CN106226528B - 脑多头蚴病的标志物gst以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒 - Google Patents

脑多头蚴病的标志物gst以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN106226528B
CN106226528B CN201610554287.1A CN201610554287A CN106226528B CN 106226528 B CN106226528 B CN 106226528B CN 201610554287 A CN201610554287 A CN 201610554287A CN 106226528 B CN106226528 B CN 106226528B
Authority
CN
China
Prior art keywords
coenosis
gst
recombinant proteins
serum
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201610554287.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106226528A (zh
Inventor
杨光友
王宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Agricultural University
Original Assignee
Sichuan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Agricultural University filed Critical Sichuan Agricultural University
Priority to CN201610554287.1A priority Critical patent/CN106226528B/zh
Publication of CN106226528A publication Critical patent/CN106226528A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106226528B publication Critical patent/CN106226528B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于动物疾病诊断领域，具体涉及一种脑多头蚴病的标志物GST以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒。以GST重组蛋白为抗原建立的间接ELISA诊断方法阴阳性血清的最大P/N值达到2.4558，灵敏度为1：6400，特异性为92.8％。此外，临床检测结果显示，在人工感染多头带绦虫的山羊血清中，攻虫后第二周山羊血清检测到抗体，说明以GST重组蛋白作抗原的间接ELISA诊断方法可以用于早期的临床诊断。因此GST重组蛋白可作为脑多头蚴病标志物，用于诊断脑多头蚴病。本发明所述脑多头蚴病的间接ELISA诊断试剂盒可以快速、灵敏、特异的用于诊断脑多头蚴病，为脑多头蚴病感染的早期的诊断及治疗效果的评价奠定基础。

Description

脑多头蚴病的标志物GST以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒
技术领域
本发明属于动物疾病诊断领域，具体涉及一种脑多头蚴病的标志物GST以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒。
背景技术
多头带绦虫(Taenia multiceps)的中绦期幼虫-脑多头蚴(Coenuruscerebralis)常寄生于绵羊、山羊、牛等有蹄类草食动物脑和脊髓等中枢神经系统，人也可感染，可引起严重的致死性脑多头蚴病。该虫呈世界性分布，在我国以西北、华北、东北等广大牧区常见，近年来动物感染率呈上升趋势。
多头蚴病的临床表现多样，而且在动物感染后的一段时间内不出现典型的临床症状，所以在感染早期难以确诊。多样的临床表现导致了临床诊断的复杂性和迫切需要更可靠的诊断工具。
医学影像技术已经用于人脑多头蚴病的诊断，主要是应用MRI和CT扫描来识别人脑部的包囊。这些技术同样也可以用在动物脑多头蚴的诊断上，Manunta等(2012)研究了33只患慢性脑多头蚴病的绵羊和1只患病山羊的脑和头骨的MRI特征，提示患病绵羊和山羊颅腔形态异常，内含大量的包囊。由于检测结果的可信度高，MRI和CT扫描被认为是诊断人和动物脑多头蚴病最好的方法，但是这些先进的诊断方法不易在养殖场实施，检测成本非常昂贵，而且MRI和CT扫描技术成功应用的前提条件是脑多头蚴在中枢神经系统内定居并形成一定大小的包囊，所以此类技术并不能在感染的早期进行诊断。
现代分子生物学技术已经用于脑多头蚴病的诊断，Ahmad Oryan等(2015)提取患脑多头蚴病的绵羊和山羊脑脊液DNA，以多头带绦虫线粒体基因COX1序列设计引物，建立了检测小型反刍动物脑多头蚴病的PCR诊断方法，研究表明多头带绦虫DNA存在于感染脑多头蚴的绵羊和山羊脑脑脊液中，能够被所建立的PCR诊断方法所扩增。该诊断方法具有较高的准确性，但抽取动物的脑脊液操作烦琐，且不能进行早期诊断。
传统的血清学诊断技术已经用于脑多头蚴病的早期诊断，目前已经建立了诊断多头蚴病的ELISA、Dot-ELISA、间接血凝试验(IHA)及斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)等方法，这些方法都具有较好的诊断效果，但其所用抗原为虫体包囊液或原头蚴等天然虫体抗原，限制了此类方法在生产上的推广及使用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的问题，提供一种脑多头蚴病的标志物GST以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒。
申请人采用多头带绦虫GST重组蛋白作抗原，建立了检测山羊脑多头蚴病的间接ELISA诊断方法，结果显示阴阳性血清的最大P/N值达到2.4558，说明具有一定的诊断价值。对其灵敏度和特异性进行分析，发现其灵敏度为1：6400，特异性为92.8％。此外，临床检测结果显示，在人工感染多头带绦虫的山羊血清中，攻虫后第二周山羊血清检测到抗体，说明以GST重组蛋白作抗原的间接ELISA诊断方法可以用于早期的临床诊断。在用药对人工感染多头带绦虫的山羊用药治疗两周后，抗体水平下降，低于临界值，表现为阴性，说明吡喹酮注射液对山羊脑多头蚴病有很好的治疗效果。临床检测结果进一步证实GST重组蛋白作为抗原建立的间接ELISA诊断方法有很好的实用价值。
因此本发明提供了GST重组蛋白制备脑多头蚴病标志物中的应用。
本发明还提供了GST重组蛋白在制备脑多头蚴病诊断试剂盒中的应用。所述诊断试剂盒包括但不限于间接ELISA诊断试剂盒。
本发明所述应用中所述脑多头蚴病的受检样品可以采用本领域技术人员公知的任何一种样品，包括但不限于血液、唾液、尿液。
优选的，所述脑多头蚴病的受检样品为血清或血浆。
本发明所述GST重组蛋白为GST基因与表达载体连接后获得的重组质粒在宿主细胞中诱导表达的蛋白。
在一些实施方案中，所述GST重组蛋白的制备方法具体为提取多头带绦虫总RNA，RT-PCR技术扩增GST基因，构建pET32a(+)-Tm-GST表达载体，转化宿主菌并诱导表达的蛋白。
本发明所述表达载体可以采用本领域技术人员公知的任何一种表达载体，如pGEX系列载体、pET系列载体等。优选的，所述表达载体为pET32a(+)为pET32a(+)。
本发明所述宿主细胞优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还提供了一种脑多头蚴病的间接ELISA诊断试剂盒，包括GST重组蛋白。
在一些实施方案中，本发明所述试剂盒还包括间接ELISA反应常用试剂。如PBST洗液、TMB显色液、反应终止液等。
进一步的，在一些实施方案中，本发明所述试剂盒还包括对照品和标准品。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种脑多头蚴病的标志物GST以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒。以GST重组蛋白为抗原建立的间接ELISA诊断方法阴阳性血清的最大P/N值达到2.4558，灵敏度为1：6400，特异性为92.8％。此外，临床检测结果显示，在人工感染多头带绦虫的山羊血清中，攻虫后第二周山羊血清检测到抗体，说明以GST重组蛋白作抗原的间接ELISA诊断方法可以用于早期的临床诊断。因此GST重组蛋白可作为脑多头蚴病标志物，用于诊断脑多头蚴病。本发明所述脑多头蚴病的间接ELISA诊断试剂盒可以快速、灵敏、特异的用于诊断脑多头蚴病，为脑多头蚴病感染的早期的诊断及治疗效果的评价奠定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示GST基因的PCR产物；其中，泳道M为DL2000 DNA Marker；泳道1为PCR产物；
图2示重组质粒pMD19-T-GST的酶切鉴定图，其中，泳道M为DL2000 DNA Marker；泳道1为重组质粒pMD19-T-GST经BamH I和Hind III酶切产物；
图3示重组质粒pET32a(+)-Tm-GST的酶切鉴定图，其中，泳道M为DL7000 DNAMarker；泳道1为重组质粒pET32a(+)-Tm-GST经BamH I和Hind III酶切产物；
图4示重组蛋白的SDS-PAGE图，其中，泳道M为蛋白Marker；泳道1为IPTG诱导的pET32a(+)空载体；泳道2为未经IPTG诱导的pET32a(+)-Tm-GST细菌；泳道3为IPTG诱导的pET32a(+)-Tm-GST细菌；
图5示重组蛋白GST的纯化和免疫印迹分析，其中，泳道M为蛋白Marker；泳道1为pET32a(+)-Tm-GST诱导表达；泳道2为纯化后的重组蛋白；泳道3自然感染脑多头蚴病的山羊阳性血清识别rTm-GST的免疫印迹图；泳道4为健康山羊血清识别rTm-GST的免疫印迹图；泳道5为兔抗rTm-GST-IgG识别原头蚴粗提蛋白的免疫印迹图；泳道6为健康兔血清识别原头蚴粗提蛋白；
图6示间接ELISA诊断方法的特异性检测图；
图7示人工感染多头带绦虫山羊血清抗TmGST抗体规律监测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。
其中实验样品及动物来源如下：脑多头蚴来自四川攀枝花某羊场自然感染并解剖的羊，参照有关文献资料鉴定为脑多头蚴。感染多头带绦虫阳性血清采自四川省攀枝花市某羊场患脑包虫病的山羊，山羊死亡后剖解在脑部发现有脑多头蚴包囊。感染细劲囊尾蚴阳性血清采自四川省攀枝花市某羊场患细颈囊尾蚴病的山羊，山羊死亡后剖解在腹腔发现有细颈囊尾蚴包囊。感染细粒棘球蚴阳性血清采自四川省石渠县某农户患包虫病绵羊，绵羊死亡后剖解在肝脏上发现有细粒棘球幼包囊。阴性血清采自非流行病地区健康山羊，山羊解剖后没有发现有寄生虫包囊。2只健康新西兰大白兔，雌性，1.5～2.0kg，购自四川农业大学养兔场。
主要试剂及来源为：动物组织总RNA抽提试剂盒(TRIzol.R.Total RNAIsolation.Reagent)和反转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，购自GIBCOBRL公司；DNA Marker、Protein Marker、限制性内切酶(BamH I、Hind III、EcoRI、Xho I)、T4DNA连接酶，购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、Ni-NTA Agarose，购自Qiagen公司；TaqPCR MasterMix、质粒小量抽提试剂盒、HRP-DAB底物显色试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司；HRP标记的羊抗兔IgG抗体，HRP标记的兔抗山羊IgG抗体，HRP标记的兔抗绵羊IgG抗体购自武汉博士德生物有限公司；IPTG，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，购自Sigma公司；HiTrap Protein A HP，购自Bio-Rad公司，PCR引物合成和测序由上海英俊生物工程有限公司完成；其它试剂均为国产分析纯。
菌株和质粒来源为：大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，pMD19-T Vector购自TaKaRa公司；原核表达载体pET32a(+)，购自invitrogen(美国)。
培养基和常用缓冲溶液的配制方法如下：
PBS Buffer①：分别称取下列试剂于烧杯中：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.42g，KH2PO4 0.27g。加入约500mL灭菌双蒸水混匀溶解，加入浓HCl使pH达到7.4，定容到1L。高压灭菌后室温保存。
电泳缓冲液(50×TAE Buffer)：称取242g Tris和37.2g Na2EDTA·2H2O于烧杯中，加入500mL灭菌双蒸水并混匀溶解，加58mL的CH3COOH再次充分搅拌，定容到1L并室温保存。
EB：将0.1gEB加入100mL的灭菌双蒸水中，分装后常温保存。
LB培养基：液态培养基：分别称取Triptone 10g，5g Yeast Extract,10g NaCl加入烧杯中溶于500mL灭菌H2O中并用烧碱调节pH至7.0，定容到1L后高压灭菌，4℃保存。LB平板：每1L溶液中加15g琼脂粉，高压灭菌，4℃保存。
IPTG溶液：电子天平称取2g的异丙基硫代半乳糖苷溶于8mL超纯水中，充分搅拌溶解后加水到10mL，用0.45μm滤膜过滤后用EP管分装贮存于-20℃。
30％聚丙烯酰胺溶液：称取0.8g的Bis-acrylamide和29.2g的Acrylamide，加入50mL去离子水混匀溶解，加水到100mL，用0.22μm滤膜过滤。
1M Tris-HCl(pH 6.8)：称取12.11g的Tris于烧杯中，加80mL双蒸水充分搅拌溶解，加浓盐酸并使用酸度计调整pH到6.8后加水到100mL，用0.22μm滤膜过滤。
1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：取19g的Tris于烧杯中，加50mL双蒸水充分搅拌溶解，加浓盐酸并使用酸度计调整pH到8.8后加水到100mL，4℃保存。
10％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液：称取10g的SDS于烧杯中，加入80mL双蒸水充分搅拌溶解后定容至100mL，用0.45μm滤膜过滤后常温保存。
10％过硫酸铵溶液：称取0.1g的APS，加水定容到1mL，常温保存。
考马斯亮蓝染色液：用电子天平称取0.1g考马斯亮蓝粉末于20mL酒精中，取100mL浓磷酸到200mL，用0.45μm滤膜过滤后常温保存。
氨苄西林钠溶液(AMP)：使用电子天平称取1gAmpicilin粉末，吸取9mL超纯水充分搅拌溶解后定容至10mL，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装EP管-20℃保存。
主要数据库和分析软件为：引物设计：Primer5.0；NCBI(GenBank)数据库:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/；BLASTn和BLASTp检测BLASTx:http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST。
实施例1、脑多头蚴总RNA的提取及GST基因的扩增
从液氮中取出脑多头蚴提取总RNA。其过程为：取脑多头蚴置于研钵中磨成粉末，然后按RNA提取试剂盒的操作步骤进行提取。
以抽提的RNA为模板，以Oligo dT(18)为反转录引物，按照反逆转录试剂盒手册进行。
参照多头带绦虫转录组数据中找出Unigene2519编码谷胱甘肽转移酶的序列，使用Primer premier 5.0软件设计如下引物,将引物送往英潍捷基公司进行合成。
上游引物P1 5’-ATGGCGCCAATTCTT-3’
下游引物P2 5’-CTAGTTGTCACCGCGTCAC-3’
扩增体系(25μL)：DNA模板各1μL，上下游引物各1μL，PCR Mixture 12.5μL，灭菌双蒸水9.5μL。
扩增条件：预变性：94℃，5min；35个循环(变性：94℃，60s；复性：48℃，60s；延伸：72℃，60s)；最后延伸：72℃，10min；8℃储存。
反应结束后，1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。结果见图1。
GST基因的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳，得到与预期结果一致的特异性条带
实施例2、原核表达载体的构建
1、GST基因表达引物的设计、扩增与克隆
根据GST基因所测序列，NCBI进行BLAST，ORF Finder确定其完整的编码序列，使用Primer premier 5.0软件设计如下引物,加上酶切位点和保护性碱基后将引物送往英潍捷基公司进行合成，分别使用BamH I和Hind III酶切位点。
上游引物P1 5’-CGCGGATCCATGGCGCCAATTCTT-3’(含BamH I酶切位点)
下游引物P2 5’-CCCAAGCTTCTAGTTGTCACCGCGTCAC-3’(含Hind III酶切位点)
PCR反应体系及扩增程序见实施例1。PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，Gold-view染色，切下目的条带，纯化并连接到pMD19-T载体。按照质粒抽提试剂盒说明书提取PCR鉴定为阳性的克隆菌株质粒。用BamH I和Hind III双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，结果见图2。
图2结果显示插入片段的大小与预期结果一致，表明GST基因已正确连接到pMD19-T载体。
酶切体系如下：总体积为10μL：T克隆质粒8μL，10X QuickCut Green Buffer 1μL，QuickCut BamHI 0.5μL，QuickCut HindIII 0.5μL。。
用胶回收试剂盒回收经过BamH I和Hind III酶切后的GST片段，在T4DNA连接酶的作用下与pET32a(+)质粒，16℃过夜连接。连接体系如下：体系总体积为10μL：酶切后GST基因片段4.5μL，酶切后pET32a(+)质粒片段1μL，T4DNA Ligase 1μL，10X DNA Ligase Buffer1μL，灭菌双蒸水2.5μL。
从-70℃超低温冰箱中出DH5α感受态细胞，室温融化后取50μL放入空EP管中，将连接过夜的30μL产物加入EP管并用微量加样枪轻轻吹打混匀，立刻放入冰水混合物冰浴30min。于42℃水浴90s立即冰浴5min。每个EP管中加入600μL的LB溶液，37℃中180r/min培养1.5h。将混合溶液倒入平板中，静置1h使液体干燥，反倒平板过夜。挑取菌落到空EP管中，加入1mL LB溶液和1μLAMP溶液，160r/min震荡培养6h至其浑浊。取菌液进行PCR序列扩增后电泳观察结果。
选择PCR扩增后电泳大小正确的菌株扩大培养后使用质粒抽提试剂盒提取质粒，分别选用BamH I和Hind III酶对质粒进行双酶切鉴定，酶切产物琼脂糖凝胶中电泳，结果见图3。图3琼脂糖凝胶电泳显示插入片段的大小与预期结果一致。
酶切鉴定正确的质粒pET32a(+)-Tm-GST转化到表达菌BL21(DE3)中，经PCR鉴定为阳性的质粒其测序，结果显示GST基因片段与载体pET32a(+)两端的序列及连接方向正确，表明成功构建表达载体pET32a(+)-Tm-GST。
实施例3、重组质粒pET32a(+)-Tm-GST在大肠杆菌中的诱导表达及SDS-P AGE分析
将pET32a(+)-Tm-GST质粒的单个白色菌落BL21(DE3)扩大培养至1mL，再从中吸取50μL菌液加入到5mL的LB液态培养基中，于37℃摇床培养4h，直至菌液OD值达到0.4-0.6；加入50μLIPTG溶液(同时选一瓶不加IPTG的作为对照)后继续在37℃培养4h；吸取2mL菌液，12,000r/min离心10min，倒掉上清(尽量吸干净)。加入40μL双蒸水和10μL上样Buffer，充分吹打混匀；将EP管放入沸水中加热15min，取出后5,000r/min离心5min。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，结果见图4。
图4结果显示，加入IPTG后在37℃诱导5h后的pET32a(+)-Tm-GST重组菌，经12％SDS-PAGE电泳显示，得到约41KDa(GST蛋白约23KDa，pET32a(+)的His标签约18KDa)左右的蛋白，与预期结果大小一致，而未经诱导的pET32a(+)-Tm-GST和含空载体pET32a(+)的细菌未表达，表明GST蛋白在原核表达系统中表达成功。
实施例4、重组蛋白的纯化
(1)按照实施例3的方法对GST蛋白进行大量表达，收集诱导表达菌。取1,000mL菌液，离心10min(8,000r/min)，弃上清，收集菌体。
(2)在菌体中加入裂解液。
(3)超声波破碎，直到菌液澄清。
(4)离心10min(12,000r/min)，留上清。
(5)取镍离子亲和层析柱，用Banding Buffer平衡5-10个柱体积；
(6)将样品于0.22μm滤膜过滤后上样；
(7)用Banding Buffer洗5-10个柱体积；
(8)用含不同梯度的咪唑洗脱液进行洗脱，并收集各洗脱峰；
(9)用400mM咪唑洗脱液清洗后，用20％的乙醇洗涤至离子浓度为0，将柱子于4℃保存。
(10)将蛋白用超滤管进行超滤和浓缩，多次加入PBS进行溶液的置换，以除去原有的咪唑；
(11)蛋白浓缩后，进行SDS-PAGE检查，结果如图5。
通过可溶性分析显示pET32a(+)-Tm-GST表达的蛋白主要以可溶蛋白形式存在。
pET32a(+)-Tm-GST表达的蛋白通过Ni-NTA亲和层析柱纯化，对不同浓度的洗脱峰收集后进行SDS-PAGE电泳判断最佳洗脱浓度。结果纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳显示，GST蛋白条带较单一，纯度较好，并用超滤管对纯化的蛋白进行超滤，得到高浓度纯化的蛋白。
实施例5、免疫印迹分析
(l)蛋白样品的制备：细菌诱导表达后，用超声波粉碎仪将菌体超声波匀浆约1min，然后12000r/min离心15min，取上清液；
(2)进行SDS-PAGE；
(3)待电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡4次，每次5min；
(4)将预先裁好的滤纸和NC膜浸入转膜缓冲液中20min；
(5)转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸阴极碳板；每层精确对齐，去除气泡，吸干多余液体。接通电源，恒流0.8mA/cm2，转移35min。转移结束后，断开电源，将膜取出。
(6)用TBST洗膜(0.01mol/L)，3次，每次5min；
(7)加入包被液(含5％脱脂奶粉的PBS溶液)，室温处理90min；
(8)去掉包被液，用0.01mol/L TBST洗膜，3次，每次5min；
(9)加入感染脑多头蚴的山羊阳性血清或健康山羊血清(用0.01mol/L PBS按1:200稀释)，4℃孵化12h；
(10)去掉一抗并用TBST(0.01mol/L)洗膜，4次，每次5min；
(1l)加入HRP-兔抗羊IgG二抗(按1:3000的比例用0.01mol/L PBS稀释)，室温平稳摇动2h；
(l2)倒掉二抗，TBST(0.01mol/L)洗膜4次，每次5min；
(l3)加入显色液(现配现用)，避光显色直至目的条带出现时加入双蒸水终止反应。结果见图5。
图5结果显示纯化的重组蛋白能被感染了脑多头蚴的山羊阳性血清识别，说明该重组蛋白具有免疫反应性。
实施例6、间接ELISA诊断方法的建立和应用
1、抗原最适包被浓度与血清最适工作浓度的确定
用包被缓冲液将重组蛋白分别按8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.125μg/mL的浓度进行稀释；用PBS溶液将阴、阳性血清按1:20、1:40、1:80、1:160、1:320稀释，按ELISA程序进行方阵实验。在酶标仪上读数后，根据P/N值确定抗原和血清的最佳工作浓度。
结果如表1所示。
表1 抗原和血清最适工作浓度的确定
注:N,阳性血清；P,阴性血清。以粗斜体显示的数字代表这种间接ELISA方法的最佳条件。
表1结果显示，抗原的最适包被浓度为4μg/mL，血清的最佳工作浓度为1:80。
2、酶标记二抗稀释度的确定
将酶标二抗分别作1:3000、1:4000、1:5000、1:6000稀释，按最适浓度稀释抗原和血清，反应1h，再加入TMB显色，出现P/N值最大的二抗浓度为最佳稀释度。结果见表2。
表2 酶标二抗最佳稀释度的确定
二抗稀释 1:3000 1:4000 1:5000 1:6000
阳性血清 0.824 0.957 0.724 0.528
阴性血清 0.389 0.443 0.352 0.252
P/N 2.851 2.160 2.057 2.095
注:N,阳性血清；P,阴性血清。
结果显示，酶标二抗浓度最佳稀释度为1:3000。
3、封闭液的选择
分别用1％明胶、2％BSA、5％BSA、5％脱脂奶粉做为封闭液封闭，对已知的阴性和阳性血清进行ELISA检测，根据P/N值评价封闭效果。结果显示，5％的脱脂奶粉有效的降低了本底值。
4、重组TmGST蛋白间接ELISA程序的确定
根据试验确定的最佳抗原包被浓度、血清稀释倍数、酶标二抗稀释倍数和封闭液，以及优化的时间确定重组TmGST蛋白间接ELISA地程序如下：
(1)抗原包被：用包被缓冲液将重组TmGST蛋白抗原稀释至4μg/mL，加入酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜，PBST洗涤3次。
(2)封闭：重组TmGST蛋白抗原包被后的酶标板用5％脱脂奶粉封闭，100μL/孔，37℃作用2h，PBST洗涤3次。
(3)一抗反应：用抗体稀释液将试验血清稀释80倍，加入板中，100μL/孔，37℃作用1h，PBST洗涤3次。
(4)二抗反应：用抗体稀释液将HRP标记的兔抗山羊IgG按1:3000倍稀释，加入板中，100μL/孔，37℃作用1h，PBST洗涤3次。
(5)底物显色：加入TMB底物显色液，100μL/孔，37℃孵育15min。
(6)终止：向酶标板中加入终止液终止反应，100μL/孔。
(7)酶标仪测定：将酶标板置酶标仪上测定样品OD450的值。
5、间接ELISA阴、阳性判断标准的确定
取24份中山羊阴性血清，采用优化出的最佳条件做ELISA检测，根据检测结果计算出OD450平均值为0.357，标准方差(SD)为0.0388，根据公式:阴阳性临界值＝阴性血清OD450平均值+3×SD，得出0.474为检测的阴阳性临界值，即OD450≥0.474者判为阳性，OD450﹤0.474者判为阴性。
6、特异性检测结果
用重组TmGST蛋白包被的酶标板分别对山羊细颈囊尾蚴阳性血清(7份)、绵羊细粒棘球蚴阳性血清(7份)、山羊脑多头蚴的阳性进行检测，结果见图6。结果显示细颈囊尾蚴血清的OD450值均低于0.474，有一份绵羊细粒棘球蚴血清表现为阳性，用重组Tm-GST蛋白做为包被抗原建立的ELISA检测方法的特异性为92.85％(13/14)。
7、重复性检测结果
1)批内重复性检测
用同一批次包被的酶标板，取5份血清，在同一条件下进行检测，每个血清样本做3个重复，检测结果显示，变异系数在1.59％～4.83％之间，小于5％。表明所建的ELISA检测方法在批内具有良好的重复性。
2)批间重复性检测
取3个不同批次包被的酶标板，在同一条件下对5份血清进行检测，每个血清样本做3个重复。结果显示，批间变异系数在3.35％～5.82％，小于10％，表明该方法在批间具有良好的稳定性。
8、灵敏度检测
利用已测定好的反应条件，将阳性血清稀释50倍后作2倍比稀释，用本研究所建立的间接ELISA检测方法检测血清，结果表明当血清6400倍稀释后，仍可以检测到血清呈阳性OD450≥0.474，说明本研究所建立的ELISA检测方法有很好的灵敏度。
9、药物治疗后脑包虫抗体的持续监测
通过对人工感染多头带绦虫的山羊血清抗体进行检测发现在攻虫2周后，治疗组和对照组均为显示为阳性(OD值＞0.474，临界值)。在9周后(用吡喹酮注射液约2周后)，药物治疗组的抗体值低于临界值，此后抗体值一直低于这个临界值，直至试验结束。而对照组，抗体值从第三周表现为阳性后一直检测为阳性的直至试验结束(17周)，结果如图7所示。

Claims (6)

1.GST重组蛋白在制备脑多头蚴病标志物中的应用，所述GST重组蛋白为多头带绦虫GST重组蛋白。
2.GST重组蛋白在制备脑多头蚴病诊断试剂盒中的应用，所述GST重组蛋白为多头带绦虫GST重组蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述脑多头蚴病的受检样品为血清或血浆。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述GST重组蛋白为GST基因与表达载体连接后获得的重组质粒在宿主细胞中诱导表达的蛋白。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述表达载体为pET32a(+)，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.一种脑多头蚴病的间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于，包括GST重组蛋白，还包括PBST洗液、TMB显色液、反应终止液中至少一种；所述GST重组蛋白为多头带绦虫GST重组蛋白。
CN201610554287.1A 2016-07-14 2016-07-14 脑多头蚴病的标志物gst以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒 Expired - Fee Related CN106226528B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610554287.1A CN106226528B (zh) 2016-07-14 2016-07-14 脑多头蚴病的标志物gst以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610554287.1A CN106226528B (zh) 2016-07-14 2016-07-14 脑多头蚴病的标志物gst以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106226528A CN106226528A (zh) 2016-12-14
CN106226528B true CN106226528B (zh) 2018-06-05

Family

ID=57520340

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610554287.1A Expired - Fee Related CN106226528B (zh) 2016-07-14 2016-07-14 脑多头蚴病的标志物gst以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106226528B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101968489A (zh) * 2010-08-25 2011-02-09 四川农业大学 一种检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒
CN102168100A (zh) * 2011-02-14 2011-08-31 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 一种细粒棘球绦虫谷胱甘肽转移酶基因及其用途
CN103184225A (zh) * 2013-03-11 2013-07-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种多头带绦虫抗原基因及其重组蛋白与用途
CN103205447A (zh) * 2012-12-24 2013-07-17 四川农业大学 脑多头蚴热休克蛋白抗原的制备方法及其应用
CN105153287A (zh) * 2015-07-13 2015-12-16 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于诊断羊脑多头蚴病的重组蛋白

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101968489A (zh) * 2010-08-25 2011-02-09 四川农业大学 一种检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒
CN102168100A (zh) * 2011-02-14 2011-08-31 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 一种细粒棘球绦虫谷胱甘肽转移酶基因及其用途
CN103205447A (zh) * 2012-12-24 2013-07-17 四川农业大学 脑多头蚴热休克蛋白抗原的制备方法及其应用
CN103184225A (zh) * 2013-03-11 2013-07-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种多头带绦虫抗原基因及其重组蛋白与用途
CN105153287A (zh) * 2015-07-13 2015-12-16 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于诊断羊脑多头蚴病的重组蛋白

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Preliminary Analysis of Taenia multiceps Metacestode Antigens by Two-Dimensional Electrophoresis;Wen Hui LI ET AL.;《Iranian J Parasitol》;20141231;第9卷(第4期);568-573 *
猪带绦虫谷胱甘肽转移酶GST的原核表达及免疫学研究;戴佳琳等;《中国人兽共患病学报》;20100414;第26卷(第2期);107-110 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106226528A (zh) 2016-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103756973B (zh) 一种草鱼呼肠孤病毒的间接elisa检测试剂盒
CN107118262A (zh) 一种牛支原体MbovP579蛋白及其应用
CN106093435B (zh) 细粒棘球绦虫谷氧还蛋白‑1的应用
CN107573417A (zh) 肺炎支原体嵌合抗原、该抗原检测试剂及两者的制备方法
CN107056898A (zh) 鲤疱疹病毒3型1301株orf136基因重组表达蛋白、抗体及其应用
CN106018831B (zh) 脑多头蚴病的标志物gp50以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒
CN111087453A (zh) 一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法及其应用方法
CN103323585B (zh) 一种检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒及其制备方法
CN111621506B (zh) 牛支原体分泌蛋白MbovP0145及其应用
CN103833830B (zh) 柯萨奇病毒a16型的保守中和表位多肽及其用途
CN106226528B (zh) 脑多头蚴病的标志物gst以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒
CN107576791A (zh) 一种猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒
CN1325649C (zh) 一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用
CN108530521A (zh) 重组丙型肝炎抗原的制备及应用
CN111704661B (zh) 日本血吸虫童虫高表达基因或其编码蛋白的应用
CN106226529B (zh) 脑多头蚴病的标志物ldh以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒
CN110196337B (zh) 一种诊断脑多头蚴病的elisa试剂盒
CN111690043B (zh) 基于SARS-CoV-2核蛋白的NTD多肽、编码基因、重组载体、表达方法及应用
CN106198979B (zh) 细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶的应用
CN106198978B (zh) 细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶的应用
CN101979406B (zh) 南非ⅱ型口蹄疫多抗原表位蛋白、其制备方法及应用
CN109810184A (zh) 人nf155抗原、人nf155抗体检测试剂盒及其制备方法与应用
CN109734792A (zh) 人cntn1抗原、人cntn1抗体检测试剂盒及其制备方法与应用
CN110133290A (zh) 一种诊断犬恶丝虫病的elisa试剂盒
CN110208553B (zh) 多头带绦虫Antigen B的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180605