CN106018831B - 脑多头蚴病的标志物gp50以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒 - Google Patents

脑多头蚴病的标志物gp50以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物疾病诊断领域，具体涉及一种脑多头蚴病的标志物GP50以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒。脑多头蚴病间接ELISA诊断方法敏感性达95％、特异性达92.6％。人工感染多头带绦虫山羊的血清抗体监测发现在感染后的整个检测期GP50抗体值均呈现阳性。因此GP50重组蛋白可作为脑多头蚴病标志物，用于诊断脑多头蚴病。本发明所述脑多头蚴病的间接ELISA诊断试剂盒可以快速、灵敏、特异的用于诊断脑多头蚴病，为脑多头蚴病感染的早期的诊断及治疗效果的评价奠定基础。

Description

脑多头蚴病的标志物GP50以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒
技术领域
本发明属于动物疾病诊断领域，具体涉及一种脑多头蚴病的标志物GP50以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒。
背景技术
脑多头蚴病(Coenuriasis)又叫脑包虫病，是由多头带绦虫(Taenia multiceps)的中绦期幼虫脑多头蚴(Coenurus cerebralis)寄生于牛、羊等偶蹄动物的脑和脊髓等处引起的一种寄生虫病。该病呈世界性分布，常引起患病动物发生死亡，给畜牧业造成巨大经济损失，同时人也有感染的报道。
多头蚴病的临床表现多样，而且在动物感染后的一段时间内不出现典型的临床症状，所以在感染早期难以确诊。多样的临床表现导致了临床诊断的复杂性和迫切需要更可靠的诊断工具。
医学影像技术已经用于人脑多头蚴病的诊断，主要是应用MRI和CT扫描来识别人脑部的包囊。这些技术同样也可以用在动物脑多头蚴的诊断上，Manunta等(2012)研究了33只患慢性脑多头蚴病的绵羊和1只患病山羊的脑和头骨的MRI特征，提示患病绵羊和山羊颅腔形态异常，内含大量的包囊。由于检测结果的可信度高，MRI和CT扫描被认为是诊断人和动物脑多头蚴病最好的方法，但是这些先进的诊断方法不易在养殖场实施，检测成本非常昂贵，而且MRI和CT扫描技术成功应用的前提条件是脑多头蚴在中枢神经系统内定居并形成一定大小的包囊，所以此类技术并不能在感染的早期进行诊断。
现代分子生物学技术已经用于脑多头蚴病的诊断，Ahmad Oryan等(2015)提取患脑多头蚴病的绵羊和山羊脑脊液DNA，以多头带绦虫线粒体基因COX1序列设计引物，建立了检测小型反刍动物脑多头蚴病的PCR诊断方法，研究表明多头带绦虫DNA存在于感染脑多头蚴的绵羊和山羊脑脑脊液中，能够被所建立的PCR诊断方法所扩增。该诊断方法具有较高的准确性，但抽取动物的脑脊液操作烦琐，且不能进行早期诊断。
传统的血清学诊断技术已经用于脑多头蚴病的早期诊断，目前已经建立了诊断多头蚴病的ELISA、Dot-ELISA、间接血凝试验(IHA)及斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)等方法，这些方法都具有较好的诊断效果，但其所用抗原为虫体包囊液或原头蚴等天然虫体抗原，限制了此类方法在生产上的推广及使用。
GPI锚定蛋白是一类依赖糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl Phosphatidyl Inositol,GPI)锚定连接在真核生物细胞膜表面的一类蛋白质。GPI锚定蛋白在许多生物进程中扮演着重要作用。Hancock等(2004)研究表明猪带绦虫GP50蛋白是一个GPI锚定在细胞膜表面的猪囊尾蚴的诊断蛋白，并成功建立了基于重组GP50蛋白检测猪的猪囊尾蚴感染血清Western-blot方法。近年来，针对猪和人的猪囊尾蚴病已经建立了基于GP50重组蛋白的FAST-ELISA(Falcon assay screening test–enzyme-linked immunosorbent assay，FAST-ELISA)和QuickELISA诊断方法，其敏感性和特异性均较高，证实了GP50重组蛋白在猪囊尾蚴病上的诊断价值，但未见关于脑多头蚴GP50(TmGP50)蛋白的相关研究报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的问题，提供一种脑多头蚴病的标志物以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒。
申请人采用多头带绦虫GP50重组蛋白作抗原，建立了检测山羊脑多头蚴病的间接ELISA诊断方法，其敏感性为95％，特异性为92.6％，能够在感染后第2周检测出山羊血清抗体阳性，与现有方法相比具有更早的检出时间(提前7天)。此外，药物治疗组山羊在肌肉注射吡喹酮后约3周呈现血清抗GP50抗体阴性，一直持续至整个试验结束。表明GP50重组蛋白可用于脑多头蚴病的诊断以及药物治疗后的效果评价。
因此本发明提供了GP50重组蛋白制备脑多头蚴病标志物中的应用。
本发明还提供了GP50重组蛋白在制备脑多头蚴病诊断试剂盒中的应用。所述诊断试剂盒包括但不限于间接ELISA诊断试剂盒。
本发明所述应用中所述脑多头蚴病的受检样品可以采用本领域技术人员公知的任何一种样品，包括但不限于血液、唾液、尿液。优选的，所述脑多头蚴病的受检样品为血清或血浆。
本发明所述GP50重组蛋白为GP50基因与表达载体连接后获得的重组质粒在宿主细胞中诱导表达的蛋白。
在一些实施方案中，所述GP50重组蛋白的制备方法具体为提取山羊脑多头蚴总RNA，RT-PCR技术扩增GP50基因，构建pET-32a-GP50表达载体并诱导表达的蛋白。
本发明所述表达载体可以采用本领域技术人员公知的任何一种表达载体，如pGEX系列载体、pET系列载体等。优选的，所述表达载体为pET32a(+)为pET32a(+)。
本发明所述宿主细胞优选为大肠杆菌。
本发明还提供了一种脑多头蚴病的间接ELISA诊断试剂盒，包括GP50重组蛋白。
在一些实施方案中，本发明所述试剂盒还包括间接ELISA反应常用试剂。如PBST洗液、TMB显色液、反应终止液等。
进一步的，在一些实施方案中，本发明所述试剂盒还包括对照品和标准品。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种脑多头蚴病的标志物以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒。以GP50重组蛋白为抗原建立的间接ELISA诊断方法敏感性达95％、特异性达92.6％，与山羊细颈囊尾蚴血清和绵羊细粒棘球蚴血清存在交叉反应。人工感染多头带绦虫山羊的血清抗体监测发现在感染后的整个检测期(2-17周)GP50抗体值均呈现阳性。因此GP50重组蛋白可作为脑多头蚴病标志物，用于诊断脑多头蚴病。本发明所述脑多头蚴病的间接ELISA诊断试剂盒可以快速、灵敏、特异的用于诊断脑多头蚴病，为脑多头蚴病感染的早期的诊断及治疗效果的评价奠定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示GP50基因PCR扩增产物电泳图，其中，泳道M为DL2000DNA Marker，泳道1为PCR产物；
图2示以多头带绦虫GP50氨基酸序列构建的进化树(NJ树)；
图3示重组质粒pMD19-T-GP50的酶切鉴定图，其中，泳道M为DL2000DNA Marker；泳道1为重组质粒pMD19-T-GP50经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切产物；
图4示重组蛋白的SDS-PAGE图，其中，泳道M为蛋白Marker；泳道1为IPTG诱导的pET32a(+)空载体；泳道2为IPTG诱导的pET32a(+)-GP50质粒；泳道3为未经IPTG诱导的pET32a(+)-GP50质粒；
图5示GP50重组表达蛋白的免疫印迹分析结果图，其中，泳道M为蛋白Marker；泳道1为山羊脑多头蚴阳性血清；泳道2为阴性对照血清；
图6示间接ELISA诊断方法的敏感性和特异性检测，其中粗体水平线表示cut-off值(0.581)；
图7示人工感染多头带绦虫山羊血清抗GP50抗体规律监测图，其中粗体水平线表示cut-off值(0.581)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。
其中实验动物及血清来源如下：2只70日龄雌性健康新西兰大白兔购自四川农业大学实验动物中心；20只健康成年雌性山羊，购自非脑多头蚴病流行区。20份山羊脑多头蚴阳性血清和7份山羊细颈囊尾蚴阳性血清采自四川某羊场自然感染山羊；8份细粒棘球蚴阳性血清采自四川地区自然感染的绵羊；36份阴性血清采自通过尸体解剖无绦虫感染的山羊，其中24份用于cut-off值的确定，12份用于所建立方法的特异性检测。340份人工感染阳性血清来自于人工感染多头带绦虫的20只山羊，从感染虫卵后第7天开始采血分离血清，每周一次，持续17周。所有血清贮存于-20℃备用。
虫体中多头带绦虫成虫从人工感染的狗体内分离获得；脑多头蚴，从四川某羊场自然感染山羊的脑部获得。所有虫体均用无菌生理盐水冲洗3～4次后放入4％的多聚甲醛或液氮中保存备用。
主要试剂及来源为：DNA Marker DL2000、DNA Marker DL5000、DNA MarkerDL7000，2×Taq PCR MasterMix，Tiangel Midi Purification Kit，Tianprep MiniPlasmid Kit，天根生化科技(北京)有限公司；逆转录试剂盒(RevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit)，Fermentas公司；限制性内切酶(BamH Ⅰ、Xho Ⅰ)、十二烷基磺酸钠(SDS)、DEPC等，大连宝生物工程有限公司；DTT，成都金线科技有限公司；GoldView I型核酸染色剂，上海索莱宝生物科技有限公司；弗氏(不)完全佐剂、IPTG，Sigma公司；PCR引物合成及测序由上海英俊生物工程有限公司完成。
菌株和质粒来源为：大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)，天根生化科技(北京)公司；pMD19-T Vector，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达载体pET32a(+)，购自invitrogen(美国)。
培养基和常用缓冲溶液的配制方法如下：
50×TAE buffer：Tris 242g加水充分溶解后，加入冰乙酸57.1mL和0.5M EDTA(pH8.0)100mL，精确定容至1L，贮存于4℃备用；
5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：30.3gTris,188g甘氨酸,10gSDS制备成1L水溶液贮存于4℃，临用前稀释5倍；
氨苄青霉素：用灭菌的双蒸水配制成储存浓度为100mg/mL，过滤除菌，储存于-20℃备用；
含氨苄青霉素的LB液体培养基配制：Casein Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，加去离子水约900mL，调PH值至7.2，定容至1L，分装后115℃高压灭菌15min，待培养基温度降至45℃左右后，加入氨苄青霉素(100μg/mL)，混匀后无菌操作倒板，待凝固后4℃保存备用；
TE缓冲液：1mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)0.5mL，0.5M EDTA(pH8.0)0.1mL，加入400mL dd H2O混匀，精确定容至500mL后，115℃高压灭菌20min，室温保存；
TB缓冲液：混合2.4mL 0.45M MnCl2，4mL1M KCl，0.6mL 0.5M CaCl2，0.5m L 0.5MK-MES buffer，加12.5mL去离子水至总体积为20mL；
10％十二烷基磺酸钠(SDS)：10g SDS粉末溶解于80mL去离子水中，37℃水浴约1h，溶解后，精确定容至100mL；
5×上样缓冲液：60mmol/L Tris-HCl(pH6.8)，25％甘油，2％SDS，14.4mmol/L 2-巯基乙醇，0.1％溴酚蓝；
1.5M Tris-HCl(8.8)溶液：Tris碱18.17g，溶于80mL去离子水，浓盐酸调pH至8.8，定容至100mL，保存4℃备用；
30％丙烯酰胺母液：29.2g Acrylamide，1g Bis-Acrylamide，用60mL去离子水充分搅拌溶解，37度水浴，之后加去离子水定容至100mL，过滤后，4℃棕色瓶保存备用；
1.0M Tris-HCl(6.8)溶液：Tris碱12.1g，溶于80mL去离子水，浓盐酸调pH至6.8，精确定容至100mL，保存于4℃备用；
10％过硫酸胺溶液：0.1g过硫酸胺溶于1mL去离子水中；
PBS液：KCl 0.2g/L，NaCl 8g/L，Na2HPO4 12.03g/L，KH2PO4 0.2g/L，用NaOH调节pH至7.2；
0.01mol/L TBST：8.8g NaCl，0.2g KCl，3g Tris base用800mL去离子水溶解后，加入500uL Tween-20，调整pH值到7.4，去离子水定容到1L高压灭菌；
25mg/mL IPTG：溶解250mg的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷于10mL水中，分成小份贮存于-20℃；
考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g，45mL甲醇，10mL冰醋酸，用去离子水定容至100mL；
Western blot转膜缓冲液：5.8g Tris，2.9g甘氨酸，0.37g SDS，200mL甲醇，加去离子水定容至1000mL；
Western blot洗涤缓冲液：Tris 2.42g，NaCl 29.2g，加水至1000mL，临用前加入Tween-20 0.25mL；
Western blot底物显色液：DAB 20mg，TBS 2.5mL，H2O 50mL，30％H2O2 1.0μL混合而成，现配现用；
Western blot显色终止液：冰醋酸2mL，蒸馏水98mL。
主要仪器设备为：PCR仪，(Mastercycle Gradient-3231，德国Eppendof公司)；电泳仪(EPS301，德国赛多利斯公司)；凝胶成像系统(GelDoc XR+，美国BIO-RAD公司)；紫外分光光度仪，(美国Pharmacia Biotech公司)；超纯水系统，(arium61316，德国赛多利斯公司)；高速离心机(德国Eppendof公司)；移液器(德国Eppendof公司)；超声波细胞破碎仪(ZJ92-ⅡDN，宁波新芝生物科技股份有限公司)。
主要数据库和分析软件为：开放阅读框预测：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html；NCBI(GenBank)数据库：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/；蛋白的分子量和等电点预测：http://web.expasy.org/compute_pi/；BLAST检测：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi；信号肽预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/；跨膜区预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/；亲水性分析：http://web.expasy.org/protscale/；二级结构预测：http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_hnn.pl；引物设计：Primer5.0软件；密码子偏好性分析：codonW 1.4.2软件；序列进化树分析：MAGA 5.1软件。
实施例1、脑多头蚴总RNA的提取及GP50基因的扩增
取液氮保存的脑多头蚴虫体，参照上海华舜生物有限公司总RNA提取试剂盒所提供程序提取脑多头蚴总RNA，置于-70℃保存备用。
按照Fermentas公司试剂盒说明书进行，将提取的多头带绦虫脑多头蚴总RNA进行反转录，合成cDNA，反应体系如下：先在PCR管中加入总10μL RNA；1μL DEPC-Water；1μLOligo dT(18)；65℃水浴5min，冰浴3min后在加入4μL 5×Reaction buffer；2μL，dNTP(10mM)；1μL AMV；1μL RNase inhibitor；反应程序为42℃60min，70℃5min，然后8℃保存。
根据多头带绦虫转录组数据中的Unigene17013序列及Genbnk中猪带绦虫GP50诊断抗原基因(Accession No：AY214922.1)开放阅读框，利用Primer 5.0设计了一对引物，引物序列如下：
上游引物：5'-ATGCTGGCACTCACTGC-3′；
下游引物：5'-TCACAAAACCATTGGTATCA-3'。
PCR扩增体系参照天根生化科技(北京)有限公司MasterMix PCR扩增试剂盒说明，在PCR反应管中分别加入以下组分：2×Taq PCR MasterMix:12.5μL；模版cDNA产物：1μL；RNase Free dH2O：9.5μL，上下游引物各1μL。将反应体系中的各个试剂混均、瞬时离心，进行PCR扩增。
扩增条件：94℃预变性5min；30个循环，每个循环条件为94℃，变性45s，52℃退火35s，72℃延伸45s；最后72℃延伸10min。PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳并观察结果，见图1。
用ORF Finder在线分析软件预测GP50基因的开放阅读框(ORF)；利用BLAST搜索目的基因同源序列；用信号肽预测软件Signal IP预测目的基因信号肽；用MEGA 5.1软件以邻接法构建进化树，结果见图2。
图1结果显示，用特异性引物从多头带绦虫脑多头蚴cDNA中扩增到一条约849bp的目的片段，与预期大小相符。其N-端有48bp的信号肽序列，除去信号肽后编码286个氨基酸，推导的蛋白分子大小为31.02kDa，等电点为7.584，与猪带绦虫(Taenia solium)GP50基因序列相似性达92％，与亚洲带绦虫(Taenia asiatica)GP50基因序列相似性达96％。基于Genbank中绦虫类GP50基因氨基酸序列的进化分析表明，所有序列仅构成较为明显的一个分支(图2)。
实施例2、原核表达载体的构建
1、GP50基因表达引物的设计、扩增与克隆
根据GP50基因序列，用Primer5.0设计引物，并在上下游引物的5’端分别添加限制性内切酶位点BamH Ⅰ、Xho Ⅰ和保护性碱基，引物序列如下：
上游引物：5’-CCGGAATTCGAAAATGCCCCAA-3’(含BamH Ⅰ酶切位点)；
下游引物：5’-CGGCTCGAGTCACAAAACCATTGGTATCA-3’(含Xho Ⅰ酶切位点)。
PCR反应体系及扩增程序见实施例1。PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，Gold-view染色，切下目的条带，纯化并连接到pMD19-T载体。按照质粒抽提试剂盒说明书提取PCR鉴定为阳性的克隆菌株质粒。用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，结果见图3。
图3结果显示双酶切得到pMD19-T载体骨架和大于750bp的目的基因片段，片段大小与预期相符，表明GP50基因已正确连接到pMD19-T载体。
酶切体系如下：BamH Ⅰ，1μL；Xho Ⅰ，1μL；10×M buffer，2μL；pMD19-T-GP50质粒，10μL；ddH2O，6μL；共计20μL。
用胶回收试剂盒回收经过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后的GP50质粒，在T4DNA连接酶的作用下与pET32a(+)质粒，16℃过夜连接。连接体系如下：双酶切GP50产物，4.5μL；pET32a(+)质粒，1μL；ddH2O，2.5μL；10×T4DNA Ligase buffer，1μL；T4DNA Ligase，1μL；共计10μL。将以上连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，并将其铺于含有氨苄青霉(50μg/mL)的LB培养基中，37℃倒置过夜培养，挑取单菌落进行PCR鉴定。
经过上述鉴定为阳性的质粒，小量提取其质粒，分别选用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶对质粒进行双酶切鉴定，酶切产物琼脂糖凝胶中电泳，检测是否有目的条带。
将经PCR鉴定和双酶切双重鉴定为阳性的重组质粒，送上海英俊生物工程有限公司进行测序。
实施例3、重组质粒pET32a(+)-GP50在大肠杆菌中的诱导表达及SDS-PAGE分析
将pET32a(+)-GP50质粒的单个白色菌落BL21(DE3)接入2mL LB培养液(含Amp 100μg/mL)中，37℃摇床过夜培养；分别取1mL培养液接种于另外两瓶100mL的含Amp(100μg/mL)的LB培养液中，37℃摇床下培养4h；其中一瓶中加入IPTG至终浓度1mmol/L，另一瓶为对照培养(不加IPTG)；分别取1mL菌液移入两个新的离心管中，12,000r/min离心2min，去上清收集菌体。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，结果见图4。
图4结果显示，重组表达蛋白位于细菌包涵体，诱导表达产物为与约20kDa的His-tag蛋白相偶联的融合蛋白，大小约51kDa。
实施例4、重组蛋白的纯化和含量测定
1、重组蛋白的纯化
(1)将过夜培养的含pET32a(+)-GP50的BL21(DE3)菌落接种至含100μg/mL浓度Amp的LB液体培养基中，加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃摇床下培养4h，摇床振荡培养，获得重组蛋白菌液；
(2)将菌液12,000r/min离心10min，弃上清，留菌体，-20℃放置50min，反复冻融，使菌体细胞壁充分破除；
(3)超声波破碎菌体，直到菌液澄清，并依次用含有不同浓度尿素的蛋白缓冲液洗涤沉淀；
(4)洗涤后，再用含8mol/L尿素结合蛋白缓冲液，悬浮沉淀，冰上放置60min，12,000r/min离心30min，用NC膜(孔径0.45mm)过滤收集上清液；
(5)用His结合树脂纯化，用缓冲液(50mmol/L咪唑，6mol/L尿素，0.5mol/LNaC1，20mmol/L Tris-HC1 pH7.9)洗去杂蛋白，用洗脱液(1mol/L咪唑，6mol/L尿素，0.5mol/LNaC1，20mmol/L Tris-HC1 pH7.9)洗脱目的重组蛋白；
(6)4℃下，将重组蛋白分别在含2mol/L尿素的PBS及PBS溶液中依次透析，将重组蛋白溶液进行冷冻干燥后，-80℃保存备用。
2、重组蛋白的含量测定
参照上海杰瑞生物公司BCA蛋白定量测定剂盒说明书进行。
实施例5、免疫印迹分析
(l)蛋白样品的制备：细菌诱导表达后，用超声波粉碎仪将菌体超声波匀浆约1min，然后12000r/min离心15min，取上清液；
(2)进行SDS-PAGE；
(3)待电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡4次，每次5min；
(4)将预先裁好的滤纸和NC膜浸入转膜缓冲液中20min；
(5)转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸阴极碳板；每层精确对齐，去除气泡，吸干多余液体。接通电源，恒流0.8mA/cm2，转移35min。转移结束后，断开电源，将膜取出。
(6)用TBST洗膜(0.01mol/L)，3次，每次5min；
(7)加入包被液(含5％脱脂奶粉的PBS溶液)，室温处理90min；
(8)去掉包被液，用0.01mol/L TBST洗膜，3次，每次5min；
(9)加入羊脑多头蚴阳性血清(用0.01mol/L PBS按1:100稀释)，4℃孵化12h；
(10)去掉一抗并用TBST(0.01mol/L)洗膜，4次，每次5min；
(1l)加入HRP-兔抗羊IgG二抗(按1:3000的比例用0.01mol/L PBS稀释)，室温平稳摇动2h；
(l2)倒掉二抗，TBST(0.01mol/L)洗膜4次，每次5min；
(l3)加入显色液(现配现用)，避光显色直至目的条带出现时加入双蒸水终止反应。结果见图5。
图5结果显示纯化的重组蛋白可与山羊脑多头蚴阳性血清发生明显免疫反应。
实施例6、间接ELISA诊断方法的建立和应用
1、抗原包被浓度及抗体稀释度的确定
将重组蛋白用包被液稀释为3.148、1.574、0.787、0.396、0.197和0.098μg/mL，100μl每孔，包被96孔板，4℃过夜；洗涤、封闭后，将阴性和阳性血清分别按1:5、1:10、1:20、1:40、1:80倍比稀释，每孔100μl，37℃反应2h。后面步骤按常规ELISA方法进行，以P/N值最大时的条件为最佳抗原浓度和最佳血清稀释度。结果如表1所示。
表1抗原包被浓度及血清稀释度的确定
注:N,阳性血清；P,阴性血清；以粗斜体显示的数字代表这种间接ELISA方法的最佳条件。
表1结果显示，当抗原浓度为0.197μg/孔，血清稀释度为1:10时，P/N值最大(2.76)，且阳性血清的OD值接近于1，所以最佳抗原浓度为0.197μg/孔，最佳血清稀释比1:10。
2、酶标记二抗稀释度的确定
抗原和血清最佳浓度确定以后，将HRP标记的兔抗羊IgG按1:250、1：500、1:1000、1:2000和1:4000倍稀释，反应1h，再加入TMB显色，出现P/N值最大的二抗浓度为最佳稀释度。结果显示酶标二抗浓度最佳稀释度为1:2000。
3、血清最佳反应时间的确定
将抗原和血清稀释到最佳浓度后，分别反应0.5、1、1.5和2h，加入酶标二抗，显色测定OD450nm，以P/N值确定最佳反应时间。结果显示血清最佳反应时间为1.5h。
4、酶标二抗最佳孵化时间的确定
加二抗后分别作用60、90和120min，常规方法进行ELISA试验。比较各组阴、阳性血清的OD450nm值和P/N值，以确定二抗最佳的反应时间。结果显示酶标二抗最佳孵化时间为1h。
5、Cut-off值的确定
按照上面已经优化的各条件用间接ELISA方法检测24份阴性血清，每份血清设2个重复，计算阴性样品OD450平均值及标准方差(SD)。根据公式：计算出Cut-off值。
结果显示24份阴性血清的OD450平均值等于0.329，标准差(SD)等于0.084，所以cut-off值＝0.329+0.252＝0.581。在阴、阳性对照有效的情况下，OD450值大于0.581就可判定为阳性。
6、敏感性和特异性检测
用已建立的GP50重组蛋白间接ELISA法，检测20份山羊脑多头蚴阳性血清、7份山羊细颈囊尾蚴阳性血清、8份绵羊细粒棘球蚴阳性血清和12份健康羊的血清，分别用下列公式对敏感性和特异性进行评价，结果见图6。
敏感性(％)＝ELISA检测阳性×100/真阳性；
特异性(％)＝ELISA检测阴性×100/真阴性。
结果显示，20份山羊脑多头蚴阳性血清仅有1份OD450值低于cut-off值，敏感性为95％(19/20)；7份山羊细颈囊尾蚴阳性血清和8份绵羊细粒棘球蚴阳性血清各有1份OD450值高于cut-off值，12份健康山羊血清OD450值均低于cut-off值，特异性为92.6％(25/27)。
7、人工感染多头带绦虫山羊抗GP50血清抗体的检测
将20只来自非脑多头蚴病流行区的成年健康山羊随机分为两组，分别为药物治疗组和对照组，每组10只，隔离饲养于四川农业大学实验动物房，按70mg/Kg体重一次肌肉注射10％(w/v)吡喹酮驱虫。所有山羊均于驱虫后第7天经口感染5500个多头带绦虫虫卵，其中药物治疗组于感染后45天按70mg/Kg体重肌肉注射10％(w/v)吡喹酮驱虫治疗，每天1次，持续2天。两组均从感染虫卵后第7天开始采血、分离血清，每周一次，持续17周，用上述建立的间接ELISA诊断方法进行血清抗体检测，结果见图7。
图7结果显示，对照组于感染后第2周血清抗体呈现阳性(OD值>0.581)，一直持续至17周试验结束；药物治疗组同样于感染后第2周抗体呈现阳性，但在感染后第10周(注射吡喹酮后第3周)抗体值呈现阴性(OD值<0.581)，一直持续至实验结束。

Claims (7)

1.GP50重组蛋白在制备脑多头蚴病标志物中的应用。
2.GP50重组蛋白在制备脑多头蚴病诊断试剂盒中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脑多头蚴病的受检样品为血清或血浆。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GP50重组蛋白为GP50基因与表达载体连接后获得的重组质粒在宿主细胞中诱导表达的蛋白。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述表达载体为pET32a(+)，所述宿主细胞为大肠杆菌。
6.一种脑多头蚴病的间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于，包括GP50重组蛋白。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括间接ELISA反应常用试剂；所述间接ELISA反应常用试剂为PBST洗液、TMB显色液、反应终止液中至少一种。
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