CN101418309B - 柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶基因的克隆、表达及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)蛋白质二硫键异构酶基因EtPDI(克隆号：BW1-E06，Genbank登录号EF552214)，本发明将该基因连接到原核表达载体pGEX-4T-2，构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-EtPDI，并在大肠杆菌系统中进行了表达，表达的重组蛋白大部分以可溶性形式存在。通过纯化重组蛋白4T-EtPDI进行SPS-PAGE，再转移至PVDF膜上，用E.tenella卵囊口服免疫鸡的抗血清作为-抗，羊抗鸡IgG作为二抗进行Western-blot分析，表明它有一定的抗原性。能用于制备抗鸡球虫病药物和抗鸡球虫病疫苗。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术药物和基因技术领域，具体涉及柔嫩艾美耳球虫新蛋白质二硫键异构酶基因(EtPDI)基因的克隆、表达及应用。
背景技术：
鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于肠道所引起的一种危害严重的全球性寄生虫病，给养鸡业造成巨大的经济损失。目前控制球虫病的主要方法包括化学药物防治和疫苗免疫预防，但由于这些方法存在安全、价格以及抗药虫株出现等问题，迫切需要寻找新的防治手段来控制球虫病。而研制高效安全的抗球虫病基因工程疫苗和新药物的关键在于寻找到重要的虫体抗原基因。本发明人对鸡危害最为严重的柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)为研究对象，开展了E.tenella孢子生殖发育阶段差异表达基因的分离、鉴定等研究，为探索鸡球虫的入侵和生长发育机制，从而研制高效、安全的抗球虫疫苗和新药物。
蛋白质二硫键异构酶(Protein disulfide iso-merases，PDI)是真核生物中一类具有混和功能的蛋白质，广泛参与生物体内硫依赖的各种氧化还原作用，能催化二硫键形成，具有分子伴侣活性，并且是脯氨酰4一羟化酶和微粒体甘油三酸酯转运蛋白的组成部分，PDI是目前发现帮助蛋白质折叠活性最高的蛋白质。对各种生物体内PDI的研究发现，PDI结构中均含有2～3个硫氧环蛋白(Thioredoxin，Trx)相关序列。Trx是一类广泛存在于自然界的小蛋白，Trx具有多种生理功能，介导的氧化还原作用广泛参与细胞内代谢及调节的诸多方面如细胞的生长、分化与凋亡，并与肿瘤发生有关。
在顶复器们原虫研究人员发现刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)的PDI(TgPDI)能被人眼泪和乳汁中的分泌型IgA抗体识别，PDI特异性抗体是粘膜抗体谱中的一部分，可能涉及宿主对虫体的防御反应。另外发现58％的牛眼泪中的IgA抗体能识别牛新孢子虫(Neospora caninum)的PDI(NcPDI)。免疫荧光显示NcPDI在缓殖子阶段表达下调，免疫金标记法定位该蛋白发现位于细胞质中，紧靠核、微线和虫体细胞表面。用PDI抑制剂或亲和纯化的抗PDI抗体加入体外培养的速殖子中，发现虫体对宿主细胞的黏附降低，表明在虫体与宿主细胞的相互作用中PDI可能起重要作用。保守功能域检索发现柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶(EtPDI)基因编码的蛋白在60-168位氨基酸间具有Tryparedoxin(TryX)-like家族蛋白的保守功能域，该家族蛋白基本是双硫键氧化还原酵素，具有CXXC(Trp-Cys-Xaa-Xaa-Cys)基序的活性位点，Tryparedoxin(TryX)是硫氧还蛋白折叠家族成员之一，在寄生锥虫体内涉及氧化应激反应的调控。这些结果显示：顶复器原虫的PDI可能是药物治疗这些原虫病的一个潜在靶标和研制新型疫苗的一个候选抗原分子。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于研究设计扩增了柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶(EtPDI)基因及其应用。
本发明以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊为驱动组，孢子化卵囊为实验组，利用抑制性消减杂交技术构建了孢子化卵囊的消减cDNA文库。从构建好的消减cDNA文库中挑选了1056个克隆，制作了cDNA微阵列(芯片)，将柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊和未孢子化卵囊的总RNA制备探针，分别用cy3和cy5标记，通过芯片杂交、筛选获得了EtPDI基因的EST序列，经实时定量RT-PCR检测，该基因在孢子化卵囊阶段高表达，而在未孢子化卵囊阶段不表达。利用RACE技术首次克隆到了编码柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶(EtPDI)基因含ORF的全长cDNA序列，构建了原核重组表达质粒(pGEX-4T-EtPDI)，在大肠杆菌中进行了表达，纯化了重组表达蛋白，并对表达的重组表达产物进行了抗原性的鉴定。
本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶(EtPDI)基因，该基因具有SEQ ID NO.1序列。
所述柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶(EtPDI)基因全长1056bp，含651bp的开放阅读框，编码216个氨基酸；在60-168位氨基酸间具有Tryparedoxin-like家族蛋白的保守功能域，该家族蛋白是双硫键氧化还原酵素，具有CXXC motif的活性位点；该蛋白具有2个酪蛋白激酶II磷酸化位点、2个N端豆蔻酰基化位点和2个PKC磷酸化位点。
本发明的另一目的是提供了一种柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶(EtPDI)基因的克隆和表达。该方法包括下列步骤：
(1)试剂与材料
Trizol、GeneRaceTM Kit购自Invitrogen公司；TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit、限制性内切酶购自大连宝生物工程有限公司；pGEM-T-easy vector购自Promega公司；DEPC、X-Gal、Tag Plus I DNA聚合酶购自上海生工生物工程技术有限公司；bacto-yeast extract、Agar A、bacto-tryptone为OXOID公司产品。丙烯酰胺、N，N‘-亚甲基甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵购自Sigama公司；HRP-羊抗兔IgG3购自上海英基生物科技有限公司；HRP-羊抗鸡IgG购自SouthernBiotech公司；蛋白质预染Marker购自Fermentas公司；High-Affinity GSTResin为南京金诗特生物公司产品。
罗曼优质黄羽鸡，购自上海汇中种鸡场，出壳后运回实验室饲养，笼具、饲料、饮水等均经严格消毒。柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)：柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，编号：CAAS 21111601，由中国农业科学院上海兽医研究所保存提供。
pGEX-4T-2表达载体、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)由中国农业科学院上海兽医研究所保存提供。
(2)方法
①RACE引物的合成：
利用抑制性消减杂交技术(SSH)和eDNA微阵列技术筛选柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)孢子发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子)虫体差异表达基因，获得了孢子化卵囊、子孢子阶段虫体高表达基因克隆BW1-E06。根据其EST序列，设计了3’和5’RACE引物(引物由上海赛百盛生物有限公司合成)。
3’Primer 5’-ACACCACGTTGCCATTTGAGTCCTT-3’
3’Nested Primer 5’-CCTCCGGGAACAGAATTAGGTCCAT-3’
5’Primer 5’-TCAGATGGGACTGGAGAAACACGAA-3’
5’Nested Primer 5’-CTTGTGCGTCGTGAAGGCTAAGT-3’
②RACE产物的扩增：
具体步骤按GeneRacerTM试剂盒操作手册进行。扩增获得的RACE产物克隆到pGEM-T-easy载体中，挑选阳性克隆，进行测序(上海英俊生物技术有限公司)。根据测序结果查找3′、5′RACE产物序列与原EST序列的重叠部分，将三段序列拼接。
③含ORF全长基因的克隆：
根据拼接的cDNA序列设计上下游引物，进行含ORF cDNA片断的PCR扩增。
上游引物： 5’-TCACAATCTAATTCCCTTTTCACT-3’
下游引物： 5’-CATTTTTGACGGATTTCGTTT-3’
以3’RACE和5’RACE扩增时mRNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增。反应条件94℃ 2.0min；94℃ 30 s，52℃ 40s，72℃ 2.0min，30个循环，72℃ 10min。扩增获得的PCR产物经纯化后与pGEM-T-easy Vector连接，构建的重组(命名为pGEM-T-EtPDI)转化JM109感受态细胞，进行兰白斑筛选，挑选白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定，鉴定正确的单菌落送上海英骏生物技术有限公司测序。
④生物信息学分析：
利用在线软件ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析获得的新基因的全长cDNA序列，找出编码框。利用ProtParam工具(http://cn.expasy.org/tools/protparam.html)计算编码蛋白质的理论分子量、等电点、氨基酸组成等。利用北京大学生物信息学中心WebLab中提供的Antigenic程序(http://weblab.cbi.pku.edu.cn/program.inputForm.do？program＝antigenic)分析其抗原位点。利用Singal P3.0在线分析软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SingnalP/)分析编码蛋白有无信号肽。ProtScale在线分析软件(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)分析编码蛋白的疏水性。利用TMHMM服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析编码蛋白有无跨膜结构。BLASTp软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 以及FASTA软件(http://www.ebi.ac.uk/fasta33)用于同源蛋白的搜索，利用CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)软件查询NCBI保守区的功能域数据库，查询有无保守功能域。利用motif_scan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif scan)，分析功能结构域。
⑤荧光实时定量RT-PCR：
选择18SrRNA看家基因作为内参，标化反应结果。提取柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子的总RNA，去除基因组DNA后，利用随机引物反转录成cDNA第一链，EtPDI基因定量PCR的引物为：
Sense Primer： 5′-CAGCGGACAAGGACGAAAG-3′，
Antisense Primer： 5′-GTCAGAGCCAACAACTACCAAG-3′。
18S rRNA的引物为Sense Primer： 5′-GAGTATGGTCGCAAGGCTGA-3′，
Antisense Primet 5′-CAGGCTAAGGTCTCGTTCGTT-3′
反应体系如下：
成分 体积(μL)
5×RT-PCR Buffer 5.0
Mg2+(250mmoL/L) 0.3
dNTP(10mmoL/L) 0.75
上游引物(10μmoL/L) 0.5
下游引物(10μmoL/L) 0.5
25×EvaGreen 1.0
HS-Ex-Taq(5U/μL) 0.25
模板 2.0
ddH2O 14.7
Total volume 25.0
反应程序：95℃ 90 s；(95℃ 5 s，58℃ 30 s，80℃ 10 s)40个循环，其中80℃ 10 s结束时间点为荧光信号检测点。
制作溶解曲线的程序为：95℃ 1min；58℃ 1min；(58℃ 10s)80个循环，每个循环温度升高0.5℃。采用BIO-RAD公司iCyclerTM IQ version 5.0软件进行计算分析，得出相对于每百万持家基因的目的基因含量(copies/μL)。
⑥重组表达质粒的构建：
将经鉴定正确的重组质粒pGEM-T-EtPDI，利用克隆载体pGEM-T-easy和表达载体pGEX-4T-2的多克隆位点，选择合适的酶进行双酶切(Bam H I和EcoR I)，酶切后回收EtPDI和pGEX-4T-2片段，连接构建重组表达质粒：pGEX-4T-EtPDI，连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行阳性克隆的鉴定(PCR鉴定和双酶切鉴定)(见图2)，对筛选的阳性克隆提取质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3)。
⑦重组表达质粒pGEX-4T-EtPDI在大肠杆菌中的表达：
将鉴定好的pGEX-4T-EtPDI/BL21(DE3)转化菌接种于液体LB(含氨苄青霉素)培养基，37℃震荡培养过夜，将培养过夜的菌液按1％的比例接种到另一LB(含氨苄青霉素)液体培养基中，37℃，200r/min，振荡培养2h-3h，使细菌生长至对数生长期，OD600＝0.6-1.0时，加入终浓度为1mmoL/L的IPTG诱导表达，在加入IPTG诱导后0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h分别收集菌体，应用SDS-PAGE分析菌体蛋白，确定最佳诱导时间，发现表达量在诱导6h即达到高峰。EtPDI基因的ORF含651个核苷酸，编码216个氨基酸，理论分子量为24.1 KDa，采用GST基因融合表达系统，对目的基因进行高效表达，表达的融合蛋白带有分子量为26 KDa的GST标签，则重组质粒4T-EtPDI表达的重组蛋白分子量大约为50KDa，SDS-PAGE电泳结果与预期的大小一致(见图3)，从图中也可看到，重组表达质粒在IPTG诱导下2h即出现表达产物，6h达到最高表达量。
⑧重组蛋白的分离纯化：
根据确定的最佳诱导时间，将重组质粒4T-EtPDI转化大肠杆菌BL21后，加入终浓度为1mmoL/L IPTG，于37℃摇床振荡培养，诱导重组蛋白的表达，当表达量达到高峰时，离心，收集菌体，确定重组表达蛋白以可溶形式存在，还是以包涵体形式存在，利用GST Resin纯化重组表达蛋白。由于pGEX-4T-2表达载体在起始密码子之后有GST标记，GST蛋白可被GST Resin亲和层析柱中的谷胱甘肽吸附，而其它蛋白不能结合上去，因此，可利用GST Resin亲和层析柱将目的蛋白吸附，然后再加入还原型的谷胱甘肽，将结合在柱上的融合蛋白洗脱下来，从而达到分离纯化重组蛋白的目的。4T-EtPDI重组表达菌经超声裂解后，离心，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析，结果发现重组蛋白大部分以可溶性蛋白表达于上清中，小部分以包涵体存在。利用GST柱纯化上清中的可溶性重组蛋白4T-EtPDI，SDS-PAGE分析表明获得了较高纯度的重组蛋白(见图4)。
⑨Western-blot检测重组表达蛋白：
将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳后转移至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，用柔嫩艾美耳球虫卵囊口服免疫鸡的抗血清(pGEX-4T-2/BL21大肠杆菌裂解液吸附处理后)作为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗鸡IgG为二抗进行Western-blot检测分析。
本发明再一个目的是提供了一种柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶(EtPDI)基因在制备抗鸡球虫病药物和新型抗鸡球虫病疫苗中的应用。
将纯化的重组蛋白(pGEX-4T-EtPDI)加弗氏佐剂和活的重组表达菌以不同剂量(重组蛋白：25μg、50μg、100μg三个剂量；重组表达菌：150μg、300μg、)分别三次免疫鸡后，用柔嫩艾美耳球虫攻击，同时设空载体pGEX-4T-2表达蛋白GST免疫组，不免疫不攻虫、不免疫攻虫组，结果显示：该重组抗原在增重、卵囊产量、病变记分等方面都诱导了部分保护效果。
本发明的柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶(EtPDI)编码基因的克隆及生物信息学分析
本研究利用抑制性消减杂交(SSH)技术和cDNA微阵列技术筛选柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊阶段虫体差异表达基因，获得了一个克隆号为BW1-E06基因的EST序列，利用RACE技术对EST序列进行了3’和5’端的延伸扩增，将获得的PCR产物测序后拼接得到了一个1185bp的DNA片段，进一步利用PCR技术获得了一个1056bp的cDNA，含651bp的开放阅读框，编码216个氨基酸。利用NCBI网站的Blast在线分析发现该序列与已知的柔嫩艾美耳球虫基因无明显同源性。编码的蛋白同源性比较后发现与刚地弓形虫(T.gondii)和间日疟原虫(P.vivax)的一种推测蛋白-蛋白质二硫键异构酶同源性分别为62％和55％。CDD软件查询NCBI保守区的功能域数据库，表明在60-168位氨基酸间具有Tryparedoxin(TryX)-like家族蛋白的保守功能域，该家族蛋白基本是双硫键氧化还原酵素，具有CXXC motif的活性位点。结构功能域分析显示该蛋白具有2个酪蛋白激酶II磷酸化位点、2个N端豆蔻酰基化位点和2个PKC磷酸化位点(见表1)。
表1编码蛋白的结构功能域分析
Table1 Analysis of the functional motifs of protein
| 位点位置 | 氨基酸序列 | 位点名称 |
| 38-41 | SLKD | Casein kinase IIphosphorylation site |
| 112-115 | TVNE | |
| 10-15 | GGKEGA | N-myristoylation site |
| 117-122 | CYSA |
| 38-40 | SLK | Protein kinase Cphosphorylation site |
| 66-68 | SPK |
利用北京大学生物信息学中心WebLab中提供的Antigenic程序(http://weblab.cbi.pku.edu.cn/program.inputForm.do？program＝antigenic)分析其抗原位点，结果发现该蛋白可能有8个抗原位点(见表2)。信号肽和跨膜结构分析表明该蛋白N-端不具有信号肽，也无跨膜结构。该蛋白疏水性分析显示，最大值为2.289，最小值为-2.478，疏水性区域分布比较均匀(见图1)。
表2 EtPDI编码蛋白的抗原肽位点分析
Table 2 Analysis of the antigenic peptides ofEtPDI protein
| 抗原位点 | 分值(Score) | 氨基酸序列 |
| 125-159 | 1.265 | RTILLRHFRVEFQDHVKHMPWLVIDFVPSLVVVGS |
| 66-99 | 1.182 | SPKCSSFLPFVVSQQHLIGKSVGLYKIEVVFVSA |
| 17-24 | 1.140 | LPQYCSPY |
| 194-200 | 1.102 | RFFLQVS |
| 104-112 | 1.101 | RALLQFYRTP |
| 208-213 | 1.081 | RALLVR |
| 30-37 | 1.079 | RLILFPEG |
| 167-173 | 1.046 | EASVPTQ |
本发明EtPDI基因在柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段的分析
为了进一步验证SSH技术和eDNA微阵列筛选差异表达基因的可靠性以及EtPDI在柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段虫体中的表达情况，分别提取了柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子的总RNA，选择持家基因18sRNA作为内参，利用荧光定量RT-PCR法检测了该基因在柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段虫体中的表达情况。实验结果证明，EtPDI基因在柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊中几乎没有表达，在孢子化卵囊和子孢子阶段都有表达，但在孢子化卵囊阶段的表达明显高于子孢子阶段。
本发明对经上述纯化分离的重组蛋白进行抗鸡球虫抗原性的鉴定：
将纯化的重组蛋白4T-EtPDI进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，再转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊口服免疫鸡的抗血清作为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗鸡IgG作为二抗进行Western-blot分析。结果4T-EtPDI重组蛋白出现了反应条带，分子量与预期结果大小一致，表明该重组蛋白都具有一定的抗原性。(见图5)
重组蛋白4T-EtPDI免疫保护效果的研究：
将纯化的重组蛋白(pGEX-4T-EtPDI)加弗氏佐剂和活的重组表达菌以不同剂量(重组蛋白：25μg、50μg、100μg三个剂量；活的重组表达菌：150μg、300μg两个剂量)分别三次免疫鸡(7、17和27日龄)。重组蛋白和GST为胸肌多点注射免疫，活菌为口服免疫。三次免疫后第4天用柔嫩艾美耳球虫攻击，同时设空载体pGEX-4T-2表达蛋白GST免疫组，不免疫不攻虫、不免疫攻虫组，结果显示：该重组抗原在增重、卵囊产量、病变记分等方面都诱导了部分保护效果(见表3)。
表3：鸡免疫试验结果
Table3：The results of immunized chickens
| 平均增重(g)※ | 相对增重(％) | 卵囊总量(×108) | 相对卵囊产量(％)※ | 肠道病变记分 | |
| 4T-EtPDI(25μg)4T-EtPDI(50μg)4T-EtPDI(100μg)GST(25μg)GST(25μg)GST(25μg)不免疫攻虫组不免疫不攻虫活菌(150μg)活菌(300μg) | 239.7±11.8a288.5±25.3abcd264.5±19.9abc315.4±22.8abcd280.9±18.9abcd240.5±24.6ab285.9±23.5abcd390.8±16.4e293.6±24.5abcd297.3±17.1abcd | 64.573.867.780.771.961.573.210075.176.1 | 8.55.88.17.86.27.99.108.97.7 | 93.463.688.886.067.786.3100.0097.884.4 | 2.3±0.3bcd1.8±0.4bcd2.2±0.5bcd2.3±0.7bcd1.8±0.2bcd2.9±0.9d2.6±0.4bcd0a2.1±0.5bcd1.6±0.3bcd |
附图说明：
图1：柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶基因编码蛋白的疏水性分析
图2：重组表达质粒(4T-EtPDI)双酶切和PCR鉴定
1、PCR鉴定；2、Bam I和EcoR I鉴定
M、标准分子量(从上至下依次为：2000bp、1500bp，750bp，500bp，250bp，100bp)
图3：SDS-PAGE分析4T-EtPDI/BL21不同时相的表达蛋白
M：标准蛋白质分子量(从上至下：94.0 KDa，66.2 KDa，45.0 KDa，35.0 KDa，26.0 KDa，20.0 KDa，14.4 KDa)；
1～2：空载体pGEX-4T-2在IPTG诱导后0 h、10 h的表达产物；
3～9：重组质粒4T-EtPDI在IPTG诱导后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h的表达产物。
图4纯化的4T-EtPDI重组蛋白
M：标准蛋白质分子量(从上至下：94.0 KDa，66.2 KDa，45.0 KDa，35.0 KDa，26.0 KDa，20.0 KDa，14.4 KDa)
1：重组质粒4T-EtPDI在IPTG诱导后8 h的表达产物
2-3：纯化的4T-EtPDI重组蛋白
图5重组蛋白Western-Blot分析
M：预染的标准蛋白分子量(从上至下：170KDa、130 KDa、95KDa、72 KDa、55 KDa、43 KDa、34 KDa、26 KDa、17 KDa、11 KDa)，
1：纯化的重组蛋白4T-EtPDI
序列表
SEQ ID NO.I
本发明柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶(EtPDI)基因序列：
TCACAATCTAATTCCCTTTTCACTCACATTTTCTCAAGATGCTGCCTCAGTACTGCTCTCCCTACAATGC
CGAGAAGCGCCGTTTTAATGAGGAGCAGATTCTCGCTGCGGGTGGCAAGGAAGGCGCCGCTGCCCCAGCA
ATGCCAATGCCACCTGCCTACAGAGATATGGACCTAATTCTGTTCCCGGAGGGCAGCCTGAAGGACTCAA
ATGGCAACGTGGTGTCCCAGCAGCACCTCATAGGCAAATCTGTTGGACTTTATTTTGCCGATGGCAGCAG
CCCGAAGTGCAGCAGCTTCCTGCCGTTCCTTCTCCAGTTTTACCGCACGGTCAACGAGGGAGGCTCTCAC
CAGAAGATCGAAGTGGTTTTCGTGTCAGCGGACAAGGACGAAAGGGCTTTTCAAGATCACGTTAAGCACA
TGCCTTGGCTCGTCATTGACTTCAACGACCCCCTGAGAACGATCTTGCTCAGACACTTCAGGGTTGAGAA
GGAAGCTAGTGTGCCCACCCAAGGCCAGGGCCCTCGCGCTGGCGTCCCCTCCTTGGTAGTTGTTGGCTCT
GACGGGCGGGACGCCCAGTTCCTCCAAGTTAGTGGGGGCAGAGACGAAGGAGAGCGAGCCTTGCTCAGAT
GGGACTGGAGAAACACGAAGTTTGGAGCTGACCGGTTTCTTGTGCGTCGTGAAGGCTAAGTGCCTAGGTA
GCTTAGTAGCTACCCAAACAGCTAGTAAAGCCACCCCTTTGCAGCTAGTTAAGCGGACTCAGCTAGCTAG
CCAGCATCTAGTTGGGTTGCATTGTTCATTAAGAGGGACCCGCCCTTACCGCTCATATGTAGCTGGGGCA
GAAACAGCCCCAGTTGCAGTAGTGATTGCAGCAAACAGACGCAGCGGGAGCAGCAGAAGTAGCAGCAGCA
GCATGCTGCTACAGTAGCAAGAACCCGTACCAGCAGCTGCAGCAGCAAGAACCCGTAGCAGCAGCTGCCC
GCTGCAGCGGCAGCAGCTGGGGGGAAGCTGATGTAACATCTGACGTTTTTTACGTAAACGAAATCCGTCA
AAAATG。
具体实施方式：
实施例1
一种柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶(EtPDI)基因的克隆：
1、材料
(1)实验动物
罗曼优质黄羽鸡，购自上海汇中种鸡场，出壳后运回实验室饲养，笼具、饲料、饮水等均经严格消毒。
(2)实验虫株
柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)：柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，编号：CAAS 21111601，由中国农业科学院上海兽医研究所保存提供。
(3)主要试剂
Trizol、GeneRaceTM Kit购自Invitrogen公司；TaKaRa Agarose Gel DNAPurification Kit购自大连宝生物工程有限公司；Agarose、PGEM-T-easy vector购自Promega公司；JM109感受态细胞购自大连宝生物有限公司；氨苄青霉素、IPTG购自华美生物工程有限公司；DNA Marker购自上海美季生物技术有限公司；DEPC、X-Gal、Tag Plus I DNA聚合酶购自上海生工生物工程技术有限公司；bacto-yeastextract、Agar A、bacto-tryptone为OXOID公司产品。
(4)RACE引物
利用抑制性消减杂交技术(SSH)和cDNA微阵列技术筛选柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)孢子发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子)虫体差异表达基因，获得了孢子化卵囊、子孢子阶段虫体高表达基因BW1-E06。根据其EST序列，设计了3’和5’RACE引物(引物由上海赛百盛生物有限公司合成)。
3’Primer 5’-ACACCACGTTGCCATTTGAGTCCTT-3’
3’Nested Primer 5’-CCTCCGGGAACAGAATTAGGTCCAT-3’
5’Primer 5’-TCAGATGGGACTGGAGAAACACGAA-3’
5’Nested Primer 5’-CTTGTGCGTCGTGAAGGCTAAGT-3’
2、方法
(1)柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子的收集
从4℃冰箱取出保存的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，室温离心，洗去重铬酸钾溶液后，计数孢子化卵囊的数量，按孢子化卵囊5×104个/羽经口感染2周龄无球虫雏鸡。接种后第8天分别收集盲肠和粪便中的卵囊。收集的未孢子化卵囊一部分纯化后液氮保存，另一部分孢子化后收集纯化孢子化卵囊和子孢子，收集纯化的孢子化卵囊和子孢子保存液氮备用。
(2)柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子总RNA的提取
取液氮中冻存的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，按Trizol试剂盒说明书进行总RNA的提取。
(3)RACE产物扩增
具体步骤按GeneRacerTM试剂盒操作手册进行。扩增获得的RACE产物克隆到PGEM-T-easy载体中，挑选阳性克隆，进行测序(上海英俊生物技术有限公司)。根据测序结果查找3′、5′RACE产物序列与原EST序列的重叠部分，将三段序列拼接。
(4)含ORF全长基因的克隆：
根据拼接的cDNA序列设计上下游引物，进行含ORF cDNA片断的PCR扩增。
上游引物：5’-TCACAATCTAATTCCCTTTTCACT-3’
下游引物： 5’-CATTTTTGACGGATTTCGTTT-3’
以3’RACE和5’RACE扩增时mRNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增。反应条件94℃ 2.0min；94℃ 30s，52℃ 40s，72℃ 2.0min，30个循环，72℃ 10min。扩增获得的PCR产物经纯化后与pGEM-T-easy Vector连接，构建的重组(命名为pGEM-T-EtPDI)转化JM109感受态细胞，进行兰白斑筛选，挑选白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定，鉴定正确的单菌落送上海英骏生物技术有限公司测序。
(5)生物信息学分析：
利用在线软件ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析获得的新基因的全长cDNA序列，找出编码框。利用ProtParam工具(http://cn.expasy.org/tools/protparam.html)计算编码蛋白质的理论分子量、等电点、氨基酸组成等。利用北京大学生物信息学中心WebLab中提供的Antigenic程序(http://weblab.cbi.pku.edu.cn/program.inputForm.do？program＝antigenic)分析其抗原位点。利用Singal P3.0在线分析软件(http://www cbs dtu.dk/services/SingnalP/)分析编码蛋白有无信号肽。ProtScale在线分析软件(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)分析编码蛋白的疏水性。利用TMHMM服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析编码蛋白有无跨膜结构。BLASTp软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)以及FASTA软件(http://www.ebi.ac.uk/fasta33)用于同源蛋白的搜索，利用CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)软件查询NCBI保守区的功能域数据库，查询有无保守功能域。利用motif scan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif scan)，分析功能结构域。
3、结果
本研究利用抑制性消减杂交(SSH)技术和cDNA微阵列技术筛选柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊阶段虫体差异表达基因，获得了一个克隆号为BW1-E06基因的EST序列，利用RACE技术对EST序列进行了3’和5’端的延伸扩增，将获得的PCR产物测序后拼接得到了一个1185bp的DNA片段，进一步利用PCR技术获得了一个1056bp的cDNA(Genbank登录号：EF552214)，含651bp的开放阅读框，编码216个氨基酸(见图1)。利用NCBI网站的Blast在线分析发现该序列与已知的柔嫩艾美耳球虫基因无明显同源性。编码的蛋白同源性比较后发现与刚地弓形虫(T.gondii)和间日疟原虫(P.vivax)的一种推测蛋白-蛋白质二硫键异构酶同源性分别为62％和55％。CDD软件查询NCBI保守区的功能域数据库，表明在60-168位氨基酸间具有Tryparedoxin(TryX)-like家族蛋白的保守功能域，该家族蛋白基本是双硫键氧化还原酵素，具有CXXC motif的活性位点。结构功能域分析显示该蛋白具有2个酪蛋白激酶II磷酸化位点、2个N端豆蔻酰基化位点和2个PKC磷酸化位点(见表1)。利用北京大学生物信息学中心WebLab中提供的Antigenic程序(http://weblab.cbi.pku.edu.cn/program.inputForm.do？program＝antigenic)分析其抗原位点，结果发现该蛋白可能有8个抗原位点(见表2)。信号肽和跨膜结构分析表明该蛋白N一端不具有信号肽，也无跨膜结构。该蛋白疏水性分析显示，最大值为2.289，最小值为-2.478，疏水性区域分布比较均匀(见图1)。
实施例2
柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶(EtPDI)基因在大肠杆菌中的表达
1、材料
(1)主要试剂
限制性内切酶购自大连宝生物生物技术有限公司。T4DNA连接酶购自Promega公司，DNA Marker购自上海美季生物技术有限公司。
(2)质粒和菌种
重组克隆质粒pGEM-T-EtPDI为上述克隆在重组质粒。质粒pGEX-4T-2、BL21(DE3)由本所提供。
2、方法
(1)重组表达质粒的构建：
将经鉴定正确的重组质粒pGEM-T-EtPDI，利用克隆载体pGEM-T-easy和表达载体pGEX-4T-2的多克隆位点，选择合适的酶进行双酶切(Bam H I和EcoR I)，酶切后回收BW1-E06和pGEX-4T-2片段，连接构建重组表达质粒：pGEX-4T-EtPDI，连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行阳性克隆的鉴定(PCR鉴定和双酶切鉴定)，对筛选的阳性克隆提取质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3)。
(2)重组表达质粒pGEX-4T-EtPDI在大肠杆菌中的表达：
将鉴定好的pGEX-4T-EtPDI/BL21(DE3)转化菌接种于液体LB(含氨苄青霉素)培养基，37℃震荡培养过夜，将培养过夜的菌液按1％的比例接种到另一LB(含氨苄青霉素)液体培养基中，37℃，200r/min，振荡培养2h-3h，使细菌生长至对数生长期，OD600＝0.6-1.0时，加入终浓度为1mmoL/L的IPTG诱导表达，在加入IPTG诱导后0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h分别收集菌体，应用SDS-PAGE分析菌体蛋白，确定最佳诱导时间。
3、结果
构建的重组表达质粒pGEX-4T-EtPDI(命名为：4T-EtPDI)。连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行阳性克隆的鉴定(PCR鉴定和双酶切鉴定)(见图2)，对筛选的阳性克隆，提取质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3)。
将重组质粒4T-EtPDI转化大肠杆菌BL21(DE3)后，加入终浓度为1mmoL/LIPTG于37℃摇床振荡培养，诱导重组蛋白的表达，发现表达量在诱导6h即达到高峰。EtPDI基因的ORF含651个核苷酸，编码216个氨基酸，理论分子量为24.1KDa，采用GST基因融合表达系统，对目的基因进行高效表达，表达的融合蛋白带有分子量为26 KDa的GST标签，则重组质粒4T-EtPDI表达的重组蛋白分子量大约为50KDa，SDS-PAGE电泳结果与预期的大小一致(见图3)，从图中也可看到，重组表达质粒在IPTG诱导下2h即出现表达产物，6h达到最高表达量。
Claims (2)
1.一种柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶基因EtPDI的克隆和表达方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)试剂与材料
Trizol、GeneRaceTM Kit；TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit、限制性内切酶；pGEM-T-easyvector；DEPC、X-Gal、Tag Plus I DNA聚合酶；bacto-yeast extract、Agar A、bacto-tryptone；丙烯酰胺、N，N‘-亚甲基甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵；HRP-羊抗兔IgG3；HRP-羊抗鸡IgG；蛋白质预染Marker；High-Affinity GST Resin；罗曼优质黄羽鸡；柔嫩艾美耳球虫E.tenella；pGEX-4T-2表达载体、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21DE3；
(2)方法
①RACE引物的合成：
利用抑制性消减杂交技术和cDNA微阵列技术筛选柔嫩艾美耳球虫E.tenella孢子发育阶段的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子虫体差异表达基因，获得了孢子化卵囊、子孢子阶段虫体高表达基因BW1-E06、根据其EST序列，设计了3’和5’RACE引物：
3’Primer 5’-ACACCACGTTGCCATTTGAGTCCTT-3’
3’Nested Primer 5’-CCTCCGGGAACAGAATTAGGTCCAT-3’
5’Primer 5’-TCAGATGGGACTGGAGAAACACGAA-3’
5’Nested Primer 5’-CTTGTGCGTCGTGAAGGCTAAGT-3’
②RACE产物的扩增：
进行RACE产物的扩增，扩增获得的RACE产物克隆到pGEM-T-easy载体中，挑选阳性克隆，进行测序，根据测序结果查找3′、5′RACE产物序列与原EST序列的重叠部分，将三段序列拼接；
③含ORF全长基因的克隆：
根据拼接的cDNA序列设计上下游引物，进行含ORF cDNA片断的PCR扩增；
上游引物：5’-TCACAATCTAATTCCCTTTTCACT-3’
下游引物：5’-CATTTTTGACGGATTTCGTTT-3’
以3’RACE和5’RACE扩增时mRNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，反应条件94℃2.0min；94℃30s，52℃40s，72℃2.0min，30个循环，72℃10min；扩增获得的PCR产物经纯化后与pGEM-T-easy Vector连接，构建的重组pGEM-T-EtPDI转化JM109感受态细胞，进行兰白斑筛选，挑选白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定，鉴定正确的单菌落测序；
④生物信息学分析：
利用在线软件ORF finder分析获得的新基因的全长cDNA序列，找出编码框；ProtParam工具计算编码蛋白质的理论分子量、等电点、氨基酸组成；Antigenic程序分析其抗原位点；利用Singal P3.0在线分析软件分析编码蛋白有无信号肽；ProtScale在线分析软件分析编码蛋白的疏水性；利用TMHMM服务器分析编码蛋白有无跨膜结构；BLASTp软件以及FASTA软件用于同源蛋白的搜索；利用CDD软件查询NCBI保守区的功能域数据库，查询有无保守功能域；利用motif_scan分析功能结构域；
⑤荧光实时定量RT-PCR：
选择18SrRNA看家基因作为内参，标准化反应结果；提取柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子的总RNA，去除基因组DNA后，利用随机引物反转录成cDNA第一链，EtPDI基因定量PCR的引物为：
Sense Primer：5′-CAGCGGACAAGGACGAAAG-3′，
Antisense Primer：5′-GTCAGAGCCAACAACTACCAAG-3′；
18S rRNA的引物为Sense Primer：5′-GAGTATGGTCGCAAGGCTGA-3′，
Antisense Primer 5′-CAGGCTAAGGTCTCGTTCGTT-3′
反应体系如下：
成分 体积μL
5×RT-PCR Buffer 5.0
Mg2+250mmoL/L 0.3
dNTP 10mmoL/L 0.75
上游引物10μmoL/L 0.5
下游引物10μmoL/L 0.5
25×EvaGreen 1.0
HS-Ex-Taq 5U/μL 0.25
模板 2.0
ddH2O 14.7
Total volume 25.0
反应程序：95℃90s；95℃5s，58℃30s，80℃10s 40个循环，其中80℃10s结束时间点为荧光信号检测点；
制作溶解曲线的程序为：95℃1min；58℃1min；58℃10s 80个循环，每个循环温度升高0.5℃；采用BIO-RAD公司iCyclerTM IQ version 5.0软件进行计算分析，得出相对于每百万持家基因的目的基因含量；
⑥重组表达质粒的构建：
将经鉴定正确的重组质粒pGEM-T-EtPDI，利用克隆载体pGEM-T-easy和表达载体pGEX-4T-2的多克隆位点，选择合适的酶Bam H I和EcoR I进行双酶切，酶切后回收EtPDI和pGEX-4T-2片段，连接构建重组表达质粒：pGEX-4T-EtPDI，连接后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，进行阳性克隆的鉴定，对筛选的阳性克隆提取质粒后转化大肠杆菌BL21
⑦重组表达质粒pGEX-4T-EtPDI在大肠杆菌中的表达：
将鉴定好的pGEX-4T-EtPDI/BL21(DE3)转化菌接种于液体LB含氨苄青霉素培养基，37℃震荡培养过夜，将培养过夜的菌液按1％的比例接种到另一LB含氨苄青霉素液体培养基中，37℃，200r/min，振荡培养2h-3h，使细菌生长至对数生长期，OD600＝0.6-1.0时，加入终浓度为1mmoL/L的IPTG诱导表达，在加入IPTG诱导后0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h分别收集菌体，应用SDS-PAGE分析菌体蛋白，确定最佳诱导时间；
⑧重组蛋白的分离纯化：
根据确定的最佳诱导时间，将重组质粒4T-EtPDI转化大肠杆菌BL21后，加入终浓度为1mmoL/L IPTG，于37℃摇床振荡培养，诱导重组蛋白的表达，当表达量达到高峰时，离心，收集菌体，确定重组表达蛋白以可溶形式存在，还是以包涵体形式存在，利用GST Resin纯化重组表达蛋白；
⑨Western-blot检测重组表达蛋白：
将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜上，用柔嫩艾美耳球虫卵囊口服免疫鸡的抗血清经pGEX-4T-2/BL21大肠杆菌裂解液吸附处理后作为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗鸡IgG为二抗进行Western-blot检测分析。
2.一种柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶基因EtPDI在制备抗鸡球虫病药物和抗鸡球虫病疫苗中的应用。
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