CN102242131A

CN102242131A - 柔嫩艾美耳球虫ama1基因及应用

Info

Publication number: CN102242131A
Application number: CN 201110134877
Authority: CN
Inventors: 姜连连; 韩红玉; 董辉; 黄兵; 林矫矫; 赵其平; 朱顺海; 马卫娇; 程军; 曾艳波; 李婷; 孔春林
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2011-05-23
Filing date: 2011-05-23
Publication date: 2011-11-16

Abstract

本发明公开了一种柔嫩艾美耳球虫AMA1基因，其核苷酸序列包含：编码SEQ ID NO.1氨基酸序列的DNA序列，或编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸所得到的具有AMA1蛋白活性的氨基酸序列的DNA序列。本发明还公开了上述基因编码的蛋白质。本发明的柔嫩艾美耳球虫AMA1基因和蛋白，与子孢子的入侵、与裂殖子的逸出和入侵、以及与有性生殖阶段小配子的逸出和入侵都密切相关，适于开发成防治球虫病的新疫苗或新药。

Description

柔嫩艾美耳球虫AMA1基因及应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种柔嫩艾美耳球虫顶体膜抗原-1(Apicalmembrane antigen 1，AMA1)基因及应用。

背景技术

鸡球虫病是由艾美耳科、艾美耳属(Eimeria)的球虫寄生于鸡肠上皮细胞内所引起的一种原虫病。而其中以柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)的致病性和危害性最大，它主要寄生于盲肠及其附近区域，能够引起出血性肠炎，对雏鸡危害最大，严重时能引起较高的死亡率，给全世界的养殖业造成巨大的经济损失。目前控制球虫病主要还是依赖抗球虫药的使用，但由于抗球虫药的长期使用，鸡球虫耐药性的产生不可避免，使药物防治球虫病面临重大挑战。

柔嫩艾美耳球虫是顶复器门中艾美耳球虫属的原虫。顶复器门原虫在虫体顶端均含有一特定的顶体结构，参与虫体的宿主细胞入侵。在入侵宿主细胞过程中，虫体顶部的特定细胞器，如棒状体、微线体和致密颗粒，会不断向虫体表面和周围分泌蛋白，这类蛋白是顶复器原虫入侵宿主细胞所必需的，也是引起宿主产生免疫应答的主要抗原物质。顶体膜抗原-1(Apical membrane antigen 1，AMA1)就是由微线体分泌的一种抗原，与虫体入侵密切相关，可以与虫体的棒状体蛋白一起形成运动环结构(MJ)。目前在疟原虫、弓形虫、牛巴贝斯虫中均发现了AMA1，但是，到目前为止还没有柔嫩艾美耳球虫AMA1基因的研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种柔嫩艾美耳球虫AMA1基因，该AMA1基因与虫体入侵密切相关，适于开发成防治鸡球虫病的新疫苗。

此外，还需要提供一种柔嫩艾美耳球虫AMA1基因的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种柔嫩艾美耳球虫基因，所述基因为柔嫩艾美耳球虫AMA1基因，其核苷酸序列包含下述DNA序列之一：

(1)编码SEQ ID NO.1氨基酸序列的DNA序列；

(2)编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸所得到的具有AMA1蛋白活性的氨基酸序列的DNA序列。

优选的，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的DNA序列。

在本发明的另一方面，提供了一种柔嫩艾美耳球虫蛋白质，所述蛋白质为柔嫩艾美耳球虫AMA1蛋白质，该蛋白质选自：

(1)具有SEQ ID NO.1氨基酸序列的蛋白质；

(2)具有SEQ ID NO.1中部分氨基酸序列的活性片段或保守性变异蛋白质；

(3)SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸所得到的具有AMA1蛋白活性的蛋白质。

优选的，所述蛋白质具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

在本发明中，由于体内或纯化期间蛋白质本身的修饰等或由于编码蛋白基因的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现氨基酸的缺失、添加、插入、取代或其他变异。事实上，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体或保守性变异蛋白质。

功能等同变异体同样适用于通过人工手段向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。例如，人白介素2(IL-2)的氨基酸序列中用丝氨酸替换特定的半胱氨酸残基所得到的多肽仍保留着IL-2的活性[Science，224，1431(1984)]。无论是天然变异还是人工变异获得的功能等同变异体，都包括在本发明的范围内。

此外，在用基因工程方法生产蛋白质时，常把所需蛋白质表达为融合蛋白质，例如，把源于其他蛋白质的N-末端肽链加到所需蛋白质的N-末端以提高所需蛋白质的表达，或者把一个合适的肽链加到所需蛋白的N-或C-末端，表达该蛋白并使用一种对所加肽链具有亲和力的载体使所需蛋白的纯化变得更加容易。

就决定基因上特定氨基酸的密码子(三联体碱基组合)而言，每种氨基酸存在1到6个密码子。因此尽管依赖于氨基酸序列，但仍有许多编码一种氨基酸的基因。在自然界中，基因并不稳定，常发生核酸变异。基因的变异可能不影响所编码的氨基酸序列(沉默变异)，这种情况下，会产生编码相同氨基酸序列的不同基因。因此，即使分离出了编码特定氨基酸序列的基因，随着含有该基因生物体的传代，仍不可避免地会产生编码相同氨基酸序列的不同基因。

用各种基因工程技术人工产生编码相同氨基酸序列的各种基因并不困难。例如，当编码所需蛋白质的天然基因的密码子在用于以基因工程技术产生蛋白质的宿主中可利用性较低、表达的蛋白量不够时，可以人工将密码子转变成在该宿主中可利用性高的另一密码子而不改变所编码的氨基酸序列，即可增强所需蛋白质的表达。因此，这类人工生产的不同多核苷酸也包括在本发明的范围内，只要它能编码出本发明公开的氨基酸序列即可。

另外，由至少一种改变(如蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸残基的缺失、添加、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性，编码这类多肽或蛋白的基因也包括在本发明的范围内，不管它是从天然来源分离还是人工生产的。

一般的，编码功能等同变异体的基因是同源的。因此，能与本发明的基因杂交且编码具有柔嫩艾美耳球虫AMA1蛋白活性的蛋白质的核酸分子也包括在本发明的范围内。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述柔嫩艾美耳球虫基因全部或部分DNA序列的重组载体。

所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体，重组表达载体包括重组原核表达载体、重组真核表达载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种宿主细胞，包含上述重组载体，或已用上述基因序列转化或转染。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因在制备预防或治疗球虫病的疫苗或药物中的应用。

所述疫苗或药物通过抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞、或抑制裂殖子的逸出和入侵、或抑制有性生殖阶段小配子的逸出和入侵，从而阻断球虫生活史来发挥作用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫蛋白质在制备预防或治疗球虫病的疫苗或药物中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因在筛选预防或治疗球虫病的药物中的应用。本发明的柔嫩艾美耳球虫AMA1基因可作为控制球虫病的药物治疗靶标，为设计和筛选抗球虫药物提供新的靶点。

本发明柔嫩艾美耳球虫AMA1基因，与子孢子的入侵、与裂殖子的逸出和入侵、以及与有性生殖阶段小配子的逸出和入侵都密切相关。Western-blot分析表明本发明EtAMA1的原核表达产物具有良好的抗原性；免疫保护性试验结果显示rEtAMA1免疫组的粪便卵囊产量、鸡只增重效果、病变积分均好于感染对照组，对鸡体内抗体水平进行检测，结果rEtAMA1免疫后的鸡体内均可以诱导产生特异性抗体，并可维持较长时间。因此，本发明的EtAMA1基因，为开发防治鸡球虫病的新疫苗提供了新的候选抗原，并为筛选抗球虫药物提供了新的靶点。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1柔嫩艾美耳球虫各发育阶段虫体总RNA提取的电泳鉴定图；

图2是本发明实施例1柔嫩艾美耳球虫AMA1基因全长cDNA的RT-PCR扩增产物电泳鉴定图；

图3是本发明实施例2实时定量PCR检测EtAMA1基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的表达图；

图4是本发明实施例3重组原核表达质粒pGEX-6P-1-AMA1的PCR鉴定图；

图5是本发明实施例3的SDS-PAGE分析pGEX-6P-1-AMA1/BL21重组蛋白表达及纯化图；

图6是本发明实施例3的rEtAMA1的Western-Blot分析图；

图7是本发明实施例5抗rEtAMA1多抗血清对子孢子入侵细胞的抑制结果图；

图8是本发明实施例6的rEtAMA1的免疫保护性试验的免疫程序图；

图9是本发明实施例6的rEtAMA1免疫鸡体内抗体水平柱状图；

图10是本发明实施例6的rEtAMA1二免后鸡盲肠中细胞因子的定量PCR结果图；

图11是本发明实施例7子孢子入侵DF-1细胞时EtAMA1的荧光定位图；

图12是本发明实施例8的EtAMA1不同感染时间段的体内荧光定位图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

本发明利用RACE技术扩增获得了柔嫩艾美耳球虫的AMA1基因全长cDNA，设计引物，将其克隆进原核表达载体pGEX-6P-1中获得了柔嫩艾美耳球虫的AMA1重组蛋白(rEtAMA1)，rEtAMA1纯化后免疫家兔获得特异性多抗血清。Western-blot分析表明rEtAMA1具有良好的免疫原性；免疫保护性试验结果显示rEtAMA1免疫组的粪便卵囊产量、鸡只增重效果、病变积分均好于感染对照组，rEtAMA1免疫后的鸡体内均可以诱导产生特异性抗体，并可维持较长时间。子孢子入侵的免疫抑制实验结果表明EtAMA1与子孢子的入侵相关。

在建立的柔嫩艾美耳球虫DF-1细胞培养体系中，用抗rEtAMA1多抗血清对子孢子入侵的宿主细胞的动态过程进行荧光定位，并用抗rEtAMA1多抗血清对子孢子在鸡体内的发育过程进行荧光定位，观察EtAMA1在子孢子入侵和发育过程中的动态分布。结果表明本发明柔嫩艾美耳球虫AMA1基因，与子孢子的入侵、与裂殖子的逸出和入侵、以及与有性生殖阶段小配子的逸出和入侵都密切相关。本发明柔嫩艾美耳球虫AMA1基因为开发抑制子孢子入侵、或抑制裂殖子的逸出和入侵、或抑制有性生殖阶段小配子的逸出和入侵，从而阻断球虫生活史的新疫苗或新药提供了新思路。

实施例1柔嫩艾美耳球虫AMA1基因全长cDNA的克隆及分析

利用柔嫩艾美耳球虫子孢子基因表达文库和裂殖子基因表达文库的差异，得到了子孢子阶段和裂殖子阶段高表达的EST序列，选取与顶体膜蛋白同源性较高的EST序列BG589进行全长基因的扩增，该扩增的全长基因为柔嫩艾美耳球虫顶体膜抗原-1基因，命名为EtAMA1。

利用RACE技术扩增获得了EtAMA1基因的全长cDNA，具体步骤如下：

1.柔嫩艾美耳球虫子孢子的收集

1.1柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊的收集与孢子化

取4℃保存的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，3000r/min离心10min，在沉淀中加入适量的蒸馏水，悬浮沉淀，3000r/min离心10min，去上清液。重复洗涤2～3次，以去除残留的重铬酸钾。在沉淀中加入适量的水稀释，用血球计数板对孢子化卵囊进行计数，最终将卵囊液稀释为4×10⁴个/mL，接种2周龄无球虫雏鸡，每只鸡经口接种1mL卵囊液。在鸡只接种后第8天，收取盲肠，将盲肠用组织捣碎机捣碎，3000r/min离心10min后，用蒸馏水悬浮沉淀，按2mg/mL量加入胃蛋白酶，并用盐酸将pH值调至2.0左右，在37℃消化至卵囊基本分散，将消化液依次经50目、100目、200目金属网筛过滤，滤液经3000r/min离心10min，沉淀用2.5％的重铬酸钾溶液悬浮后，置于28℃培养箱中进行孢子化培养，当卵囊的孢子化率达90％以上，收集卵囊于4℃冰箱保存，保存时间一般不超过2个月。

1.2柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的纯化

在使用前取出卵囊液，置于10mL离心管，3000r/min离心10min，倒去重铬酸钾，用蒸馏水反复洗涤2～3次，除净卵囊液中的重铬酸钾，用沉淀中加入30％的次氯酸钠，混匀后冰浴放置30min以上，可见溶液出现分层现象，吸取溶液上方的白色漂浮物(卵囊)于灭菌的10mL离心管中，加入10倍体积以上的无菌HBBS，3000r/min离心10min，收集沉淀，再用灭菌的HBBS反复洗涤4～5次，以彻底清除卵囊液中残留的次氯酸钠，纯化好的卵囊可置于4℃冰箱保存。

1.3柔嫩艾美耳球虫子孢子的制备

将纯化后的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，用干烤灭菌的玻璃匀浆器研磨破坏卵囊壁，释放出孢子囊，收集孢子囊于无菌的10mL离心管，加入HBBS，2000r/min离心10min，用灭菌的HBBS悬浮沉淀，转移至50mL灭菌的三角烧瓶中，加入0.5％的胰蛋白酶和5％的鸡胆汁，混匀后置于41℃消化至90％以上的子孢子溢出，2500r/min离心5min，收集沉淀，用HBBS悬浮后，用干烤过的G3砂芯漏斗，收集滤液于无菌的离心管中，离心洗涤后即可得到用于细胞培养的柔嫩艾美耳球虫子孢子，子孢子一般是现用现制，可置于4℃短时间保存。

2.柔嫩艾美耳球虫各阶段虫体总RNA的提取

将总RNA提取过程中所用的金属物品和玻璃器皿，用双蒸水洗净晾干后用铝箔纸包好，置于烤箱中160℃干烤5h以上；塑料制品用0.1％的DEPC水浸泡过夜，再高压灭菌30min左右，以除去RNA酶。75％乙醇用DEPC水配制而成，所用的离心管和移液器枪头均为无RNA酶处理，在整个提取过程中应使用一次性手套，且经常更换。

用TRizol试剂提取了柔嫩艾美耳球虫4个发育阶段(子孢子，孢子化卵囊，未孢子化卵囊，第二代裂殖子)的总RNA，操作步骤按照Trizol试剂的说明书。

结果如图1所示，经紫外分光光度计测定OD260/OD280的比值为1.6～1.9之间，符合纯度要求。在甲醛变性凝胶电泳上，可见明显的28S和18S两个条带，表明提取的总RNA质量良好，可用于后续实验。图1中，1：子孢子；2：孢子化卵囊；3：未孢子化卵囊；4：第二代裂殖子。

3.按照GeneRacer^TMKit(美国Invitrogen公司)说明书操作步骤将提取柔嫩艾美耳球虫子孢子RNA反转录合成cDNA第一链。

4.柔嫩艾美耳球虫BG589基因全长cDNA的获取

利用Oligo引物设计软件根据BG589基因的ESTs序列设计引物，分别获得两个EST序列的3’端和5’端的RACE扩增引物。所有RACE引物见表1。

表1RACE引物序列

利用上述设计的RACE引物扩增3’和5’cDNA末端。将3’RACE和5’RACE PCR扩增产物回收后，与pGEM-T-easy载体(Promega公司)连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，挑选白色菌落进行PCR鉴定，如果扩增片段与预期一致，则取500μL菌液送公司测序。对于阳性克隆测序结果，用DNAstar软件查找3’RACE和5’RACE扩增产物序列与原EST序列的重叠部分，将三段序列进行拼接即可获得cDNA全长序列。

根据拼接的目的基因全长cDNA序列，利用Oligo软件设计全长序列的上下游引物(表2)，以3’RACE和5’RACE扩增时mRNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增全长cDNA。

表2全长cDNA扩增引物序列

反应结束后取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳分析(见图2)。在图2中，M：DNA标准分子量(DL2000，从上到下依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；1：BG589基因扩增的全长cDNA产物。

PCR扩增产物回收，与pGEM-T-easy连接后，转化TOP10感受态细菌，涂布含X-gal，IPTG的氨卞抗性LB平板，37℃培养过夜，挑取白色菌落进行PCR鉴定，选取分子量大小与预期一致的阳性菌落送公司测序。

利用常规生物信息学软件对获得的全长cDNA序列及其编码蛋白结构进行预测分析。

5.结果

根据BG589基因的EST序列，利用RACE技术扩增获得了基因全长为2349bp的cDNA全长序列(SEQ ID NO.2)，分析表明，在469～2079位碱基之间有一个完整ORF，共1608bp，编码536个氨基酸(SEQ ID NO.1)，推测理论分子量58kDa，等电点为5.79。同源搜索发现该基因编码的蛋白与巨型艾美耳球虫、疟原虫、弓形虫、牛巴贝斯虫的顶体膜抗原-1具有很高的同源，推测该基因编码的蛋白为柔嫩艾美耳球虫顶体膜抗原-1，命名为EtAMA1。

实施例2EtAMA1基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的表达差异分析

分别提取柔嫩艾美球虫4个发育阶段虫体(孢子化卵囊、未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子)的总RNA，以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子的cDNA第一链为模板，利用实时荧光定量PCR，选择看家基因18S rRNA作为内参，观察EtAMA1基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段虫体中的mRNA转录情况。实验结果表明，EtAMA1基因在柔嫩艾美耳球虫子孢子发育阶段高度表达(见图3)。表3为实时荧光定量PCR扩增引物序列。

表3实时定量PCR扩增引物序列

实施例3EtAMA1基因的原核表达

1.原核表达载体pGEX-6P-1质粒的提取

利用质粒DNA小量制备试剂盒提取空载体质粒pGEX-6P-1和含AMA1基因全长序列的质粒pGEM-T-BG589，保存于-20℃备用。

2.含酶切位点的EtAMA1基因序列的克隆

对AMA1基因的全长序列进行序列分析，去除AMA1基因的信号肽及跨膜区后，针对胞外区序列设计引物进行序列扩增，上游和下游引物分别为SPA1、SPA2(表4)，在引物中加入BamH I和EcoR I，以含有AMA1基因的全长序列的克隆质粒pGEM-T-BG589为模板，PCR扩增AMA1基因的表达序列，从而在基因序列中引入BamH I和EcoRI酶切位点。

表4PCR反应中所用的引物名称及序列

将扩增获得的目的片段与pGEM-T-easy连接后，转化TOP10感受态细菌，挑取白色菌落，接种含氨卞的LB液体培养基，经PCR检测阳性菌落进行测序，对测序结果进行分析，选择基因序列正确的菌液进行质粒提取。

3.EtAMA1基因的原核表达体系的构建

将上述步骤获得的质粒和表达载体pGEX-6P-1分别进行BamH I和EcoRI双酶切。利用T4DNA连接酶连接目的片段与pGEX-6P-1表达载体，构建pGEX-6P-1-AMA1重组表达质粒。将该pGEX-6P-1-AMA1重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21，利用表达引物SPA1和SPA2对构建的重组表达质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定，图4为重组表达质粒pGEX-6P-1-AMA1的PCR鉴定图，在图4中，M：标准DNA分子量(从上到下依次为：2000bp、1500bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；1：pGEX-6P-1-AMA1重组表达质粒的PCR鉴定。对鉴定筛选出的阳性克隆，进行rEtAMA1的诱导表达。

4.重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达

将鉴定正确的阳性克隆进行LB平板(含氨苄青霉素)划线培养，挑取单个菌落接种至3mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中，200r/min振荡培养过夜。将的菌液按1∶100的比例接种至300mL的LB(含氨苄青霉素)液体培养基中，37℃，200r/min，振荡培养至细菌达到对数生长期，即OD₆₀₀＝0.6～1.0时，取出1mL作为阴性对照，加入终浓度为1mmoL/L IPTG诱导重组蛋白的表达。置于37℃，200r/min振荡培养，分别在加入IPTG后2h、4h、6h、8h、10h、12h取出1mL细菌培养物。将不同时间段取出的菌液，12000r/min，室温离心2min，弃去上清液，沉淀中加入40μL ddH₂O，悬浮细菌，每管加入40μL2×SDS-PAGE上样缓冲液，充分混匀后煮沸5min，12000r/min离心5min，取上清液，进行SDS-PAGE电泳分析。重组蛋白的表达量在诱导6h即达到高峰。AMA1基因的细胞外表达序列含有1260bp，编码420个aa，推测理论分子量46kDa，表达的融合蛋白带有分子量为26kDa的GST标签，则重组质粒pGEX-6P-1-AMA1表达的rEtAMA1分子量大约为72kDa，由SDS-PAGE电泳结果可见重组蛋白的大小与预期分子量一致(见图5)。将表达rEtAMA1的重组表达菌经超声裂解后，离心，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析，结果发现重组蛋白以包涵体形式存在。利用包涵体纯化蛋白的方法对重组蛋白进行纯化，SDS-PAGE分析结果表明获得了较高纯度的rEtAMA1(图5)。图5中，M：标准蛋白质分子量(从上至下：94.0kDa，66.2kDa，45.0kDa，35.0kDa，26.0kDa，20.0kDa，14.4kDa)；1：空载体pGEX-6P-1在IPTG诱导后的表达产物；2：重组质粒pGEX-6P-1-AMA1在IPTG诱导后的表达产物；3：纯化的rEtAMA1。

实施例4rEtAMA1的抗原性分析

将纯化的rEtAMA1进行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，用柔嫩艾美耳球虫子孢子多抗兔血清，1∶100稀释后作为一抗，1∶5000稀释的羊抗兔IgG-HRP为二抗进行Western-blot分析，检测rEtAMA1的抗原性。

结果rEtAMA1处出现了明显的反应条带，分子量与预期结果大小一致(图6)，表明rEtAMA1具有一定的免疫原性。图6中，M：预染的标准蛋白分子量(从上至下：170kDa、130kDa、95kDa、72kDa、55kDa、43kDa、34kDa、26kDa、17kDa、11kDa)；1：空载体pGEX-6P-1在IPTG诱导后的表达产物；2，3：rEtAMA1。

实施例5抗rEttAMA1多抗血清对子孢子入侵细胞的抑制作用

(1)rEtAMA1多抗血清的制备

将纯化后的rEtAMA1，在测定蛋白质的浓度后，与弗氏完全佐剂按1∶1比例进行乳化，以每只兔子免疫200μg的剂量免疫8周龄的母兔，免疫两周后，再以相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后加强免疫三次，每次间隔时间均为两周，最后一次加强免疫后8d，对兔子进行大量采血，分离血清。

(2)rEtAMA1多抗血清对子孢子入侵细胞的抑制作用

利用Protein A Agarose对rEtAMA1、子孢子、GST多抗血清进行纯化，分离IgG抗体，已建立的DF-1细胞入侵检测体系对rEtAMA1多抗血清子孢子的入侵作用进行研究，将CFDA SE标记后的子孢子进行细胞计数，将子孢子分为30万/管，共4管，分别加入纯化后的抗AMA1多抗IgG，浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL。37℃孵育2h，4000r/min离心5min，弃上清，用含5％胎牛血清的DMEM悬浮子孢子，接入预先铺被好的DF-1细胞中，测定子孢子的入侵率，同时设立对应浓度梯度的抗子孢子多抗血清的阳性对照组和抗GST多抗血清对照组，以及未加抗体的阴性对照组，计算公式为：抗体的入侵抑制率＝[1-(抗体作用的子孢子入侵率/未经抗体作用的子孢子入侵率)]×100％。

结果：流式细胞仪检测结果可见与抗子孢子和rEtAMA1的抗体作用后的子孢子对DF-1细胞的入侵能力明显减低(图7A)。且抗rEtAMA1多抗血清对子孢子的入侵抑制率随抗体浓度的不断增加而逐渐增大，但当抗体浓度达到200μg/mL时，对子孢子入侵细胞的抑制率基本保持不变，抗子孢子多抗血清的阳性对照组，则对子孢子入侵细胞的抑制率高于实验组，而抗GST多抗血清的对照组对子孢子入侵细胞的抑制率较低(图7B)。该实验结果说明EtAMA1与子孢子的入侵相关。在图7A中，左边图为：未用与抗体作用的子孢子接种后的DF-1细胞；右边图为：与200μg/mL抗rEtAMA1多抗血清作用后的子孢子接种后的DF-1细胞。

实施例6rEtAMA1的免疫保护性试验

1.免疫保护性试验分组及免疫程序

将1日龄小鸡在无球虫环境中饲养，7日龄时进行称重分组，每组25只鸡，试验共6组。免疫方式采用肌肉注射法，免疫剂量和免疫组别见表5，具体免疫程序如图8所示。

表5rEtAMA1的免疫保护性试验的分组情况

2.免疫保护性效果观察

主要从以下几个方面评价免疫保护性效果：

1)粪便中卵囊减少率：攻虫后第5d开始收集粪便，对粪便进行称重后，取2g粪便，加入58mL水，混合均匀，经两层纱布过滤后，取2mL滤液加入4mL的饱和盐水重，充分混匀后，用麦氏计数板对卵囊进行计数，从而得到每克粪便中卵囊数(OPG)，计数出卵囊减少率。

2)鸡只增重效果：本实验对鸡共进行3次称重，即首次免疫前，卵囊接种前和鸡只宰杀前。分别用下列公式衡量鸡只增重效果：

平均增重＝鸡只宰杀时重量-卵囊接种时鸡只重量

相对增重＝试验组增重/阴性对照组增重×100％

3)盲肠病变积分：在卵囊接种后的第8d，每组剖杀8只鸡，观察并记录盲肠病变情况，按Johnson和Reid(1970)设计的病变记分法进行肠道病变记分，标准如下：两侧盲肠病变不一致时，以严重的一侧为准。

0分，无肉眼病变。

+1分，盲肠壁有很少量散在的瘀点，肠壁不增厚，内容物正常。

+2分，病变数量较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚，内容物正常。

+3分，盲肠内有大量血液或有盲肠芯(血凝块或灰白色干酪样的香蕉型块状物)，盲肠壁肥厚明显，盲肠中粪便含量少。

+4分，因充满大量血液或肠芯而盲肠肿大，肠芯中含有粪渣或不含，死亡鸡只也记4分。

4)体液免疫水平免疫效果：分别在免疫前、一免后7d、二免后7d和攻虫后7d，每组随机抓取3只鸡，在翅膀静脉处采血，分离血清。利用间接ELISA法对血清中IgG动态变化情况进行监测，利用方正试验确定最佳抗原和血清稀释浓度。

5)细胞免疫水平主要是利用荧光定量PCR的方法，检测盲肠中细胞因子的动态变化，测定的细胞因子为IL-2，IL-8，IL-18和IFN-γ。荧光定量PCR的引物序列见表6。

表6荧光定量PCR中所用的引物

3.rEtAMA1的免疫保护性试验结果

柔嫩艾美耳球虫的rEtAMA1免疫保护性试验共分为六组，即重组蛋白免疫剂量为50μg/只一组、重组蛋白免疫剂量为100μg/只一组、GST标签免疫剂量为50μg/只一组、GST标签免疫剂量为100μg/只一组以及PBS免疫的健康对照组和感染对照组，以粪便卵囊产量、鸡只增重效果、病变积分以及鸡体内抗体水平和细胞免疫水平衡量rEtAMA1的免疫效果。结果发现，从鸡只增重来看，rEtAMA1免疫的两个实验组和高剂量免疫的GST标签免疫组的鸡只增重与感染对照组的鸡只增重差异显著(P＜0.05)，接近或高于健康对照组的平均增重。且100μg/只的免疫组(118.13％)好于50μg/只的免疫组(92.30％)，并高于健康对照组的增重(100％)；从病变积分来看，免疫组和感染对照组与健康对照组差异显著，均出现了明显的盲肠病变，但rEtAMA1免疫组的病变积分要小于感染对照组的病变积分；从粪便卵囊产量来看，免疫组和感染对照组差异显著，且rEtAMA1免疫组的卵囊产量要好于GST标签免疫组卵囊产量(表7)。

表7rEtAMA1的免疫保护性试验结果

注：同列数据肩标2个字母中有1个或2个相同，差异不显著(P＞0.01)；肩标2个字母不同，差异极显著(P＜0.01)。

利用ELISA方法对免疫前、一免后7d、二免后7d和攻虫后7d所采集的血清进行抗体效价的测定，方阵实验确定了抗原的最佳稀释浓度：rEtAMA1：25μg/mL，GST标签：14μg/mL，抗体的最佳稀释浓度为1∶1000。用上述的最佳浓度的抗原抗体进行抗体水平检测，结果可见：免疫前鸡只的抗体水平无明显差异，而在一免后7d，用大剂量重组蛋白和GST标签免疫的鸡体内均明显产生了特异性抗体，而低剂量免疫组的鸡体内的特异性抗体增加不明显，但二免后7d，低剂量和高剂量免疫组均产生了较高的抗体水平，用rEtAMA1免疫的鸡体内特异性抗体水平可以持续较长时间，而用GST标签免疫组的抗体则会降低(见图9)。

利用荧光定量PCR方法对二免后鸡盲肠中的细胞免疫水平进行测定，主要选择了IL-2、IL-8、IL-18、INF-γ四种细胞因子进行检测，结果可见：二免后的第4、6d，鸡盲肠中IL-2、IL-8、INF-γ的表达水平较低，但二免后第10d，可见rEtAMA1免疫组(100μg/只)和健康对照组鸡体内的IL-2、IL-8、INF-γ基因的表达水平明显升高(图10A、B、D)。而IL-18的基因表达水平在rEtAMA1免疫后第4d的表达量较高，且高剂量免疫组(100μg/只)明显高于低剂量免疫组(50μg/只)，免疫后第6d时，表达水平显著降低，但高剂量免疫组仍高于低剂量免疫组，免疫后第10d，高剂量免疫组和健康对照组的IL-18表达水平均略有升高，但高剂量免疫组的表达水平高于健康对照组(图10C)。从该实验结果可以看出高剂量rEtAMA1免疫组的IL-2、IL-8、IL-18、INF-γ四种细胞因子表达水平均高于感染对照组，即存在细胞免疫反应，说明高剂量的rEtAMA1可以诱导机体产生细胞免疫保护。

实施例7EtAMA1的体外荧光定位

利用rEtAMA1多抗血清，对子孢子、子孢子入侵宿主细胞的过程进行免疫荧光定位，观察虫体入侵细胞过程中EtAMA1蛋白的动态分布。rEtAMA1多抗血清使用前需与GST重组蛋白作用，以去除血清中抗GST的非特异性抗体。实验具体操作过程如下：

1)取泡酸处理过的盖玻片，经干烤灭菌后放于细胞培养皿中，每孔接入10万DF-1细胞，37℃，5％CO₂培养过夜。

2)将纯化后的子孢子，悬浮于含10％胎牛血清的DMEM中，37℃作用1h后，接种DF-1细胞，继续置于二氧化碳培养箱中培养。

3)分别在2h、24h、36h、48h、60h、72h取出一个细胞培养皿，倒去细胞上清，用PBS清洗3次，洗去未入侵的子孢子。

4)加入1mL 2％的多聚甲醛固定15min，用PBS洗三次。

5)加入1mL 1％Triton X-100室温下透明15min，用PBS洗三次。

6)加入2mL 2％PBS配制的BSA，4℃封闭过夜。

7)PBS清洗三次后，rEtAMA1多抗血清1∶100稀释后，取100μL滴加在Parafilm膜上，用平头镊子取出盖玻片，将铺有细胞的一面覆盖在抗体上，37℃作用1h。

8)用PBST(PBS中加入0.5％吐温-20)清洗三次后，置于PBS中浸泡30min。

9)用与一抗相同的操作方法，加入1∶500稀释的FIFC标记的荧光二抗，37℃避光反应1h。

10)用PBST清洗三次后，置于PBS中浸泡30min。

11)在盖玻片上滴加DAPI染液进行核染，室温下避光放置10min，用PBST清洗三次。

12)取干净的载玻片，滴加50μL抗荧光淬灭的封片液，将盖玻片细胞面向下放在载玻片上，在正置荧光显微镜下进行观察。

结果可见：新鲜制备的子孢子表面EtAMA1分布于子孢子的表面(图11A)；当子孢子准备入侵细胞时，子孢子表面的EtAMA1明显增多，且顶部的蛋白含量较高(图11B)；当子孢子接种DF-1细胞后的2h时，子孢子入侵到宿主细胞中，且EtAMA1蛋白主要集中在子孢子表面(图11C)；当子孢子接种DF-1细胞24h时，可见子孢子开始发育，且EtAMA1开始均匀分布于子孢子表面(图11D)；当子孢子接种DF-1细胞36h时，可见子孢子发育为滋养体，EtAMA1大量分布于滋养体的表面(图11E)；当子孢子接种DF-1细胞48h时，虫体发育为未成熟裂殖体，EtAMA1分布于未成熟裂殖体中，但表达量有所降低(图11F)；当子孢子接种DF-1细胞60h时，虫体发育为成熟裂殖体，EtAMA1主要分布于裂殖体内的裂殖子表面，而裂殖体表面的蛋白含量明显减少(图11G)；当子孢子接种DF-1细胞72h时，第一代裂殖子由裂殖体中逸出，且EtAMA1大量分布于第一代裂殖子的表面，主要集中于裂殖子顶端，且在裂殖体与宿主的交界处含有大量的EtAMA1颗粒(图11H)。该实验结果表明，在子孢子发育为裂殖子的过程中，存在EtAMA1动态转移的过程，且EtAMA1参与裂殖子从裂殖体逸出过程。

实施例8EtAMA1的鸡体内荧光定位

将洗涤干净的柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵囊，计数后每只鸡经口接种1×10⁴个卵囊，接种3日龄雏鸡，接种后每24h进行盲肠取样，固定于4％PBS(pH7.4)配制的多聚甲醛中，同时对相应时间段的正常鸡只的盲肠作为阴性对照，共收取了24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h的柔嫩艾美耳球虫感染鸡和正常鸡的盲肠，固定1～2周后制备冰冻切片，同时收取球虫感染后110h时的鸡盲肠中第二代裂殖子，纯化后涂布载玻片进行固定，用经GST蛋白处理后的抗rEtAMA1多抗血清对子孢子在鸡体内的发育过程进行荧光定位(步骤同上述实施例7荧光染色操作)，观察EtAMA1在子孢子入侵和发育过程中的动态分布。

结果可见：当柔嫩艾美耳球虫卵囊接种鸡后24h时，即有子孢子经历脱囊过程，移行至鸡盲肠中，吸附于盲肠上皮细胞上，此时EtAMA1大量表达于子孢子的表面，且主要集中于子孢子顶端(图12A1，A2，其中，A1：400倍放大下的柔嫩艾美耳球虫感染鸡只24h后盲肠；A2：400倍放大下的相同时间的健康鸡的盲肠)；当柔嫩艾美耳球虫卵囊接种鸡后48h后，可见子孢子开始发育为滋养体，EtAMA1均匀分布于滋养体表面(图12B1，B2，其中，B1：400倍放大下的柔嫩艾美耳球虫感染鸡只48h后盲肠；B2：400倍放大下的相同时间的健康鸡的盲肠)；当柔嫩艾美耳球虫卵囊接种鸡后72h时，则滋养体发育为第一代成熟裂殖体，并释放出第一代裂殖子，EtAMA1均匀表达量增多，并集中于裂殖子顶端(图12C1，C2，其中，C1：400倍放大下的柔嫩艾美耳球虫感染鸡只72h后盲肠；C2：400倍放大下的相同时间的健康鸡的盲肠)；当卵囊接种鸡后96h，可见盲肠上皮出现大量的第二代裂殖体(21～30μm×50～55μm)，盲肠上皮细胞被严重破坏，此时EtAMA1的表达量降低，主要在裂殖体内的裂殖子顶部高表达(图12D1，D2，其中，D1：400倍放大下的柔嫩艾美耳球虫感染鸡只96h后盲肠；D2：200倍放大下的相同时间的健康鸡的盲肠)；当柔嫩艾美耳球虫卵囊接种鸡后120h时，可见裂殖体释放出裂殖子后继续感染宿主细胞，形成形状较小的第三代裂殖子(9μm×7.6μm)，EtAMA1存在于裂殖体表面，在裂殖体内部为点状分布(图12E1，E2，其中，E1：400倍放大下的柔嫩艾美耳球虫感染鸡只120h后盲肠；E2：200倍放大下的相同时间的健康鸡的盲肠)；当柔嫩艾美耳球虫卵囊接种鸡后144h时，虫体进入有性生殖阶段，发育为大小配子体，则虫体内的EtAMA1表达量呈现两种趋势，在大配子体中的EtAMA1含量降低(图12F1，F2，其中，F1：400倍放大下的柔嫩艾美耳球虫感染鸡只144h后盲肠；F2：200倍放大下的相同时间的健康鸡的盲肠)，而小配子体中含有的小配子的EtAMA1的表达量显著增高(图12G，G：400倍放大下的柔嫩艾美耳球虫感染鸡只144h后盲肠)，且在大小配子体形成合子中有大量点状分布的EtAMA1，合子表面也大量分布着EtAMA1(图12H，H：400倍放大下的柔嫩艾美耳球虫感染鸡只144h后盲肠)；当柔嫩艾美耳球虫卵囊接种鸡后168h时，虫体发育为大量的未孢子化卵囊，EtAMA1表达量降低，基本上在未孢子化卵囊的细胞质中不表达，仅少量存在于卵囊壁周围(图12I1，I2，其中，I1：400倍放大下的柔嫩艾美耳球虫感染鸡只168h后盲肠；I2：200倍放大下的相同时间的健康鸡的盲肠)。此外对柔嫩艾美耳球虫接种后110h时盲肠收取的第二代裂殖子的EtAMA1进行定位，可见EtAMA1大量分布于第二代裂殖子的表面，主要集中于顶端(图12J)。

该实验结果表明，EtAMA1与裂殖子的逸出和入侵相关，且EtAMA1与小配子逸出和入侵大配子体密切相关。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>柔嫩艾美耳球虫AMA1基因及应用

<160>24

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>536

<212>PRT

<213>Eimeria tenella

<400>1

Met Arg Arg Leu Ser Pro Ala Leu Gly Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ser

1 5 10 15

Cys Ala Gly Pro Ala Ala Gly Val Gln His Lys Leu Gln His Arg Gln

20 25 30

Gln Gln Gln Gln Gln His Ser His Ala Ser Thr Ser His Ala Ala Ala

35 40 45

Val Leu Ala Ala Ser Ser Asp Ala Ser Thr Asp Ser Asn Pro Phe Met

50 55 60

Gln Pro Pro Tyr Ala Glu Phe Met Ala Arg Phe Asn Ile Pro Lys Val

65 70 75 80

His Gly Ser Gly Val Tyr Val Asp Leu Gly Asn Asp Lys Glu Val Lys

85 90 95

Gly Lys Met Tyr Arg Glu Pro Gly Gly Arg Cys Pro Val Phe Gly Lys

100 105 110

Asn Ile Glu Phe Tyr Gln Pro Leu Asp Ser Asp Leu Tyr Lys Asn Asp

115 120 125

Phe Leu Glu Asn Val Pro Thr Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Lys Pro

130 135 140

Leu Pro Gly Gly Phe Asn Asn Asn Phe Leu Met Lys Asp Lys Lys Pro

145 150 155 160

Phe Ser Pro Met Ser Val Ala Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Gln Leu Lys

165 170 175

Ala Arg Thr Gly Leu Gly Lys Cys Ala Glu Met Ser Tyr Leu Thr Thr

180 185 190

Ala Ala Gly Ser Ser Tyr Arg Tyr Pro Phe Val Phe Asp Ser Lys Lys

195 200 205

Asp Leu Cys Tyr Leu Leu Leu Val Pro Leu Gln Arg Leu Met Gly Glu

210 215 220

Arg Tyr Cys Ser Thr Arg Gly Ser Pro Pro Gly Leu Ser His Phe Cys

225 230 235 240

Phe Lys Pro Leu Lys Ser Val Ser Leu Arg Pro His Leu Val Tyr Gly

245 250 255

Ser Ala Tyr Val Gly Glu Arg Pro Asp Asp Trp Glu Thr Lys Cys Pro

260 265 270

Asn Lys Ala Val Lys Asp Ala Val Phe Gly Val Trp Glu Gly Gly Arg

275 280 285

Cys Glu Glu Gln Arg Leu Arg Leu Gly Ala Gln Thr Ala Ala Ala Ala

290 295 300

Ala Lys Glu Asp Cys Trp Ala Leu Ala Phe Asn Asn Pro Phe Ala Ala

305 310 315 320

Ser Asp Gln Pro Thr Ser Gln Asp Glu Ala Ala Thr Ser Pro Gly Tyr

325 330 335

Tyr Phe Pro Ser Ile Thr Pro Ser Gln Pro Lys Ser Gly Gly Val Gly

340 345 350

Val Asn Phe Ala Ser Tyr Tyr Pro Ser Gly Glu Cys Val Leu Ser Gly

355 360 365

Glu Val Pro Thr Cys Leu Leu Pro Arg Arg Gly Ala Ala Ala Phe Thr

370 375 380

Ser Glu Gly Ser Leu Glu Glu Glu Glu Leu Pro His Cys Asp Pro Thr

385 390 395 400

Phe Pro Ala Ser Leu Gly Ser Cys Asp Pro Ser Ser Cys Lys Ala Ile

405 410 415

Leu Thr Glu Cys Arg Gly Gly Arg Leu Val Glu Gln Gln Thr Asp Cys

420 425 430

Val Pro Glu Asp Gly Ser Lys Cys Glu Ser Lys Gly Gly Gly Val Phe

435 440 445

Ile Gly Leu Ala Val Ala Gly Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr Gly

450 455 460

Gly Ala Phe Phe Ile Tyr Lys Gln Arg Gln Lys Ala Leu Pro Lys Glu

465 470 475 480

Ser Ser Pro Gln Arg Thr Asp Phe Val Gln Asp Glu Ala Ala Thr Gly

485 490 495

Arg Gly Lys Lys Arg Gln Ser Asp Leu Val Gln Gln Ala Glu Pro Ser

500 505 510

Phe Trp Glu Glu Ala Glu Ala Asp Glu Pro His Ala Asp Glu Asn Thr

515 520 525

Gln Val Leu Leu Asp Gln Glu Tyr

530 535

<210>2

<211>2349

<212>DNA

<213>Eimeria tenella

<220>

<221>CDS

<222>(469)..(2079)

<400>2

gaaacttaaa aactttccat ttcttcccgg tttttctctt ttctgtttca tttcttcttc 60

aactctggca aaagccggag agcgtctcgc cccggtcggg tctgcgcgcg ggttcctcgc 120

cttgctttcc cctttgtgca gatctttttc cgcgtcgaaa gcgaattaat ttctaatttc 180

cgacttttat ttgttcttct gctgactctg ctgctcattt gctgctgcct gtggagcccg 240

gaaggcgcgg atctgctgct gctgctgctt ctgctgcttc cgtcacctgc agctcgtttc 300

gcagcagcat tttcaggtgt ctcgacagac acccggcggc actgcagcag cagcagctgg 360

cgtggccctt ctgcagcagt tgcggtctct tgatattcca ttcgagtttg attttactca 420

aaatttgaaa aaaagaaatc ccaaaacttg aaaagacccc ccagcacc atg cgg cgg 477

Met Arg Arg

1

ctt tcc cca gct ctg ggc ctt ctt gct gcg gcc ctc agc tgc gca ggg 525

Leu Ser Pro Ala Leu Gly Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ser Cys Ala Gly

5 10 15

cca gca gca ggg gtg cag cac aag ctg cag cac agg cag cag cag cag 573

Pro Ala Ala Gly Val Gln His Lys Leu Gln His Arg Gln Gln Gln Gln

20 25 30 35

cag cag cac agc cac gcc tca act tcg cat gct gct gca gtt ctt gct 621

Gln Gln His Ser His Ala Ser Thr Ser His Ala Ala Ala Val Leu Ala

40 45 50

gct tct tcg gat gca tcc aca gac tcc aat ccc ttc atg cag ccg ccc 669

Ala Ser Ser Asp Ala Ser Thr Asp Ser Asn Pro Phe Met Gln Pro Pro

55 60 65

tat gcc gag ttc atg gcc aga ttc aac att ccc aaa gtc cac ggg agc 717

Tyr Ala Glu Phe Met Ala Arg Phe Asn Ile Pro Lys Val His Gly Ser

70 75 80

ggg gtg tac gtg gac ctg ggg aac gac aaa gag gtg aag gga aag atg 765

Gly Val Tyr Val Asp Leu Gly Asn Asp Lys Glu Val Lys Gly Lys Met

85 90 95

tac aga gag cct ggg ggc cgc tgt ccc gtc ttt ggc aaa aac atc gag 813

Tyr Arg Glu Pro Gly Gly Arg Cys Pro Val Phe Gly Lys Asn Ile Glu

100 105 110 115

ttt tat cag ccc ctg gat tcg gac ttg tac aaa aac gac ttt ctc gaa 861

Phe Tyr Gln Pro Leu Asp Ser Asp Leu Tyr Lys Asn Asp Phe Leu Glu

120 125 130

aat gtc ccg acg gaa gaa gca gca gca gca gca aag ccc ctc ccc gga 909

Asn Val Pro Thr Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Lys Pro Leu Pro Gly

135 140 145

ggc ttc aac aac aac ttt ttg atg aaa gac aaa aag ccc ttt tcg ccg 957

Gly Phe Asn Asn Asn Phe Leu Met Lys Asp Lys Lys Pro Phe Ser Pro

150 155 160

atg tct gtg gcg cag ctc aac agc tac ccg cag ttg aag gcg cgg acg 1005

Met Ser Val Ala Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Gln Leu Lys Ala Arg Thr

165 170 175

ggc ctg ggg aag tgc gcg gag atg agc tac ctg acg acg gcg gcg ggc 1053

Gly Leu Gly Lys Cys Ala Glu Met Ser Tyr Leu Thr Thr Ala Ala Gly

180 185 190 195

agc agc tac aga tac ccc ttc gtg ttc gac agc aaa aag gac ttg tgc 1101

Ser Ser Tyr Arg Tyr Pro Phe Val Phe Asp Ser Lys Lys Asp Leu Cys

200 205 210

tat ttg ctg ctg gtc ccg ctg cag cgg ctc atg ggg gaa aga tac tgt 1149

Tyr Leu Leu Leu Val Pro Leu Gln Arg Leu Met Gly Glu Arg Tyr Cys

215 220 225

tca act cgg gga agt cct ccg ggc ctt tcc cac ttc tgc ttc aaa ccc 1197

Ser Thr Arg Gly Ser Pro Pro Gly Leu Ser His Phe Cys Phe Lys Pro

230 235 240

tta aag agt gtt tcc ctc cgc ccg cac ctg gtc tac ggc tcc gcc tac 1245

Leu Lys Ser Val Ser Leu Arg Pro His Leu Val Tyr Gly Ser Ala Tyr

245 250 255

gtg ggc gag cgc ccc gac gac tgg gag acc aag tgc ccg aac aag gcg 1293

Val Gly Glu Arg Pro Asp Asp Trp Glu Thr Lys Cys Pro Asn Lys Ala

260 265 270 275

gtg aag gac gcg gtg ttc ggg gtg tgg gag ggg ggc cgc tgc gag gag 1341

Val Lys Asp Ala Val Phe Gly Val Trp Glu Gly Gly Arg Cys Glu Glu

280 285 290

cag cgg ctg cgg ctg ggc gcg cag act gca gca gca gca gca aaa gaa 1389

Gln Arg Leu Arg Leu Gly Ala Gln Thr Ala Ala Ala Ala Ala Lys Glu

295 300 305

gac tgc tgg gct ttg gct ttt aat aat cct ttt gct gct tcc gac cag 1437

Asp Cys Trp Ala Leu Ala Phe Asn Asn Pro Phe Ala Ala Ser Asp Gln

310 315 320

ccc aca tct caa gac gaa gca gca aca agt ccc ggc tac tac ttc cct 1485

Pro Thr Ser Gln Asp Glu Ala Ala Thr Ser Pro Gly Tyr Tyr Phe Pro

325 330 335

tcc atc acc ccc agc cag ccc aaa tcc ggg ggc gtg ggg gtg aac ttc 1533

Ser Ile Thr Pro Ser Gln Pro Lys Ser Gly Gly Val Gly Val Asn Phe

340 345 350 355

gcg agc tac tac ccc tcg ggc gag tgc gtc ctg tcg ggc gaa gtg ccc 1581

Ala Ser Tyr Tyr Pro Ser Gly Glu Cys Val Leu Ser Gly Glu Val Pro

360 365 370

act tgt ttg ctg cca agg cga gga gca gca gca ttt act tct gag ggg 1629

Thr Cys Leu Leu Pro Arg Arg Gly Ala Ala Ala Phe Thr Ser Glu Gly

375 380 385

tct ttg gaa gaa gaa gaa ctt ccc cac tgc gac ccc aca ttt ccc gcc 1677

Ser Leu Glu Glu Glu Glu Leu Pro His Cys Asp Pro Thr Phe Pro Ala

390 395 400

tcc ctg gga tcg tgc gat ccc agc tcc tgc aag gcg atc ctc acg gag 1725

Ser Leu Gly Ser Cys Asp Pro Ser Ser Cys Lys Ala Ile Leu Thr Glu

405 410 415

tgc agg ggc ggc cgc ctc gtc gag cag cag acg gac tgc gtc ccc gaa 1773

Cys Arg Gly Gly Arg Leu Val Glu Gln Gln Thr Asp Cys Val Pro Glu

420 425 430 435

gac ggc agc aag tgc gag tct aaa ggg ggc ggt gtc ttc att ggg ctg 1821

Asp Gly Ser Lys Cys Glu Ser Lys Gly Gly Gly Val Phe Ile Gly Leu

440 445 450

gcc gtc gcg ggg ggt ctg ctg ctg ctg ctg ctg acg gga ggg gct ttc 1869

Ala Val Ala Gly Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr Gly Gly Ala Phe

455 460 465

ttc att tac aag cag cgg caa aaa gct ctt ccg aaa gaa tct tct ccg 1917

Phe Ile Tyr Lys Gln Arg Gln Lys Ala Leu Pro Lys Glu Ser Ser Pro

470 475 480

cag cga aca gat ttt gtt caa gac gaa gca gca aca ggc cgc ggc aaa 1965

Gln Arg Thr Asp Phe Val Gln Asp Glu Ala Ala Thr Gly Arg Gly Lys

485 490 495

aag aga cag tcc gat ttg gtg cag cag gcc gag ccg tcc ttt tgg gaa 2013

Lys Arg Gln Ser Asp Leu Val Gln Gln Ala Glu Pro Ser Phe Trp Glu

500 505 510 515

gaa gca gaa gct gat gag cct cac gcc gat gaa aac acc caa gtg ctg 2061

Glu Ala Glu Ala Asp Glu Pro His Ala Asp Glu Asn Thr Gln Val Leu

520 525 530

ctg gac cag gaa tac tag tagcagcagc agcaacaaca acagcagcag 2109

Leu Asp Gln Glu Tyr

535

cagcagctac tgctgctgct gctgcagctg caggtgcagc tgcagcggca aaagagcagc 2169

aaagagcagc agcagcagca aagagcagca gcagcagcaa aaagcagcag cagcagcaaa 2229

agggaaattg aatttaactg aattcaattc gaattagttt cattcaaaag ttcttttctt 2289

caaattaact ctccattttc cttttttatt caaaaggcga agttttcgcc ttttcacttc 2349

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(26)

<223>引物

<400>3

aagtgcgagt ctaaaggggg cggtgt 26

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(23)

<223>引物

<400>4

gaagggaagt agtagccggg act 23

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>引物

<400>5

gtgtcttcat tgggctggcc gtcg 24

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(28)

<223>引物

<400>6

gggacttgtt gctgcttcgt cttgagat 28

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(23)

<223>引物

<400>7

tcttcttcaa ctctggcaaa agc 23

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>8

gaagtgaaaa ggcgaaaact 20

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>引物

<400>9

gctgactctg ctgctcattt g 21

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(23)

<223>引物

<400>10

ggaatatcaa gagaccgcaa ctg 23

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>引物

<400>11

tgtagtggag tcttggtgat tc 22

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>12

cctgctgcct tccttagatg 20

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>引物

<400>13

cgggatccgg ggtgcagcac aa 22

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>14

cggaattcgc cccctttaga 20

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>引物

<400>15

cagtgttacc tgggagaagt g 21

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(23)

<223>引物

<400>16

gcagatatct cacaaagttg gtc 23

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>17

attcaagatg tgaagctgac 20

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>引物

<400>18

aggatctgca attaacatga gg 22

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>引物

<400>19

cgtccaggta gaagataaga g 21

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>20

aggagtcttc ttcctcaaag 20

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>21

ttcgatgtac ttggaaatgc 20

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>22

ttgcatctcc tctgagactg 20

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>23

ggtggtgcta agcgtgttat 20

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>24

acctctgtca tctctccaca 20

Claims

1.一种柔嫩艾美耳球虫基因，其特征在于，所述基因为柔嫩艾美耳球虫AMA1基因，其核苷酸序列包含下述DNA序列之一：

(1)编码SEQ ID NO.1氨基酸序列的DNA序列；

2.根据权利要求1所述的柔嫩艾美耳球虫基因，其特征在于，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的DNA序列。

3.一种柔嫩艾美耳球虫蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为柔嫩艾美耳球虫AMA1蛋白质，该蛋白质选自：

(1)具有SEQ ID NO.1氨基酸序列的蛋白质；

4.根据权利要求3所述的柔嫩艾美耳球虫蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有SEQ IDNO.1所示氨基酸序列。

5.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫基因的全部或部分DNA序列。

6.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求5所述的重组载体，或已用权利要求1所述基因序列转化或转染。

7.一种能与权利要求3所述柔嫩艾美耳球虫蛋白质特异性结合的抗体或抗血清。

8.权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫基因在制备预防或治疗球虫病的疫苗或药物中的应用。

9.权利要求3所述柔嫩艾美耳球虫蛋白质在制备预防或治疗球虫病的疫苗或药物中的应用。

10.权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫基因在筛选预防或治疗球虫病的药物中的应用。