CN106198978B - 细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶的应用 - Google Patents

细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106198978B
CN106198978B CN201610553289.9A CN201610553289A CN106198978B CN 106198978 B CN106198978 B CN 106198978B CN 201610553289 A CN201610553289 A CN 201610553289A CN 106198978 B CN106198978 B CN 106198978B
Authority
CN
China
Prior art keywords
echinococcus granulosus
kit
sheep
liquid
elisa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610553289.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106198978A (zh
Inventor
杨光友
闫敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Agricultural University
Original Assignee
Sichuan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Agricultural University filed Critical Sichuan Agricultural University
Priority to CN201610553289.9A priority Critical patent/CN106198978B/zh
Publication of CN106198978A publication Critical patent/CN106198978A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106198978B publication Critical patent/CN106198978B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/43504—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates
    • G01N2333/43526—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from worms
    • G01N2333/43539—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from worms from cestodes
    • G01N2333/43543—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from worms from cestodes from Taenia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶在制备检测细粒棘球蚴病的免疫抗原和/或试剂盒中的应用，其作为免疫抗原能够被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别，应用于间接ELISA检测时，具备较高的特异性和敏感性，临床检测符合率高达97.9％。以细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶为免疫抗原建立的检测方法具有良好的诊断效果，可以用于疫区绵羊细粒棘球蚴病的初步筛选。

Description

细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶的应用。
背景技术
细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)属带科(Taeniidae)棘球属(Echinococcus)，其中绦期幼虫寄生于动物和人的肝、肺及其他器官内所引起细粒棘球蚴病，又称囊性包虫病，是一种人兽共患病，主要寄生在人和家畜等多种哺乳动物体内。90％以上的细粒棘球蚴包囊生长于宿主的肝脏、肺脏或者同时生长于肝肺。细粒棘球蚴病呈世界性分布，引起一系列的经济和公共卫生问题。在一些流行地区，其感染率可高达5-10％，死亡率高达2-4％。据估计，全球人囊性棘球蚴病每年至少损失1-3.6百万伤残调整生命年(DALYs)，而动物囊性棘球蚴病每年造成的经济损失至少为20亿美元。因此，世界卫生组织已经把棘球蚴病列为《被忽视的热带疾病》，作为其2008-2015年重点防治计划。
目前，细粒棘球蚴病免疫诊断的研究主要集中在粗囊液抗原上，但是其成分复杂，具有难以大量提纯、抗原来源不稳定、成本高、诊断特异性低等缺陷。缺乏标准有效的特异性重组抗原是细粒棘球蚴病免疫诊断中的一个尚未解决的难题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶(Eg-lap)的应用，使其能够能被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别，具有良好的免疫原性，并具有较高的特异性和敏感性，减少与其他带科绦虫病阳性血清的交叉反应。
亮氨酸氨基肽酶(LAPs)具有水解N末端氨基酸的功能，属于M1或者M17基因家族，并且在调节合成代谢和分解代谢、维持细胞形态、生长和免疫方面具有重要的作用。LAPs是金属肽酶；有Mn2+，Co2+，或者Ni2+离子存在时能提高该酶的活性。LAPs在较高温度(60-70℃)和偏碱的PH(8.5-9.5)条件下仍然具有稳定性。葡萄球菌的LAP参与葡萄球菌的生物膜形成和生长，表明LAP对在细菌生长和致病机理潜在的重要性。
目前，关于亮氨酸氨基肽酶的研究在寄生虫、线虫和疟原虫上有一些功能性的报道，但是关于免疫抗原识别的研究还未见任何报道。因此，本发明对细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶(Eg-lap)进行了生物信息学分析，并通过反转录表达出rEg-lap蛋白，制备出抗rEg-lap的多克隆抗体，对该蛋白进行免疫印迹分析表明其可被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别，具有良好的免疫原性，利用rEg-lap蛋白建立细粒棘球蚴病间接ELISA诊断方法，为细粒棘球蚴病的防控提供监测手段。
因此，本发明提出了细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶在制备检测细粒棘球蚴病的免疫抗原和/或试剂盒中的应用。
其中，作为优选，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒或免疫印迹检测试剂盒。
同时，本发明还提供了一种检测细粒棘球蚴病的ELISA检测试剂盒，包括细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶(作为抗原进行包被)和ELISA检测试剂盒常规组分。所述试剂盒依据间接ELISA检测原理。
作为优选，所述ELISA检测试剂盒常规组分包括抗原包被液、酶标板、封闭液、HRP标记的二抗和TMB底物。
进一步优选地，所述封闭液为5％脱脂奶粉；所述HRP标记的二抗为HRP标记的山羊或绵羊抗兔二抗。
在具体的ELISA检测过程中，抗原包被最佳条件是4℃过夜，抗原最佳浓度为0.14μg/每孔，最佳血清稀释浓度为1:80，血清孵育最佳时间是37℃1h，二抗孵育最佳时间是37℃1h，二抗最佳稀释浓度为1:3000。
作为优选，所述ELISA检测试剂盒常规组分还包括显色反应终止液H2SO4、洗涤液PBST和稀释液PBS。
本发明先提取细粒棘球绦虫总RNA，而后进行反转录获得cDNA，根据Eg-lap的基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物扩增目的片段，然后进行测序验证。最后连接至表达载体中，转入大肠杆菌中表达，获得细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶的反转录重组蛋白rEg-lap。
免疫印迹显示rEg-lap能被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别，具有良好的免疫原性。间接ELISA结果显示，该方法的cut-off值为0.4952，特异性和敏感性分别为78.5％(11/14)和95.8％(23/24)。
由以上技术方案可知，本发明提供了细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶在制备检测细粒棘球蚴病的免疫抗原和/或试剂盒中的应用，其作为免疫抗原能够被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别，应用于间接ELISA检测时，具备较高的特异性和敏感性，临床检测符合率高达97.9％。以细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶为免疫抗原建立的检测方法具有良好的诊断效果，可以用于疫区绵羊细粒棘球蚴病的初步筛选。
附图说明
图1所示为Eg-lap PCR扩增凝胶图；其中，M为DNA分子质量标准DL2000；1为Eg-lapcDNA PCR产物；
图2所示为rEg-lap的western blot凝胶图；其中，M为蛋白质标准品；1为IPTG诱导的含pET28a(+)-Eg-LAP的细菌；2为纯化后的rEg-lap；
图3所示为rEg-lap的western blot凝胶图；其中，M为蛋白质标准品；1为自然感细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别rEg-lap；2为健康绵羊血清识别rEg-lap；
图4所示为间接ELISA对不同血清的检测结果；其中，横坐标从左至右依次为绵羊抗细粒棘球蚴阳性血清、绵羊抗脑多头蚴阳性血清、山羊抗细颈囊尾蚴阳性血清；Cuto-offvalue表示临界值；
图5所示为间接ELISA对不同血清的检测结果；其中，横坐标从左至右依次为阳性血清和阴性血清；Cuto-off value表示临界值。
具体实施方式
本发明公开了细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，各试验所涉及的材料和试剂如下：
1、主要试剂
动物组织总RNA抽提试剂盒(TRIzol.R.Total RNA Isolation.Reagent)和反转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，购自GIBCOBRL公司；DNAMarker、Protein Marker、限制性内切酶(BamH I、Hind III、EcoRI、Xho I)、T4DNA连接酶，购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、Ni-NTA Agarose，购自Qiagen公司；TaqPCRMasterMix、质粒小量抽提试剂盒、HRP-DAB底物显色试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司；HRP标记的羊抗兔IgG抗体，HRP标记的兔抗山羊IgG抗体，HRP标记的兔抗绵羊IgG抗体，FITC标记的羊抗兔IgG抗体购自武汉博士德生物有限公司；IPTG，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，购自Sigma公司；HiTrap Protein A HP，购自Bio-Rad公司，PCR引物合成和测序由上海英俊生物工程有限公司完成；其它试剂均为国产分析纯。
2、菌株和质粒载体
宿主菌大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)、pMD19-T Vector购自TaKaRa公司；pET32a(+)载体由四川农业大学动物寄生虫病实验室提供。
3、常用缓冲溶液和培养基的配制
PBS Buffer①：分别称取下列试剂于烧杯中：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.42g，KH2PO4 0.27g。加入约500mL灭菌双蒸水混匀溶解，加入浓HCl使pH达到7.4，定容到1L。高压灭菌后室温保存。
电泳缓冲液(50×TAE Buffer)：称取242g Tris和37.2g Na2EDTA·2H2O于烧杯中，加入500mL灭菌双蒸水并混匀溶解，加58mL的CH3COOH再次充分搅拌，定容到1L并室温保存。
EB：将0.1gEB加入100mL的灭菌双蒸水中，分装后常温保存。
LB培养基：液态培养基：分别称取Triptone 10g，5g Yeast Extract,10g NaCl加入烧杯中溶于500mL灭菌H2O中并用烧碱调节pH至7.0，定容到1L后高压灭菌，4℃保存。LB平板：每1L溶液中加15g琼脂粉，高压灭菌，4℃保存。
IPTG溶液：电子天平称取2g的异丙基硫代半乳糖苷溶于8mL超纯水中，充分搅拌溶解后加水到10mL，用0.45μm滤膜过滤后用EP管分装贮存于-20℃。
30％聚丙烯酰胺溶液：称取0.8g的Bis-acrylamide和29.2g的Acrylamide，加入50mL去离子水混匀溶解，加水到100mL，用0.22μm滤膜过滤。
1M Tris-HCl(pH 6.8)：称取12.11g的Tris于烧杯中，加80mL双蒸水充分搅拌溶解，加浓盐酸并使用酸度计调整pH到6.8后加水到100mL，用0.22μm滤膜过滤。
1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：取19g的Tris于烧杯中，加50mL双蒸水充分搅拌溶解，加浓盐酸并使用酸度计调整pH到8.8后加水到100mL，4℃保存。
10％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液：称取10g的SDS于烧杯中，加入80mL双蒸水充分搅拌溶解后定容至100mL，用0.45μm滤膜过滤后常温保存。
10％过硫酸铵溶液：称取0.1g的APS，加水定容到1mL，常温保存。
考马斯亮蓝染色液：用电子天平称取0.1g考马斯亮蓝粉末于20mL酒精中，取100mL浓磷酸到200mL，用0.45μm滤膜过滤后常温保存。
氨苄西林钠溶液(AMP)：使用电子天平称取1gAmpicilin粉末，吸取9mL超纯水充分搅拌溶解后定容至10mL，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装EP管-20℃保存。
4、试验动物
2只健康新西兰兔，1.4～2.2kg，购自四川农业大学试验动物中心。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：细粒棘球蚴总RNA的提取
细粒棘球绦虫的中绦期幼虫(细粒棘球蚴)包囊来自于自然感染的绵羊肝脏，样本采自青海西宁或四川甘孜，液氮保存。
取出液氮保存的细粒棘球蚴，用研钵将其磨碎，随后参照天根的动物组织RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。
(1)每10-20mg原头蚴加300μL裂解液，使用研磨棒研磨；
(2)向匀浆液中加入Proteinase K(10μL)和RNase-Free ddH2O(590μL)，混匀后反应15min(56℃)。
(3)离心5min(12,000rpm)，将上清转移到干净的管子中；在管子中加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀后转入吸附柱中，离心1min(12,000rpm)后弃废液。
(4)在吸附柱中加去蛋白质液RW1(350μL)，离心1min(12,000rpm)后，弃废液。
(5)将DNase I工作液(80μL)加入吸附柱，室温放置反应15min；随后加去蛋白质液RW1(350μL)，离心1min(12,000rpm)后弃废液。
(6)500μL漂洗液RW加入吸附柱中，放置2min(室温)，离心1min(12,000rpm)后弃废液。
(7)重复(6)。
(8)空离，弃废液，晾干残余漂洗液。
(9)把吸附柱放入一个新的离心管中，用RNase-Free ddH2O(30-100μL)洗脱，静置2min(室温)，离心2min(12,000rpm)后得到细粒棘球蚴总RNA提取液。
实施例2：第一链cDNA的合成
以抽提的细粒棘球蚴总RNA为模板，以Oligo dT(18)为反转录引物，参照Thermo公司反转录试剂盒说明书进行操作：
(1)冰上制备反应混合物
Oligo dT18 1μL
模板RNA 1μL
DEPC ddH2O 1μL
(2)在70℃(5min)孵育后转到冰上冷却
(3)在冰上按照顺序加入以下反应物：
5reaction buffer 4μL
核糖核酸酶抑制剂 1μL
10dNTP混合物 2μL
(4)37℃(5min)孵育后加RevertAidTM反转录酶1μL。
(5)PCR程序：42℃，1h；70℃，10min。
(6)得到的cDNA于-80℃保存。
实施例3：Eg-lap基因的扩增
根据Eg-lap的基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物：
上游：5’-CCGGAATTCATGTGGCGCTTTTTATC-3’下划线为EcoR I
下游：5’-CCGCTCGAGCTCTAAAAGTTCAGCAAGTG-3’下划线Xho I
扩增体系(25μL)：DNA模板各1μL，上下游引物各1μL，PCR Mixture 12.5μL，灭菌双蒸水9.5μL。
扩增条件：预变性：95℃5min；38个循环(变性：95℃，40s；退火：54℃，45s；延伸：72℃，45s)；最后延伸：72℃，10min。
PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，Gold-view染色，以细粒棘球绦虫原头蚴的cDNA为模板扩增出一条1824bp左右的条带，与预期相符(图1)，切下目的条带，纯化并连接到pMD19-T载体。
实施例4：Eg-lap基因克隆测序和比对
(1)将下列试剂混合：4μL的Solution 1，3.5μL的模板DNA，0.5μL的pMD19-Tvector，放入离心机瞬离后放于16℃恒温水连接过夜。
(2)从-70℃出感受态细胞，室温融化后取30μL放入空EP管中，将连接过夜的8μL产物加入EP管并用微量加样枪轻轻吹打混匀，立刻放入冰水混合物冰浴30min。42℃水浴90s立即冰浴5min。每个EP管中加入600μL的LB溶液，37℃中180r/min培养1.5h。将混匀的溶液倒在到LB平板上，37℃冷却1h使表面干燥，反倒平板过夜。
(3)挑取菌落到空EP管中，加入1mL LB溶液和1μLAMP溶液，160r/min震荡培养6h至其浑浊。吸取1μL菌液扩增并将产物跑电泳后观察。选取电泳观察阳性的菌液送至英潍捷基公司进行测序。
经测序得到的序列与Eg-lap的序列同源性达到100％。
实施例5：Eg-lap基因克隆、鉴定及转化
1、质粒提取
按照质粒抽提试剂盒说明书提取PCR鉴定为阳性的克隆菌株质粒，具体操作程序如下：
(1)接种单个菌落于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃震荡培养过夜后，将浑浊的培养液吸入另一离心管，12,000r/min离心30s，去掉上清。
(2)向吸附柱中加入500μL的平衡液BL，12,000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；
(3)向离心管中加入250μL的预冷溶液(P1)，振荡悬浮细胞；
(4)向离心管中加入250μL溶液P2，轻柔地上下颠倒离心管使菌体与P2溶液充分混匀，静置离心管数分钟，至液体澄清为止；
(5)向离心管中加入350μL溶液P3，轻柔地上下颠倒离心管，13,000r/min离心10min；
(6)将上清液转移到吸附柱中，静置5min，待质粒DNA与吸附柱充分结合，12,000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
(7)将收集管中液体再次转移到吸附柱，重复步骤(6)；
(8)倒掉收集管中的废液，向吸附柱中加入500μL去蛋白液，静置1min，12,000r/min离心1min；
(9)倒掉收集管中的废液，向吸附柱中加入700μL漂洗液，12,000r/min离心1min；
(10)重复步骤(9)
(11)将吸附柱放入收集管中，放在12,000r/min空离2min，最大限度去除多余的漂洗液；
(12)向吸附柱中滴加50μL已预热的TE溶液，室温静置5min待TE溶液完全浸透硅胶膜，12000r/min，离心1min收集质粒DNA溶液；
(13)将离心管底部的溶液再次滴加到吸附柱中，重复步骤(12)，以最大程度的得到质粒DNA。
2、质粒酶切回收
将提取的pMD19-T-LAP用EcoR I和Xho I双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收酶切产物。酶切体系如下：EcoR I，1μL；Xho I，1μL；10×Mbuffer，2μL；pMD19-T-LAP质粒，10μL；ddH2O，6μL；共计20μL。
3、目的片段连接表达载体
将经过EcoR I和Xho I酶切后的pMD19-T-LAP质粒和pET28a(+)质粒，在T4DNA连接酶的作用下，16℃过夜连接，连接体系如下：双酶切LAP产物，4.5μL；pET28a(+)质粒，1μL；ddH2O，2.5μL；10×T4DNA Ligase buffer，1μL；T4DNA Ligase，1μL；共计10μL。将以上连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，并将其铺于含有氨苄青霉(50μg/mL)的LB培养基中，37℃倒置过夜培养，挑取单菌落进行PCR鉴定。
4、pET28a(+)-LAP重组质粒双酶切鉴定
对重组质粒进行双酶切鉴定，方法参照“2、质粒酶切回收”。
实施例6：重组Eg-lap在大肠杆菌中的表达
1、重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
将pET28a(+)-LAP质粒的单个白色菌落BL21(DE3)接入2mL LB培养液(含Kana 50μg/mL)中，37℃摇床过夜培养；分别取1mL培养液接种于另外两瓶100mL的含Kana(100μg/mL)的LB培养液中，37℃摇床下培养直4h；其中一瓶中加入IPTG至终浓度1mmol/L，另一瓶为对照培养(不加IPTG)；分别取1mL菌液移入两个新的离心管中，12,000r/min离心2min，去上清收集菌体。
2、表达产物SDS-PAGE分析
(1)正确安装聚丙烯酰胺凝胶电泳玻璃板，在两块玻璃板间注入双蒸水，检查装置是否漏液，若不漏液则可继续后面操作；
(2)按表1配制12％分离胶5mL，用微量加样器将分离胶迅速沿长玻璃板加入两块已经固定好的玻璃板中，加至约距短玻璃板顶端1.5cm处时，立即向玻璃板中加入适量的双蒸水，室温下静置待聚合，当胶与水层间的界面重新出现时表明胶已聚合；
(3)按后表配制5％的浓缩胶1mL，混匀，用滤纸小心吸干水层后，使用微量加样器将浓缩胶注入，并插入样品梳，防止梳子底部产生气泡，待胶凝固后，取出样品梳；
(4)将提取的菌液蛋白按1:1的比例分别加入2倍样品缓冲液，混匀后，100℃沸水浴5min，以12,000r/min离心10min。用微量加样器在样品孔内分别加入标准样品和待检样品，每孔10μL；
(5)盖上电泳槽，接通电源，70V恒压电泳，直至溴酚蓝进入分离胶后，将电压调整为180V，当溴酚蓝前沿移至接近胶底时，断开电源，停止电泳；
(6)取出凝胶后，置于平皿中用蒸馏水漂洗3次，加入考马斯亮蓝R-250染色液，将平板放置于摇床上，室温染色60min；
(7)取出已经染好色的凝胶，置于平皿中，用自来水漂洗3次后，往平皿中加入考马斯亮蓝脱色液，当脱色液颜色变深时更换脱色液，直至蛋白条带清晰。
(8)拍照，保存实验结果。
表1
试剂 12％分离胶 5％浓缩胶
缓冲液(mL) － 0.25
缓冲液(mL) 1.3 －
Acr/Bis贮液(mL) 2.0 0.33
ddH2O(mL) 1.6 1.4
10％APS(mL) 0.05 0.02
10％SDS(mL) 0.05 0.02
TEMED(μL) 2 2
3、重组蛋白的纯化
(1)将过夜培养的含pET28a(+)-LAP的BL21(DE3)菌落接种至含50μg/mL浓度Kana的LB液体培养基中，在最适IPTG工作浓度和最佳诱导时间条件下，摇床振荡培养，获得重组蛋白菌液；
(2)将菌液12,000r/min离心10min，弃上清，留菌体，-20℃放置50min，反复冻融，使菌体细胞壁充分破除；
(3)超声波破碎菌体，直到菌液澄清，并依次用含有不同浓度尿素的蛋白缓冲液洗涤沉淀；
(4)洗涤后，再用含8mol/L尿素结合蛋白缓冲液，悬浮沉淀，冰上放置60min，12,000r/min离心30min，用NC膜(孔径0.45mm)过滤收集上清液；
(5)用His结合树脂纯化，用缓冲液(50mmol/L咪唑，6mol/L尿素，0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris-HC1pH7.9)洗去杂蛋白，用洗脱液(lmol/L咪唑，6mol/L尿素，0.5mol/LNaC1，20mmol/L Tris-HC1pH7.9)洗脱目的重组蛋白；
(6)4℃下，将重组蛋白分别在含2mol/L尿素的PBS及PBS溶液中依次透析，将重组蛋白溶液进行冷冻干燥后，-80℃保存备用。
4、结果
通过SDS-PAGE可溶性分析表明，重组表达蛋白大多数位于细菌包涵体，有少量在上清，诱导表达产物为与约6kDa的His-tag蛋白相偶联的融合蛋白，大小约71.8kDa，rEg-lap表达为可溶性蛋白，纯化后的重组蛋白为单一条带(图2)。
实施例7：免疫原性分析
1、兔抗rEg-lap-IgG的制备
将纯化后的rEg-lap蛋白分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按照1:1比例混合制备乳剂苗。对两只新西兰兔进行皮下四次注射免疫，每次间隔两个周免疫一次，第一次用弗氏完全佐剂和200μg重组蛋白皮下注射免疫，后三次均用弗氏不完全佐剂和200μg重组蛋白皮下注射免疫。
免疫结束后，使用HiTrap ProteinA 1mL预装柱和HPLC纯化系统(Bio-Rad)纯化血清，将流速调为1.0mL/min，使用A2Buffer洗柱子10min。将0.45μm NC膜过滤过的血清放入柱子中，0.5mL/min。用10-20ml的B Buffer洗脱，收集洗脱下来的IgG，并用50mM的Tris调节洗脱下来的IgG溶液的PH。平衡后用20％的酒精洗涤柱子，直到离子浓度降为0。通过SDS-PAGE鉴定抗体纯化情况。
2、免疫印迹
(1)按照上述方法制备蛋白质电泳凝胶，对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳。
(2)蛋白质电泳结束后，取蛋白质所在的相应凝胶部位，放入转膜缓冲液中进行平衡，共3次，每次4min。
(3)将硝酸纤维素滤膜(NC膜)和24层滤纸置于转移缓冲液中浸泡5min。
(4)按顺序将阴极电极板、24层滤纸、凝胶、NC膜、24层滤纸置于Bio-Rad半干式转印槽内，盖上阳极电极板。
(5)将电转移装置接到电转仪上，并加入转移缓冲液35mA转移30min。
(6)转移结束后，取出NC膜，浸泡在3％BSA的TBST中，4℃封闭过夜。
(7)封闭结束后，剪开NC膜，阴性和阳性分开放置，加入1：1000稀释的一抗，室温孵育2h后，倒掉一抗，用TBST快速洗膜3次，5min/次。
(8)将HRP标记的Goat-anti-sheep IgG按1:1000稀释后，加入NC膜，室温孵育2h后，倒掉二抗，用TBST快速洗膜3次，5min/次。
(9)将NC膜置于平皿中，以新鲜底物显色液冲洗直至显色。
(10)显色后，用双蒸水冲洗NC膜终止显色，并对结果进行拍照记录。
3、结果
免疫印迹显示，rEg-lap能被细粒棘球蚴病阳性绵羊血清识别，且为单一条带(图3)，说明rEg-lap具有较好的免疫原性。
实施例8：间接ELISA方法的建立
1、间接ELISA操作步骤
(1)以抗原包被液按比列稀释rEg-lap蛋白，每孔100μL加入96酶标板中进行包被；
(2)倒掉包被液，拍干孔内液体，用PBST洗涤，重复四次；
(3)加入封闭液(5％的脱脂奶粉)封闭后，洗涤四次；
(4)用PBS按比例稀释血清后，加入酶标孔孵育，倒掉液体，洗涤四次；
(5)加入稀释好的HRP标记的山羊或绵羊抗兔二抗，孵育，洗涤四次；
(6)在避光条件下向孔中加入可溶性单组分底物TMB进行显色反应；
(7)在孔中加入100μL 2M H2SO4终止反应，在紫外吸光度为450nm时测定其OD值。
(8)倒掉液体，拍干后，按(2)所示洗涤四次，每次3min；
(9)倒掉液体，拍干后，在避光条件下进行颜色反应，向孔中加入可溶性单组分底物TMB，每孔100μL，室温孵育10～20min；
(10)再向孔中加入100μL 2M H2SO4终止反应，立即将96孔板置于酶标仪上，在紫外吸光度为450nm时测定其OD值。
2、确定最佳条件
(1)抗原包被浓度及抗体稀释度的确定。将重组蛋白用包被液稀释为5.6、2.8、1.4、0.7、0.35和0.175ug/mL，100ul每孔，包被96孔板，4℃过夜；洗涤、封闭后，将阴性和阳性血清分别按1:20、1:40、1:80、1：160、1：320、1：640倍比稀释，每孔100ul，37℃反应2h。后面步骤按常规ELISA方法进行，以P/N值最大时的条件为最佳抗原浓度和最佳血清稀释度。
(2)酶标记二抗稀释度的确定。抗原和血清最佳浓度确定以后，将HRP标记的兔抗羊IgG按1:250、1：500、1:1000、1:2000和1:4000倍稀释，反应1h，再加入TMB显色，出现P/N值最大的二抗浓度为最佳稀释度。
(3)血清最佳反应时间的确定。将抗原和血清稀释到最佳浓度后，分别反应0.5、1、1.5和2h，加入酶标二抗，显色测定OD450nm，以P/N值确定最佳反应时间。
(4)酶标二抗最佳孵化时间的确定。加二抗后分别作用60、90和120min，常规方法进行ELISA试验。比较各组阴、阳性血清的OD450nm值和P/N值，以确定二抗最佳的反应时间。
间接ELISA结果显示，抗原包被最佳条件是4℃过夜，抗原最佳浓度为0.14μg/每孔，最佳血清稀释浓度为1:80，血清孵育最佳时间是37℃1h，二抗孵育最佳时间是37℃1h，二抗最佳稀释浓度为1:3000。
3、临界值的确定
在最佳条件下，测定24份绵羊细粒棘球蚴病阴性血清的OD450。设置2个重复。按照临界值＝平均值+3倍标准差计算。
用24份绵羊阴性血清样品的OD450值确定临界值，通过统计学分析，计算出24份绵羊阴性血清样品OD450值的平均值为0.3404，标准差为0.0516。根据计算公式：临界值＝阴性样本OD450平均值+3倍标准差，得出临界值为0.4952，即OD450>0.4952时，理论上可判定为阳性，OD450<0.4952可判定为阴性。
4、敏感性和特异性检测
用建立的间接ELISA法检测24份绵羊细粒棘球蚴阳性血清、7份山羊细颈囊尾蚴阳性血清、7份绵羊脑多头蚴阳性血清和24份健康羊的血清，分别用下列公式对本方法的敏感性和特异性进行了评价：敏感性(％)＝ELISA检测阳性×100/真阳性；特异性(％)＝ELISA检测阴性×100/真阴性。
24份绵羊细粒棘球蚴阳性血清仅有1份OD450值低于cut-off值，敏感性为95.8％(23/24)；7份山羊细颈囊尾蚴阳性血清和7份绵羊脑多头蚴阳性血清分别有2份、1份OD450值高于cut-off值，24份健康山羊血清OD450值均低于cut-off值，特异性为78.5％(11/14)(见图4和图5)。
8、临床试验
用建立的间接ELISA方法分别对24份细粒棘球蚴病阴性绵羊血清和24分细粒棘球蚴病阳性绵羊血清进行检测，根据临界值判断该方法的可靠性。
用24份绵羊细粒棘球蚴病阳性血清和24份阴性血清对建立的间接ELISA方法进行临床检测(见图5)，结果显示23份绵羊细粒棘球蚴病阳性血清的OD450均大于临界值，24份阴性血清OD450均小于临界值，检测的符合率高达97.9％(47/48)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶在制备检测细粒棘球蚴病的免疫抗原和/或免疫检测试剂盒中的应用，所述免疫检测试剂盒为ELISA检测试剂盒或免疫印迹检测试剂盒，所述检测的样品为血清。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒包括细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶和ELISA检测试剂盒常规组分，所述ELISA检测试剂盒常规组分包括抗原包被液、酶标板、封闭液、HRP标记的二抗和TMB底物。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述封闭液为5％脱脂奶粉。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述HRP标记的二抗为HRP标记的山羊或绵羊抗兔二抗。
5.根据权利要求2-4任意一项所述应用，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒常规组分还包括显色反应终止液H2SO4、洗涤液PBST和稀释液PBS。
CN201610553289.9A 2016-07-14 2016-07-14 细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶的应用 Active CN106198978B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610553289.9A CN106198978B (zh) 2016-07-14 2016-07-14 细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610553289.9A CN106198978B (zh) 2016-07-14 2016-07-14 细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106198978A CN106198978A (zh) 2016-12-07
CN106198978B true CN106198978B (zh) 2018-04-17

Family

ID=57475171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610553289.9A Active CN106198978B (zh) 2016-07-14 2016-07-14 细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106198978B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108982849A (zh) * 2018-06-06 2018-12-11 四川农业大学 EG-TPx的应用以及用于诊断家畜细粒棘球蚴病的试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102168100A (zh) * 2011-02-14 2011-08-31 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 一种细粒棘球绦虫谷胱甘肽转移酶基因及其用途
CN202256339U (zh) * 2011-10-19 2012-05-30 中华人民共和国四川出入境检验检疫局 动物细粒棘球蚴病检测试剂盒
CN104101716A (zh) * 2014-07-22 2014-10-15 重庆澳龙生物制品有限公司 一种羊棘球蚴elisa抗体检测试剂盒
CN104651328A (zh) * 2014-12-31 2015-05-27 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 一种新的细粒棘球绦虫阳性抗原及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102168100A (zh) * 2011-02-14 2011-08-31 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 一种细粒棘球绦虫谷胱甘肽转移酶基因及其用途
CN202256339U (zh) * 2011-10-19 2012-05-30 中华人民共和国四川出入境检验检疫局 动物细粒棘球蚴病检测试剂盒
CN104101716A (zh) * 2014-07-22 2014-10-15 重庆澳龙生物制品有限公司 一种羊棘球蚴elisa抗体检测试剂盒
CN104651328A (zh) * 2014-12-31 2015-05-27 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 一种新的细粒棘球绦虫阳性抗原及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of excretory–secretory products from protoscoleces of Echinococcus granulosus and evaluation of their potential for immunodiagnosis of human cystic echinococcosis;D.CARMENA ET AL.;《Parasitology》;20040930;第129卷(第3期);摘要，372页右栏、373页右栏，表1 *
Proteomic characterization of larval and adult developmental stages in Echinococcus granulosus reveals novel insight into host–parasite interactions;Shu-Jian Cui et al.;《JOURNAL OF PROTEOMICS》;20130417;第84卷;参见表1，图3，170页右栏最后1段 *
细粒棘球绦虫基因型与抗原研究进展;王颖旺等;《中国动物传染病学报》;20100131;第18卷(第1期);79-86 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106198978A (zh) 2016-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106093435B (zh) 细粒棘球绦虫谷氧还蛋白‑1的应用
CN101833005B (zh) 一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的竞争elisa试剂盒
CN103756973B (zh) 一种草鱼呼肠孤病毒的间接elisa检测试剂盒
CN101825633B (zh) 用于检测非洲猪瘟病毒的竞争elisa试剂盒
CN103014047B (zh) 一种具有天然活性的重组人胱抑素c蛋白及其制备方法
CN101915835B (zh) 百合斑驳病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备方法
CN106066398A (zh) 一种a型产气荚膜梭菌毒素抗体的间接elisa检测方法
CN106018831B (zh) 脑多头蚴病的标志物gp50以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒
CN106198978B (zh) 细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶的应用
CN106811470A (zh) 一种犬松弛素原重组蛋白及犬松弛素原多克隆抗体的制备方法
CN109239351A (zh) 一种莲藕潜隐病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备与检测方法
CN103059117A (zh) 日本血吸虫重要抗原的高通量筛选及其在血吸虫病诊断中的应用
CN1928562B (zh) 一种检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒
Philpot Serological differences among the dermatophytes
CN106198979B (zh) 细粒棘球绦虫二氢叶酸还原酶的应用
CN103880953B (zh) 一种猪p21蛋白抗体及其制备方法与应用
CN101113455A (zh) 食线虫芽孢杆菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其应用
CN103319577B (zh) 一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原OppA
CN108251445A (zh) 一种gcrv ii s9及s10重组蛋白规模化的制备工艺及应用
CN106397546A (zh) 一种o型口蹄疫病毒人工重组抗原及其制备与应用
CN106046137B (zh) 一种鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋-2突变体EtMIC2-1130
CN110196337A (zh) 一种诊断脑多头蚴病的elisa试剂盒
CN103450358A (zh) 一种猪gapdh蛋白抗体及其制备方法与应用
CN106226529B (zh) 脑多头蚴病的标志物ldh以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒
Meirelles et al. Functional and antigenic properties of the major cysteine proteinase (GP57/51) of Trypanosoma cruzi

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant