KR102208505B1 - 고처리량 수용체:리간드 확인을 위한 방법 - Google Patents

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로날드 디. 3세 사이델
브란단 에스. 힐러리치
사라 씨. 가렛-톰슨
제임스 디. 러브
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앨버트 아인슈타인 컬리지 오브 메디신
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Abstract

수용체의 고처리량 확인을 위한 방법과 시스템: 리간드 상호작용이 제공된다. 본 출원 전반에서 다양한 간행물이 괄호 안에 인용된다. 이들 참고문헌에 대한 전체 인용은 본 명세서의 종결 부분에서 발견될 수 있다. 이들 간행물, 그리고 본원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원 공보와 서적의 개시는 본 발명이 관련되는 분야를 더욱 충분히 설명하기 위해, 본 출원에 전체적으로 참조로서 편입된다.

Description

고처리량 수용체:리간드 확인을 위한 방법{METHODS FOR HIGH THROUGHPUT RECEPTOR:LIGAND IDENTIFICATION}
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2012년 12월 11일자 제출된 U.S. 가출원 번호 61/735,791, 그리고 2013년 6월 11일자 제출된 U.S. 가출원 번호 61/833,588에 우선권을 주장하고, 이들 각각의 내용은 본원에 참조로서 편입된다.
정부 지원의 진술
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 보조금 번호 3U54GM094662-02, 5U01GM094665-02와 AI057158 하에 정부 지원을 받아 만들어졌다. 정부는 본 발명에서 일정한 권리를 갖는다.
발명의 배경
본 출원 전반에서 다양한 간행물이 괄호 안에 인용된다. 이들 참고문헌에 대한 전체 인용은 본 명세서의 종결 부분에서 발견될 수 있다. 이들 간행물, 그리고 본원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원 공보와 서적의 개시는 본 발명이 관련되는 분야를 더욱 충분히 설명하기 위해, 본 출원에 전체적으로 참조로서 편입된다.
세포 표면 수용체와 부착 분자는 정상적인 생리와 병리에 중심적인 발달 과정, 형태형성 과정 및 환경 과정을 비롯한 세포 기능의 문지기이다. 이들 분자는 주요 치료적 표적이다. 이들 복합체의 높은-분석력 구조적 특성화는 수용체:리간드 특이성, 친화성, 올리고머성 상태, 원자가, 그리고 이들 상호작용과 이들의 연관된 신호전달 경로의 전반적인 세포 생리 내로의 통합에 중요한 전반적인 조형적 특질의 기초가 되는 화학적 및 물리적 결정인자를 규정한다. 이들 특질 모두 복합 세포 과정을 주동하고 치료적 개입을 위한 독특한 기회를 제공하는 근본적인 기전을 이해하는데 결정적이다. 유감스럽게도, 현재, 이들 결정적인 복합체의 체계적인 구조적 특성화 (즉, 세크레톰의 구조적 유전체학)는 비현실적인 목적인데, 그 이유는 대부분은 아닐지라도, 많은 수용체:리간드 쌍이 규정되지 않은 상태로 남아있고, 따라서 구조적으로 특징화될 수 없기 때문이다.
본 발명은 인간 생리, 질환과 의약에 유관한 수용체:리간드 상호작용의 레퍼토리의 효율적이고 체계적인 확인을 위한 기술을 제공함으로써 이러한 필요를 해소한다.
발명의 요약
다음을 포함하는 세포 마이크로어레이가 제공된다:
(i) 첫 번째 미리 결정된 이종성 분비된 단백질, 이종성 막 단백질 또는 이종성 세포 표면 단백질 및 첫 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 첫 번째 복수의 세포, 그리고 (ii) 두 번째 미리 결정된 이종성 분비된 단백질 또는 두 번째 이종성 단백질 및 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 최소한 두 번째 복수의 세포,
여기서 첫 번째와 두 번째 복수의 세포는 마이크로어레이의 고체 표면에 부착되고, 그리고 여기서 첫 번째와 두 번째 복수의 세포는 고체 표면 상에서 공간적으로 별개의 위치에 있다.
다음을 포함하는 세포 마이크로어레이가 제공된다:
(i) (a) 첫 번째 미리 결정된 이종성 단백질 및 (b) 첫 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 첫 번째 복수의 세포, 그리고 (ii) (a) 두 번째 미리 결정된 이종성 단백질 및 (b) 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 최소한 두 번째 복수의 세포,
여기서 첫 번째와 두 번째 복수의 세포는 마이크로어레이의 고체 표면에 부착되고, 그리고 여기서 첫 번째와 두 번째 복수의 세포는 고체 표면 상에서 공간적으로 별개의 위치에 있다.
본원에서 설명된 바와 같은 세포 마이크로어레이를 만들기 위한 방법이 제공되고, 첫 번째 이종성 단백질과 형광 단백질을 인코딩하는 첫 번째 복수의 발현 구조체를 마이크로어레이의 고체 표면 상에 부착하고 두 번째 이종성 단백질과 두 번째 형광 단백질을 인코딩하는 최소한 두 번째 복수의 발현 구조체를 부착된 첫 번째 복수의 발현 구조체와 상이한 공간적으로 별개의 위치에서 고체 표면 상에서 마이크로어레이의 고체 표면 상에 부착하며, 그리고 세포가 고체 표면에 부착하고 각 공간적으로 별개의 위치에서 개별 발현 구조체로 세포 중에서 최소한 일부의 형질감염이 발생하도록 허용하기 위해, 형질감염 작용제의 존재를 포함하는 조건 하에 이들 발현 구조체를 복수의 세포와 접촉시키는 것을 포함한다.
후보 단백질 또는 펩티드가 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합하는 지를 결정하기 위한 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 두 번째 단백질을 본원에서 설명된 세포 마이크로어레이의 이종성 단백질로서 발현하고, 그리고 세포 마이크로어레이를 후보 단백질 또는 펩티드와 접촉시키고, 여기서 후보 단백질 또는 펩티드는 거기에 세 번째 형광 단백질 또는 펩티드를 부착하고, 결합되지 않은 후보 단백질 또는 펩티드를 제거하기 위해 후보 단백질 또는 펩티드와 접촉된 세포 마이크로어레이를 세척하고, 그리고 세척 후, 세포 마이크로어레이에 결합된 임의의 후보 단백질 또는 펩티드가 있는 지를 결정하는 것을 포함하고, 여기서 첫 번째 이종성 단백질로 형질전환된 세포에 상응하는 첫 번째 공간 위치에서 세척 후, 세포 마이크로어레이에 결합된 후보 단백질 또는 펩티드의 존재는 후보 단백질 또는 펩티드가 첫 번째 이종성 단백질에 결합한다는 것을 지시하고, 그리고 여기서 세척 후, 첫 번째 공간 위치에서 세포 마이크로어레이에 결합된 후보 단백질 또는 펩티드의 부재는 후보 단백질 또는 펩티드가 이종성 단백질에 결합하지 않는다는 것을 지시한다.
(i) 마이크로어레이 고체 표면 및 세포 표면 상에서 후보 리간드 단백질 또는 펩티드와 첫 번째 C 말단 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 현탁-적합된 세포주, 그리고 (ii) 최소한 a) 세포 표면 상에서 미리 결정된 이종성 단백질 및 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 두 번째 복수의 세포, 또는 b) 이종성 단백질을 표면에 부착하고 두 번째 형광 단백질을 부착한 복수의 마이크로비드를 포함하는 시스템이 또한 제공되고, 여기서 a) 또는 b)는 마이크로어레이 고체 표면에 부착된다. 상기에서 필요한 부분만 약간 수정된 시스템이 또한 제공되는데, 여기서 후보 리간드 단백질 또는 펩티드는 두 번째 복수의 형질전환된 세포 또는 복수의 마이크로비드 상에서 발현되고, 그리고 이종성 단백질은 형질전환된 현탁-적합된 세포주의 세포 표면 상에서 발현된다.
후보 리간드 단백질 또는 펩티드가 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합하는 지를 결정하기 위한 방법, 상기 방법은 본 발명의 시스템의 현탁-적합된 세포주 복수에서 후보 리간드 단백질 또는 펩티드 및 첫 번째 형광 단백질을 발현하고, 그리고 상기 복수를 a) 이종성 단백질 및 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 두 번째 복수의 세포, 또는 b) 이종성 단백질 및 두 번째 형광 단백질을 표면에 부착한 복수의 마이크로비드와 접촉시키고, 그리고 결합되지 않은 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 제거하기 위해 세척하고, 그리고 첫 번째와 두 번째 형광 단백질 둘 모두의 동시국지화를 보여주는 세포를 FACS 분석에 의해 확인하는 것을 포함하고, 여기서 공간적으로 별개의 위치에서 첫 번째와 두 번째 형광 단백질 둘 모두의 동시국지화를 보여주는 세포는 첫 번째 단백질 또는 펩티드가 공간적으로 별개의 위치에 상응하는 이종성 단백질에 결합된다는 것을 지시한다.
다음을 포함하는 시스템이 제공된다: 세포 표면 상에서 첫 번째 이종성 단백질을 발현하고 첫 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 벡터로 형질전환된 첫 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 여기서 상기 벡터는 첫 번째 이종성 단백질에 대한 독특한 미리 결정된 15-35개 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 독특한 서열은 하나 또는 그 이상의 보편적인 프라이머(들)에 의해 기폭될 수 있고, 그리고 세포 표면 상에서 두 번째 이종성 단백질을 발현하고 첫 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 두 번째 벡터로 형질전환된 두 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 여기서 상기 두 번째 벡터는 두 번째 이종성 단백질에 대한 상이한 독특한 미리 결정된 15-35개 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 그리고 (i) 세포 표면 상에서 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 발현하고 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 하나 또는 그 이상의 추가 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 상기 두 번째 현탁-적합된 세포주는 안정되게-발현된 펩티드 세포 표면 에피토프를 포함하고, 또는 (ii) 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 표면에 부착하고 두 번째 형광 단백질을 부착한 복수의 자성 마이크로비드.
후보 리간드 단백질 또는 펩티드가 두 번째 미리 결정된 단백질에 결합하는 지를 결정하기 위한 방법이 또한 제공되고, 두 번째 미리 결정된 단백질을 본 발명의 시스템의 이종성 단백질로서 발현하고, 그리고 (i) 세포 표면 상에서 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 발현하고 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 하나 또는 그 이상의 추가 복수의 현탁-적합된 세포주 세포의 후보 리간드 단백질 또는 펩티드, 상기 두 번째 현탁-적합된 세포주는 안정되게-발현된 펩티드 세포 표면 에피토프를 포함하고, 또는 (ii) 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 표면에 부착하고 두 번째 형광 단백질을 부착한 복수의 자성 마이크로비드의 후보 리간드 단백질 또는 펩티드와 접촉시키고;
두 번째 복수의 세포 중에서 하나 또는 그 이상에 또는 복수의 자성 마이크로비드에 결합된 첫 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포 중에서 한 가지를 자력에 의해 분리하고;
이런 분리된 세포-세포 또는 세포-마이크로비드 접합체로부터 DNA를 획득하고, 그리고 독특한 서열이 DNA 내에 존재하면, 이를 보편적인 프라이머를 이용하여 증폭하고;
독특한 서열의 사본을 염기서열결정하여 이의 존재를 확증하고;
이렇게 확인된 독특한 서열(들)을 독특한 미리 결정된 15-35개 뉴클레오티드 서열을 특정한 이종성 단백질 또는 펩티드와 상관하는 데이터베이스에 대하여 비교하고, 그리고 따라서, 이렇게 상관된 임의의 이종성 단백질 또는 펩티드 결합을 확인하고,
따라서 특정한 이종성 단백질 또는 펩티드를 후보 단백질 또는 펩티드에 결합하는 것으로 확인하는 것을 포함한다.
다음을 포함하는 시스템: (i) 첫 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 여기서 상기 복수의 세포는 (a) 세포 표면 상에서 이종성 단백질을 발현하고 (b) 첫 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 벡터로 형질전환되고, 그리고 여기서 상기 벡터는 첫 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포가 최소한 2가지 상이한 유형의 첫 번째 이종성 단백질을 발현하도록, 발현된 이종성 단백질에 대해 독특한 미리 결정된 15-35개 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 그리고 (ii) 세포 표면 상에서 두 번째 이종성 단백질을 발현하고 두 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 두 번째 벡터로 형질전환된 두 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 여기서 두 번째 복수의 현탁-적합된 세포는 단일 유형의 두 번째 이종성 단백질을 발현한다. 한 구체예에서, 첫 번째 복수의 세포의 임의의 개별 세포는 세포 표면 상에서 단지 한 가지 이종성 단백질을 발현한다. 한 구체예에서, 첫 번째 복수의 상이한 유형의 첫 번째 이종성 단백질 중에서 어느 것도 두 번째 복수의 두 번째 이종성 단백질과 동일한 서열을 갖지 않는다.
후보 리간드 단백질 또는 펩티드가 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합하는 지를 결정하기 위한 방법이 또한 제공되고, 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 본원에서 설명된 바와 같은 시스템에서 첫 번째 복수의 세포의 첫 번째 이종성 단백질로서 발현하고 두 번째 단백질 또는 펩티드를 첫 번째 이종성 단백질이 두 번째 이종성 단백질에 결합하도록 허용하는 조건 하에 본원에서 설명된 바와 같은 시스템에서 두 번째 이종성 단백질로서 발현하고, 그리고 임의선택적으로, 임의의 결합되지 않은 첫 번째 이종성 단백질을 제거하기 위해 세척하고, 이후 첫 번째와 두 번째 이종성 단백질 둘 모두의 동시국지화를 갖는 세포를 회수하고, 회수된 세포로부터 핵산을 획득하고, 상기 핵산을 염기서열결정하여 그 안에 내포된 독특한 15-35개 뉴클레오티드 서열을 확인하고, 따라서 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합한 독특한 15-35개 뉴클레오티드에 상응하는 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 확인하는 것을 포함한다.
두 번째 단백질에 첫 번째 단백질의 결합에 대한 첫 번째 단백질의 미리 결정된 아미노산 잔기의 효과를 결정하기 위한 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 첫 번째 단백질에 비하여 하나 또는 그 이상의 점 돌연변이로 돌연변이된 단백질을 본원에서 설명된 시스템의 첫 번째 현탁-적합된 세포주 복수에서 복수의 상이한 유형의 이종성 단백질로서 발현하고, 그리고 상기 복수를 두 번째 단백질 및 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 본원에서 설명된 시스템의 두 번째 복수의 세포의 두 번째 이종성 단백질의 형태에서 두 번째 단백질과 접촉시키고, 그리고 첫 번째와 두 번째 형광 단백질 둘 모두의 동시국지화를 보여주는 세포를 회수하고, 회수된 세포로부터 핵산을 획득하고, 상기 핵산을 염기서열결정하여 그 안에 내포된 독특한 15-35개 뉴클레오티드 서열을 확인하고, 따라서 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합한 첫 번째 단백질을 확인하고, 그리고 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합한 단백질의 수준을 미리 결정된 참고 수준에 비교하는 것을 포함하고,
여기서 미리 결정된 참고 수준을 초과하여 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합한 단백질의 수준은 상기 단백질에서 돌연변이된 잔기 또는 잔기들이 두 번째 단백질에 첫 번째 단백질 결합을 증강한다는 것을 지시하고, 그리고 여기서 미리 결정된 참고 수준 미만으로 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합한 단백질의 수준은 상기 단백질에서 돌연변이된 잔기 또는 잔기들이 두 번째 단백질에 첫 번째 단백질 결합을 저해한다는 것을 지시한다.
다음을 포함하는 시스템이 또한 제공된다: (i) 세포 표면 상에서 첫 번째 이종성 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 발현하고 첫 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 벡터로 형질전환된 첫 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포 및 세포 표면 상에서 두 번째 이종성 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 발현하고 두 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 두 번째 벡터로 형질전환된 두 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 그리고 (ii) 표적 단백질, 펩티드 또는 항체를 표면에 부착한 복수의 자성 마이크로비드.
2개의 후보 리간드 단백질 또는 펩티드 중에서 하나 또는 그 이상이 표적 단백질, 펩티드 또는 항체에 결합하는 지를 결정하기 위한 방법이 또한 제공되고, 첫 번째 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 본 발명의 시스템에서 첫 번째 복수의 세포의 첫 번째 이종성 단백질로서 발현하고 두 번째 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 첫 번째 이종성 단백질 및 두 번째 이종성 단백질이 표적 단백질, 펩티드 또는 항체에 결합하도록 허용하는 조건 하에 본 발명의 시스템에서 두 번째 이종성 단백질로서 발현하고, 그리고 첫 번째 형광 단백질-발현 세포로 복합화된 및/또는 두 번째 형광 단백질-발현 세포로 복합화된 임의의 마이크로비드를 회수하고, 그리고 복합체에서 후보 리간드 단백질을 확인하는 것을 포함하고, 여기서 첫 번째 형광 단백질-발현 세포의 복합체에 부착된 마이크로비드의 회수는 첫 번째 후보 리간드 단백질 또는 펩티드가 표적 단백질 또는 펩티드에 결합한다는 것을 지시하고, 그리고 여기서 두 번째 형광 단백질-발현 세포의 복합체에 부착된 마이크로비드의 회수는 두 번째 후보 리간드 단백질 또는 펩티드가 표적 단백질 또는 펩티드에 결합한다는 것을 지시하고, 그리고 여기서 첫 번째 형광 단백질 발현 세포 또는 두 번째 형광 단백질 발현 세포의 복합체에 부착된 마이크로비드의 회수 없음은 각각, 첫 번째 후보 리간드 단백질이 표적 단백질 또는 펩티드에 결합하지 않고, 그리고 두 번째 후보 리간드 단백질이 표적 단백질 또는 펩티드에 결합하지 않는다는 것을 지시한다.
다음을 포함하는 시스템이 제공된다: (i) 세포 표면 상에서 첫 번째 이종성 표적 단백질 또는 펩티드를 발현하고 첫 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 벡터로 형질전환된 첫 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포 및 세포 표면 상에서 두 번째 이종성 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 발현하고 두 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 두 번째 벡터로 형질전환된 하나 또는 그 이상의 두 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 그리고 (ii) 후보 리간드 단백질 또는 펩티드에 지향되거나, 또는 표적 단백질 또는 펩티드에 지향된 항체를 표면에 부착한 복수의 자성 마이크로비드. 후보 리간드 단백질 또는 펩티드가 표적 단백질 또는 펩티드에 결합하는 지를 결정하기 위한 방법이 또한 제공되고, 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 본 발명의 시스템에서 두 번째 복수의 세포의 두 번째 이종성 단백질로서 발현하고 표적 단백질 또는 펩티드를 후보 리간드 단백질 또는 펩티드 및 표적 단백질 또는 펩티드가 결합하도록 허용하는 조건 하에 본 발명의 시스템에서 첫 번째 이종성 단백질로서 발현하고, 그리고 첫 번째 형광 단백질-발현 세포 및 두 번째 형광 단백질-발현 세포 둘 모두로 복합화된 임의의 마이크로비드를 회수하는 것을 포함하고, 여기서 첫 번째 형광 단백질-발현 세포 및 두 번째 형광 단백질-발현 세포 둘 모두의 복합체에 부착된 마이크로비드의 회수는 후보 리간드 단백질 또는 펩티드가 표적 단백질 또는 펩티드에 결합한다는 것을 지시하고, 그리고 여기서 첫 번째 형광 단백질-발현 세포 및 두 번째 형광 단백질-발현 세포 둘 모두의 복합체에 부착된 마이크로비드의 회수 없음은 후보 리간드 단백질이 표적 단백질 또는 펩티드에 결합하지 않는다는 것을 지시한다.
도면의 간단한 설명
도면 1. T 세포와 항원 제시 세포 사이에 형성된 면역학적 시냅스의 결정학적 보기. 면역학적 시냅스의 중심 영역에서 TCR:MHC 및 공동자극성 수용체:리간드 복합체의 복합 모델. TCR:MHC (PDB 코드 1G6R), PD-1:PD-L1 (3BIK), PD-1:PD-L2 (3BP5) 및 CTLA-4:B7-1 (1I8L) 복합체는 현존하는 결정 구조의 대표이다; 일가 CD28:B7-1 복합체의 모델은 CD28 단위체 (1YJD) 및 CTLA-4:B7-1 구조에 기초된다. 이들 복합체의 근사 치수 (즉, 길이)뿐만 아니라 구조화된 Ig 도메인을 막에 연결하는 잔기의 숫자가 도시된다. 면역학적 시냅스에서 원형질막 사이에 대략 140Å 거리가 또한 언급된다. 수용체:리간드 엑토도메인 사이에 상호작용에 의해 부과된 국지화와 조직화를 채택하는 세포질 신호전달과 골격 단백질이 개략적으로 도시된다 (즉, 기하학적 부호). 이러한 도면은 세포 표면 수용체와 리간드에 대한 기능의 결정적인 결정인자인 염기성 특질 (가령, 올리고머성 상태, 원자가, 리간드 특이성) 및 전반적인 조직적 원리를 규정하는데 있어서 수용체:리간드 구조의 중요성을 강조한다 [45].
도면 2: 수용체:리간드 구조의 활용. 왼쪽: 뮤린 PD-1:PD-L2 복합체의 구조. 오른쪽: 증강된 친화성 및 변경된 특이성을 갖는 PD-1 수용체를 유발하는 점 돌연변이체의 위치.
도면 3: 세포 마이크로어레이 플랫폼. 왼쪽: 세포 마이크로어레이를 산출하기 위한 계통도. 오른쪽: 예시를 위해, GFP 발현 구조체 (즉, 플라스미드)는 발현 어레이를 창출하기 위해 유리 표면 위에 "핀으로 고정"되었다. HEK293 세포는 인쇄된 cDNA 위에 도말되었는데, 이들은 차후에 형질감염되고 생존 세포 어레이를 유발하였다. 이러한 2000-반점 격자는 맞춤 제작된 마이크로어레이 프린터를 이용하여 작제되었다. 각 반점은 50-80개 세포의 클러스터이다.
도면 4A-4C: 세포 마이크로어레이 플랫폼을 이용하여 T-세포 리간드와 수용체 결합의 검출. (A) 세포질 GFP 또는 원형질막 포매된 PD-L1-GFP를 발현하는 HEK 세포의 교대성 열을 내포하는 고밀도 세포 마이크로어레이 (개략적으로 도시됨). (B) Alexa 594 이차성 항체 (적색)와 예혼합되고 Axon 4000B 마이크로어레이 스캐너에서 영상화된 정제된 PD-1 IgG로 어레이의 처리. 단지 PD-L1 엑토도메인을 제공하는 세포만 염색을 전시한다; 세포질 GFP를 발현하는 세포는 염색 없음을 보여주고 음성 대조로서 역할한다. (C) 표지화된 PD-1-Ig-융합 단백질과 PD-L1 GFP의 동시국지화를 보여주지만, 세포질 GFP 구조체에서는 그렇지 않은 합병된 이미지. 이들 결과는 상기 마이크로어레이의 특이성을 증명한다. PD-L1과 대조 (GFP 단독) 사이에 GFP 형광 강도에서 차이는 발현의 방법으로부터 현성한다.
도면 5: Ig 상과의 상이한 구성원 사이에 특이적 결합을 보여주는 3개의 세포 마이크로어레이. 슬라이드는 PD-1, B7-1과 CD200R의 GFP 융합 구조체, 또는 GFP 단독을 인코딩하는 플라스미드 DNA의 교대성 열로 인쇄되었다. 3개의 인쇄된 슬라이드는 10 cm 사각형 페트리 접시에서 배치되고, 형질감염 시약으로 처리되고, 그리고 이후, HEK 세포로 도말되었다. 형질감염후 3 일에, 슬라이드는 세척되고 차후에, PD-L2 (슬라이드 1), CTLA-4 (슬라이드 2) 또는 CD200 (슬라이드 3)의 Ig-융합으로 처리되었다; Ig-융합은 검출을 위해 Cy7 이차성 항체와 함께 전배양되었다. 모든 인쇄된 열은 성공적으로 형질감염되었고 GFP 양성이었다 (데이터 제시되지 않음). 이미지는 Cy7 통로 단독으로부터 형광 신호를 보여준다. 각 어레이의 경우에, Ig-융합의 유의미한 결합은 동계 수용체 또는 리간드가 존재하는 열에 대해서만 검출된다. 가령: PD-L2, 수용체 PD-1의 리간드는 PD-1 GFP가 인쇄된 열에서만 결합한다. 개별 슬라이드는 명료함을 위해 가성-착색되고, 그리고 오버레이는 결합의 특정한 패턴을 드러낸다.
도면 6: Ig 상과 포유류 발현 라이브러리의 산출. 계통도 (상부)는 유형 I 분비된 단백질의 급속하고 효율적인 클로닝을 위해 특이적으로 가공된 결찰 독립된 벡터를 보여준다. Ig 상과의 283개 구성원이 클로닝되고 HEK293 세포의 일시적인 형질감염에 의해 발현이 검사되었다. 형광 검경을 이용하여, 이들 클론 중에서 240 (~85% 성공)개가 배경을 초과하여 발현되고 정확한 막 국지화를 전시하였다. 240개의 발현 라이브러리 구성원 중에서 24개의 대표적인 세트에 대한 GFP 형광 이미지가 도시된다. 각 발현 구조체의 사전 검증은 추가 "구급 노력"을 필요로 하는 이들 단백질을 강조하고, 그리고 완전히 특징화되고 견실한 플랫폼을 위해 결정적이다.
도면 7: 세포 마이크로어레이 형식에서 동시형질감염. 왼쪽) 세포질 GFP로 형질감염된 HEK293 세포. 중앙) 세포질 mCherry로 형질감염된 HEK293 세포. 오른쪽) 세포질 GFP와 mCherry로 동시형질감염된 HEK293 세포. 녹색과 적색 형광단으로 동시형질감염은 황색 형광을 유발한다. 이것은 세포 마이크로어레이 형식에서 기능적 다성분 수용체의 실현을 위해 필요한, 다중 폴리펩티드의 발현에 대한 원리 증명을 제공한다.
도면 8A-8C: 높은 항원항체결합력 마이크로비드로 수용체:리간드 발견을 위한 전략. A) 현탁 적합된 HEK293 세포는 세포질 mCHERRY에 연결된 선택된 세포 표면으로 일시적으로 형질감염된다 (가령, PD-L1; 적색 세포). B) 50 nm 단백질 A-코팅된, GFP-태그된 마이크로비드는 PD-1 Ig 또는 B7-1 Ig-융합 단백질로 장식된다 (녹색 비드). C) 적색 세포와 녹색 마이크로비드의 배양은 적색:녹색 접합체를 유발한다. D) 유세포분석법은 수용체:리간드 상호작용의 검출과 정량을 가능하게 한다. 적색의 결합되지 않은 형질감염된 세포는 y축을 따른다; 결합되지 않은 녹색 마이크로비드는 x축을 따른다; 수용체:리간드 상호작용을 보고하는 적색:녹색 세포:마이크로비드 접합체는 대각선을 따른다.
도면 9: PD-L1:PD-1 및 PD-L1:B7-1 상호작용의 마이크로비드-기초된 입증. 단백질 A 마이크로비드는 FITC-IgG 대 Ig-융합 (즉, PD-1 또는 B7-1)의 1:4 비율에서 예혼합된 IgG로 포화되고, 펠렛화되고, 그리고 차후에, PBS에서 재현탁되었다. 접합된 마이크로비드는 mCherry 단독 또는 PD-L1 mCherry 융합을 발현하는 HEK 세포와 함께 배양되고, 그리고 결합의 정도는 유세포분석법에 의해 결정되었다. 이들 데이터는 단지 PD-L1 발현 HEK 세포에만 PD-1 접합된 마이크로비드와 B7-1 접합된 마이크로비드 둘 모두의 결합을 명확하게 증명하고, 그리고 리간드의 항원항체결합력을 증가시키는 것이 실험적으로 계측될 수 있는 잠재적인 수용체 리간드 상호작용의 역동적 범위를 향상시킨다는 전략을 뒷받침한다.
도면 10: 유세포분석법에 의한 특정한 가공된 세포-세포 상호작용의 검출. HEK 293 세포는 GFP, mCherry, PD-L1 mCherry 또는 PD-1 GFP로 형질감염되었다. 세포는 2% BSA를 포함하는 얼음같이 차가운 DMEM에서 재현탁되었고, 그리고 세포주는 1:1 화학양론적 비율에서 함께 혼합되었다. 개별 개체군 및 혼합된 이진수 쌍은 4℃에서 2 시간 동안 배양되었다. 적색 & 녹색 형광 이벤트 (즉, 접합체)의 숫자에서 유의미한 (~60-배) 증가는 리간드와 수용체 둘 모두 존재할 때에만 관찰된다.
도면 11: 유세포분석법에 의한 CD200:CD200-수용체 상호작용의 검출. HEK293 세포는 GFP, mCherry, CD200 mCherry 또는 CD200-수용체 GFP로 형질감염되었다. 세포는 도면 10에서처럼 처리되고 분석되었다. 적색:녹색 형광 이벤트 (즉, 접합체)의 숫자에서 유의미한 증가는 리간드와 수용체 둘 모두를 개별적으로 발현하는 세포가 존재할 때에만 관찰된다.
도면 12: 고도로 선별적인 기능을 갖는 PD-L1 돌연변이체를 확인하기 위한 마이크로비드와 세포-세포 FACS 검정의 이용. A) 한 세트의 > 100 PD-L1 mCherry 돌연변이체 구조체가 HEK293 세포 내로 일시적으로 형질감염되었다. 이들 라인은 이후, PD-1의 Ig-융합으로 (오렌지색에서 마이크로비드 데이터) 또는, 별개의 실험 세트에서, PD-1 GFP를 일시적으로 발현하는 세포로 (청색에서 세포-세포 데이터) 미리 포화된 마이크로비드로 공격되었다. 각 실험에서, FACS 분석에 의해 결정된 퍼센트 결합은 야생형 결합에 대해 정규화되었다. 데이터는 마이크로비드 또는 세포-세포 방법을 이용하여 관찰된 평균 결합의 직접적인 비교를 보여준다. 명료함을 위해, 상기 데이터의 단지 부분집합만 도시된다. PD-L1의 다른 공지된 리간드인 B7-1로 PD-L1 돌연변이체를 공격하는 유사한 세트의 실험이 또한 수행되었다 (데이터 제시되지 않음). B) PD-L1 돌연변이체를 선별검사하는 것은 PD-1, B7-1 또는 둘 모두에 손상된 결합을 보여주는 여러 돌연변이체를 산출하였다. 이들 결과를 더욱 실증하기 위해, PD-L1 돌연변이체 중에서 7개가 Ig-융합으로서 발현되었다. 정제된 PD-L1 돌연변이체는 검출을 위해 Alexa 594 이차성 Ab (적색)와 함께 전배양되고 PD-1 GFP 또는 B7-1 GFP (녹색) 발현 HEK293 세포에 첨가되었다. FACS 데이터는 Alexa 594 형광 (y축)과 대비하여 GFP 형광 (x축)을 보여준다. 정제된 단백질을 이용하여 관찰된 결합의 정도는 양쪽 선별검사 방법에서 관찰된 것을 반영하지만, 상기 데이터는 세포-세포 결합 방법으로 획득된 결과와 더욱 가깝게 상관하는 것으로 보인다.
도면 13A-13E: 세포 표면 단백질-단백질 상호작용의 평행 확인을 위한 전략. A) 바코드화된 라이브러리는 바코드화된 라이브러리 벡터 (BC-L 벡터, 이것은 보편적인 T7 전방과 후방 프라이머 부위에 의해 접하는 GFP 리포터와 28개 뉴클레오티드 독특한 코어 바코드를 산출한다) 내로 LIC 클로닝을 통해 산출된다. 라이브러리는 모아지고 현탁 적합된 HEK293 세포 내로 일제히 형질감염된다. B) 별개의 반응에서, 단일 조회 수용체가 mCherry 및 자성 포획/분리를 허용하는 세포 표면 제공된 FLAG 에피토프로 또한 표시된 HEK293 세포 내로 형질감염된다. C) 모아진 라이브러리는 동계 수용체 사이에 생산적 상호작용을 허용하는 조회 발현 세포와 혼합된다 (1:1). D) 양성 상호작용 (즉, 접합체)은 조회 수용체 세포의 자성 포획 ("분류")에 의해 발현 풀로부터 회수된다. E) 플라스미드 DNA는 추출되고 바코드의 PCR 증폭이 보편적인 프라이머로 수행된다. F) 대량으로 평행 차세대 염기서열결정을 이용하여, 각 PCR 산물의 서열이 획득된다. 독특한 바코드 서명은 조회 수용체와 복합으로 이들 리간드를 독특하게 확인한다. 특히, 이러한 프로토콜은 다수의 조회 단백질에 대해 상기 단계를 수행하고, 다중웰 평판 형식 (가령, 24-웰 평판)에서 결과의 접합체를 개별적으로 포획하고, 그리고 "충분히 특정한" 식별자 (독특한 8개 뉴클레오티드 바코드)를 단계 E에서 프라이머에 첨가함으로써 다중화될 수 있다. 이들 앰플리콘은 이후, 단일 차세대 염기서열결정 작업으로 모아지고, 그리고 각 반응의 비용을 감소시키기 위해 염기서열결정 후 디콘볼류션될 수 있다.
도면 14A-14B: 자성 마이크로비드가 특정한 세포-세포 결합 이벤트를 포획하고 단리하는데 이용될 수 있다. A) PD-L1 mCherry-융합을 일시적으로 발현하는 HEK293 세포는 GFP 또는 PD-1 GFP-융합을1:1 비율에서 일시적으로 발현하는 세포와 혼합되었다 (4 x 106 세포 전체). PD-L1 항체로 장식된 자성 단백질 A-코팅된 마이크로비드 (Miltenyi)가 첨가되고, 그리고 표본이 이전되었다 (전체); 이것은 출발 혼합물의 조성을 나타낸다). 혼합물은 자성 세포 분리 칼럼에 적용되고, 그리고 결합된 세포가 세척되고 용리되었다. "전체"와 "결합된" 표본은 GFP 양성 세포의 퍼센트를 결정하기 위해 FACS에 의해 분석되었다. 자성 비드에 의해 포획된 PD-L1 발현 세포는 GFP 단독을 발현하는 세포보다 PD-1 GFP-융합을 발현하는 훨씬 많은 세포를 단리하였는데, 이것은 동계 수용체:리간드 접합체의 명백하고 특정한 농축을 증명한다. B) 고처리량 스크린에서 목격되는 바와 같이, "희귀한" 이벤트를 단리하는 능력을 증명하기 위해, 106 PD-L1 mCherry 세포는 PD-1 GFP-융합 또는 GFP를 발현하는 0.1 x 106 세포, 그리고 5 x 106 형질감염되지 않은 세포 (가성 라이브러리를 모의한다)와 혼합되었다. 이러한 실험에서, GFP 양성 세포는 전체 세포의 ~1.5%를 나타낸다. 2 시간 후, 항 PD-L1 코팅된 마이크로비드가 첨가되었다, "전체" 표본이 채취되고, 그리고 결합된 분획물이 A에서 설명된 바와 같이 단리되었다. 데이터는 자성으로 포획된 PD-L1 발현 세포에 의한 PD-1 GFP-융합 발현 세포의 유의미한 농축을 보여준다.
도면 15: 모의된 신호 대 잡음: FACS 분류에 연계된 세포-세포 결합에 의해 풀로부터 "희귀한" 수용체의 농축. A) 발현 라이브러리를 모의하기 위해, GFP를 일시적으로 발현하는 107 HEK293 세포는 PD-1 GFP-융합을 발현하는 0.02 x 106 세포 (GFP 양성 세포의 0.2 %)와 혼합되었다. 이러한 "라이브러리"는 이후, mCherry (음성 대조) 또는 PD-L1 mCherry-융합을 일시적으로 발현하는 106 HEK293 세포로 공격되었다. 데이터는 3 x 106 전체 이벤트에 대한 유세포분석기 분석을 보여준다. 게이트는 GFP "라이브러리", mCherry 또는 PD-L1 mCherry-융합 단독의 10,000개 이벤트 판독에 기초하여 설정되었다. B) PD-1 GFP-융합의 농축을 실증하는데 이용된 프라이머의 위치를 보여주는 계통도. C) PD-L1 mCherry 공격 (A에서 오른쪽 패널)의 경우에, 양성 결합 이벤트 (Q2)가 분류되고 10,000개 이벤트가 수집되었다. 비교를 위해, 10,000개 세포가 또한, 분류에 앞서 세포 혼합물로부터 수집되었다 (분류전 표본). PD-1 GFP-융합 PCR 대조는 왼쪽 레인에 있다. 분류전과 분류후 PCR 산물의 비교는 분류된 양성 결합 이벤트가 PD-1 GFP에 대해 농축되었다는 것을 실증한다.
도면 16: 세포-세포 FACS 검정의 다중화: 분비된 단백질 포유류 발현 라이브러리는 독특하게 바코드화된 각 발현 구조체 (변수 ~ 3' 단부의 하류에 발현 플라스미드 상에서 20개 염기쌍 서열)로 산출되었다. 이들 구조체는 GFP 형광 단백질 마커와 함께 발현된다. 바코드화되지 않은 "챌린저" 분비된 단백질 발현 구조체 역시, 예로서 mCherry 형광 단백질 마커로 산출되었다. 라이브러리 구조체 및 "챌린저" 구조체는 포유류 세포에서 개별적으로 발현된다. "라이브러리"와 "챌린저"의 세포 개체군은 함께 혼합된다. 세포-세포 상호작용은 이후, 상호작용하지 않는 세포로부터 분류된다. 분류는 형광에 의해 (즉, 모든 이중 양성 이벤트, mCherry + GFP를 분류) 또는 임의의 결합된 라이브러리 상대와 함께 모든 "챌린저" 세포를 포획하는 자성 비드를 이용하여 자성으로 수행될 수 있다. 세포 표본은 분류전과 분류후 채취되고, 용해되고, 그리고 상층액이 발현 플라스미드의 PCR 증폭에 이용되었다. 모아진 PCR 표본은 심층 염기서열결정을 위해 발송되고, 이것은 특정 바코드의 얼마나 많은 사본이 존재하는 지의 정량적 사정을 제공한다. 우리의 실험에서 배경에 비하여 특정한 바코드의 농축은 특정한 단백질-단백질 상호작용을 지시할 것이다. 우리는 이후, 특정한 바코드 서열을 이용하여 어떤 단백질이 라이브러리로부터 유래되는 지를 확인할 수 있다.
도면 17: 세포-세포 "희귀한 이벤트" 검정: 다중화 접근법은 라이브러리로부터 특이적 결합 상호작용을 끄집어내는 것을 가능하게 하는데, 여기서 관심되는 단백질은 전체 라이브러리와 비교하여 상대적으로 희귀할 것이다. 가령, 100개 유전자의 라이브러리를 갖고 이들을 포유류 세포에서 개별적으로 발현하고 이들 100개의 발현 개체군을 동등한 양으로 함께 혼합하면, 발현된 임의의 한 가지 유전자는 전체 라이브러리의 1/100을 나타낼 것이다.
이러한 실험은 관심되는 유전자, 본 출원의 경우에 PD-1이 GFP 양성 세포의 전체 개체군의 1/100일 때에도, 본원에서 설명된 기술을 이용하여 PD-1 / PD-L1 상호작용을 여전히 농축할 수 있다는 것을 증명한다. 심층 염기서열결정 접근법의 초기 검사로서, 한 세트의 이전에 특징화된 PD-L1 돌연변이체가 활용되었다. 개념은 돌연변이체 서열을 "바코드"로서 이용하는 것이었는데, 그 이유는 각 PD-L1 돌연변이체 서열이 내재적으로 상이하기 때문이다. 이들 돌연변이체 중에서 여러 개는 PD-1에 감소된 결합을 보여주었고, 그리고 다중화된 심층 염기서열결정 접근법을 이용하여 이들 동일한 돌연변이체를 확인하는 것이 가능하였다.
도면 18: PD-L1 돌연변이체: 검사 사례 - 도시된 서열은 생쥐 PD-L1 유전자의 부분에 해당한다. 강조된 아미노산은 독특한 점 돌연변이의 위치를 보여준다. 녹색은 돌연변이될 때, PD-1에 결합에 대한 효과 없음을 보여주는 잔기이다. 적색 잔기는 돌연변이될 때, PD-1에 결합의 강한 손실을 보여주는 것들이고, 그리고 황색 잔기는 PD-1에 결합의 더욱 온건한 손실을 보여준다. 청색으로 강조된 DNA 서열은 분류전과 분류후 둘 모두에서 모아진 PD-L1 라이브러리를 PCR 증폭하는데 이용된 프라이머의 위치를 보여준다. FACS 패널은 PD-L1 돌연변이체 라이브러리에 도전하기 위해 GFP를 이용한 음성 대조 모의 분류, 그리고 실험적 PD-1 시험 분류를 보여준다. 실험을 위해, 20,000개 세포가 분류에 앞서 (분류전) 및 분류된 개체군 Q2 (분류후)로부터 수집되었고, 그리고 상기 강조된 프라이머를 이용하여 PCR 증폭되었다. 하부 오른쪽 상에서 아가로오스 겔 이미지는 분류전과 분류후 표본으로부터 획득된 PCR 산물을 보여준다. 이들 표본은 이후, 심층 염기서열결정 분석을 위해 발송되었다.
도면 19: 심층 염기서열결정 결과는 각 독특한 PD-L1 서열이 얼마나 많은 횟수에서 확인되는 지를 결정하기 위해 분석되었다 (발생의 전체 #). 농축 비율은 이후, 분류전과 분류후 표본 사이에 발생에서 계산되었다. 가령, 분류전 표본에서 10개 야생형 PD-L1 서열이 계수되고 분류후 표본에서 100개가 계수되면, 야생형 PD-L1의 10-배 농축이 관찰되었다 (10에 의해 나눗셈된 100). 특정한 PD-L1 돌연변이체, 예를 들면, D122A가 PD-1에 결합하지 않으면, 분류전 표본에서는 10개 D122A 서열이 여전히 계수될 수 있을 지도 모르지만 분류후 표본에서는 단지 5개 서열만 계수된다. 이것은 0.5의 농축 비율을 제공한다 (10에 의해 나눗셈된 5). 상기 데이터를 우리의 전통적인 FACS 결합 방법을 이용하여 획득된 데이터 (밝은 청색 막대)와 비교하기 위해, 모든 데이터는 야생형 PD-L1 결합에 대해 정규화되었다. 상기 데이터는 불량한 PD-1 결합제로서 이전에 확인된 이들 돌연변이체가 다중화된 심층 서열 접근법을 이용하면 유사하게 확인된다는 것을 명확하게 증명한다.
도면 20: T-세포 리간드의 검출 - 본원에서 설명된 세포 마이크로어레이 플랫폼을 이용한 수용체 결합이 여러 IgSF 수용체/리간드 쌍을 조사하는데 이용되었다. 결합은 특이적이다.
도면 21: 선별적인 기능을 갖는 PD-L1 돌연변이체를 확인하기 위한 마이크로비드 플랫폼의 이용.
도면 22: 유리 슬라이드는 야생형 PD-L1, mCherry 단독, 또는 일련의 PD-L1 돌연변이체를 인코딩하는 플라스미드 DNA로 인쇄되었다. 각 인쇄된 구조체의 위치는 오른쪽 끝에서 다이어그램 상에 도시된다. mCherry (Cy3) 레이저로부터 형광 신호는 각 인쇄된 구조체의 발현 수준을 보고한다. Alexa 647 (Cy5) 레이저는 PD-L1 발현 세포에 PD-1 (위쪽 패널) 또는 B7-1 (아래쪽 패널) Fc 융합 단백질의 결합을 보여준다. 이런 이유로, Cy5 통로에서 형광이 아닌 반점은 결합을 보여주지 않는다. 오른쪽에 격자는 마이크로비드 결합 실험을 이용하여 관찰된 결합을 지시하기 위해 칼라 코딩된다. 녹색의 이들 구조체는 야생형과 유사한 결합을 보여주었다. 황색 돌연변이체는 감소된 결합을 보여주었고, 그리고 적색 돌연변이체는 거의 내지 전혀 결합 없음을 보여주었다. 결합의 동일한 패턴이 마이크로어레이 상에서 관찰된다.
도면 23: 세포-세포 결합 검정을 고처리량 단백질-단백질 상호작용 선별검사에 적합한 96-웰 평판 형식으로 확장. A) 16가지 대조 세포 표본의 복제물 세트가 3가지 상이한 전체 세포 농도에서 설정되고 96-깊은 웰 블록에서 4℃에서 2 시간 동안 배양되었다. 동계 리간드:수용체 쌍을 내포하고 이런 이유로, 유의미한 결합을 증명하는 세포-세포 혼합물은 녹색으로 강조된다 (표 A의 아래쪽 2개 열). 배양 후, 세포의 분취량은 96-웰 U-바닥 평판으로 이전되고, 그리고 BD Accuri 세포계산기에 연결된 Intellicyt HTFC 연속적 흐름 시스템을 이용하여 분석되었다. B) 대표적인 96-웰 평판 실행으로부터 웰 파인더 보기. 각 피크는 한 웰로부터 수집된 이벤트를 나타낸다. 식별자는 96-웰 평판의 각 열의 종결점을 표지한다. 주목할 점은 피크의 크기가 웰 내에서 세포의 농도를 반영하고 3개의 상이한 세포 농도를 명확하게 식별가능하도록 만든다는 것이다. C) 전체 96-웰 평판으로부터 모든 단일항 세포는 GFP 형광, mCherry 형광 또는 둘 모두 (이중 양성 "히트")에 대해 게이팅되었다. D) "이중 양성 히트"를 모든 단일항 세포 이벤트의 백분율로서 보여주는 열 지도. E) 그래프는 검사된 각 세포 농도에서 16개 대조 세포 표본 모두에 대한 전체 단일항 세포 이벤트의 백분율로서 이중 양성 (히트)을 보여준다. 주목할 점은 세포-세포 결합의 백분율이 감소하는 전체 세포 농도에서 감소하지만, 음성과 양성 쌍 사이에 배수적 차이가 1 x 106 세포/mL에서 ~6-배에서 0.2 x 106 세포/mL에서 ~10-배로 약간 향상된다는 것이다. 데이터는 2번의 독립된 실험의 평균을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도면 24: IgG 상과의 세포 마이크로어레이 발현 구성원. A) 폴리-l-리신 코팅된 유리 슬라이드는 IgG 상과에서 144개 인간 유전자에 대한 발현 구조체로 인쇄되었다. 각 구조체는 하나의 열을 교차하여 4개 복제물에서 인쇄되어 4 x 144 반점의 전체 어레이를 유발하였다. 형질감염 후, 인쇄된 각 구조체의 발현이 mCherry 형광을 통해 직접적으로 관찰될 수 있다 (가성착색된 녹색, 단일 통로 도시되지 않음). 이러한 세포 어레이는 차후에, Alexa 647 표지화된 항인간 IgG와 함께 전배양된 재조합 PD-L1-Fc로 처리되고, 세척되고, 그리고 4% 포름알데히드로 고정되었다 (가성착색된 적색, 단일 통로 도시되지 않음). 데이터는 덧씌워진 녹색과 적색 가성착색된 이미지를 보여주는데, 여기서 결합은 녹색과 적색 형광 신호의 합병으로부터 발생하는 황색/오렌지 칼라로서 관찰된다. A와 B 표지화된 열은 PD-L1, PD-1 (A)와 B7-1 (B)의 2가지 공지된 결합 표적을 내포한다. B) 주변 반점으로부터 관찰된 신호와 비교하여, PD-1과 B7-1에 PD-L1 결합에 대해 관찰된 양성 신호를 보여주는 A에서 강조된 이들 열의 10x 배율.
발명의 상세한 설명
다음을 포함하는 세포 마이크로어레이가 제공된다: (i) 첫 번째 미리 결정된 이종성 분비된 단백질, 이종성 막 단백질 또는 이종성 세포 표면 단백질 및 첫 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 첫 번째 복수의 세포, 그리고 (ii) 두 번째 미리 결정된 이종성 분비된 단백질 또는 두 번째 이종성 단백질 및 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 최소한 두 번째 복수의 세포,
여기서 첫 번째와 두 번째 복수의 세포는 마이크로어레이의 고체 표면에 부착되고, 그리고 여기서 첫 번째와 두 번째 복수의 세포는 고체 표면 상에서 공간적으로 별개의 위치에 있다.
다음을 포함하는 세포 마이크로어레이가 제공된다:
(i) (a) 첫 번째 미리 결정된 이종성 단백질 및 (b) 첫 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 첫 번째 복수의 세포, 그리고 (ii) (a) 두 번째 미리 결정된 단백질 및 (b) 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 최소한 두 번째 복수의 세포,
여기서 첫 번째와 두 번째 복수의 세포는 마이크로어레이의 고체 표면에 부착되고, 그리고 여기서 첫 번째와 두 번째 복수의 세포는 고체 표면 상에서 공간적으로 별개의 위치에 있다.
한 구체예에서, 첫 번째 또는 두 번째 미리 결정된 단백질은 고전적으로 분비된 단백질이다. 한 구체예에서, 첫 번째 또는 두 번째 미리 결정된 단백질은 비고전적으로 분비된 단백질이다. 비고전적 분비는 단백질, 예를 들면, 충분히 규정된 비고전적 분비 경로를 갖는 FGF2뿐만 아니라 세포 용해/사멸로 인해 방출되는 세포질 단백질을 포함한다.
한 구체예에서, 세포 마이크로어레이는 (i) 이종성 단백질 중에서 한 가지에 대한 후보 단백질 또는 펩티드 리간드 및 (ii) 이종성 단백질 중에서 한 가지에 결합된 세 번째 형광 단백질을 포함하는 융합 단백질을 더욱 포함하거나, 또는 이종성 단백질 중에서 한 가지에 대한 펩티드 또는 단백질 리간드를 포함하는 화합물을 더욱 포함하고, 상기 화합물은 비펩티드 결합에 의해 거기에 결합된 세 번째 형광 단백질을 갖고, 여기서 상기 화합물은 세포 마이크로어레이의 이종성 단백질 중에서 한 가지에 결합된다.
한 구체예에서, 세포 마이크로어레이는 세 번째 복수의 세포를 대조로서 더욱 포함하고, 이들 세 번째 복수의 세포는 첫 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 임의선택적으로 형질전환되지만, 첫 번째 또는 두 번째 미리 결정된 이종성 단백질로 형질전환되지 않는다.
한 구체예에서, 각 복수의 세포는 복수의 포유류 세포이다.
한 구체예에서, 포유류 세포는 단리된 인간 세포이다.
한 구체예에서, 포유류 세포는 인간 배아 신장 (HEK) 세포주 세포이다.
한 구체예에서, 포유류 세포는 HEK293 세포주 세포이다.
한 구체예에서, 마이크로어레이는 최소한 10개의 상이한 복수의 세포를 포함하고, 각 복수의 세포는 미리 결정된 이종성 단백질 및 첫 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환되고, 상기 이종성 단백질은 마이크로어레이 내에 각각의 다른 복수의 형질전환된 세포에 의해 발현된 이종성 단백질과 상이하다.
한 구체예에서, 마이크로어레이는 최소한 100개의 상이한 복수의 세포를 포함하고, 각 복수의 세포는 미리 결정된 이종성 단백질 및 첫 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환되고, 상기 이종성 단백질은 마이크로어레이 내에 각각의 다른 복수의 형질전환된 세포에 의해 발현된 이종성 단백질과 상이하다.
한 구체예에서, 첫 번째 및/또는 형광 단백질은 녹색 형광 단백질 또는 황색 형광 단백질이다.
한 구체예에서, 세 번째 형광 단백질은 적색 형광 단백질이다.
한 구체예에서, 각 복수의 세포는 첫 번째 미리 결정된 이종성 단백질 및 첫 번째 형광 단백질만을 발현하기 위해 형질전환되고, 그리고 임의의 다른 이종성 단백질을 발현하도록 형질전환되지 않는다.
한 구체예에서, 첫 번째 미리 결정된 이종성 단백질은 다중아단위 이종성 단백질의 아단위이고, 그리고 복수의 세포는 다중아단위 이종성 단백질의 하나 또는 그 이상의 나머지 구성원을 발현하도록 또한 형질전환된다.
한 구체예에서, 첫 번째 미리 결정된 이종성 단백질은 발현될 때, C 말단을 통해 첫 번째 형광 단백질에 부착된다.
한 구체예에서, 첫 번째 미리 결정된 이종성 단백질은 발현될 때, 막경유 앵커 펩티드에 부착된다.
한 구체예에서, 세포 마이크로어레이는 첫 번째 이종성 단백질과 형광 단백질을 인코딩하는 첫 번째 복수의 발현 구조체를 마이크로어레이의 고체 표면 상에 부착하고 두 번째 이종성 단백질과 형광 단백질을 인코딩하는 최소한 두 번째 복수의 발현 구조체를 부착된 첫 번째 복수의 발현 구조체와 상이한 공간적으로 별개의 위치에서 고체 표면 상에서 마이크로어레이의 고체 표면 상에 부착하며, 그리고 각 공간적으로 별개의 위치에서 개별 발현 구조체로 세포 중에서 최소한 일부의 형질감염을 허용하기 위해, 형질감염 작용제의 존재를 포함하는 조건 하에 이들 발현 구조체를 복수의 세포와 접촉시킴으로써 제작된다.
한 구체예에서, 발현 구조체는 pEGFP-N1 발현 구조체를 포함한다. 한 구체예에서, 발현 구조체는 CMV 프로모터를 포함한다.
한 구체예에서, 세포는 곤충 세포이다. 한 구체예에서, 세포는 초파리 (Drosophila) S2 세포이다.
한 구체예에서, 첫 번째 또는 두 번째 미리 결정된 이종성 단백질은 면역글로불린 상과 단백질, TNF 수용체 단백질, 사이토킨, 케모킨, 유형 1 막경유 수용체 단백질, 유형 2 막경유 수용체 단백질, 이온 통로 단백질 또는 막 전달체 단백질이다.
한 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 첫 번째 또는 두 번째 미리 결정된 이종성 단백질은 1) 인간의 전체 세크레톰 (즉, GPCRCs를 비롯하여 ~8000개의 분비되고 필수적인 막 단백질); 2) 인간/생쥐의 비고전적으로 분비된 단백질; 3) 세포 표면 또는 분비된 단백질에 결합을 통해 세포외 기능을 전시하는 세포질 단백질; 또는 4) 병원체 분비된 또는 필수적인 막 단백질이다.
한 구체예에서, 첫 번째 또는 두 번째 미리 결정된 이종성 단백질은 톨-유사 수용체, TNF 수용체, GPCR, 성장 인자 수용체, 넥틴, 인터류킨, 또는 인터류킨 수용체이다.
한 구체예에서, 첫 번째 또는 두 번째 미리 결정된 이종성 단백질은 포유류이다.
한 구체예에서, 첫 번째 또는 두 번째 미리 결정된 이종성 단백질은 혈장-막 국부적인 위치에서 발현된다. 한 구체예에서, 첫 번째 및/또는 두 번째 이종성 단백질은 분비된 단백질, 막경유 단백질 또는 세포 표면 단백질이다. 한 구체예에서, 세포 마이크로어레이는 이종성 단백질을 발현하도록 형질전환된 100, 200, 300, 400 또는 500개 또는 그 이상의 상이한 복수의 세포 중에서 하나를 포함하고, 여기서 각 복수의 세포는 다른 복수의 형질전환된 세포에 의해 발현된 이종성 단백질과 서로 상이한 이종성 단백질을 발현한다. 한 구체예에서, 세포 마이크로어레이는 이종성 단백질을 발현하도록 형질전환된 750개 또는 그 이상의 상이한 복수의 세포를 포함하고, 여기서 각 복수의 세포는 다른 복수의 형질전환된 세포에 의해 발현된 이종성 단백질과 서로 상이한 이종성 단백질을 발현한다. 한 구체예에서, 세포 마이크로어레이는 이종성 단백질을 발현하도록 형질전환된 1000개 또는 그 이상의 상이한 복수의 세포를 포함하고, 여기서 각 복수의 세포는 다른 복수의 형질전환된 세포에 의해 발현된 이종성 단백질과 서로 상이한 이종성 단백질을 발현한다.
한 구체예에서, 이종성 단백질은 분비된 단백질이고 막경유 나선에 융합되어 발현된다.
한 구체예에서, 첫 번째 형광 단백질 및 두 번째 형광 단백질은 동일한 유형이고, 그리고 세 번째 형광 단백질은 상이한 유형이다.
한 구체예에서, 각 복수의 세포는 복수의 세포의 반점 내로 나눠지고, 각 복수의 세포는 상기 복수에서 세포의 전체 숫자보다 적고, 그리고 여기서 각 반점은 다른 복수의 반점보다 동일한 복수의 세포의 다른 반점에 더욱 가깝도록 배열된다.
본원에서 설명된 바와 같은 세포 마이크로어레이를 만들기 위한 방법이 제공되고, 첫 번째 이종성 단백질과 첫 번째 형광 단백질을 인코딩하는 첫 번째 복수의 발현 구조체를 마이크로어레이의 고체 표면 상에 부착하고 두 번째 이종성 단백질과 두 번째 형광 단백질을 인코딩하는 최소한 두 번째 복수의 발현 구조체를 부착된 첫 번째 복수의 발현 구조체와 상이한 공간적으로 별개의 위치에서 마이크로어레이의 고체 표면 상에 부착하며, 그리고 세포가 고체 표면에 부착하고 각 공간적으로 별개의 위치에서 개별 발현 구조체로 세포 중에서 최소한 일부의 형질감염이 발생하도록 허용하기 위해, 형질감염 작용제의 존재를 포함하는 조건 하에 이들 발현 구조체를 복수의 세포와 접촉시키는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 발현 구조체는 이종성 단백질 및 형광 단백질을 단일 공유적으로 융합된 폴리펩티드로서 포괄하는 융합 단백질에 대한 단일 전사체를 인코딩할 수 있다. 한 구체예에서, 발현 구조체는 이종성 단백질 및 형광 단백질을 2개의 상이한 폴리펩티드 (가령, IRES 구조체)로서 인코딩할 수 있다. 한 구체예에서, 결찰 독립된 클로닝 (LIC)이 발현 구조체를 제조하는데 이용된다. 한 구체예에서, 전통적인 제한 부위 클로닝이 이용된다.
후보 단백질 또는 펩티드가 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합하는 지를 결정하기 위한 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 두 번째 단백질을 본원에서 설명된 세포 마이크로어레이의 이종성 단백질로서 발현하고, 그리고 세포 마이크로어레이를 후보 단백질 또는 펩티드와 접촉시키고, 여기서 후보 단백질 또는 펩티드는 거기에 세 번째 형광 단백질 또는 펩티드를 부착하고, 결합되지 않은 후보 단백질 또는 펩티드를 제거하기 위해 후보 단백질 또는 펩티드와 접촉된 세포 마이크로어레이를 세척하고, 그리고 세척 후, 세포 마이크로어레이에 결합된 임의의 후보 단백질 또는 펩티드가 있는 지를 결정하는 것을 포함하고, 여기서 첫 번째 이종성 단백질로 형질전환된 세포에 상응하는 첫 번째 공간 위치에서 세척 후, 세포 마이크로어레이에 결합된 후보 단백질 또는 펩티드의 존재는 후보 단백질 또는 펩티드가 첫 번째 이종성 단백질에 결합한다는 것을 지시하고, 그리고 여기서 세척 후, 첫 번째 공간 위치에서 세포 마이크로어레이에 결합된 후보 단백질 또는 펩티드의 부재는 후보 단백질 또는 펩티드가 이종성 단백질에 결합하지 않는다는 것을 지시한다.
한 구체예에서, 세척 후, 세포 마이크로어레이에 결합된 임의의 후보 단백질 또는 펩티드가 존재하는 지를 결정하는 것은 세 번째 형광 단백질의 형광을 계측하고 세포 마이크로어레이 상에서 이의 위치를 결정함으로써 달성되고, 여기서 공간적으로 별개의 위치에서 세 번째 형광 단백질과 첫 번째 또는 두 번째 형광 단백질의 동시국지화는 첫 번째 단백질 또는 펩티드가 공간적으로 별개의 위치에 상응하는 이종성 단백질에 결합된다는 것을 지시한다.
(i) 마이크로어레이 고체 표면 및 세포 표면 상에서 후보 리간드 단백질 또는 펩티드와 첫 번째 C 말단 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 현탁-적합된 세포주, 그리고 (ii) 최소한 a) 세포 표면 상에서 미리 결정된 이종성 단백질 및 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 두 번째 복수의 세포, 또는 b) 이종성 단백질을 표면에 부착하고 두 번째 형광 단백질을 부착한 복수의 마이크로비드를 포함하는 시스템이 또한 제공되고, 여기서 a) 또는 b)는 마이크로어레이 고체 표면에 부착된다. 상기에서 필요한 부분만 약간 수정된 시스템이 또한 제공되는데, 여기서 후보 리간드 단백질 또는 펩티드는 두 번째 복수의 형질전환된 세포 또는 복수의 마이크로비드 상에서 발현되고, 그리고 이종성 단백질은 형질전환된 현탁-적합된 세포주의 세포 표면 상에서 발현된다.
마이크로어레이 상에서 세포는 1) 형광으로-표지화된 프로브 단백질; 2) 형광 마이크로비드 상에 제공된 프로브 단백질; 및/또는 3) 표면 상에서 프로브 분자를 발현하는 세포로 탐침될 수 있다.
한 구체예에서, 시스템은 c) 세포 표면 상에서 상이한 미리 결정된 이종성 단백질 및 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 하나 또는 그 이상의 추가 복수의 세포, 또는 d) 상이한 미리 결정된 이종성 단백질을 표면에 부착하고 두 번째 형광 단백질을 부착한 하나 또는 그 이상의 추가 복수의 마이크로비드를 더욱 포함하고, 여기서 c) 또는 d)는 복수 a) 및/또는 b)로부터 공간적으로 별개의 위치에서 마이크로어레이 고체 표면에 부착된다.
한 구체예에서, 이종성 단백질은 단백질 A 분자를 통해 마이크로비드에 부착된다.
한 구체예에서, 세포 표면 상에서 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 발현하기 위해 형질전환된 현탁-적합된 세포주는 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 핵산 구조체로 일시적으로 형질감염된다. 한 구체예에서, 이종성 단백질은 마이크로비드에 부착된 항체에 의해 결합됨으로써 마이크로비드에 부착된다. 한 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 형광 단백질은 상이한 칼라이다. 한 구체예에서, 한 가지 형광 단백질은 녹색이고 다른 형광 단백질은 적색이다. 무제한적 실례는 녹색 형광 단백질 및 mCherry™을 포함한다.
한 구체예에서, 복수의 세포는 복수의 포유류 세포이다. 한 구체예에서, 포유류 세포는 단리된 인간 세포이다. 한 구체예에서, 포유류 세포는 인간 배아 신장 (HEK) 세포주 세포이다. 한 구체예에서, 포유류 세포는 HEK293 세포주 세포이다.
한 구체예에서, 미리 결정된 이종성 단백질은 다중아단위 이종성 단백질의 아단위이고, 그리고 복수의 세포는 다중아단위 이종성 단백질의 하나 또는 그 이상의 나머지 구성원을 발현하도록 또한 형질전환된다. 한 구체예에서, 미리 결정된 이종성 단백질은 분비된 단백질, 막 단백질 또는 세포 표면 단백질이다. 한 구체예에서, 미리 결정된 이종성 단백질은 발현될 때, C 말단을 통해 형광 단백질에 부착된다. 한 구체예에서, 미리 결정된 이종성 단백질은 분비된 단백질이고, 그리고 발현될 때, 막경유 앵커 펩티드 또는 단백질에 부착된다. 한 구체예에서, 발현 구조체는 pEGFP-N1 발현 구조체 및/또는 CMV 프로모터를 포함한다. 한 구체예에서, 이종성 단백질은 면역글로불린 상과 단백질, TNF 수용체 단백질, 사이토킨, 케모킨, 유형 1 막경유 수용체 단백질, 유형 2 막경유 수용체 단백질, 이온 통로 단백질 또는 막 전달체 단백질이다. 한 구체예에서, 이종성 단백질은 톨-유사 수용체, TNF 수용체, GPCR, 성장 인자 수용체, 넥틴, 인터류킨, 또는 인터류킨 수용체이다. 한 구체예에서, 이종성 단백질은 포유류이다. 한 구체예에서, 이종성 단백질은 혈장-막 국부적인 위치에서 발현된다.
후보 리간드 단백질 또는 펩티드가 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합하는 지를 결정하기 위한 방법, 상기 방법은 본 발명의 시스템의 현탁-적합된 세포주 복수에서 후보 리간드 단백질 또는 펩티드 및 첫 번째 형광 단백질을 발현하고, 그리고 상기 복수를 a) 이종성 단백질 및 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 두 번째 복수의 세포, 또는 b) 이종성 단백질 및 두 번째 형광 단백질을 표면에 부착한 복수의 마이크로비드와 접촉시키고, 그리고 결합되지 않은 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 제거하기 위해 세척하고, 그리고 첫 번째와 두 번째 형광 단백질 둘 모두의 동시국지화를 보여주는 세포를 FACS 분석에 의해 확인하는 것을 포함하고, 여기서 공간적으로 별개의 위치에서 첫 번째와 두 번째 형광 단백질 둘 모두의 동시국지화를 보여주는 세포는 첫 번째 단백질 또는 펩티드가 공간적으로 별개의 위치에 상응하는 이종성 단백질에 결합된다는 것을 지시한다.
한 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 형광 단백질 둘 모두의 동시국지화는 FACS 분석에 의해 결정된다.
혈액친화성 상호작용의 특정한 구체예에서, 후보 리간드 단백질 또는 펩티드 및 두 번째 단백질 또는 펩티드는 동일한 서열을 갖는다.
다음을 포함하는 시스템이 제공된다: 세포 표면 상에서 첫 번째 이종성 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 발현하고 첫 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 벡터로 형질전환된 첫 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 여기서 상기 벡터는 첫 번째 이종성 후보 리간드 단백질 또는 펩티드에 대한 독특한 미리 결정된 15-35개 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 독특한 서열은 하나 또는 그 이상의 보편적인 프라이머(들)에 의해 기폭될 수 있고, 그리고 세포 표면 상에서 두 번째 이종성 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 발현하고 첫 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 두 번째 벡터로 형질전환된 두 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 여기서 상기 두 번째 벡터는 두 번째 이종성 후보 리간드 단백질 또는 펩티드에 대한 상이한 독특한 미리 결정된 15-35개 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 그리고 (i) 세포 표면 상에서 수용체 단백질 또는 펩티드를 발현하고 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 하나 또는 그 이상의 추가 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 상기 두 번째 현탁-적합된 세포주는 안정되게-발현된 펩티드 세포 표면 에피토프를 포함하고, 또는 (ii) 수용체 단백질을 표면에 부착하고 두 번째 형광 단백질을 부착한 복수의 자성 마이크로비드.
한 구체예에서, 수용체 단백질은 고전적으로 인식되는 수용체일 수 있다. 한 구체예에서, 수용체 단백질은 고전적으로 인식되는 수용체가 아니고 단순히 상기 리간드에 대한 수용 단백질이다.
다음을 포함하는 시스템이 제공된다: 세포 표면 상에서 첫 번째 이종성 단백질을 발현하고 첫 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 벡터로 형질전환된 첫 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 여기서 상기 벡터는 첫 번째 이종성 단백질에 대한 독특한 미리 결정된 15-35개 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 독특한 서열은 하나 또는 그 이상의 보편적인 프라이머(들)에 의해 기폭될 수 있고, 그리고 세포 표면 상에서 두 번째 이종성 단백질을 발현하고 첫 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 두 번째 벡터로 형질전환된 두 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 여기서 상기 두 번째 벡터는 두 번째 이종성 단백질에 대한 상이한 독특한 미리 결정된 15-35개 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 그리고 (i) 세포 표면 상에서 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 발현하고 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 하나 또는 그 이상의 추가 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 상기 두 번째 현탁-적합된 세포주는 안정되게-발현된 펩티드 세포 표면 에피토프를 포함하고, 또는 (ii) 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 표면에 부착하고 두 번째 형광 단백질을 부착한 복수의 자성 마이크로비드.
한 구체예에서, 보편적인 프라이머는 T7 전방과 후방 보편적인 프라이머를 포함한다.
한 구체예에서, 펩티드 세포 표면 에피토프는 FLAG 에피토프 (DYKDDDDK) (서열 번호: 1)이다. 한 구체예에서, 상기 시스템은 자성 분자 실체를 포함하는 항-FLAG 에피토프 항체를 더욱 포함하고, 상기 항체는 FLAG 에피토프에 결합된다.
한 구체예에서, 자성 분자 실체는 초상자성 철-함침된 비드이다. 한 구체예에서, 독특한 미리 결정된 20-35개 뉴클레오티드 서열은 길이에서 28개 뉴클레오티드이다.
후보 리간드 단백질 또는 펩티드가 두 번째 미리 결정된 단백질에 결합하는 지를 결정하기 위한 방법이 또한 제공되고, 두 번째 미리 결정된 단백질을 본 발명의 시스템의 이종성 단백질로서 발현하고, 그리고 (i) 세포 표면 상에서 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 발현하고 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 하나 또는 그 이상의 추가 복수의 현탁-적합된 세포주 세포의 후보 리간드 단백질 또는 펩티드, 상기 두 번째 현탁-적합된 세포주는 안정되게-발현된 펩티드 세포 표면 에피토프를 포함하고, 또는 (ii) 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 표면에 부착하고 두 번째 형광 단백질을 부착한 복수의 자성 마이크로비드의 후보 리간드 단백질 또는 펩티드와 접촉시키고;
두 번째 복수의 세포 중에서 하나 또는 그 이상에 또는 복수의 자성 마이크로비드에 결합된 첫 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포 중에서 한 가지를 자력에 의해 분리하고;
이런 분리된 세포-세포 또는 세포-마이크로비드 접합체로부터 DNA를 획득하고, 그리고 독특한 서열이 DNA 내에 존재하면, 이를 보편적인 프라이머를 이용하여 증폭하고;
독특한 서열의 사본을 염기서열결정하여 이의 존재를 확증하고;
이렇게 확인된 독특한 서열(들)을 독특한 미리 결정된 15-35개 뉴클레오티드 서열을 특정한 이종성 단백질 또는 펩티드와 상관하는 데이터베이스에 대하여 비교하고, 그리고 따라서, 이렇게 상관된 임의의 이종성 단백질 또는 펩티드 결합을 확인하고,
따라서 특정한 이종성 단백질 또는 펩티드를 후보 단백질 또는 펩티드에 결합하는 것으로 확인하는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 후보 리간드 단백질 또는 펩티드는 단백질 A 분자를 통해 마이크로비드에 부착된다. 한 구체예에서, 후보 리간드 단백질 또는 펩티드는 마이크로비드에 부착된 항체에 의해 결합됨으로써 마이크로비드에 부착된다. 한 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 형광 단백질은 상이한 칼라이다. 한 구체예에서, 한 가지 형광 단백질은 녹색이고 다른 형광 단백질은 적색이다. 이런 형광 단백질의 무제한적 실례는 상기에서 제공된다. 한 구체예에서, 복수의 세포는 복수의 포유류 세포이다. 한 구체예에서, 포유류 세포는 인간 배아 신장 (HEK) 세포주 세포이다. 한 구체예에서, 포유류 세포는 HEK293 세포주 세포이다. 한 구체예에서, 미리 결정된 이종성 단백질은 다중아단위 이종성 단백질의 아단위이고, 그리고 복수의 세포는 다중아단위 이종성 단백질의 하나 또는 그 이상의 나머지 구성원을 발현하도록 또한 형질전환된다. 한 구체예에서, 미리 결정된 이종성 단백질은 발현될 때, C 말단을 통해 형광 단백질에 부착된다. 한 구체예에서, 미리 결정된 이종성 분비된 단백질은 발현될 때, 막경유 앵커 펩티드에 부착된다. 한 구체예에서, 이종성 단백질은 면역글로불린 상과 단백질, TNF 수용체 단백질, 사이토킨, 케모킨, 유형 1 막경유 수용체 단백질, 유형 2 막경유 수용체 단백질, 이온 통로 단백질 또는 막 전달체 단백질이다. 한 구체예에서, 이종성 단백질은 톨-유사 수용체, TNF 수용체, GPCR, 성장 인자 수용체, 넥틴, 인터류킨, 또는 인터류킨 수용체이다. 한 구체예에서, 이종성 단백질은 포유류이다. 한 구체예에서, 이종성 단백질은 혈장-막 국부적인 위치에서 발현된다.
다음을 포함하는 시스템: (i) 첫 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 여기서 상기 복수의 세포는 (a) 세포 표면 상에서 이종성 단백질을 발현하고 (b) 첫 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 벡터로 형질전환되고, 그리고 여기서 상기 벡터는 첫 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포가 최소한 2가지 상이한 유형의 첫 번째 이종성 단백질을 발현하도록, 발현된 이종성 단백질에 대해 독특한 미리 결정된 15-35개 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 그리고 (ii) 세포 표면 상에서 두 번째 이종성 단백질을 발현하고 두 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 두 번째 벡터로 형질전환된 두 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 여기서 두 번째 복수의 현탁-적합된 세포는 단일 유형의 두 번째 이종성 단백질을 발현한다. 한 구체예에서, 첫 번째 복수의 세포의 임의의 개별 세포는 세포 표면 상에서 단지 한 가지 이종성 단백질만을 발현한다. 한 구체예에서, 첫 번째 복수의 상이한 유형의 첫 번째 이종성 단백질 중에서 어느 것도 두 번째 복수의 두 번째 이종성 단백질과 동일한 서열을 갖지 않는다.
한 구체예에서, 두 번째 이종성 단백질은 막 수용체이다. 한 구체예에서, 첫 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포에서 발현된 각각의 이종성 단백질은 분비된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이다. 한 구체예에서, 상이한 유형의 복수의 첫 번째 이종성 단백질은 미리 결정된 야생형 단백질의 각 돌연변이체이다. 한 구체예에서, 두 번째 이종성 단백질은 야생형 단백질이다. 한 구체예에서, 첫 번째 복수의 상이한 단백질 중에서 각 유형의 이종성 단백질은 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 잔기 점 돌연변이에 의해 상기 복수의 각각 다른 유형의 이종성 단백질과 상이하다. 한 구체예에서, 복수의 상이한 단백질 중에서 각 유형의 단백질은 1개 아미노산 잔기 점 돌연변이에 의해 상기 복수의 각각 다른 유형의 이종성 단백질과 상이하다.
한 구체예에서, 독특한 서열은 하나 또는 그 이상의 보편적인 프라이머(들)에 의해 기폭될 수 있다. 한 구체예에서, 독특한 서열은 15-35개 뉴클레오티드이다. 한 구체예에서, 첫 번째 또는 두 번째 형광 단백질은 녹색이다. 한 구체예에서, 다른 형광 단백질은 적색이다.
후보 리간드 단백질 또는 펩티드가 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합하는 지를 결정하기 위한 방법이 또한 제공되고, 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 본원에서 설명된 바와 같은 시스템에서 첫 번째 복수의 세포의 첫 번째 이종성 단백질로서 발현하고 두 번째 단백질 또는 펩티드를 첫 번째 이종성 단백질이 두 번째 이종성 단백질에 결합하도록 허용하는 조건 하에 본원에서 설명된 바와 같은 시스템에서 두 번째 이종성 단백질로서 발현하고, 그리고 임의선택적으로, 임의의 결합되지 않은 첫 번째 이종성 단백질을 제거하기 위해 세척하고, 이후 첫 번째와 두 번째 이종성 단백질 둘 모두의 동시국지화를 갖는 세포를 회수하고, 회수된 세포로부터 핵산을 획득하고, 상기 핵산을 염기서열결정하여 그 안에 내포된 독특한 15-35개 뉴클레오티드 서열을 확인하고, 따라서 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합한 독특한 15-35개 뉴클레오티드에 상응하는 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 확인하는 것을 포함한다.
두 번째 단백질에 첫 번째 단백질의 결합에 대한 첫 번째 단백질의 미리 결정된 아미노산 잔기의 효과를 결정하기 위한 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 첫 번째 단백질에 비하여 하나 또는 그 이상의 점 돌연변이로 돌연변이된 단백질을 본원에서 설명된 시스템의 첫 번째 현탁-적합된 세포주 복수에서 복수의 상이한 유형의 이종성 단백질로서 발현하고, 그리고 상기 복수를 두 번째 단백질 및 두 번째 형광 단백질을 발현하기 위해 형질전환된 본원에서 설명된 시스템의 두 번째 복수의 세포의 두 번째 이종성 단백질의 형태에서 두 번째 단백질과 접촉시키고, 그리고 첫 번째와 두 번째 형광 단백질 둘 모두의 동시국지화를 보여주는 세포를 회수하고, 회수된 세포로부터 핵산을 획득하고, 상기 핵산을 염기서열결정하여 그 안에 내포된 독특한 15-35개 뉴클레오티드 서열을 확인하고, 따라서 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합한 첫 번째 단백질을 확인하고, 그리고 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합한 단백질의 수준을 미리 결정된 참고 수준에 비교하는 것을 포함하고,
여기서 미리 결정된 참고 수준을 초과하여 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합한 단백질의 수준은 상기 단백질에서 돌연변이된 잔기 또는 잔기들이 두 번째 단백질에 첫 번째 단백질 결합을 증강한다는 것을 지시하고, 그리고 여기서 미리 결정된 참고 수준 미만으로 두 번째 단백질 또는 펩티드에 결합한 단백질의 수준은 상기 단백질에서 돌연변이된 잔기 또는 잔기들이 두 번째 단백질에 첫 번째 단백질 결합을 저해한다는 것을 지시한다.
한 구체예에서, 미리 결정된 수준은 대조이다. 한 구체예에서, 미리 결정된 수준은 두 번째 단백질에 결합하는 돌연변이되지 않은 첫 번째 단백질의 수준을 검정함으로써 획득된다. 이들 방법의 한 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 형광 단백질 둘 모두의 동시국지화를 보여주는 세포는 FACS 분석을 통해 회수된다.
다음을 포함하는 시스템이 또한 제공된다: (i) 세포 표면 상에서 첫 번째 이종성 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 발현하고 첫 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 벡터로 형질전환된 첫 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포 및 세포 표면 상에서 두 번째 이종성 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 발현하고 두 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 두 번째 벡터로 형질전환된 두 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 그리고 (ii) 표적 단백질, 펩티드 또는 항체를 표면에 부착한 복수의 자성 마이크로비드.
2개의 후보 리간드 단백질 또는 펩티드 중에서 하나 또는 그 이상이 표적 단백질, 펩티드 또는 항체에 결합하는 지를 결정하기 위한 방법이 또한 제공되고, 첫 번째 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 본 발명의 시스템에서 첫 번째 복수의 세포의 첫 번째 이종성 단백질로서 발현하고 두 번째 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 첫 번째 이종성 단백질 및 두 번째 이종성 단백질이 표적 단백질, 펩티드 또는 항체에 결합하도록 허용하는 조건 하에 본 발명의 시스템에서 두 번째 이종성 단백질로서 발현하고, 그리고 첫 번째 형광 단백질-발현 세포로 복합화된 및/또는 두 번째 형광 단백질-발현 세포로 복합화된 임의의 마이크로비드를 회수하고, 그리고 복합체에서 후보 리간드 단백질을 확인하는 것을 포함하고, 여기서 첫 번째 형광 단백질-발현 세포의 복합체에 부착된 마이크로비드의 회수는 첫 번째 후보 리간드 단백질 또는 펩티드가 표적 단백질 또는 펩티드에 결합한다는 것을 지시하고, 그리고 여기서 두 번째 형광 단백질-발현 세포의 복합체에 부착된 마이크로비드의 회수는 두 번째 후보 리간드 단백질 또는 펩티드가 표적 단백질 또는 펩티드에 결합한다는 것을 지시하고, 그리고 여기서 첫 번째 형광 단백질 발현 세포 또는 두 번째 형광 단백질 발현 세포의 복합체에 부착된 마이크로비드의 회수 없음은 각각, 첫 번째 후보 리간드 단백질이 표적 단백질 또는 펩티드에 결합하지 않고, 그리고 두 번째 후보 리간드 단백질이 표적 단백질 또는 펩티드에 결합하지 않는다는 것을 지시한다.
다음을 포함하는 시스템이 제공된다: (i) 세포 표면 상에서 첫 번째 이종성 표적 단백질 또는 펩티드를 발현하고 첫 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 벡터로 형질전환된 첫 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포 및 세포 표면 상에서 두 번째 이종성 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 발현하고 두 번째 세포질-발현 형광 단백질을 발현하기 위한 두 번째 벡터로 형질전환된 하나 또는 그 이상의 두 번째 복수의 현탁-적합된 세포주 세포, 그리고 (ii) 후보 리간드 단백질 또는 펩티드에 지향되거나, 또는 표적 단백질 또는 펩티드에 지향된 항체를 표면에 부착한 복수의 자성 마이크로비드. 후보 리간드 단백질 또는 펩티드가 표적 단백질 또는 펩티드에 결합하는 지를 결정하기 위한 방법이 또한 제공되고, 후보 리간드 단백질 또는 펩티드를 본 발명의 시스템에서 두 번째 복수의 세포의 두 번째 이종성 단백질로서 발현하고 표적 단백질 또는 펩티드를 후보 리간드 단백질 또는 펩티드 및 표적 단백질 또는 펩티드가 결합하도록 허용하는 조건 하에 본 발명의 시스템에서 첫 번째 이종성 단백질로서 발현하고, 그리고 첫 번째 형광 단백질-발현 세포 및 두 번째 형광 단백질-발현 세포 둘 모두로 복합화된 임의의 마이크로비드를 회수하는 것을 포함하고, 여기서 첫 번째 형광 단백질-발현 세포 및 두 번째 형광 단백질-발현 세포 둘 모두의 복합체에 부착된 마이크로비드의 회수는 후보 리간드 단백질 또는 펩티드가 표적 단백질 또는 펩티드에 결합한다는 것을 지시하고, 그리고 여기서 첫 번째 형광 단백질-발현 세포 및 두 번째 형광 단백질-발현 세포 둘 모두의 복합체에 부착된 마이크로비드의 회수 없음은 후보 리간드 단백질이 표적 단백질 또는 펩티드에 결합하지 않는다는 것을 지시한다.
이들 방법의 한 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 형광 단백질 둘 모두의 동시국지화를 보여주는 세포는 자성으로 분류된다. 자성 실체, 예를 들면, 비드는 두 번째 복수의 세포에 부착될 수 있고, 첫 번째와 두 번째 형광 단백질 둘 모두의 동시국지화를 보여주는 세포가 확인될 때 자성 분리가 적용된다. 따라서, 본원에서 설명된 방법과 시스템은 두 번째 복수의 세포의 세포에 부착된 자성 실체, 예를 들면, 자성 마이크로비드를 포함할 수 있고, 그리고 두 번째 복수의 세포의 세포에 부착된 자성 실체, 예를 들면, 자성 마이크로비드를 부착하는 것을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 이종성 단백질 또는 펩티드는 단백질의 공급원 (가령, 다른 세포 유형 또는 다른 종)에 관해서 자신이 발현되는 세포에 이종유래한다. 한 구체예에서, 이종성 단백질 또는 펩티드는 위치에 관해서 자신이 발현되는 세포에 이종유래한다, 예를 들면, 상기 단백질은 정상적인 생리학적 조건 (가령, 생체내) 하에 상기 위치 (가령, 세포 표면)에서 발현되지 않는다.
이들 방법의 한 구체예에서, PCR이 독특한 15-35개 뉴클레오티드 서열 상에서 수행된다. 한 구체예에서, 심층 염기서열결정이 독특한 15-35개 뉴클레오티드 서열을 확인하기 위해 모아진 PCR 산물에서 수행된다. 이들 방법의 한 구체예에서, 이들 방법은 독특한 15-35개 뉴클레오티드 서열이 분류전 (또는 회수전)과 대비하여 분류후 (또는 회수후) 농축되는 지를 결정하는 것을 포함한다.
본원에서 설명된 방법과 시스템의 한 구체예에서, 독특한 서열은 20-35개 뉴클레오티드이다. 본원에서 설명된 방법과 시스템의 한 구체예에서, 독특한 서열은 20-30개 뉴클레오티드이다. 본원에서 설명된 방법과 시스템의 한 구체예에서, 독특한 서열은 25-30개 뉴클레오티드이다. 본원에서 설명된 방법과 시스템의 한 구체예에서, 독특한 서열은 길이에서 20개 뉴클레오티드이다. 본원에서 설명된 방법과 시스템의 한 구체예에서, 독특한 서열은 길이에서 28개 뉴클레오티드이다.
본원에서 설명된 방법의 한 구체예에서, 동시국지화 세포, 또는 회수된 세포는 용해되고, 그리고 이들의 상층액의 내용물 상에서 염기서열결정이 수행된다.
본원에서 설명된 방법의 추가의 구체예에서, 이들 방법은 다중웰 접시에서 수행되고, 각 웰에서 앰플리콘은 나머지 웰의 것들과 상이하다. 한 구체예에서, 다중웰 접시의 상이한 웰은 상이한 수용체 단백질을 포함한다.
본원에서 설명된 다양한 원소의 모든 조합은 본원에서 달리 지시되지 않으면 또는 문맥에 의해 달리 명백하게 부인되지 않으면, 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명은 하기의 실험적 상세로부터 더욱 잘 이해될 것이다. 하지만, 당업자는 논의된 특정한 방법과 결과가 하기의 청구항에서 더욱 충분히 설명된 바와 같은 본 발명을 단지 예시한다는 것을 쉽게 인지할 것이다.
실험적 상세
수용체:리간드 복합체의 지속된 구조적 특성화에 대한 필요: 면역글로불린 (Ig), TNF/TNFR, GPCR, 케모킨과 수용체 키나아제 상과의 구성원을 비롯한 넓은 범위의 생체분자는 세크레톰의 체계적인 구조적 특성화의 목적에 중심이 된다. 최적 T 세포 기능을 위한 주요 신호를 제공하는 면역글로불린 상과 (IgSF)의 부분집합인 CD28 수용체 패밀리 (즉, CD28, CTLA-4, ICOS 및 PD-1)가 아래에 설명된다 [41-43]. 이들 신호전달 수용체는 구조적 특질을 공유하고, 그리고 유사한 상호작용 방식을 갖는 관련된 세포 표면 리간드 (가령, B7-1, B7-2, ICOS-L, PD-L1 및 PD-L2)를 인식한다 (도면 1) [44, 45]. 가령, B7-1과 B7-2에 의한 CD28의 포용은 T 세포 활성화를 야기하는 반면, CTLA-4에 의한 동일한 B7 리간드의 포용은 저해 신호를 제공한다. 유도성 동시자극성 수용체 (ICOS)는 ICOS-L에 결합 시에 추가 중요한 양성 신호를 제공하고 (즉, 동시자극성), 그리고 2개의 B7-유사 리간드, PD-L1과 PD-L2 중에서 어느 한쪽으로 PD-1의 포용은 추가 저해성 경로를 개시한다 (즉, 동시저해성). 본 실험실로부터 여러 개를 비롯한 이들 분자와 복합체의 구조 [28, 35, 46-48]는 도면 1에서 요약된 바와 같은 동시자극성과 동시저해성 신호전달을 위해 필요한 근본적인 기계적인 특질 (가령, 올리고머성 상태, 원자가, 리간드 특이성 등) 및 전반적인 조직적 원리를 규정하는데 중요하였다 [45].
기본적인 생물물리학적 및 조직적 특질을 규정하는 것을 뛰어넘어, 이들 구조는 신규한 생화학적 시약 및 독특한 기계적으로 유익한 모델 시스템을 산출하기 위한 기초를 제공한다. 가령, PD-1:PD-L2 복합체의 본원에서 개시된 구조 [35]에 의해 유도된 돌연변이체 뮤린 PD-1 수용체가 산출되었는데, 이것은 야생형 친화성으로 뮤린 PD-L2에 결합하지만, PD-L1과의 어떤 상호작용도 전시하지 않는다. 이들 조사 결과에 기초하여, 정상적인 생리학과 질환에서 이들 두 리간드-연관된 신호전달 경로의 기계적인 역할을 해부하는 전례 없는 기회를 제공하는 Ig-융합 단백질과 녹인 생쥐 모델의 산출이 본원에서 개시된다 (도면 2). 또한, 이러한 복합체의 구조에 기초하여, 인간 PD-1 수용체의 단일 점 돌연변이체가 각각, 인간 PD-L1과 PD-L2에 대한 50-배와 30-배 더욱 높은 친화성에서 산출되었다 (미발표 데이터). 이러한 시약은 독특한 치료적 기회를 제공할 수 있는 신규한 높은 친화성 종류를 대표한다 (하기 참조). 이들 실례는 이런 수용체:리간드 구조의 귀중한 가치 및 이들이 생물학적 통찰력과 새로운 치료적 기회를 위해 수용될 수 있는 방식을 강조한다.
새로운, 결정적인 수용체:리간드 상호작용은 여전히 규정되어야 한다. 본 출원과 특히 관련해서, 심지어 수용체의 매우 면밀히 조사된 CD28 패밀리 내에서도, 추가의 중요한 상호작용이 단지 매우 최근에야 발견되었다. B7-1은 PD-L1에 결합하여 양지향성 저해 신호를 유발하는 것으로 증명된 반면, ICOS-L은 CD28과 CTLA4 둘 모두에 결합하는 것으로 증명되었는데, CD28:ICOS-L 상호작용은 인간 T 세포 활성화에 필수적이다 [49, 50]. 이들 교차하고 경쟁하는 상호작용은 신호전달 경로의 고도로 복잡한 네트워크를 유발한다. 이들 실례는 수용체:리간드 상호작용의 전체 레퍼토리를 조직적으로 규정하는 가치를 강조하는데, 그 이유는 심지어 단일한 새로운 수용체:리간드 쌍의 발견도 T 세포 기능, 인간 생리학과 질환에 유관한 신호전달 경로의 기계론적인 이해에 유의미하게 충격을 줄 수 있기 때문이다.
수용체:리간드 복합체의 치료적 관련성. 중요하게는, 많은 세포 표면 분자 및 이들의 연관된 결합 상대는 넓은 범위의 인간 질환을 치료하기 위한 신호전달 경로의 신중한 조정을 위한 탁월한 표적이다. 세포 표면 면역 수용체와 리간드를 표적으로 하는 기능 차단 항체는 감염성 질환, 자가면역 질환, 그리고 악성을 치료하기 위한 면역반응의 조작을 위한 주요 부류의 단백질 치료제이다. 주요 실례는 CTLA-4 저해성 수용체에 대항하는 기능 차단 mAb인 Yervoy™ (Bristol Myers Squibb)를 포함하는데, 이것은 전체 면역 자극을 유발하고 2011년 3월에 후기 단계 흑색종의 치료에 대해 FDA 승인을 받았다 [51]. 이들 면역 수용체는 표적일 뿐만 아니라, 그 자체로 강력한 치료제이다. 가령, Orencia™ (BMS)로서 시판된, CTLA-4의 가용성 이형은 B7 리간드에 결합하는 것에 대해 CD28과 경쟁하고 CD28-연관된 자극성 경로의 저해를 유발한다. CD28 자극의 차단은 Orencia를 류마티스성 관절염을 비롯한 자가면역 질환을 위한 선도적인 치료제로 만드는 전체 면역 억제를 유발한다 [52]. 2개의 점 돌연변이를 소유하는 Orencia의 가용성 CTLA-4 변이체인 Belatacept™ (BMS)가 특히 주목된다. Belatacept는 급성 신장 이식 거부반응의 예방을 위해 2011년 11월에 FDA 승인을 받았는데, 현존하는 치료제와 동등한 효능 및 이들 돌연변이의 결과로서, 크게 감소된 부작용과 독성을 보여준다. 특히, Belatacept는 B7 리간드에 대한 항원항체결합력에서 단지 2-배 증가를 소유하지만, 생물학적 효능에서 10-배 증강을 전시한다 [26, 53]. 이런 조사 결과는 신규한 치료제의 개발을 뒷받침하는 분자 통찰력을 획득하기 위한 일차적인 동시자극성 분자와 그들의 동계 복합체의 구조적 및 생화학적 분석을 위한 지속된 역할을 강하게 뒷받침한다. 이들 원리는 전체 세크레톰으로 일반화될 수 있다.
제안된 고처리량 기술의 실현은 예로서, 인간 세크레톰과 연관된 상호작용에서 이용하고, 바이러스, 세균, 진균과 기생충 질환과 연관된 세포외 숙주:병원체 상호작용의 범위를 규정하고 (가령, [54]), 숙주:병원체 상호작용을 확인하기 위한 강력한 연구 도구를 제공할 것이다. 추가적으로, 최근 증거는 다수의 "외관상" 세포질 단백질이 세포외 기능을 또한 소유한다는 것을 암시한다 [55-59]. 비고전적 분비 기전 (즉, 신호 서열-독립된 분비)은 계속 설명되고 있고 중요한 조사의 주제이다 [60, 61]. 특히, 이들 비고전적으로 분비된 단백질 중에서 많은 수의 세포 표면 수용체가 확인되지 않았다.
포유류 세크레톰과 연관된 상호작용을 규정하는 중대한 가치는 오랫동안 인식되었고 작은 바이오테크, 큰 제약회사 및 학계로부터 상당한 연구를 이끌어냈다. 학문적 연구소로부터 발생하는 노력은 매우 간소한 규모에서 수행되었다 [62, 63]; 가장 두드러진/포괄적인 실례는 Genetech와 Five Prime Therapeutics, Inc의 기여를 포함한다. Genentech는 표면 플라스몬 공명 기술을 이용한 직접적인 결합 분석을 위한 >1000 Ig-융합 단백질의 라이브러리를 산출하기 위해 그들의 상당한 재원을 활용하였다. 이들 노력은 Ig 상과 구성원에 대한 새로운 리간드, BTLA와 TIGIT의 발견을 유발하였다 [64, 65]. 각 개별 표적 (가령, TIGIT)이 라이브러리의 각 구성원에 대하여 개별적으로 선별검사되어야 한다는 점을 고려하면, 이러한 접근법은 진정한 고처리량의 실현을 위해 필요한 특질을 결여하였다. Genentech는 ~700개 분비된 단백질이 고체 지지체 위에 개별적으로 핀으로 고정된 단백질 어레이를 최근에 설명하였다; 이러한 어레이는 차후에, ~90개 인간 Ig-융합 단백질을 개별적으로 제공하는 다가 시약으로 선별검사되었다 [66]. 이러한 플랫폼은 B7-1과 NGFR 사이에 예상치 못한 상호작용을 비롯하여, 새롭고 놀라운 수용체:리간드 상호작용의 발견을 뒷받침하였다.
이들 "배열된" 접근법과 대조적으로, Five Prime Therapeutics, Inc.는 더욱 "억지" 접근법을 취하였는데, 여기서 막경유 단백질의 분비된 단백질과 엑토도메인의 ~3400개 구조체가 293T 세포에서 개별적으로 발현되었다 [67]. 이들 단백질은 넓은 범위의 세포주에서 면역과 심혈관 기능뿐만 아니라 암 증식에 유관한 물질대사, 전사와 성장 반응을 탐침하는 30번의 상이한 HTP 검정에서 조사되었다. 이들 노력은 이전에 특징화되지 않은 단백질 IL-34이 (외관상) 충분히 특징화된 집락 자극 인자 1 수용체에 대한 리간드라는 입증을 유발하였다. 이러한 연구는 분자 (가령, IL-34)를 탈고아화하는 필요의 주요 실례이고, 그리고 심지어 충분히 특징화된 세포 표면 분자도 예상치 못한 상호작용을 가질 수 있다는 사실을 강조한다.
수용체:리간드 상호작용을 확인하기 위한 이들 고처리량 접근법은 생물학적 과학에서 가장 흥미로운 최근 발달에 속하는데, 그 이유는 이들이 새로운 근본적인 생물학적 기전을 발견하고 새로운 치료적 전략을 산출하는 잠재력을 유지하기 때문이다. 하지만, 여러 이유로 인하여, 이들 연구는 요망될 지도 모르는 넓은 확산된 충격을 달성할 수 없다. 첫 번째, 이들 검정을 위해 필요한 방대한 숫자의 분비된 단백질/Ig-융합을 산출하는 능력이 단백질 구조 계획에 의해 지원을 받는 것들을 비롯하여, 심지어 가장 야심찬 학교, 실험실의 능력 범위를 벗어난다. 게다가, 이들 접근법 모두 단백질이 정제될 수 없거나, 보관과 차후 조작 동안 불안정을 전시하거나, 또는 불리한 용해 행태 (가령, 응집, 이것은 Ig-융합 단백질을 통상적으로 괴롭힌다)를 전시하는 사례에서 실패한다. Five Prime Therapeutics 스크린의 경우에, 선별된 세포-기초된 스크린에 의해 커버되지 않는 생물학적 기능을 갖는 단백질 (또는 동계 결합 단백질)은 상호작용을 산출하지 못할 것이다. 특히, 이들 접근법 모두 GPCR, 전달체와 통로를 비롯하여, 가장 중요한 부류의 필수적인 막 단백질 중에서 일부와 양립하지 않는데, 그 이유는 이들 단백질이 일반적으로, 기능적으로 활성 물질의 고처리량 정제와 양립하지 않고 배열화의 물리적 과정을 관용할 수 없기 때문이다. 최종적으로, 그리고 아마도 가장 중요하게는, 이들 상업적인 노력으로부터 보고된 결과는 일반 대중에게 발표를 위해 허용되는 것으로 간주되는 상호작용만을 제시한다; 다양한 "비과학적" 인자가 이들 결정에 영향을 주고, 그리고 이들 중요한 데이터의 실제적인 비율이 결코 공유되지 않을 것이라는 점은 거의 확실하다.
고해상도 구조 발견, 생화학적 분석 및 치료적 개발을 위해 예로서, 포유류 세크레톰을 수반하는 상호작용의 수용가능하고 효율적인 고처리량 확인을 위한 3가지 기술이 본원에서 개시된다. 이들 개시된 기술은 현존하는 방법에 비하여 다양한 이점을 제공한다: 1) 세포 마이크로어레이 형식에서 발현은 모든 부류의 단백질 (다중스팬 필수적인 막 단백질, 예를 들면, GPCR과 전달체뿐만 아니라 다성분 수용체, 예를 들면, 인테그린 포함)의 체계적인 발현을 허용한다; 2) 세포 마이크로어레이 발현은 매우 다루기 쉬운데, 그 이유는 단지 DNA (즉, 발현 벡터)만 필요하고, 그리고 정제된 단백질 자체가 필요하지는 않기 때문이다; 3) 이들 기술 모두 직접적인 물리적 상호작용의 검출에 기초되고, 그리고 따라서, 생물학적 기능에 관한 임의의 지식을 필요로 하지 않는다; 4) 유세포분석법-기초된 방법은 미끼와 먹이 둘 모두 독립된 식별가능한 세포의 표면 상에서 발현되도록 허용하고, 따라서 정제된 단백질에 대한 모든 요건을 제거한다; 그리고 5) 심층 염기서열결정 및 분비된 단백질-발현 세포의 바코드화된 라이브러리와 연계된 자성 분리의 실행은 잠재적 수용체의 전체 패널에 대하여 많은 (모든) 리간드의 대량 평행 규문을 제공한다.
세포 표면 단백질-단백질 상호작용의 고처리량 확인을 위한 세포 마이크로어레이의 개발: 세포 마이크로어레이 기술은 단일 조회 리간드에 대하여 세포 표면 수용체의 범유전체 라이브러리 (즉, 세크레톰)을 조직적으로 선별검사하기 위해 적합된다. 이러한 접근법은 살아있는 숙주 세포의 배경에서 다수의 수용체를 정확히 배열된 형식에서 제공한다. 잠재적 수용체 구조체의 라이브러리를 효율적으로 선별검사하기 위해, 세포 마이크로어레이 기술 [68, 69]이 성공적으로 적합되었다. 각 발현 구조체 (가령, pEGFP-N1 중추에 기초된 플라스미드 및 다른 형광 변이체, 이들은 CMV 프로모터를 통해 발현을 주동한다)는 라이브러리 분자의 발현 어레이를 창출하기 위해 유리 표면 위에 개별적으로 "핀으로 고정된다". 포유류 세포는 형질감염 시약 (가령, 지질-기초된 시약)의 존재에서 이들 인쇄된 cDNA 위에 도말될 때, 형질감염되어 생존 세포 어레이를 유발하는데, 각 개별 클러스터는 라이브러리의 상이한 구성원을 발현한다 (도면 3). (이들 인쇄된 cDNA 사이에서 성장하는 세포는 형질감염되지 않고 "흑색"으로 남아있다). 이들 발현 어레이는 이후, 정제된 형광으로-태그된 조회 단백질로 시험된다. 양성 상호작용은 결합되지 않은 리간드를 제거하기 위한 세척 후, 형광의 함수로서 채점된다. 각 구조체가 마이크로어레이 내에 공지된 위치에서 "핀으로 고정"되기 때문에, 양성 "히트"는 상호작용 상대와 즉시 상관될 수 있다.
세포 마이크로어레이 플랫폼은 PD-1:PD-L1 상호작용 (Kd ~5.5 μΜ)을 이용하여 검증되었다. PD-L1의 GFP 융합 또는 GFP 단독을 발현하는 세포의 교대성 열로 구성되는 생존 세포 마이크로어레이가 산출되었다 (도면 4A). 개요 (도면 4, 왼쪽 끝)에서 예시된 바와 같이, GFP 대조는 세포질에서 발현되고 (속이 차있는 녹색 원), 반면 PD-L1에 융합된 GFP (녹색 고리)는 막 국부적이다 (PD-L1-GFP에 대해 관찰된 더욱 낮은 절대 GFP 형광은 세포질 GFP 구조체의 더욱 높은 발현 수준에 기인한다). 이들 어레이를 PD-1 엑토도메인의 적색 Alexa 594-결합된 이가 Ig-융합 (즉, Fc-융합) 구조체로 시험함으로써, 동계 PD-L1 리간드를 특이적으로 발현하는 반점이 정확하게 확인되었다 (도면 4B/C). 이들 실험은 수용체:리간드 복합체의 확인을 위한 세포 마이크로어레이 기술을 명확하게 증명한다. 도면 5는 다양한 상이한 단백질 상호작용 (PD-1:PD-L2, CTLA-4:B7-1 및 CD200R:CD200)에 대한 세포 마이크로어레이 기술을 보여준다; 이들 결과는 세포 마이크로어레이 플랫폼의 넓은 확산된 적용가능성을 더욱 검증하고, 그리고 이러한 접근법의 신호 대 잡음 및 특이성을 강조한다.
Ig 상과 (IgSF)에 속하는 넥틴/넥틴-유사 패밀리의 14개 구성원이 유사하게 조사된다. 이들 단백질 중에서 최소한 10개는 특이성 상호작용을 전시하고, 그리고 넥틴 패밀리의 구성원 사이에 최소한 20개 비특이성 상호작용이 존재한다 [70-72]. 또한 ~500개 엑토도메인 및 전체 인간 IgSF를 포함하는 분비된 단백질이 이러한 시스템을 통해 실행된다. 이들 실험에서, IgSF의 각 구성원에 대한 발현 벡터는 마이크로어레이를 산출하기 위해 인쇄되고 (즉, 각 반점은 IgSF의 단일 구성원을 나타낸다), 이것은 특정한 IgSF 구성원의 Ig 융합 구조체로 탐침된다. 대다수의 IgSF 구성원이 IgSF의 다른 구성원에 결합하기 때문에, 이것은 IgSF 내에서 새로운 수용체:리간드 상호작용을 규정하는 흥미로운 기회를 제공한다. 암 생물학 및 자가면역 질환에서 중대한 기계적 및 치료적 중요성에 기초하여, IgSF 구성원 B7-H4[73-80], VISTA[81], B7-H3[74, 79, 82-85], LAG-3[86-90] 및 부티로필린 패밀리의 10개 구성원[91-94]에 대한 리간드를 확인하는 것이 또한 보증된다. 확장된 B7의 다른 구성원, 암배아 항원-관련된 세포 부착 분자 (CEACAM)[95] 및 백혈구 수용체 복합체[96] 패밀리를 비롯한 IgSF의 다른 구성원은 후보 표적이다. IgSF의 유의미한 분획물에 대한 발현 시약이 성공적으로 산출되고 검증되었다 (도면 6).
TNF와 TNFR 상과의 모든 구성원은 플랫폼의 부분일 수 있다; 이들 단백질 모두 중요한 기계적 및 치료적 표적이고 유형-II 막 단백질 (즉, TNF 상과 구성원)이다. 상기 기술은 GPCR, 톨-유사 수용체, 성장 인자 수용체, 인터류킨, 인터류킨 수용체, 이온 통로 등을 비롯한 전체 세크레톰에 적용될 수 있다.
클로닝: 다수의 필요한 클로닝 원형에 접근이 가용하다. 가령, NYSGRC는 OpenBiosystems로부터 전체 인간 포유류 유전체 수집 (MGC) cDNA 세트를 수중에 갖고, 그리고 이들 클로닝 원형은 자유롭게 가용하다. 바람직한 구체예에서, 고도로 효율적인 결찰 독립된 클로닝 (LIC)[97]이 발현 라이브러리의 산출에 이용된다; 관심되는 삽입된 유전자는 막경유 앵커가 뒤따를 것이고 C 말단 (유형-I 막 단백질)에서 세포질적으로 국부적인 GFP 발현 리포터에 공유적으로 융합될 것이다 (도면 4와 6). 최근에, LIC 클로닝의 실행은 대규모 구조적 (nysgrc.org) 및 기능 유전체학 (enzymefunction.org) 프로그램을 위해 지난 18 개월 동안 > 15,000개 서열-실증된 구조체의 산출을 뒷받침하였다. 상기 방법은 상기 라이브러리를 신속히 산출하기 위해 필요한 고처리량 분자생물학을 위한 자동화된 액체 취급 로봇, 예를 들면, Biomek FxP 액체 취급기 및 Perkin-Elmer EP3 로봇에 의해 보조된다. 필요한 발현 벡터 모두 쉽게 산출된다 (도면 6).
조회 단백질의 Ig-융합 구조체의 품질의 산출: 고처리량 일시적인 형질감염 및 렌티바이러스-주동된 플랫폼이 분비된 단백질의 산출, 특히 Ig-융합 단백질을 위해 확립되었다. 도면 12는 최근에 산출된 다수의 돌연변이체 PD-L1 Ig-융합 구조체를 보여준다. 이러한 플랫폼은 Daedelus 시스템 [98]에 기초되고 주당 48개 렌티바이러스를 산출하는 능력을 갖는다. 게다가, 무수한 분비된 단백질과 엑토도메인이 효과적으로 산출되고 기계적 연구 [21-23] 및 치료적 적용 [24-27]을 위한 가용성 Ig-융합 단백질로서 이용되었다. 이러한 방대한 조사는 비선천적 도메인에 공유 융합이 유해한 효과를 갖지 않고 넓은 범위의 분비된 단백질과 엑토도메인과 양립한다는 것을 증명한다.
세포 마이크로어레이에서 기능적 원형질막-국부적인 GFP-융합의 발현: 자연 필수적인 막 단백질은 세포 마이크로어레이 선별검사의 배경에서 유형 I과 유형 II 필수적인 막 단백질을 구분하는 문제를 방지하기 위해 선천적 막경유 원소를 활용할 것이다. 중요하게는, Ig, TNF/TNFR[1-3], GPCR[4-6], 인테그린[7] 및 전달체[8] 상과의 구성원을 비롯한 생물학적으로 유관한 형광 단백질-융합 (가령, GFP-융합)의 다양한 실례가 보고되었다. 세포 마이크로어레이의 경우에, 분비된 단백질은 이들을 차후 탐침을 위한 세포 표면에 고정하는 막경유 나선의 부가를 통해 필수적인 막 단백질로 효과적으로 가공될 수 있다. 대안적 스플라이싱 및/또는 흘림 (즉, 단백질분해) [9-19]으로 인해 생물학적으로 중요한 막-고정된 형태와 분리된 형태 둘 모두를 갖는 다양한 패밀리로부터 다양한 단백질의 실존에 기초하여, 결박은 문제가 되지 않는다. 게다가, 복수의 분비된 단백질 (가령, IL-2 및 GM-CSF)는 신규한 치료적 전략 (가령, 백신 설계)을 제공하는 단일 스팬 내재성 막 단백질로서 신중하게 가공되었다 [20].
일부 수용체는 그들의 동계 리간드 (가령, T 세포 수용체, 인테그린)에 결합 활성을 전시하기 위해 복수의 성분을 필요로 한다. 타당하면, 이들 더욱 복잡한 수용체는 세포 마이크로어레이의 단일 위치에서 복수의 성분을 공동발현함으로써 주소 지정된다 (도면 7).
마이크로어레이 발현을 위해 선별된 세포주: 세포 마이크로어레이 기술은 HEK293 세포로 확고히 확립되었다. HEK293 세포에 의해 내생적으로 발현되는 세포 표면 단백질에 결합하는 조회 단백질을 식별하기 위해, 모든 마이크로어레이 내에 존재하는 형질감염되지 않은 대조 세포 (즉, 원형질막 국부적인 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 수용하지 않은 세포)에 결합은 편의한 대조로서 역할한다. 하지만, 많은 경우에, 강한 CMV 프로모터에 의해 주동된 과다발현의 포화 수준이 세포 표면 발현의 낮은 내인성 수준을 압도할 것이다. 게다가, 적절한 통계학적 방법이 신호 결합 이벤트를 통계학적으로 확인할 수 있다. 이들 통계학적 분석을 보조하기 위해, 모든 발현 벡터는 세포 마이크로어레이에서 2중으로 인쇄될 수 있다. 중요하게는, 넓은 범위의 대안적 세포주가 또한, 마이크로어레이에서 "구급 숙주 라인"으로서 활용될 수 있다. 가령, 초파리 (Drosophila) S2 세포가 마이크로어레이 형식에서 유전체-규모 기능 상실 연구를 위해 Sabatini에 의해 활용되었다 [99, 100].
항원항체결합력 및 역동적 범위: 이가 Ig-융합은 중간 친화성을 갖는 상호작용의 확인에 효과적이었다 (즉, PD-1:PD-L1; Kd = 5.5 μΜ). PD-L1 발현 세포를 더욱 높은 원자가 B7-1 장식된-마이크로비드로 시험하는 것은 유세포분석법-기초된 실험에서 수용체:리간드 결합의 견실한 모집과 특정한 확인을 가능하게 하였다 (도면 9). 이러한 비교는 리간드의 항원항체결합력을 증가시키는 것이 실험적으로 계측될 수 있는 잠재적 수용체:리간드 상호작용의 역동적 범위를 확장하고 인쇄된 세포 마이크로어레이에 결합을 검출하는 능력을 향상시킨다는 개념을 뒷받침한다. 더욱 낮은 친화성의 경우에, 마이크로어레이를 예로서, Ig-융합 단백질로 장식된 높은 항원항체결합력 다가 마이크로비드로 탐침하는 것이 유용하다.
일시적으로 형질감염된 세포와 더욱 높은 항원항체결합력: 앞서 설명된 실험은 생존 세포 어레이를 정제된 조회 리간드로 탐침하고, 궁극적으로 실험의 부담을 조회 단백질 생산과 표지화로 몰아넣는 것을 수반한다. 플랫폼의 용이함, 유용성과 처리량을 증강하기 위해, 감소된 부착 성질을 갖는 현탁-적합된 포유류 세포주 (즉, HEK293 Freestyle (Invitrogen) [101])가 이용될 수 있는데, 이것은 조회 단백질을 표면 상에서 발현하고 세포질 C 말단 mCherry 리포터 단백질 (또는 다른 적합한 형광 단백질)과 융합된 단일 막경유 나선에 의해 고정된다. mCherry (적색) 현탁 세포는 이후, 고정된 녹색 "수용체" 세포를 어레이 상에 시험하는데 이용된다. GFP (가령, 마이크로어레이 국부적인 수용체) 및 mCherry (가령, 현탁 조회 리간드) 둘 모두를 내포하는 공동국부적인 세포 반점은 양성 점수를 유발할 것이다. 세포 배경에서 조회 리간드를 발현하는 것은 조회 리간드 정제와 표지화의 부담을 제거한다; 이것은 선천적 상태에 더욱 가까운 환경에서 조회 단백질 리간드를 유지하는 부가된 이점을 갖고, 이것은 GPCR 등과 같은 단백질에 대해 결정적이다. 비특이적 결합, 그리고 배경을 해소하기 위해, 다음이 언급된다. 세포 마이크로어레이에서 각 "반점"은 형질감염되지 않은 세포의 단층 사이에서 규정된 유전자 산물을 과다발현하는 세포의 클러스터를 나타낸다. 관찰된 배경은 형광 검출에 앞서 마이크로어레이를 활발하게 세척하는 전반적인 능력 없음과 연계된, 마이크로어레이 전역에서 형질감염되지 않은 세포의 단층과의 비특이적 상호작용으로부터 발생한다. 세척의 혹독함을 견뎌내기 위한 단층 부착의 증강, 또는 명백한 경계를 갖는 특이적으로 규정된 구역에 세포의 공간적으로-한정된 침적은 이들 문제를 경감할 수 있다. 마이크로어레이의 배경에서 반점 세포의 국부적인 부착을 향상시키기 위해, 기능적 세포 표면 레지던트 단일 사슬-아비딘 (scAvidin)을 안정되게 발현하는 HEK293 세포주가 원형질막의 외부 첨판에서 scAvidin을 감독하고 고정시키는 비고전적 분비 시스템을 이용함으로써 성공적으로 가공되었다 (데이터 제시되지 않음) [102]. 이러한 안정된 세포주는 비세포 투과성 Alexa 594 표지화된 비오틴에 특이적으로 결합하고, 그리고 이러한 전략은 더욱 엄격한 세척 단계가 요망되면, 세포를 어레이에 전체적으로 고정시키는데 이용될 수 있고, 또는 세포를 비오틴 접합체의 부위 특이적 프린팅을 통해 규정된 구역에 특이적으로 묶는데 이용될 수 있다. 양쪽 시나리오는 배경 신호를 감소시킬 것이다.
세포 마이크로어레이의 통계학적 분석: 고도로 유의미한 상호작용이 눈에 의해 쉽게 식별가능하지만 (가령, 도면 4와 6), 적절한 통계학적 규준이 바람직하게는, 통계학적으로 유의한 더욱 약한 상호작용을 확인하는데 적용된다.
세포 표면 단백질-단백질 상호작용의 고처리량 확인을 위한 자동화된 유세포 계측 기술. 유세포분석법을 이용하여 특정한 수용체:리간드 상호작용을 결정하기 위한 강력한 대안적 방법이 또한 개시된다. 이러한 플랫폼은 넓은 범위의 항원항체결합력을 갖는 친화성 프로브 (즉, 이가 Ig-융합, 높은 항원항체결합력 마이크로비드 및 매우 높은 항원항체결합력 일시적으로 형질감염된 세포)의 손쉬운 검사를 허용한다. Ig-융합 단백질의 이용은 개념적으로, 앞서 설명된 실험과 유사하다. 새로운 수용체:리간드 상호작용의 발견을 위한 마이크로비드 및 일시적으로 형질감염된 세포의 유용성은 아래에 더욱 충분히 설명된다.
마이크로비드-기초된 접근법은 앞서 설명된 동일한 PD-1:PD-L1 상호작용으로 증명되고, 그리고 PD-L1:B7-1 상호작용을 포함함으로써 확대된다. 도면 8은 마이크로비드 실험의 전반적인 전략을 보여준다. 도면 9는 PD-1 또는 B7-1 Ig-융합 단백질로 적하된 마이크로비드, 그리고 원형질막 국부적인 PD-L1:mCherry 융합 단백질을 발현하는 HEK293 세포 사이에 고도로 특정한 상호작용을 보여준다. 이들 실험은 복수의 단백질 (가령, PD-1과 B7-1)이 마이크로비드 제시에 순응한다는 것을 보여주고, 그리고 예상될 수 있는 높은 신호 대 잡음을 증명한다 (즉, 세포질 GFP만을 발현하는 세포에서 매우 낮은 배경 결합이 검출된다). 이들 원리 증명 실험은 수용체:리간드 상호작용을 규정하기 위한 유세포 계측 분석과 연계된 마이크로비드-기초된 표현의 유용성과 힘을 강조한다. 세포-마이크로비드 접근법에 대해 설명된 동일한 PD-L1 상호작용을 이용하여, 세포-세포 유세포분석법 접근법이 더욱 예시된다. 마이크로비드 제시가 Ig-융합 단백질에 비하여 증강된 항원항체결합력을 제공하긴 하지만, 진핵 세포의 원형질막 상에서 조회 단백질의 발현은 더욱 큰 수용체 밀도, 훨씬 높은 항원항체결합력 및 더욱 약한 수용체:리간드 상호작용을 검출하기 위한 확대된 역동적 범위를 제공한다.
다음이 현탁-적합된 HEK293 세포에서 개별적으로 발현되었다: 1) mCherry 융합으로서 전장 PD-L1, 2) GFP 융합으로서 전장 PD-1, 3) 세포질 mCherry 및 4) 세포질 GFP. 개별 개체군과 혼합된 개체군의 유세포 계측 분석은 PD-1을 발현하는 세포 및 PD-L1을 발현하는 세포가 둘 모두 존재할 때에만 특정한 세포-세포 상호작용을 나타내는 신호에서 유의미한 증가 (~60-배)를 명확하게 증명하였다 (도면 10). 추가 음성 대조로서 PD-1은 또한, mCherry 융합으로서 표시되고, 그리고 예상된 바와 같이 PD-1은 그 자체와 상호작용하지 않는다 (데이터 제시되지 않음). 마이크로비드 분석에서처럼, 상기 세포-세포 접근법은 또한, 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포로부터 PD-L1-mCherry와 B7-1-GFP 사이에 상호작용을 증명하였다 (데이터 제시되지 않음). 이러한 접근법은 보편적인 유용성을 갖는 것으로 보이는데, 그 이유는 이것이 PD-1, PD-L1, B7-1 단백질 패밀리와 무관한 CD200과 CD200-수용체 (CD200R) 사이에 예상된 상호작용 역시 명확하게 드러냈기 때문이다 (도면 11).
이들 유세포분석법 접근법은 앞서 설명된 넥틴 패밀리 내에 특이성과 비특이성 상호작용을 비롯하여, 다른 공지된 T-세포 동시자극성 수용체:리간드 쌍에 적용될 수 있다 (도면 5). 마이크로비드 및 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포 둘 모두 전체 Ig 상과, TNF/TNFR 상과 전역에서 결합을 탐침하는 공지된 면역 수용체를 이용한 방법을 시험하고 이들 실험을 프로브 전체 세크레톰으로 궁극적으로 확장하는데 이용될 수 있다.
생화학적 기능의 해부: 마이크로비드-세포와 세포-세포 상호작용은 다수의 돌연변이체 분자를 선별검사함으로써 복잡한 생화학적 기능을 해부하는데 이용될 수 있다. 이들 능력은 PD-1과 B7-1에 대한 넓은 범위의 친화성을 전시하는 PD-L1 점 돌연변이체, 그리고 특히 중요하게는, PD-1 또는 B7-1에 배타적으로 결합하는 PD-L1 점 돌연변이체를 산출함으로써 증명되었다. 이들 연구는 큰 숫자 (즉, >100)의 PD-L1 돌연변이체-mCherry 융합으로 개별적으로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포주의 산출을 이용하였다. 이들 세포는 유세포분석법에 의해, 야생형 PD-1 Ig-융합 또는 야생형 B7-1 Ig-융합 단백질로 장식된 GFP-적하된 마이크로비드, 또는 원형질막-국부적인 야생형 PD-1-GFP 또는 B7-1-GFP 융합으로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포에 결합하는 그들의 능력에 대해 탐침되었다. 마이크로비드 검정에서 결합을 결여한 여러 돌연변이체가 세포-세포 형식의 배경에서 유의미한 결합을 보여준다는 관찰 결과가 특히 주목되었다 (가령, K124A와 K125A) (도면 12). 이러한 차이는 세포 표면 발현과 연관된 증강된 원자가/항원항체결합력에 직접적으로 기인하고, 그리고 다양한 항원항체결합력을 갖는 복수의 플랫폼의 가치를 강조한다. 이들 연구는 PD-1 (G119A, G120A) 또는 B7-1 (D122A, Y123A)에 특이적으로 결합하는 돌연변이체 PD-L1 Ig-융합 단백질 (도면 12)의 산출을 유발하고, 그리고 PD-1과 B7-1 인식을 책임지는 상이하지만 중복된 PD-L1 표면의 지도화를 제공하였다 (데이터 제시되지 않음); 이들 독특한 시약은 포유류 면역성에 대한 PD-L1:PD-1과 PD-L1:B7-1 상호작용의 상이한 기여가 규정될 수 있도록 허용한다. 이들 결과는 마이크로비드-세포와 세포-세포 상호작용 플랫폼의 선택성, 유용성과 상보성을 강조한다. 게다가, 이들 PD-L1 돌연변이체 상호작용에 대한 Kd의 진행 중인 정량적 결정 (가령, 표면 플라스몬 공명)은 결합 친화성에 관하여, 이들 마이크로비드-세포와 세포-세포 플랫폼뿐만 아니라 세포 마이크로어레이 플랫폼의 감수성을 벤치마킹하는데 보조할 것이다.
증강된 처리량. 상기 수행된 연구는 BD FacsAria III을 이용하여 수행되었는데, 이것은 분당 ~1개 표본의 보통 처리량을 "일회성 방식"으로 지원하고, 지속적인 사용자 주의를 필요로 한다. 이들 방법은 예로서, IntellicytTM HTFC 시스템을 활용하는 고처리량 선별검사를 지원하는 다른 시스템, 예를 들면, 96/384-웰 평판 형식에서 이용될 수 있다. IntellicytTM은 핸즈프리 방식에서 96개 웰 평판마다 3 분/384개 웰 평판마다 12 분의 처리량을 지원한다. 이러한 유세포분석법-기초된 방법은 다중웰 기초된 세포계산기 및 완전히 자동화된 조직 배양 로봇공학을 이용하여 수행될 때, 대규모 수용체 탈고아화 실험을 위해 필요한 고처리량을 제공한다. 이들 방법에서 이용가능한 시스템의 다른 실례는 Perkin Elmer Cell::Explorer; 완전히 자동화된 조직 배양-기초된 액체 취급기, Janus 웍스테이션, Liconic 진탕 인큐베이터, Envision 평판 판독기를 포함한다 - 이들 모두 예로서, 무균을 담보하기 위한 BSL-2 생물안전 후드 내에 내포된 6-축 로봇 팔을 통해 접근가능하다. 세포 성장, 배지 교환, 형질감염 등을 비롯하여, 완전히 실행된 자동화된 조직 배양 능력은 효율을 보조한다. 다중웰 형식에서 플랫폼은 임의선택적으로, 증명된 상호작용 쌍 (PD-1:PD-L1, PD-1:PD-L2, PD-L1:B7-1, CTLA-4:B7, CD200R:CD200; 도면 4, 6, 10, 11)뿐만 아니라 PD-L1 돌연변이체의 전체 패널 (도면 12)에 대하여 벤치마킹될 수 있다. 이것은 앞서 설명된 바와 같은 Ig 상과의 모든 구성원 및 궁극적으로 전체 세크레톰으로 확장될 수 있다. 많은 실험실이 세포-세포 기초된 상호작용이 FACS 분석에 의해 쉽게 조사될 수 있다는 것을 보여주긴 했지만 (도면 10과 11), 이들 노력이 낮은 처리량 성격에 불과하고 본원에서 설명된 바와 같은 이점을 부여하는 완전한 스크린으로 쉽게 이행되지 못한다는 점을 주목하는 것이 중요하다.
세포 표면 단백질-단백질 상호작용의 고도로 다중화된 확인을 위한 자성 포획 기술과 차세대 염기서열결정의 개조: 본원에서 설명된 다른 플랫폼은 특정한 수용체:리간드 상호작용의 결과로서 형성된 세포-마이크로비드 (또는 세포-세포) 접합체를 급속히 농축하기 위한 자성 포획 기술 [103], 그리고 결과의 풀을 디콘볼류션 (가령, [107-110])하기 위한 대량 평행 차세대 염기서열결정 (가령, Illumina/454[104-106])을 이용한다. 이러한 플랫폼은 "보편적인 프라이머"로 증폭되고 심층 염기서열결정에 의해 쉽게 확인될 수 있는 독특한 뉴클레오티드 바코드 (실례에서, 28개 뉴클레오티드, 하지만 다른 범위가 이용될 수도 있다)를 내포하는, 발현 라이브러리의 각 구성원에 대한 태그된 발현 벡터를 수용한다 (도면 13) [107-110]. 바코드화된 벡터의 라이브러리는 모아지고 현탁-적합된 HEK293 세포 내로 일제히 형질감염될 수 있다. 모아진 발현 라이브러리는 조회 단백질 (마이크로비드 또는 세포 표면 제시의 배경에서)과 혼합되어 접합체를 형성하고, 이들은 다중웰 자성 분리 (예로서, 30 분 이내에 24회 평행 분리를 수행)에 의해 회수된다. 비록 조회 단백질이 모아진 라이브러리에서 존재하긴 하지만, 자성 조회 단백질 (마이크로비드 또는 세포 표면 제시의 배경에서)은 매우 과잉이고, 따라서 모아진 라이브러리 성분으로부터 경쟁을 제거한다. 농축된 풀 구성원으로부터 바코드는 증폭되고, 그리고 포획 과정에 의해 농축된 바코드를 확인하기 위한 차세대 심층 염기서열결정 (가령, 각각 75개 뉴클레오티드의 최대 10,000,000 판독)에 종속된다. 이들 농축된 바코드는 시험관내 생화학적 접근법 (SPR, ITC, SEC, FACS)에 의한 차후 검증을 위해 잠재적 수용체:리간드 상호작용을 직접적으로 확인한다. 상기 전략은 단일 조회 단백질에 대한 결합 상대의 신속한 확인을 허용하면서도, 처리량을 매우 증가시키고 비용을 감소시키기 위해 쉽게 다중화될 수 있다. 가령, 조직 배양 자동화를 이용하여, IgSF의 500개 구성원 각각은 조회로서 개별적으로 이용될 수 있고, 각 조회로부터 포획된 접합체는 다중웰 평판의 별개의 웰에서 수집된다. 각 조회 단백질에 대한 후보 상호작용자의 이러한 물리적 분리는 "복합" 프라이머가 증폭 단계에서 이용될 수 있도록 한다 (즉, 각 웰은 독특한 프라이머 세트를 수용하고, 여기서 2개의 "보편적인 T7 기폭 서열"이 추가 8개 독특한, 충분히 특정한 뉴클레오티드와 측면에서 접한다). 복합 프라이머의 이용은 특정 웰 (추가 웰-특정한 뉴클레오티드 바코드, 예를 들면, 8개 뉴클레오티드)에 상응하는 조회 단백질과의 상호작용으로 인해 농축되는 라이브러리 구성원 (28개 뉴클레오티드 코어 바코드)의 특정한 확인을 허용한다 (도면 13). 이들 복합 프라이머로 각 웰의 별개의 증폭 후, 앰플리콘은 모아지고 단일 심층 염기서열결정 실행으로 디콘볼류션된다. 이것은 IgSF의 각 구성원에 배정된 독특한 뉴클레오티드 바코드의 기초에서 라이브러리의 상호작용 구성원을 확인한다. 이들 상호작용자는 각 웰에 특이적인 독특한 (가령, 8개 뉴클레오티드) 바코드에 의해 특정한 조회 단백질에 대한 결합 상대로서 확인된다.
자성 포획/농축: 세포-마이크로비드 접합체의 배경에서 세포 농축을 위한 Miltenyi 시스템의 이용은 단순하다 [103]. 세포 농축을 위한 50 nm 자성 비드의 이용이 바람직하지만 한정되지 않는다. 도면 14는 동계 수용체:리간드 상호작용의 결과로서 형성되는 특정한 세포-세포 접합체를 분리/농축하기 위한 자성 마이크로비드의 이용을 증명한다. 자성 분리에 의한 세포-세포 접합체의 고처리량 포획을 위한 이러한 접근법을 일반화하기 위해, 조회 단백질은 막경유-고정된 태그 (가령, FLAG)를 표면 상에서 안정되게 발현하여 항-FLAG 보유 자성 비드에 의한 포획을 허용하는 세포주에서 발현된다. 이러한 전략은 마이크로비드-결합된 포획 시약 (가령, 항-FLAG)이 특정한 수용체:리간드 복합체를 간섭하는 것을 예방한다. 따라서, 다양한 라이브러리 풀:조회 세포 화학량론을 조사하고 활용된 자성 비드의 양을 변화시키는 것이 가능한데, 그 이유는 이들 변수가 선별의 수율과 엄격함에 영향을 줄 것이기 때문이다. 중요하게는, 자성 마이크로비드 포획은 광범위한 세척 단계를 가능하게 하고 감소된 배경을 유발한다. 세포-세포 접합체 형성과 연관된 매우 높은 다가 상호작용의 강도는 상대적으로 온건한 자성 분리 기술과 완전히 양립한다. 이러한 접근법은 "결합된" 이벤트 및 "결합되지 않은" 이벤트를 결정하기 위한 형광 신호의 계측에 의존하지 않고, 그리고 게이팅, 레이저 세팅 등의 복잡화를 제거한다.
신호 대 잡음: 비특이적 결합은 조회-발현 세포주 및 "오프 타깃" (즉, 동계 리간드를 발현하지 않는 세포) 사이에서 일어날 수 있다. 도면 14B는 "희귀한 이벤트" (즉, 전체 가능한 상호작용의 1.5%)를 특이적으로 농축하는 자성 포획 기술의 능력을 증명한다. 도면 15는 상기 바코드 접근법이 훨씬 희귀한 이벤트를 검출할 수 있다는 증명을 제공한다. 개체군이 동계 수용체:리간드 쌍 (가령, PD-1:PD-L1 및 CD200:CD200R)을 발현하는 세포의 1:1 혼합물로 구성되는 전형적인 이진수 세포-세포 검정의 경우에, 이벤트 중에서 10-30%가 양성 결합 상호작용으로서 전형적으로 채점된다 (도면 10과 11 참조). 음성 대조 (가령, GFP와 mCherry)의 경우에, 전형적으로 이벤트 중에서 ~0.2 - 0.5 %가 결합된 것으로 채점되는데, 여기서 "결합된"은 GFP와 mCherry 둘 모두 양성인 숫자 이벤트로서 규정된다 (즉, 도면 15A, 사분면 2).
발현 라이브러리의 배경에서 동계 상호작용을 확인하는 것과 연관된 시험을 특이적으로 사정하기 위해, 배경은 GFP를 일시적으로 발현하는 107 HEK293 세포를 PD-1 GFP-융합을 발현하는 0.02 x 106 세포 (GFP 양성 세포의 0.2%, 이들은 모두가 동등한 효율에서 형질감염되면 IgSF의 단일 구성원을 나타낼 것이다)와 혼합함으로써 모의되었다. 이러한 라이브러리는 106 mCherry (음성 대조) 또는 PD-L1 mCherry-융합 일시적으로 발현 HEK293 세포로 시험되었다. 도면 15는 특정한 PD-1:PD-L1 상호작용으로 인한 GFP:mCherry 접합체의 명백한 농축 (사분면 2)을 증명한다. 중요하게는, PD-1 발현 세포의 농축의 PCR-기초된 검증은 모아진 앰플리콘을 디콘볼류션하기 위해 실행된 바코드화 전략과 완전히 유사하다 (즉, PD-1 코딩 서열은 내재성 바코드로서 기능한다). 중요하게는, 도면 14와 15에서 달성된 농축의 수준은 이용된 차세대 심층 염기서열결정 접근법의 검출 한계의 완전한 범위 안에 있다[113].
PD-L1:PD-1과 PD-L1:B7-1 상호작용은 2가지 발현 벡터 (즉, 500개 수용체, 500개 리간드) 각각으로 통합된 인간 IgSF에 속하는 500개 유전자가 그러할 수 있는 것처럼 도면 13에서 설명된 독특한 바코드 접근법으로 조사될 수 있고, 그리고 상호작용 선별검사에 종속될 수 있다. 이러한 시스템은 잠재적 수용체의 전체 패널에 대하여 많은 리간드의 동시 조회를 할 수 있게 하고, 큰 조회 목록의 동시적이고, 효율적이고, 비용 효과적인 규문을 허용한다. 이러한 접근법은 전체 세크레톰을 커버할 수 있다.
본 발명의 추가 양상, 그리고 이들의 검증은 도면 16-24에서 증명된다.
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Claims (111)

  1. D28{A, R}, E60{A, D, R}, I116{A, D, R}, G119{A, D, R}, G120{A, D, R}, A121{D, R}, D122{A, R}, Y123{A, D, R}, K124{A, D, R} 및 R125{A, D}로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에 치환을 포함하는 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체로서,
    상기 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체는:
    i) PD-L1에 대하여 야생형 결합 친화성의 적어도 75 %를 보유하고; 및
    ii) 야생형 PD-L1 과 비교하여 B7-1에 감소된 결합 친화성을 전시하는 것을 특징으로 하는 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체.
  2. 제1 항에 있어서, 상기 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체는 D28A, D28R, D122A, Y123D, Y123R, Y123A, K124A, K124D, K124R, R125A 및 R125D 로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하고,
    상기 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체는:
    i) 야생형 PD-L1 과 비교하여 PD-1에 감소된 결합 친화성을 전시하고; 및
    ii) B7-1에 대하여 야생형 결합 친화성의 적어도 40 %를 보유하는 것을 특징으로 하는 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체.
  3. 제1 항에 있어서, 상기 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체는 E60A, E60D 및 E60R 로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하고,
    상기 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체는:
    i) 야생형 PD-L1 과 비교하여 PD-1에 감소된 결합 친화성; 및
    ii) 야생형 PD-L1 과 비교하여 B7-1에 감소된 결합 친화성을 전시하는 것을 특징으로 하는 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체.
  4. 제1 항에 있어서, 상기 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체는 I116A, G119D, G119R 및 G120D로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하고,
    상기 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체는:
    i) PD-L1에 대하여 야생형 결합 친화성의 적어도 75 %를 보유하고; 및
    ii) 야생형 PD-L1 과 비교하여 B7-1에 감소된 결합 친화성을 전시하는 것을 특징으로 하는 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체.
  5. 제1 항에 있어서, 상기 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체는 I116D, I116R, G120A, G120R, A121R, A121D 및 D122R로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하고,
    상기 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체는:
    i) 야생형 PD-L1 과 비교하여 PD-1에 감소된 결합 친화성; 및
    ii) 야생형 PD-L1 과 비교하여 B7-1에 감소된 결합 친화성을 전시하는 것을 특징으로 하는 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체.
  6. 제1 항에 있어서, 상기 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체는 고체 지지체에 고정된 것을 특징으로 하는 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체.
  7. 제6 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 마이크로비드인 것을 특징으로 하는 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체.
  8. PD-1에 특이적으로 결합하는 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체로서, 상기 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체는 Gly-119 또는 Gly-120의 아미노산 잔기 점 돌연변이를 내포하는 것을 특징으로 하는 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체.
  9. 제8 항에 있어서, 상기 점 돌연변이는 G119A를 포함하는 것을 특징으로 하는PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체.
  10. 제8 항에 있어서, 상기 점 돌연변이는 G119D를 포함하는 것을 특징으로 하는 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체.
  11. 제8 항에 있어서, 상기 점 돌연변이는 G119R을 포함하는 것을 특징으로 하는 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체.
  12. 제8 항에 있어서, 상기 점 돌연변이는 G120D를 포함하는 것을 특징으로 하는 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체.
  13. 제1 항 내지 제12 항 중 어느 한 항의 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  14. 제13 항에 있어서, 형광 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  15. 제13 항의 재조합 핵산을 포함하는, 시험관내( in vitro) 세포.
  16. a) 제1 항 내지 제12 항 중 어느 한 항의 PD-L1 폴리펩티드 돌연변이체; 및
    b) 융합 상대 폴리펩티드;
    를 포함하는, 융합 폴리펩티드.
  17. 제16 항에 있어서, 상기 융합 상대 폴리펩티드는 형광 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
  18. 제16 항에 있어서, 상기 융합 상대 폴리펩티드는 면역글로불린 Fc (immunoglobulin Fc; Ig Fc) 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
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