癌、および脳がんを処置する。
ある特定の実施形態では、PK延長IL−2、ノッチン−Fcおよび場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)により、腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害する。
ある特定の実施形態では、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)により、腫瘍サイズを縮小させる。
ある特定の実施形態では、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)により、原発腫瘍の転移を阻害する。
ある特定の実施形態では、IL−2を伴ってまたは伴わずに、ノッチン−Fcおよび免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)により、腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害する。ある特定の実施形態では、IL−2を伴ってまたは伴わずに、ノッチン−Fcおよび免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)により、腫瘍サイズを縮小させる。ある特定の実施形態では、IL−2を伴ってまたは伴わずに、ノッチン−Fcおよび免疫チェックポイント遮断薬により、原発腫瘍の転移を阻害する。
本明細書における処置への言及は、予防法ならびに示されたがんおよび症状の処置に拡大することが当業者には理解されよう。
キット
キットは、本明細書に開示されているPK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)、ならびに使用説明書を含んでよい。キットは、適切な容器中に、PK延長IL−2、インテグリン結合性ノッチン−Fc、場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)、1つまたは複数の対照、ならびに種々の緩衝液、試薬、酵素および当技術分野で周知の他の標準の成分を含んでよい。ある特定の実施形態では、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を同じバイアル中に伴うキットが含まれる。ある特定の実施形態では、キットは、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を別々のバイアル中に含む。
容器は、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)を入れること、およびいくつかの場合には、適切に分注することができる、少なくとも1つのバイアル、ウェル、試験管、フラスコ、ビン、シリンジ、または他の容器手段を含んでよい。追加的な構成成分が提供される場合、キットは、この構成成分を入れることができる追加的な容器を含有してよい。キットは、PK延長IL−2、ノッチン−Fc、および場合によって免疫チェックポイント遮断薬(またはVEGFのアンタゴニスト)ならびに任意の他の試薬容器を商業販売のために密封して含めるための手段も含んでよい。そのような容器は、所望のバイアルが保持された射出成形または吹込み成形されたプラスチック容器を含んでよい。容器および/またはキットは、使用説明書および/または警告を伴うラベルを含んでよい。
以下の実施例によって本開示をさらに例示するが、これは、さらに限定するものと解釈されるべきではない。全ての図ならびに本出願全体を通して引用されている全ての参考文献、Genbank配列、特許および公開特許出願の内容は、明白に参照により本明細書に組み込まれる。特に、PCT公開WO13/177187、米国特許第8,536,301号、および米国特許出願公開第2014/0073518号の開示は、明白に参照により本明細書に組み込まれる。
以下は、本明細書に記載の方法を実行するための特定の実施形態の例である。実施例は、単に例示的な目的で提供されており、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものではない。使用される数字(例えば、量、温度など)に関しては正確さを確実にするための試みが行われているが、いくらかの実験誤差および偏差は当然許容されるべきである。本発明の実施では、別段の指定のない限り、当技術分野の技術の範囲内に入るタンパク質化学、生化学、組換えDNA技法および薬理学の従来の方法を使用する。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、T.E. Creighton、Proteins: Structures and Molecular Properties(W.H. Freeman and Company、1993年);A.L. Lehninger、Biochemistry(Worth Publishers, Inc.、最新版);Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第2版、1989年);Methods In Enzymology(S. ColowickおよびN. Kaplan編、Academic Press, Inc);Remington’s Pharmaceutical Sciences、第18版(Easton、Pennsylvania:Mack Publishing Company、1990年);CareyおよびSundberg、 Advanced Organic Chemistry、第3版(Plenum Press)A巻およびB巻(1992年)を参照されたい。
さらに、下記の実施例ではマウス起源のPK延長IL−2(すなわち、PK延長基(マウス血清アルブミン)とIL−2の両方がマウス起源のものである)、およびインテグリン結合性ノッチンと融合したマウスFcを使用しているが、対応するヒトPK延長IL−2(すなわち、ヒト血清アルブミン(HSA)およびヒトIL−2、ならびにその改変体)、およびインテグリン結合性ヒト−Fc(すなわち、ノッチンと融合したヒトIgG1由来のFc)を当業者が上記の方法を使用して容易に生成できること、および本明細書に開示されている方法において使用できることが理解されるべきである。
(実施例1)
B16F10腫瘍においてノッチン−Fc処置はTA99処置と同様に有効である
一般的な腫瘍関連抗原の欠如に取り組むために、ノッチン−Fcタンパク質を工学的に操作した。ノッチン−Fcタンパク質は、1)腫瘍関連αvβ3、αvβ5、およびα5β1インテグリン受容体に高い親和性で結合する、工学的に操作されたシスチンノット(ノッチン)ペプチド(具体的には2.5F、配列番号94または96)、および2)in vivoにおける免疫エフェクター機能を媒介する抗体Fcドメインの2つの部分を含む。使用するノッチン−Fcは、別段の指定のない限り、K15S置換を伴う、マウスIgG2a Fcドメインと融合した2.5F、配列番号45である。
腫瘍の成長に対するノッチン−Fcの効果を決定するために、B16F10マウスメラノーマ細胞2.5×10個をC57BL/6マウスの側腹部に皮下注射した。80μgのノッチン−Fc、80μgのノッチン−D265A(マウスIgG2a FcドメインにおけるD265A変異は、FcγRおよび補体への結合を排除する)、または200μgのTA99を、腫瘍接種日に開始して2日毎に、合計で10回の処置で腹腔内投与する予防的処置を行った。TA99は、TYRP−1(メラノーマ細胞で見いだされる抗原)に結合し、メラノーマ腫瘍の成長を阻害する抗体である。
腫瘍面積を測定し、プロットした(図2)。カリパスを使用して腫瘍面積を測定した。まず任意の方向で腫瘍の最長寸法を測定し、その後、最長の垂直寸法を測定した。次いで、2つの値を掛け算して腫瘍面積を平方ミリメートル単位で定量化した。
TA99処置およびノッチン−Fc処置のいずれによっても、腫瘍の成長が同程度に制御された。ノッチン−D265Aでは腫瘍の成長を妨げることができなかったことにより、ノッチン−Fcによる腫瘍制御がFcのエフェクター機能によって媒介されることが示される。
(実施例2)
ノッチン−FcおよびPK延長IL−2により、B16F10腫瘍の腫瘍成長が相乗的に制御される
ノッチン−Fc処置にMSA/IL−2を加えることの効果を調査するために、治療研究を行った。C57BL/6マウスの皮下にB16F10マウスメラノーマ細胞1×10個を注射することによって腫瘍を樹立した。30μgのMSA/IL−2および/または500μgのノッチン−Fcを、腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で腹腔内投与した。
腫瘍面積を測定し、プロットした(図3A)。MSA/IL−2単独およびノッチン−Fc単独では腫瘍の成長に対する効果がなかったが、MSA/IL−2とノッチン−Fcの組み合わせでは、腫瘍の成長が有効に制御された。カプラン・マイヤー生存プロットにより、MSA/IL−2とノッチン−Fcの組み合わせにより、これらのマウスの生存が延長されるが、単独療法には有意な効果がないことが明らかになった(図3B)。
(実施例3)
ノッチン−FcおよびPK延長IL−2により、MC38腫瘍の腫瘍成長が相乗的に制御される
標的にできる抗原が報告されていない腫瘍型におけるノッチン−Fcの有効性に対するMSA/IL−2の効果を調査するために、別の治療研究を行った。MC38マウス結腸癌細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA−IL−2および/または500μgのノッチン−Fcを、腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で腹腔内投与した。
腫瘍の成長は、MSA/IL−2とノッチン−Fcの組み合わせを用いると制御されたが、各構成成分を単独療法として投与した場合には制御されなかった(図4A)。カプラン・マイヤー生存プロットにより、MSA/IL−2とノッチン−Fcの組み合わせを用いて処置したマウスにおいて、各構成成分を単独療法として投与した場合と比較して生存が増加したことが示される(図4B)。
(実施例4)
ノッチン−FcおよびPK延長IL−2により、Ag104A腫瘍の腫瘍成長が相乗的に制御される
異なる腫瘍型におけるノッチン−Fcの有効性に対するMSA/IL−2の効果を調査するために、追加の研究を行った。C3H/HeNマウスの側腹部にAg104A細胞1.0×10個を注射することによってAg104A線維肉腫腫瘍を樹立した。30μgのMSA/IL−2および/または500μgのノッチン−Fcを腫瘍接種の6日後から開始して、その後6日毎に腹腔内投与した。
腫瘍の成長は、MSA/IL−2とノッチン−Fcの組み合わせを用いると制御されたが、各構成成分を単独療法として投与した場合には制御されなかった(図5A)。カプラン・マイヤー生存プロットにより、MSA/IL−2とノッチン−Fcの組み合わせを用いて処置したマウスにおいて、各構成成分を単独で投与した場合と比較して生存が増加することが示された(図5B)。
(実施例5)
相乗的な腫瘍制御にはエフェクター機能が必要である
実施例1の結果は、ノッチン−Fcによる腫瘍制御にはエフェクター機能が必要であることを示すものである。MSA/IL−2を用いた相乗的処置による腫瘍制御におけるエフェクター機能の役割を決定するために、B16F10細胞とMC38細胞の両方を使用してさらなる研究を行った。1×10個のB16F10細胞(図6Aおよび6B)またはMC38細胞(図7Aおよび7B)をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA−IL−2を、腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で腹腔内投与した。500μgのノッチン−Fcまたはノッチン−D265AFc(マウスIgG2a FcドメインにおけるD265A変異は、FcγRおよび補体への結合を排除する)を、腫瘍接種の6日後、およびその後6日毎に、合計4回の処置で腹腔内投与した。
個々の腫瘍サイズ測定値(図6Aおよび7A)および生存プロット(図6Bおよび7B)から、ノッチン−Fcによる腫瘍制御にはFcのエフェクター機能が必要であることが示される。
(実施例6)
治療用抗体および免疫チェックポイント遮断薬により、B16F10腫瘍におけるノッチン−FcおよびPK延長IL−2の有効性が増強される
ノッチン−FcおよびPK延長IL−2による相乗的な腫瘍制御に対する抗体の影響を決定するために、B16F10細胞を使用して追加の研究を行った。B16F10細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2を腫瘍接種の6日後に開始して6日毎に、合計5回の処置で投与し、200μgのノッチン−Fcを腫瘍接種の6日後から30日後まで毎日投与した。TYRP−1に対する抗体(TA99)をマウス当たり100μgでB16F10腫瘍接種の6日後に開始して6日毎に投与した。PD−1に対する抗体を、マウス当たり200μgで、腫瘍接種の6日後に開始して6日毎に投与した。
個々の腫瘍サイズ測定値(図8A)および生存プロット(図8B)から、抗体により、ノッチン−FcおよびMSA/IL−2を介する腫瘍制御が増強されたことが示された。しかし、これは、抗体が腫瘍細胞上に存在する抗原を標的化する場合にのみ有効である。ノッチン−FcおよびMSA/IL−2を治療用抗体または免疫チェックポイント遮断薬と組み合わせることにより、腫瘍制御および生存改善の有効性が増大した。
(実施例7)
免疫チェックポイント遮断薬により、MC38腫瘍におけるノッチン−FcおよびPK延長IL−2の有効性が増強される
ノッチン−FcおよびPK延長IL−2による相乗的な腫瘍制御に対する抗体の影響を決定するために、MC38細胞を使用して追加の研究を行った。MC38細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2および500μgのノッチン−Fcを、腫瘍接種の6日後に開始して6日毎に、合計4回の処置で投与した。PD−1に対する抗体を、マウス当たり200μgで、腫瘍接種の6日後に開始して6日毎に投与した。
個々の腫瘍サイズ測定値(図9A)および生存プロット(図9B)から、抗体によりノッチン−FcおよびMSA/IL−2を介する腫瘍制御が増強されたことが示される。しかし、これは、抗体が腫瘍細胞上に存在する抗原を標的化する場合にのみ有効である。最も有効な処置は、ノッチン−FcおよびMSA/IL−2と免疫チェックポイント遮断(抗PD−1)抗体を組み合わせることであった。
(実施例8)
ノッチン−Fcは、隔日または毎週投与した場合に有効である
抗腫瘍応答の最小の投薬要件を決定するために、B16F10メラノーマおよびMC38結腸癌腫瘍モデルを使用し、ノッチン−Fcを、毎日、隔日、または毎週投与した。B16F10細胞1×10個(図10)またはMC38細胞1×10個(図11)をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2を、腫瘍接種の6日後、12日後、18日後、および24日後に投与した。200μgのノッチン−Fcを、6日目に開始し、28日目に終了して、毎日または隔日で投与した。500μgのノッチン−Fcを、毎週レジメンで6日目、12日目、18日目、および24日目に投与した。どちらのモデルにおいても、MSA/IL−2と合わせてノッチン−Fcを隔日でまたは6日毎に投与することは、毎日投与することと同等であった。
(実施例9)
ノッチン−FcおよびFc−ノッチン構築物により腫瘍成長が制御される
抗腫瘍応答のために最適な、ノッチンと融合するFcの配置を決定するために、FcをN末端(ノッチン−Fc)またはC末端(Fc−ノッチン)に融合した。B16F10メラノーマ細胞2.5×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。80μgのノッチン−Fc、80μgのFc−ノッチン、または200μgのIgG−ノッチンを、腫瘍接種の直後、およびその後2日毎に、合計10回の処置で投与した。腫瘍面積を測定した(図12)。異なるノッチン−Fc融合タンパク質の間で有効性の差異は基本的になかった。
この所見を検証するために、別のマウス腫瘍モデルを利用した。MC38結腸癌細胞1×10個をアルビノC57BL/6マウスの側腹部に注射した。200μgのノッチン−FcまたはFc−ノッチンを、腫瘍接種の直後、およびその後2日毎に、合計10回の処置で投与した。腫瘍面積を測定した(図13)。ノッチン−FcとFc−ノッチンの間で有効性の差異は基本的になかった。これらのマウス腫瘍モデルからの結果のいずれによっても、ノッチン−Fc融合タンパク質におけるFcの配置は、抗腫瘍応答の有効性に影響を及ぼさないことが示される。
最適なインテグリン結合性ノッチン−Fc構築物を決定するために、ノッチンとFcドメインの間に(Gly4Ser)3リンカーを含有する融合タンパク質を作出した。リンカーを含有しないインテグリン結合性ノッチン−Fcと比較して、U87MG神経膠芽腫細胞に対するインテグリン結合親和性に差異は観察されなかった(データは示していない)。
(実施例10)
ノッチン−FcとIL−2の組み合わせにより、二次腫瘍攻撃から保護される
ノッチン−FcとMSA/IL−2の組み合わせにより、処置したマウスが二次攻撃から保護されるかどうかを決定するために、MC38腫瘍モデルを使用した。MC38細胞1×10個をC57BL/6マウスの側腹部に注射し、30μgのMSA/IL−2と500μgのノッチン−Fcの両方を、腫瘍接種の6日後に開始して6日毎に、合計4回の処置で投与した。以前に治癒したマウスまたは年齢を釣り合わせたナイーブなマウスに、最初の腫瘍接種の16〜20週間後に、逆側の側腹部にMC38細胞1×10個を接種した。さらなる処置は行わなかった。
個々の腫瘍サイズ測定値(図14A)および生存プロット(図14B)から、ノッチン−FcおよびMSA/IL−2により、以前に処置したマウスが二次腫瘍攻撃から保護されることが示され、これにより、腫瘍に対する強力かつ持続的な免疫応答が実証される。
(実施例11)
3種のインテグリンの全てを標的化するノッチン−Fcにより、腫瘍の成長が最も有効に制御される
腫瘍の成長の制御における、3種のインテグリンの全てを標的化するノッチン−Fc(すなわち、αvβ3、αvβ5、およびα5β1、「2.5F_ノッチン−Fc」配列番号45)の有効性を、2種のインテグリンのみを標的化するノッチン−Fc(すなわち、αvβ3およびαvβ5、「2.5D_ノッチン−Fc」配列番号47)と比較して評価するために、3種の異なる腫瘍モデル(すなわち、B16F10、MC38、およびAg104A)を使用して実験を行った。1×10個のB16F10細胞(図15Aおよび15B)またはMC38細胞(図16Aおよび16B)をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。Ag104A細胞1.0×10個(図17Aおよび17B)をC3H/HeNマウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2、500μgの2.5F_ノッチン−Fcおよび/または2.5D_ノッチン−Fcを腫瘍接種の6日後に開始して6日毎に、合計4回の処置で投与した。
個々の腫瘍サイズ測定値(図15A、16Aおよび17A)および生存プロット(図15B、16Bおよび17B)から、3種のインテグリンの全てを標的化するノッチン−Fcは、2種のインテグリンのみを標的化するノッチン−Fcよりも有効に腫瘍の成長を制御することが示される。
(実施例12)
腫瘍を担持するマウスにおける、生存に重要な免疫細胞集団
ノッチン−FcおよびMSA/IL−2を用いて処置したMC38腫瘍を有するマウスの生存の改善における種々の免疫細胞集団の役割を評価するために、枯渇実験を行った。400μgの抗CD8、抗CD4、抗NK1.1、抗Ly6Gまたは抗CD19抗体を、腫瘍接種の4日後に開始して4日毎に、合計6回の処置で投与した。300μgの抗CSF−1R抗体を、腫瘍接種の4日目に開始して2日毎に、合計11回の処置で投与した。30μgのコブラ毒因子(CVF)を、腫瘍接種の5日後に開始して6日毎に、合計4回の処置で投与した。抗CD8はCD8+T細胞を枯渇させるものであり、抗CD4はCD4+T細胞を枯渇させるものであり、抗NK1.1はナチュラルキラー細胞を枯渇させるものであり、抗Ly6Gは好中球を枯渇させるものであり、抗CD19はB細胞を枯渇させるものであり、抗CSF−1Rは組織常在性/腫瘍常在性マクロファージを枯渇させるものである。CVFは補体活性を阻害するものである。
個々の腫瘍サイズ測定値(図18A)および生存プロット(図18B)から、腫瘍制御に対するノッチン−FcとMSA/IL−2の相乗効果には、CD8+T細胞およびマクロファージが特に重要であることが示される。
免疫細胞枯渇に加えて、Batf3−/−マウスを使用して、交差提示性CD8+樹状細胞の役割を評価した。Batf3−/−マウスは、基本的なロイシンジッパー転写因子であるATF様3の機能を欠く。Batf3の欠失により、MHCクラスI上の外因性抗原の交差提示に重要であるCD8+樹状細胞の発生が妨げられることが示されている。
処置したC57BL/6マウス(すなわち、「対照」)およびBatf3−/−マウスの腫瘍面積を測定し、プロットし(図19A)、MSA/IL−2およびノッチン−Fcを用いて処置したBatf3−/−マウスにおける腫瘍制御が低いことが実証された。カプラン・マイヤー生存プロットも作成し、それにより、ノッチン−FcおよびMSA/IL−2を用いて処置したBatf3−/−マウスの生存がC57BL/6マウスと比較して有意に減少することが明らかになった(図19B)。これにより、樹状細胞による交差提示が、MC38腫瘍の成長を制御することに対する併用療法の有効性に寄与する因子であり得ることが示された。
ノッチン−FcとMSA−IL−2の組み合わせの有効性にはCD8+T細胞が重大であることが見いだされ、また、MSA−IL−2と治療用抗体の組み合わせの有効性にはIFNγが重要であることが以前報告されているので(Zhuら、Cancer Cell(2015年)27巻:489〜501頁)、IFNγの役割をMC38腫瘍モデルにおいて調査した。1×10個のMC38をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2および500μgのノッチン−Fcを腫瘍接種の6日後に開始して6日毎に、合計4回の処置で投与した。200μgの抗INFγ抗体を、腫瘍接種の5日後に開始して2日毎に、合計11回の処置で投与した。
図20Aおよび20Bに示されている通り、IFNγ枯渇は、MC38腫瘍を有するマウスの腫瘍制御または生存に有意な影響を及ぼさなかった。
(実施例13)
免疫抑制との拮抗により腫瘍を担持するマウスの生存が改善される
免疫系のサプレッサーを阻害することによって腫瘍制御の有効性を増強できるかどうかを決定するために、血管内皮増殖因子(VEGF)のアンタゴニストまたは細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA−4)のアンタゴニストを、MC38またはB16F10腫瘍を有するマウスに投与した。1×10個のMC38細胞(図21A、21Bおよび22)またはB16F10(図23Aおよび23B)をC57BL/6マウスの側腹部に注射した。30μgのMSA/IL−2、500μgのノッチン−Fc、および200μgの抗VEGF抗体または抗CTLA−4抗体を腫瘍接種の6日後に開始して6日毎に、合計4回の処置で投与した。
抗VEGF抗体(クローンB20−4.1.1)(Bagriら、Clin. Cancer Res.(2010年)16巻:3887〜900頁)および抗CTLA−4抗体(9D9)(Selbyら、Cancer Immunol. Res.(2013年)1巻:32〜42頁)の重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)をコードする合成遺伝子を、哺乳動物細胞(GeneArt、Life Technologies)における発現についてコドン最適化した。B20−4.1.1抗体構築物は、VH領域およびVL領域をコードするDNA挿入断片をPCR増幅し、CMVプロモーター、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、ならびにマウスIgG2a重鎖定常領域(CH1、CH2およびCH3)または軽鎖定常領域(CL)(以下のB20−4.1.1についての配列1および2を参照されたい)のいずれかをコードするDNA配列を含有する別々のgWiz発現ベクター(Genlantis)にGibson assemblyによってクローニングすることによって生成した。9D9抗体構築物を、VH領域およびVL領域をコードするDNA挿入断片をPCR増幅し、CMVプロモーター、アンピシリン抗生物質耐性遺伝子、およびマウスIgG2a重鎖定常領域(CH1、CH2およびCH3)または軽鎖定常領域(CL)の両方を含有する2重カセットp2MPT発現ベクター(EPFL Protein expression core facility、http://pecf.epfl.ch)に、それぞれ、制限部位NotI/BamHIおよびEcoRI/XbaIを介してサブクローニングすることによって生成した。全ての構築物をDNA配列決定(Macrogen)によって検証した。
抗VEGF抗体B20−4.1.1は、以前に記載されている通り、一過性にトランスフェクトしたヒト胎児腎臓(HEK293−F)細胞において、Free−Style 293 Expression System(Life Technologies)を使用して発現させたものであった(Zhuら、Cancer Cell(2015年)27巻:489〜501頁)。抗体9D9は、一過性にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において発現させたものであり、EPFL Protein expression core facility(http://pecf.epfl.ch)により提供された。発現の7日後に、細胞を、遠心分離することによって取り出し(4℃、15,000×gで30分)、濾過(0.22μmのPES膜フィルター)し、上清中のタンパク質を、プロテインAクロマトグラフィーによって製造者(GE Healthcare)の説明書に従って精製した。溶出した抗体をさらに脱塩し、AKTApurifier systemに接続し、緩衝液1×PBS、pH7.4を用いて平衡化したHiLoad Superdex 200 10/600サイズ排除カラム(GE Healthcare)で精製した。精製された抗体を30000 NMWL Amicon Ultra centrifugal filterデバイス(Millipore)を4℃、4000gで使用して濃縮し、NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific)を使用して280nmにおける吸光度を測定することによって定量化した。分子量を還元および非還元SDS/PAGEによって確認した。純度をFPLCによって評価した。タンパク質試料を、MOPS緩衝液中NuPAGE 4−12% Bis−Tris Gel(Life Technologies)を使用した変性および還元条件下でのSDS−PAGE、その後のクーマシー染色によって分析した。濃縮後の抗体のネイティブなサイズおよびオリゴマー形成状況も、AKTApurifier systemに接続し、緩衝液1×PBS、pH7.4を用いて平衡化したSuperdex 200 10/300 GL カラム(GE Healthcare)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。
腫瘍面積を測定し、プロットし(図21A、22および23A)、生存プロットを作成した(図21Bおよび23B)。三重の組み合わせ(すなわち、MSA/IL−2+ノッチン−Fc+抗VEGFおよびMSA/IL−2+ノッチン−Fc+抗CTLA−4)は、2重の組み合わせ(すなわち、MSA/IL−2+抗VEGFおよびノッチン−Fc+抗VEGFまたはMSA/IL−2+抗CTLA−4およびノッチン−Fc+抗CTLA−4)と比較して、腫瘍の成長を有意に制御し、生存を改善した。これは、抗PD−1抗体をMSA/IL−2とノッチン−Fcの組み合わせに加えた場合に観察された結果と同様であり、これにより、MSA/IL−2+ノッチン−Fcの組み合わせの有効性を改善するために免疫系の他のサプレッサーを阻害することができることが示された。抗VEGF抗体を加えることによる治療有効性の改善は、RENCA(腎腺癌)およびLLC(Lewis肺癌)腫瘍モデルにおいても観察された(データは示していない)。
均等物
当業者は、常套的な実験だけを使用して、本明細書に記載されている本明細書に記載の特定の実施形態の多くの均等物を理解するまたは確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。

Claims (23)

  1. 被験体における腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害するための、有効量のインテグリン結合性Fc融合タンパク質を含む組成物であって、前記被験体に免疫チェックポイント遮断薬がさらに投与されることを特徴とし、前記免疫チェックポイント遮断薬は、PD−1を標的化する抗体またはその抗原結合断片、PD−L1を標的化する抗体またはその抗原結合断片、ならびにCTLA4を標的化する抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択され、前記インテグリン結合性Fc融合タンパク質は、(i)インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに(ii)免疫グロブリンFcドメインを含み、前記インテグリン結合性ポリペプチドが前記Fcドメインと作動可能に連結しており、前記インテグリン結合性ループは、RGDペプチド配列を含む、組成物。
  2. 被験体における腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害するための、有効量の免疫チェックポイント遮断薬を含む組成物であって、前記免疫チェックポイント遮断薬は、PD−1を標的化する抗体またはその抗原結合断片、PD−L1を標的化する抗体またはその抗原結合断片、ならびにCTLA4を標的化する抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択され、前記被験体にインテグリン結合性Fc融合タンパク質がさらに投与されることを特徴とし、前記インテグリン結合性Fc融合タンパク質は、(i)インテグリン結合性ループおよびノッチンポリペプチド足場を含むインテグリン結合性ポリペプチドならびに(ii)免疫グロブリンFcドメインを含み、前記インテグリン結合性ポリペプチドが前記Fcドメインと作動可能に連結しており、前記インテグリン結合性ループは、RGDペプチド配列を含む、組成物。
  3. 前記インテグリン結合性ポリペプチドが、αβ、αβ、およびαβからなる群より選択される腫瘍関連インテグリンまたはその組み合わせに結合する、請求項1または請求項2に記載の組成物。
  4. 前記インテグリン結合性ポリペプチドが、αβ、αβ、およびαβに結合する、請求項1または請求項2に記載の組成物。
  5. 前記ノッチンポリペプチド足場が、少なくとも3つのシステインジスルフィド結合または架橋結合したシステイン残基を含み、前記インテグリン結合性ループが、前記ノッチンポリペプチド足場のシステイン残基に近接している、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
  6. 前記ノッチンポリペプチド足場が、EETI−II、AgRP、およびアガトキシンからなる群より選択されるノッチンタンパク質に由来する、請求項1〜のいずれか1項に記載の組成物。
  7. 前記ノッチンタンパク質が、EETI−IIである、請求項に記載の組成物。
  8. 前記インテグリン結合性ループが、ネイティブなEETI−II配列内の第1のシステインの後に挿入されている、請求項に記載の組成物。
  9. 前記インテグリン結合性ポリペプチドが、配列番号42(GCX RGDX 10 11 CKQDSDCLAGCVCGPNGFCG)または配列番号43(GCX RGDX 10 11 CSQDSDCLAGCVCGPNGFCG)に記載されているアミノ酸配列を含み、ここでXが、A、V、L、P、F、Y、S、H、D、およびNからなる群より選択され;Xが、G、V、L、P、R、E、およびQからなる群より選択され;Xが、G、A、およびPからなる群より選択され;Xが、WおよびNからなる群より選択され;Xが、A、P、およびSからなる群より選択され;Xが、PおよびRからなる群より選択され;X10が、A、V、L、P、S、T、およびEからなる群より選択され;X11が、G、A、W、S、T、K、およびEからなる群より選択される、請求項1または請求項2に記載の組成物。
  10. 前記インテグリン結合性ポリペプチドが、配列番号67〜133からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項2に記載の組成物。
  11. 前記インテグリン結合性ポリペプチドが、配列番号94または96のアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項2に記載の組成物。
  12. 前記FcドメインがヒトIgG1 Fcドメインである、請求項1〜1のいずれか1項に記載の組成物。
  13. 前記インテグリン結合性ポリペプチドが、リンカーを伴ってまたは伴わずに、前記Fcドメインと作動可能に連結している、請求項1〜1のいずれか1項に記載の組成物。
  14. 前記インテグリン結合性ポリペプチドが、前記FcドメインのN末端と作動可能に連結している、請求項1〜1のいずれか1項に記載の組成物。
  15. 前記インテグリン結合性ポリペプチドが、前記FcドメインのC末端と作動可能に連結している、請求項1〜1のいずれか1項に記載の組成物。
  16. 前記インテグリン結合性Fc融合タンパク質が、配列番号48、49、50、または51のアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項2に記載の組成物。
  17. 前記免疫チェックポイント遮断薬が、PD−1を標的化する抗体またはその抗原結合断片である、請求項1〜1のいずれか1項に記載の組成物。
  18. 前記免疫チェックポイント遮断薬が、CTLA4を標的化する抗体またはその抗原結合断片である、請求項1〜1のいずれか1項に記載の組成物。
  19. 前記免疫チェックポイント遮断薬が、PD−L1を標的化する抗体またはその抗原結合断片である、請求項1〜1のいずれか1項に記載の組成物。
  20. 前記被験体にVEGFのアンタゴニストがさらに投与されることを特徴とする、請求項1〜19のいずれか1項に記載の組成物。
  21. 前記VEGFのアンタゴニストが、VEGFに結合する抗体もしくはその抗原結合断片、VEGF受容体に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、VEGF受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤、ドミナントネガティブVEGF、またはVEGF受容体である、請求項2に記載の組成物。
  22. 前記被験体に薬物動態延長インターロイキン(IL)−2がさらに投与されることを特徴とする、請求項1〜2のいずれか1項に記載の組成物。
  23. 前記がんが、メラノーマ、白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸がん、腎細胞癌、膵がん、子宮頸がん、および脳がんからなる群より選択される、請求項1〜2のいずれか1項に記載の組成物。
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Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008045252A2 (en) * 2006-10-04 2008-04-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Engineered integrin binding peptides
US9844582B2 (en) 2012-05-22 2017-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with extended-PK IL-2 and therapeutic agents
KR102208505B1 (ko) 2012-12-11 2021-01-27 앨버트 아인슈타인 컬리지 오브 메디신 고처리량 수용체:리간드 확인을 위한 방법
WO2017139570A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 Massachusetts Intitute Of Technology Synergistic tumor treatment with il-2, an integrin-binding-fc fusion protein, and a cancer vaccinne
EP3213768A1 (en) 2016-03-01 2017-09-06 LODOCO CLINICAL Kft Combination of low dose immune checkpoint blockade with high dose il-2 for treating metastatic cancer
WO2017201210A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
US11339201B2 (en) 2016-05-18 2022-05-24 Albert Einstein College Of Medicine Variant PD-L1 polypeptides, T-cell modulatory multimeric polypeptides, and methods of use thereof
US10690573B2 (en) * 2016-05-25 2020-06-23 Cytoskeleton, Inc. Methods of reducing viscosity of biological samples
AU2017379900A1 (en) 2016-12-22 2019-06-13 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
EP3565829A4 (en) 2017-01-09 2021-01-27 Cue Biopharma, Inc. MULTIMER POLYPEPTIDES T-LYMPHOCYTE MODULATORS AND THEIR METHODS OF USE
EP3568150A4 (en) * 2017-01-10 2020-12-02 Xcella Biosciences, Inc. POLYTHERAPY FOR TUMOR TREATMENT WITH INTEGRIN-BOUND FC FUSION PROTEIN AND IMMUNE MODULATOR
US10350266B2 (en) 2017-01-10 2019-07-16 Nodus Therapeutics, Inc. Method of treating cancer with a multiple integrin binding Fc fusion protein
EP3596108A4 (en) 2017-03-15 2020-12-23 Pandion Operations, Inc. TARGETED IMMUNOTOLERANCE
EP3596118B1 (en) 2017-03-15 2024-08-21 Cue Biopharma, Inc. Combination of multimeric fusion polypeptides and immune checkpoint inhibitor for treating hpv-associated cancer
AU2018274216A1 (en) 2017-05-24 2019-12-12 Novartis Ag Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use in the treatment of cancer
BR112019024127A2 (pt) 2017-05-24 2020-06-23 Pandion Therapeutics, Inc. Imunotolerância alvejada
EP3630162A1 (en) * 2017-05-24 2020-04-08 Novartis AG Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use
US10174092B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
WO2019139896A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Cue Biopharma, Inc. Multimeric t-cell modulatory polypeptides and methods of use thereof
US20210113606A1 (en) * 2018-02-12 2021-04-22 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Treatment using cytokine encoding rna
CA3102036A1 (en) * 2018-06-18 2019-12-26 Anwita Biosciences, Inc. Cytokine fusion proteins and uses thereof
GB201810329D0 (en) * 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to integrin avB3
US11235032B2 (en) 2019-01-23 2022-02-01 Massachusetts Institute Of Technology Combination immunotherapy dosing regimen for immune checkpoint blockade
US20220119891A1 (en) 2019-02-06 2022-04-21 Cornell University Darc expression as prognosticator of immunotherapy outcomes
AU2020235864A1 (en) * 2019-03-08 2021-09-30 Lisata Therapeutics, Inc. Low-dose cytokine co-administered with iRGD for treating cancer
EP3972992A4 (en) 2019-05-20 2023-07-19 Pandion Operations, Inc. ANTI-MADCAM IMMUNE TOLERANCE
CN114786701A (zh) * 2019-11-27 2022-07-22 Gi 医诺微新 用于治疗癌症的包括包含il-2蛋白和cd80蛋白的融合蛋白和免疫检查点抑制剂的药物组合物
CA3162406A1 (en) 2020-01-10 2021-07-15 Vijaya Raghavan PATTABIRAMAN Modified il-2 polypeptides and uses thereof
US11981715B2 (en) 2020-02-21 2024-05-14 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a CD39 effector
IL296209A (en) 2020-05-12 2022-11-01 Cue Biopharma Inc Multimeric t-cell modulatory polypeptides and methods of using them
JP2023541366A (ja) 2020-09-09 2023-10-02 キュー バイオファーマ, インコーポレイテッド 1型真性糖尿病(t1d)を治療するためのmhcクラスii t細胞調節多量体ポリペプチド及びその使用方法

Family Cites Families (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4615885A (en) 1983-11-01 1986-10-07 Terumo Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing urokinase
US5128319A (en) 1987-08-28 1992-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Prophylaxis and therapy of acquired immunodeficiency syndrome
US5766897A (en) 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US20030206899A1 (en) 1991-03-29 2003-11-06 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
DE69332377T2 (de) 1992-07-13 2003-07-03 Bionebraska, Inc. Verfahren zur modifizierung rekombinanter polypeptide
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
DE69233803D1 (de) 1992-10-28 2011-03-31 Genentech Inc Verwendung von vaskulären Endothelwachstumsfaktor-Antagonisten
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
IL117645A (en) 1995-03-30 2005-08-31 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
DK1695985T3 (da) 1997-04-07 2011-06-14 Genentech Inc Fremgangsmåde til dannelse af humaniserede antistoffer ved tilfældig mutagenese
DK0973804T3 (da) 1997-04-07 2007-05-07 Genentech Inc Anti-VEGF-antistoffer
US6703030B2 (en) 1998-06-16 2004-03-09 Marvin E. Klein Amino fruit acid composition and method for the treatment of skin
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
EP3214175A1 (en) 1999-08-24 2017-09-06 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human ctla-4 antibodies and their uses
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
US20050287153A1 (en) 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
JP2003520828A (ja) 2000-01-27 2003-07-08 ジェネティクス インスティテュート,エルエルシー Ctla4(cd152)に対する抗体、これを含む結合体、およびその使用
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
NZ545176A (en) 2001-01-29 2008-05-30 Biogen Idec Inc Modified antibodies reactive with CD20 and methods of use
US7176278B2 (en) 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
ES2466716T3 (es) 2002-11-08 2014-06-11 Ablynx N.V. Anticuerpos de un solo dominio estabilizados
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
MXPA05012723A (es) 2003-05-30 2006-02-08 Genentech Inc Tratamiento con anticuerpos anti-vgf.
US7569215B2 (en) 2003-07-18 2009-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
WO2005018572A2 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
WO2005063815A2 (en) 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
AU2004296376B2 (en) 2003-12-05 2010-03-04 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
US20050251617A1 (en) 2004-05-07 2005-11-10 Sinclair Alan W Hybrid non-volatile memory system
SI1729795T1 (sl) 2004-02-09 2016-04-29 Human Genome Sciences, Inc. Albuminski fuzijski proteini
US20060009360A1 (en) 2004-06-25 2006-01-12 Robert Pifer New adjuvant composition
NZ563193A (en) 2005-05-09 2010-05-28 Ono Pharmaceutical Co Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
EP1888649A2 (en) 2005-05-09 2008-02-20 GlycArt Biotechnology AG Antigen binding molecules having modified fc regions and altered binding to fc receptors
PT2397156T (pt) * 2005-06-08 2016-12-23 The President And Fellows Of Harvard College Métodos e composições para tratamento de infeções persistentes e cancro através da inibição da via de morte celular programada 1 (pd-1)
DK1907424T3 (en) 2005-07-01 2015-11-09 Squibb & Sons Llc HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO PROGRAMMED death ligand 1 (PD-L1)
US20070269422A1 (en) 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
WO2008012629A2 (en) 2006-07-24 2008-01-31 Biorexis Pharmaceutical Corporation Exendin fusion proteins
KR100762642B1 (ko) * 2006-08-21 2007-10-01 삼성전자주식회사 단말기에서 sms 메시지 배경화면을 디스플레이하는 방법및 그 단말기
CN101646689A (zh) 2006-09-08 2010-02-10 埃博灵克斯股份有限公司 具有长半衰期的血清清蛋白结合蛋白
WO2008045252A2 (en) 2006-10-04 2008-04-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Engineered integrin binding peptides
ATE516814T1 (de) 2007-02-02 2011-08-15 Bristol Myers Squibb Co 10fn3 domain zur behandlung von krankheiten begleitet von unerwünschter angiogenese
EP2145205B1 (en) 2007-05-01 2019-09-18 QUALCOMM Incorporated Position location for wireless communication systems
CA2710835A1 (en) 2007-12-27 2009-07-09 Novartis Ag Improved fibronectin-based binding molecules and their use
AU2009231439A1 (en) 2008-03-31 2009-10-08 Glaxo Group Limited Drug fusions and conjugates
EP3173424A1 (en) 2008-05-02 2017-05-31 Novartis Ag Improved fibronectin-based binding molecules and uses thereof
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
TWI496582B (zh) 2008-11-24 2015-08-21 必治妥美雅史谷比公司 雙重專一性之egfr/igfir結合分子
US8741839B2 (en) 2009-01-18 2014-06-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Polypeptides targeting vascular endothelial growth factor receptor-2 and αvβ3 integrin
US20100210511A1 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Bristol-Myers Squibb Company Combination VEGFR2 Therapy with Temozolomide
CA2776241A1 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
GEP201706660B (en) 2010-03-04 2017-04-25 Macrogenics Inc Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
WO2011124718A1 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Novozymes A/S Albumin derivatives and variants
DK2558491T3 (en) 2010-04-13 2018-10-15 Bristol Myers Squibb Co Fibronectin-based Scaffold domain proteins that bind PCSK9
WO2012064658A1 (en) * 2010-11-08 2012-05-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fusion proteins comprising an engineered knottin peptide and uses thereof
GB201103955D0 (en) 2011-03-09 2011-04-20 Antitope Ltd Antibodies
US8841418B2 (en) 2011-07-01 2014-09-23 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to TIM3
EP2780364A2 (en) 2011-11-18 2014-09-24 Eleven Biotherapeutics, Inc. Proteins with improved half-life and other properties
US9844582B2 (en) 2012-05-22 2017-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with extended-PK IL-2 and therapeutic agents
AR091220A1 (es) 2012-05-31 2015-01-21 Genentech Inc Metodos para tratar cancer usando antagonistas de union a pd-1 axis y antagonistas de vegf
US9401875B2 (en) 2012-06-01 2016-07-26 Nippon Telegraph And Telephone Corporation Packet transfer processing method and packet transfer processing device
US20140057851A1 (en) 2012-08-24 2014-02-27 WKD Holding Oy Anti-Angiogenic Gene Therapy With Soluble VEGF Receptors -1, -2 and -3 Together With Paclitaxel Prolongs Survival Of Mice With Human Ovarian Carcinoma
JP5988157B2 (ja) 2012-10-29 2016-09-07 株式会社リコー 熱定着装置、これを備えた画像形成装置
US20140154255A1 (en) * 2012-11-30 2014-06-05 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
WO2014201378A1 (en) * 2013-06-13 2014-12-18 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with extended-pk il -2 and adoptive cell therapy
WO2015103643A2 (en) * 2014-01-06 2015-07-09 The General Hospital Corporation Integrin antagonists
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof

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