CN100567492C - 绵羊多头蚴病特异性基因及其分离与鉴定 - Google Patents

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CN100567492C CNB2007100892526A CN200710089252A CN100567492C CN 100567492 C CN100567492 C CN 100567492C CN B2007100892526 A CNB2007100892526 A CN B2007100892526A CN 200710089252 A CN200710089252 A CN 200710089252A CN 100567492 C CN100567492 C CN 100567492C
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Abstract

本发明涉及一种绵羊多头蚴病特异性基因及其分离与鉴定，设计引物，用RT-PCR的方法，绵羊多头蚴病的幼虫阶段分离到新的基因，将其命名为45m，其长度为698bp，编码232个氨基酸。该基因和羊带绦虫、牛带绦虫的保护性基因片断具有很高的同源性。所表达的蛋白质分子量约为6,300道尔顿。将45m克隆到pET41b表达载体中，构建符合读码框的融合基因，表达量可达100-120mg/L。将该蛋白用于绵羊的免疫试验中，可有效激起机体的免疫反应，其抗血清可以与成虫和幼虫抗原总蛋白在63KD处发生特异性反应。认为该基因有可能成为多头蚴病的候选疫苗分子。

Description

绵羊多头蚴病特异性基因及其分离与鉴定
技术领域
本发明涉及一种绵羊多头蚴病新基因的克隆、表达及初步的免疫性试验，更具体说，涉及从绵羊多头蚴病总RNA中分离1个新的基因，利用基因工程的方法在高效大肠杆菌表达系统表达并纯化出具有免疫原性的重组蛋白，它可有效激起动物机体的免疫反应，其抗血清可以识别自然虫体(成虫和幼虫)抗原的特异性蛋白。
背景技术
多头蚴病(俗称脑包虫)是由多头绦虫(Multiceps multiceps)引起的人兽共患寄生虫病。成虫主要寄生于终末宿主家犬的小肠内，狼、狐等肉食动物也有感染。家畜羊、牛、猪和人等中间宿主误食虫卵后，卵移行至大脑、延髓、脊髓，发育成包囊，表现中枢神经受损症状，死亡率为80-100％。人偶有感染，虫体寄生于脑、皮下肌肉和眼内。此病在西北牧区感染率较高且牛羊并行感染，新疆绵羊多头蚴病历年的平均发病率为1-2％，死亡率为100％，平均每年因该病就死亡数十万只羊。新疆局部地区如伊犁地区感染率达5％，塔里木河南岸垦区感染率达5.7％，哈密地区感染率为4％，在西藏绵羊感染率高达0.9-22.85％。严重危害人畜健康，对畜牧业生产造成很大的经济损失。研制有效的疫苗作为预防该病的有力“武器”实属刻不容缓。
羊绦虫(Taenia ovis)基因工程疫苗(45W)的问世为寄生虫病疫苗的研制掀开了具有历史意义的篇章。此后，Lightowlers等用高免六钩蚴的羊血清在细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)六钩蚴cDNA文库中筛选获得阳性克隆Eg95，其重组蛋白(16.5KD)对羊抗细粒棘球绦虫感染的免疫保护可达到96-98％。Charles等从多房棘球蚴(Echinococcus alveolaris)中获得Eg95的同源基因EM95，将其重组蛋白运用于小鼠免疫实验，证实EM95的免疫保护率可达63.1-82.9％。目前国际上已成功研制出羊绦虫、细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、牛带绦虫(Taenia saginata)、猪带绦虫(Taeniasolium)的基因工程疫苗，对中间宿主可产生很高的免疫。有趣的是不同绦虫的保护性抗原的特异性基因碱基序列具有很大的同源性，在大肠杆菌中经诱导表达后，重组蛋白的生物学功能也非常相似。虽然这些保护性重组蛋白的生物功能及其免疫学作用机制有待于进一步的研究，但这为其它带科绦虫特异性抗原基因的分离提供了理论依据。
对于多头绦虫特异性基因的分离研究在国内外很少有人涉及。文献查新显示，目前国际刊物发表的有关多头蚴病的文章仅有72篇，主要偏重于多头蚴病的流行病学、生化组织形态学、运用分子生物学手段与其它绦虫进行区别鉴定、分离脂蛋白抗原作为诊断抗原的研究等方面。我课题组于1991年在国内首次报道利用多头绦虫的六钩蚴或六钩蚴的分泌代谢抗原免疫绵羊，可以取得85-100％的保护，Verster等也证实了这一点。但这种抗原不可能依靠培养六钩蚴的途径工业化生产，只能通过重组基因疫苗的方法，关键是寻找保护性抗原基因，为多头蚴病疫苗的研制奠定基础。
本发明通过对多种绦虫保护性基因的综合分析，设计出多种绦虫保护性基因共有的引物，运用RT-PCR法，从多头蚴cDNA中扩增出可能具有保护性的基因片断，将其命名为45m，其长度为698bp，编码232个氨基酸。这段基因未在genebank中发表，是新发现的多头蚴病的新基因。经同源性比较得，45m蛋白与羊绦虫的45W蛋白的同源性为89％，与牛带绦虫保护性抗原的同源性为85％。将45m基因利用基因工程的方法在高效大肠杆菌表达系统表达并进行纯化，该重组蛋白可有效激起动物机体的免疫反应，其抗血清可以识别自然虫体(成虫和幼虫)抗原的特异性蛋白。45m重组蛋白有可能成为候选疫苗。
发明内容
本发明的目的在于，研究绵羊多头蚴病特异性基因及其分离与鉴定，通过对畜间多种绦虫病保护性基因的综合分析，设计引物，用RT-PCR的方法，绵羊多头蚴病的幼虫阶段分离到新基因，将其命名为45m，其长度为698bp，编码232个氨基酸。这段基因未在genebank中发表，是新发现的多头蚴病的新基因。该基因和羊绦虫、牛带绦虫的保护性基因片断具有很高的同源性。所表达的蛋白质分子量约为6,300道尔顿。将45m克隆到pET41b表达载体中，构建符合读码框的融合基因，表达量可达100-120mg/L。将该蛋白用于绵羊的免疫试验中，可有效激起机体的免疫反应，其抗血清可以与成虫和幼虫抗原总蛋白在63KD处发生特异性反应。
本发明所述的一种绵羊多头蚴病特异性基因及其分离与鉴定，提供一种序列表中所示的碱基序列，命名为45m基因，其长度为698bp，其碱基序列为：
TTTTGTTAGCGACTGCAGTTTTGGCTTCGGACTTCGAACAACCCATCGAG
AGGACAGTGACAGGACATCAATCATTACGCGATATCTTCACTTGGGGTCC
TGTGTTCTCTGAGCTCATTGGCCTAAATTGGAATAGGGATGCATTTCATA
ATGCGTACCATGAAGTGCTCACATTAAAGGCAGCGCTGTCTTCTGACCCT
AGTAACACAAAGACAACATATGCGCAACTCGGCGATGGAAGTGCCACTCT
TAAAGGACTGACGTCTAATGCCACATATCTTGTGACTGCGACGGTAAATA
TAAGTGGAAACACAATTCTGGTATTGAGCAGCACTATTCATACACTGGCC
AACGACACGGATCCTATCCAAAACTGCTTCCATTGGGGCCCTGTGACTAA
CCAATCCATTCAAGTAAGTTGGGATCAGCTAGATCCGGAGGACACACACG
ATATGATAGTCACACTGACGGCAGAGATGGCTTCGAACCCCAGTGTGGAA
AGATCGGAGTCTGCACGCTTCAGTCAAGGAAGAGTCACCGTTGACGGACT
GATGTCCGACACACTATATATTGCAACCGTGACAGTATTGAAAGATGGAC
GGCAATTCTTCAATTCCACCAGAGACATTCAAACACTCGATACTGGCCAT
AAGGAAGTAACAGTCGTAACGACTAGTGGATCTGCTATAGTCTCCGCA
提供一种序列表中所示碱基序列编码的232个氨基酸，其氨基酸序列为：
LLATAVLASDFEQPIERTVTGHQSLRDIFTWGPVFSELIGLNWNRDAFHN
AYHEVLTLKAALSSDPSNTKTTYAQLGDGSATLKGLTSNATYLVTATVNI
SGNTILVLSSTIHTLANDTDPIQNCFHWGPVTNQS IQVSWDQLDPEDTHD
MIVTLTAEMASNPSVERSESARFSQGRVTVDGLMSDTLYIATVTVLKDGR
QFFNSTRDIQTLDTGHKEVTVVTTSGSAIVSA
提供一种重组载体，该载体包括一种核苷酸序列。
重组载体是以谷胱甘肽转移酶为融合伴体，并有6个His的亲和标记位点的高效表达载体pET-41b。
提供一种含有重组载体的原核细菌。
原核细菌是大肠杆菌。
提供一种用作引物的DNA片断，该片断由核苷酸序列的一部分序列组成。上下游引物分别为：
上游引物：5′GGAATTCTGCCTCATTTTGTTAGCGACTGCAGT 3′，
下游引物：5′TGCGGAGACTATAGCAGATCCACTAGTC 3′。
本发明所述的绵羊多头蚴病特异性基因及其分离与鉴定，采用(1)用RT-PCR的方法，从多头绦虫的多头蚴阶段虫体的总RNA中分离到1个新的基因，此基因同羊绦虫和牛带绦虫的保护性基因具有很高的同源性；(2)利用基因工程的方法，在高效大肠杆菌表达系统表达重组蛋白并进行纯化；(3)通过绵羊的动物免疫试验，表明该重组蛋白可有效激起动物机体的免疫反应，其抗血清还可以识别成虫和幼虫抗原，为进一步进行该病的疫苗研究奠定基础。
本发明所选择的绵羊多头蚴病的多头蚴采自新疆巴音郭楞蒙古自治州种畜场。首先解剖患病羊的脑部，分离到寄生于脑部的包囊，从囊腔和囊壁获得多头蚴，然后提取总RNA，通过多羊绦虫(45W)、细粒棘球绦虫(Eg95)、牛带绦虫保护性基因的保守序列的综合分析，设计引物，运用RT-PCR方法，扩增得到目的条带(图3)，将得到的目的条带连接到pGEM-T载体，并转化到JM109中，进行蓝白斑筛选挑选重组克隆。经基因测序获得1个新的基因，命名为45m。通过基因工程方法表达出重组蛋白。新基因编码232个氨基酸，分子量为63KD。
本发明通过设计一对引物，将新基因45m用PCR方法从pGEM-T载体中扩增出来，克隆到原核表达载体pET-41b上，构建成表达质粒并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。通过对大肠杆菌培养时间、诱导时间、温度等条件的摸索和优化，45m融合蛋白表达量可达100mg/L。
本发明获得的45m重组蛋白可激起绵羊机体很强的免疫反应，ELISA检测效果(图7)。Western-blot试验结果表明，经四次免疫后的绵羊的抗血清可以与成虫和幼虫的虫体总蛋白在63KD处发生特异性反应(图8)，这表明45m重组蛋白是具有免疫原性的。
多头蚴病的45m基因是首次发现，45m蛋白与羊绦虫的45W蛋白、牛带绦虫保护性抗原有很高的同源性。经中间宿主绵羊的免疫试验证实，45m重组蛋白可有效激起机体的免疫应答，其抗血清可以与成虫和幼虫抗原总蛋白在63KD处发生特异性反应。认为该基因有可能成为多头蚴病的候选疫苗分子。
附图说明
图1为本发明45m基因的碱基序列图
图2为本发明45m基因的氨基酸序列图
图3为本发明运用RT-PCR方法从多头蚴cDNA中扩增得到目的片断(698bp)
图4为本发明45m重组蛋白与羊绦虫的45W蛋白、牛带绦虫(Ts)和羊绦虫(To)的保护性抗原蛋白的氨基酸序列进行同源性对比分析。45m蛋白与羊绦虫的45W蛋白的同源性为89％，与牛带绦虫(Ts)保护性抗原的同源性为85％，与羊绦虫(To)的保护性抗原的同源性为81％。
图5为本发明45m重组蛋白的诱导表达(1、IPTG诱导前大肠杆菌菌液的SDS-PAGE电泳图；2、经IPTG诱导4小时后大肠杆菌菌液裂解液的SDS-PAGE电泳图。)
图6为本发明45m重组蛋白的纯化(采用亲和层析柱TALON进行纯化，将45m重组蛋白的纯化产物做SDS-PAGE电泳。)
图7为本发明用ELISA法检测45m重组蛋白免疫绵羊后特异性抗体的变化图(横坐标为第一次免疫后的周数，纵坐标为OD405读值，45m表示用45m重组蛋白免疫绵羊的免疫组，GST表示用pET41b空载体接种绵羊的对照组，PBS表示用PBS接种绵羊的空白对照组。)
图8为本发明45m重组蛋白免疫绵羊后抗血清可以与成虫和幼虫的虫体总蛋白在63KD处发生特异性反应(1、2、3分别为多头蚴虫体总蛋白、多头绦虫虫体总蛋白、45重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；4、5、6分别为45m重组蛋白免疫绵羊后抗血清与多头绦虫虫体蛋白、多头绦虫虫体蛋白、45重组蛋白进行的Western-blot反应，在63KD处发生特异性结合)
具体实施方式
实施例1
一、多头绦虫的多头蚴阶段虫体的获取
采集患病绵羊脑部寄生的包囊，小心分离获得附着在囊壁和悬浮在囊液中的多头蚴，将收集到的虫体沉淀用灭菌的PBS冲洗10遍，存于液氮中备用。
二、多头蚴的总RNA的提取和RT-PCR扩增
用Trizol试剂(Gibco)提取多头蚴的总RNA；获得多头蚴的总RNA，浓度测定为300ng/μl，经1％甲醛变性胶电泳检测可见清晰的18s和28s两条带，表明总RNA完整性良好。取3μg RNA用SUPERSCRIPTTM反转录酶系统(Invitrogen)进行反转录以合成cDNA第一链，得到20ul cDNA第一链产物。
引物设计依据对羊绦虫的45W蛋白、细粒棘球绦虫(Eg95)、牛带绦虫保护性基因等基因的保守序列的综合分析，用Oligo引物设计软件设计出上下游引物：
上游引物(A1)：5′GGAATTCTGCCTCATTTTGTTAGCGACTGCAGT 3′，
下游引物(A2)：5′TGCGGAGACTATAGCAGATCCACTAGTC 3′。
每50ul PCR反应体积加入1ul cDNA单链作为模板，PCR扩增试剂与条件如下：
10x Taq DNA聚合酶缓冲液     5μl
模板cDNA                    1μl
A1上游引物(1.25μg/μl)     1μl
A2下游引物(1.25μg/μl)     1μl
脱氧核苷酸混合物dNTP(2.5mM) 1μl
Taq DNA聚合酶               0.5μl
灭菌水                      37.5μl
-总体积                     50μl
PCR反应条件为：首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环：94℃1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 1分钟30秒，共进行37个循环，最后72℃延伸7分钟。
电泳检测，发现在700附近出现预期的特异性条带(图3)，回收此带。
三、45m基因序列的测定和分析
将回收的电泳产物连接到pGEM-T载体(Promega公司)，转化到JM109菌中，经蓝白斑筛选，挑出10个克隆，进行重组克隆的序列测定，其碱基序列均一致，序列如下：
45m基因的碱基序列：
TTTTGTTAGCGACTGCAGTTTTGGCTTCGGACTTCGAACAACCCATCGAG
AGGACAGTGACAGGACATCAATCATTACGCGATATCTTCACTTGGGGTCC
TGTGTTCTCTGAGCTCATTGGCCTAAATTGGAATAGGGATGCATTTCATA
ATGCGTACCATGAAGTGCTCACATTAAAGGCAGCGCTGTCTTCTGACCCT
AGTAACACAAAGACAACATATGCGCAACTCGGCGATGGAAGTGCCACTCT
TAAAGGACTGACGTCTAATGCCACATATCTTGTGACTGCGACGGTAAATA
TAAGTGGAAACACAATTCTGGTATTGAGCAGCACTATTCATACACTGGCC
AACGACACGGATCCTATCCAAAACTGCTTCCATTGGGGCCCTGTGACTAA
CCAATCCATTCAAGTAAGTTGGGATCAGCTAGATCCGGAGGACACACACG
ATATGATAGTCACACTGACGGCAGAGATGGCTTCGAACCCCAGTGTGGAA
AGATCGGAGTCTGCACGCTTCAGTCAAGGAAGAGTCACCGTTGACGGACT
GATGTCCGACACACTATATATTGCAACCGTGACAGTATTGAAAGATGGAC
GGCAATTCTTCAATTCCACCAGAGACATTCAAACACTCGATACTGGCCAT
AAGGAAGTAACAGTCGTAACGACTAGTGGATCTGCTATAGTCTCCGCA
用Sequence Utilities程序(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/)寻找其编码区，结果如下：
DNA：TTTTGTTAGCGACTGCAGTTTTGGCTTCGGACTTCGAACAACCCATCGAGA
+3：  L  L  A  T  A  V  L  A  S  D  F  E  Q  P  I  E  R
DNA：GGACAGTGACAGGACATCAATCATTACGCGATATCTTCACTTGGGGTCCTG
+3：  T  V  T  G  H  Q  S  L  R  D  I  F  T  W  G  P  V
DNA：TGTTCTCTGAGCTCATTGGCCTAAATTGGAATAGGGATGCATTTCATAATG
+3：  F  S  E  L  I  G  L  N  W  N  R  D  A  F  H  N  A
DNA：CGTACCATGAAGTGCTCACATTAAAGGCAGCGCTGTCTTCTGACCCTAGTA
+3：  Y  H  E  V  L  T  L  K  A  A  L  S  S  D  P  S  N
DNA：ACACAAAGACAACATATGCGCAACTCGGCGATGGAAGTGCCACTCTTAAAG
+3：  T  K  T  T  Y  A  Q  L  G  D  G  S  A  T  L  K  G
DNA：GACTGACGTCTAATGCCACATATCTTGTGACTGCGACGGTAAATATAAGTG
+3：  L  T  S  N  A  T  Y  L  V  T  A  T  V  N  I  S  G
DNA：GAAACACAATTCTGGTATTGAGCAGCACTATTCATACACTGGCCAACGACA
+3：  N  T  I  L  V  L  S  S  T  I  H  T  L  A  N  D  T
DNA：CGGATCCTATCCAAAACTGCTTCCATTGGGGCCCTGTGACTAACCAATCCA
+3：  D  P  I  Q  N  C  F  H  W  G  P  V  T  N  Q  S  I
DNA：TTCAAGTAAGTTGGGATCAGCTAGATCCGGAGGACACACACGATATGATAG
+3：  Q  V  S  W  D  Q  L  D  P  E  D  T  H  D  M  I  V
DNA：TCACACTGACGGCAGAGATGGCTTCGAACCCCAGTGTGGAAAGATCGGAGT
+3：  T  L  T  A  E  M  A  S  N  P  S  V  E  R  S  E  S
DNA：CTGCACGCTTCAGTCAAGGAAGAGTCACCGTTGACGGACTGATGTCCGACA
+3：  A  R  F  S  Q  G  R  V  T  V  D  G  L  M  S  D  T
DNA：CACTATATATTGCAACCGTGACAGTATTGAAAGATGGACGGCAATTCTTCA
+3：  L  Y  I  A  T  V  T  V  L  K  D  G  R  Q  F  F  N
DNA：ATTCCACCAGAGACATTCAAACACTCGATACTGGCCATAAGGAAGTAACAG
+3：  S  T  R  D  I  Q  T  L  D  T  G  H  K  E  V  T  V
DNA：TCGTAACGACTAGTGGATCTGCTATAGTCTCCGCA
+3：  V  T  T  S  G  S  A  I  V  S  A
45m氨基酸序列为：
LLATAVLASDFEQPIERTVTGHQSLRDIFTWGPVFSELIGLNWNRDAFHN
AYHEVLTLKAALSSDPSNTKTTYAQLGDGSATLKGLTSNATYLVTATVNI
SGNTILVLSSTIHTLANDTDPIQNCFHWGPVTNQSIQVSWDQLDPEDTHD
MIVTLTAEMASNPSVERSESARFSQGRVTVDGLMSDTLYIATVTVLKDGR
QFFNSTRDIQTLDTGHKEVTVVTTSGSAIVSA
对该序列进行蛋白家族分析，应用protein-protein BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)程序进行基因的蛋白家族进行分析，其中与其同源性最高的三个蛋白例举如下：
gi|2114399|gb|AAC47532.1|45W antigen ToW5/7[Taenia ovis]Length＝254Score＝355bits(911)，Expect＝1e-96，Method：Composition-basedstats.
Identities＝-194/232(83％)，Positives＝207/232(89％)，Gaps＝0/232(0％)gi|39837079|emb|CAE83579.1|host-protective antigen homologue[Taeniasaginata]
Length＝255 Score＝324 bits(831)，Expect＝2e-87，Method：Composition-based stats.
Identities＝177/233(75％)，Positives＝200/233(85％)，Gaps＝1/233(0％)gi|683737|gb|AAC46949.1|host-protective antigen(Taenia ovis)
Score＝308 bits(789)，Expect＝1e-82，Method：Composition-basedstats.
Identities＝168/232(72％)，Positives＝190/232(81％)，Gaps＝0/232(0％)
将上述三个蛋白羊绦虫45W蛋白、牛带绦虫保护性抗原、羊绦虫保护性抗原与45m重组蛋白进行对比分析(图4)。45m蛋白与三者的同源性分别为89％，85％和81％，表明45m蛋白很可能与这三个保护性蛋白一样是具有个体特异性的保护性蛋白。
四、45m基因表达质粒的构建
依据45m基因的两端序列合成一对引物，上游引物含EcoRI酶切位点，下游引物含XhoI酶切位点。
上游引物(B1)：5′GG AAT TCC TTT TGT TAG CGA CTG CAG TTT TG 3′
                    EcoRI
下游引物(B2)：5′G CTC GAG TAG TGG ATC TGC TATAGT CTC CGC A 3′
                    XhoI
以含45m基因的pGEM-T的质粒为模板，B1，B2为引物PCR扩增，得到特异性扩增的单一条带，产物大小约在700bp的位置。将PCR扩增产物克隆到原核表达载体pET-41b上，①用EcoRI和XhoI酶切pET-41b载体(Novagen)；②用T4DNA连接酶(Promega)将目的基因45m插入pET-41b表达载体；③将含45m基因的质粒转化入BL21-(DE3)大肠杆菌中(Novagen)，铺板培养；④提取转化后大肠杆菌的质粒(QIAGEN)，融合的表达载体中外源基因经双酶切和测序鉴定正确。
五、45m重组融合蛋白的表达和纯化
将pET41b-45m融合蛋白转化到大肠杆菌BL21后，进行蛋白的诱导表达。超声裂解基因工程菌上清液经SDS-PAGE电泳分析表明，菌体经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件PROTEINANALYSIS预测的理论值63KD相符(图5)。
经过对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索，菌体扩大培养不同时间后诱导表达量的比较，基因工程菌的培养条件为：接单菌落于50ml卡那抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜，取过夜培养物20ml接种于2L的卡那抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD600＝0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，继续37℃，250rpm诱导培养4小时后离必收获菌体。经SDS-PAGE电泳分析表明，在此条件下45m融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的80％以上(图5)。
采用亲和层析柱TALON(Clontech)纯化表达蛋白，将纯化产物做SDS-PAGE电泳(图6)，可获得较纯的重组蛋白。将重组蛋白大肠杆菌培养液的量与最终获得纯化蛋白的量进行比较分析得，该45m重组蛋白的表达量为110mg/L培养液。具有较理想的重组蛋白产量。
使用效果
动物免疫试验
一、45m重组蛋白用于中间宿主(绵羊)的免疫接种
分四次将纯化的45m重组蛋白免疫接种绵羊，接种剂量为50μg/只，0.5ml/只；第一次免疫使用弗氏完全佐剂，第二、三、四次免疫均使用弗氏不完全佐剂途；第一次免疫途径为皮下接种，第二、三、四次免疫途径均为腹腔接种；第一次和第二次免疫间隔时间为三周，第二、三、四次免疫间隔时间均为二周；每周定期采集试验绵羊的血清，4℃储存备用。
二、对定期采集到的血清进行ELISA和Western-blot检测试验
1、酶链免疫吸附实验(ELISA)检测
用45m重组蛋白作为包被抗原，10ng/孔包板；将自第一次免疫后0-24周的绵羊血清稀释至1∶2400作为工作浓度；使用二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG；使用ABST(2，2′-azino-bis(3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic))显色，室温作用约10min，观察结果时以样品孔(双孔平均)与参考阴性血清(双孔平均)的光密度OD405比值等于或大于3(P/N≥3，N＝0.1)为阳性，反之为阴性。记录读值，并做抗体水平消涨图(图7)。结果表明，45m重组蛋白可有效激起中间宿主绵羊的体液免疫反应，产生高滴度抗血清。
2、免疫印迹实验(Western-blot)检测
提取多头绦虫(成虫)和多头蚴(幼虫)虫体粗抗原：将虫体反复冻融、研磨三次后，10,000rpm 4℃离心20分钟，收集上清。将成虫抗原、幼虫抗原和45m重组蛋白做SDS-PAGE电泳；将三种蛋白从凝胶转移至NC膜上；经5％的脱脂奶粉封闭后；与1∶100的绵羊血清反应；并与辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG结合；使用4-氯-1-奈酚(4-chloro-1-naphthol)(Sigma)显色1-5分钟。在三种抗原的63KD处均出现反应条带(图8)。Western-blot结果表明45m基因是自然存在于多头蚴(幼虫)和多头绦虫(成虫)中的，同时45m重组蛋白具有良好的免疫原性，并进一步验证了其引起机体免疫反应的能力。
TTTTGTTAGCGACTGCAGTTTTGGCTTCGGACTTCGAACAACCCATCGAG
AGGACAGTGACAGGACATCAATCATTACGCGATATCTTCACTTGGGGTCC
TGTGTTCTCTGAGCTCATTGGCCTAAATTGGAATAGGGATGCATTTCATA
ATGCGTACCATGAAGTGCTCACATTAAAGGCAGCGCTGTCTTCTGACCCT
AGTAACACAAAGACAACATATGCGCAACTCGGCGATGGAAGTGCCACTCT
TAAAGGACTGACGTCTAATGCCACATATCTTGTGACTGCGACGGTAAATA
TAAGTGGAAACACAATTCTGGTATTGAGCAGCACTATTCATACACTGGCC
AACGACACGGATCCTATCCAAAACTGCTTCCATTGGGGCCCTGTGACTAA
CCAATCCATTCAAGTAAGTTGGGATCAGCTAGATCCGGAGGACACACACG
ATATGATAGTCACACTGACGGCAGAGATGGCTTCGAACCCCAGTGTGGAA
AGATCGGAGTCTGCACGCTTCAGTCAAGGAAGAGTCACCGTTGACGGACT
GATGTCCGACACACTATATATTGCAACCGTGACAGTATTGAAAGATGGAC
GGCAATTCTTCAATTCCACCAGAGACATTCAAACACTCGATACTGGCCAT
AAGGAAGTAACAGTCGTAACGACTAGTGGATCTGCTATAGTCTCCGCA

Claims (3)

1、一种绵羊多头蚴病特异性基因，其特征在于其碱基序列为：
TTTTGTTAGCGACTGCAGTTTTGGCTTCGGACTTCGAACAACCCATCGAG
AGGACAGTGACAGGACATCAATCATTACGCGATATCTTCACTTGGGGTCC
TGTGTTCTCTGAGCTCATTGGCCTAAATTGGAATAGGGATGCATTTCATA
ATGCGTACCATGAAGTGCTCACATTAAAGGCAGCGCTGTCTTCTGACCCT
AGTAACACAAAGACAACATATGCGCAACTCGGCGATGGAAGTGCCACTCT
TAAAGGACTGACGTCTAATGCCACATATCTTGTGACTGCGACGGTAAATA
TAAGTGGAAACACAATTCTGGTATTGAGCAGCACTATTCATACACTGGCC
AACGACACGGATCCTATCCAAAACTGCTTCCATTGGGGCCCTGTGACTAA
CCAATCCATTCAAGTAAGTTGGGATCAGCTAGATCCGGAGGACACACACG
ATATGATAGTCACACTGACGGCAGAGATGGCTTCGAACCCCAGTGTGGAA
AGATCGGAGTCTGCACGCTTCAGTCAAGGAAGAGTCACCGTTGACGGACT
GATGTCCGACACACTATATATTGCAACCGTGACAGTATTGAAAGATGGAC
GGCAATTCTTCAATTCCACCAGAGACATTCAAACACTCGATACTGGCCAT
AAGGAAGTAACAGTCGTAACGACTAGTGGATCTGCTATAGTCTCCGCA。
2、如权利要求1所述的绵羊多头蚴病特异性基因，其特征在于其编码的氨基酸序列为：
LLATAVLASDFEQPIERTVTGHQSLRDIFTWGPVFSELIGLNWNRDAFHN
AYHEVLTLKAALSSDPSNTKTTYAQLGDGSATLKGLTSNATYLVTATVNI
SGNTILVLSSTIHTLANDTDPIQNCFHWGPVTNQSIQVSWDQLDPEDTHD
MIVTLTAEMASNPSVERSESARFSQGRVTVDGLMSDTLYIATVTVLKDGR
QFFNSTRDIQTLDTGHKEVTVVTTSGSAIVSA。
3、用于扩增如权利要求1所述的绵羊多头蚴病特异性基因的上下游引物，其特征在于其核苷酸序列为：
上游引物：5′GGAATTCTGCCTCATTTTGTTAGCGACTGCAGT 3′，
下游引物：5′TGCGGAGACTATAGCAGATCCACTAGTC 3′。
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