CN101915835B

CN101915835B - 百合斑驳病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备方法

Info

Publication number: CN101915835B
Application number: CN 201010233082
Authority: CN
Inventors: 童勋章; 谢忠奎; 王亚军; 张玉宝; 安丽萍; 郭志鸿; 张亚娟
Original assignee: Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute of CAS
Current assignee: Northwest Institute of Eco Environment and Resources of CAS
Priority date: 2010-07-22
Filing date: 2010-07-22
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2030-07-22
Also published as: CN101915835A

Abstract

一种百合斑驳病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备方法，检测试剂盒包括：96微孔ELISA板，酶标抗体，缓冲液，显色液，终止液，其中96孔板上包被有LMoV特异的多克隆抗体，酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的LMoV特异多克隆抗体。本发明采用的免疫原为基因工程表达的LMoV外壳蛋白和细胞质内含体蛋白的融合重组抗原。由此免疫产生的抗体建立的双抗夹心酶联免疫吸附法用于检测百合叶片标本，与其他检测方法相比，检测灵敏度高，可以检出ng级别的病毒抗原，并且准确性强，试剂盒的制备方法简便快捷，经济实用。

Description

百合斑驳病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于植物病毒检测的生物技术产品，具体涉及一种可用于对百合斑驳病毒病进行快速灵敏检测的百合斑驳病毒(LMoV)双抗体夹心酶联免疫(DAS-ELISA)检测试剂盒，本发明还涉及该试剂盒的制备方法。

背景技术

百合(Lilium spp.)传统上是药用和食用植物，现已成为国际上重要切花观赏花卉之一。荷兰是世界最大的百合种球生产国，2005年荷兰百合种球生产面积达3800hm²，约占世界切花百合生产总面积的72％。切花百合在我国花卉产业产值中占第四位，同时百合作为食品和药材，也是一种重要的经济作物。随着百合种植面积日益扩大，高密度种植和长期无性繁殖使病毒不断积累，病毒病对百合的危害日趋严重，影响了百合的产量和品质，给百合种植业造成巨大的经济损失。而百合的抗病毒品种极少，加上引种频繁，鲜花进出口频率高，加速了病毒的传播。据报道，现已知百合病毒病原有14种，类菌原体1种，其中为害严重的病毒有4种，即百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、百合斑驳病毒(Lily mottlevirus，LMoV)和百合病毒X(Lily virus X，LVX)，其他各种病毒均为局部地区发生，百合病毒常复合侵染，不同病毒在百合上表现相似症状，同种病毒在不同条件下的症状有很大变异。

LMoV可在世界范围内广泛分布，特别是在适合其寄主生长的所有温带地区及蚜虫媒介丰富的地区尤为普遍。侵染百合科植物常造成严重的叶片斑驳症状、植株形态异常和球茎减小。百合斑驳病毒属于马铃薯Y病毒科、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。病毒粒子呈弯曲线状且呈螺旋对称，大小(650～900)nm×(11～15)nm。病毒基因组为单分子正链RNA，约9.4kb，5’端缺少帽子结构，连接一个VPg蛋白，3’端带有Poly(A)尾。基因组包含一个长ORF，编码相对分子质量约340kDa的多聚蛋白，并通过病毒编码的蛋白酶，即P1、HC-Pro和NIa切割形成十个不同大小的病毒蛋白。其中CP是外壳蛋白，分子量为30kDa，它一方面负责组装病毒粒子包裹病毒RNA，另一方面参与蚜虫介导的病毒传播，而且靠近外壳蛋白的N端的氨基酸序列决定蚜虫的传播能力；CI是细胞质内含体蛋白，在病理组织细胞质内形成电镜下特征明显的风轮状结构，可能与病毒的胞间运动有关。

要减少病毒病在百合种植业中的损失，最便捷的方法是采用脱毒培养。国内现在大量采用脱毒培养技术，但依然存在不少问题，其中之一就是是缺少方便快捷、准确可靠的病毒检测方法。

目前国内外对百合斑驳病毒的主要检测手段有指示植物检测、电镜检测、分子生物学检测和免疫学检测等。其中指示植物检测为较为传统的检测方法，测试条件受外界环境变化影响会出现不同的检测结果，检测周期也很长，操作十分复杂，检测结果不准确。

电镜检测灵敏度不高，需要大量病毒样本，检测过程复杂，并且检测结果受主观影响较大。由于电子显微镜代价昂贵，对大多数检测来说不具备条件。

分子生物学检测方法操作较为简单，通过病毒特异性引物进行RT-PCR检测，所需检测时间较短。但由于该病毒是单链正链RNA病毒，制备用于检测的样本模板较为复杂，对检测实验条件要求很高，且需要PCR仪等贵重仪器，检测试剂昂贵。需要有相当经验的操作者才能获得较为可靠的结果。

免疫学检测方法基于病原的一种或多种蛋白质与动物针对抗原产生的抗体间的相互作用。在植物病毒检测中其优势在于：①反应特异；②反应迅速；③一定范围内可定量化；④灵敏；⑤抗血清可长期储存；⑥适合批量检测、操作难度低、检测费用低。因此适合作为大规模商业检测方法推广。

目前国内外尚无商品化的LMoV免疫检测试剂盒，著名植物病毒试剂盒检测公司Agdia也仅有马铃薯Y病毒属通用免疫试纸条实现了商品化，而没有专一检测LMoV的试剂盒，另外国外植物病毒诊断试剂价格昂贵，如Agdia公司试剂盒多在人民币1500～4000元之间，很难满足国内花卉及食用百合的脱毒检测需求。因此建立灵敏、稳定、高通量和易操作的百合斑驳病毒检测方法及试剂盒，是生产百合脱毒株的基础，是提高花卉百合品质和食用药用百合产量和质量的前提。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种准确高效、经济简便、易于推广使用的双抗体夹心酶联免疫检测方法及试剂盒，以及该试剂盒的制备方法。

本发明的技术问题通过下述技术方案解决：

构建一种LMoV双抗夹心法检测试剂盒，由96孔多克隆抗体包被板、辣根过氧化物酶标记多克隆抗体、LMoV重组融合蛋白PI200标准品、质控品及底物反应液等辅助试剂组成。

本发明试剂盒的制作方法包括标准品的制备、多克隆抗体包被板的制备、酶标多克隆抗体的制备、质控品的制备以及辅助试剂的制备。

本发明中LMoV重组融合蛋白PI200标准品的制备，以感染LMoV的百合叶片的总RNA为模板，使用两对引物CP-F/CP-R，CI200-F/CI200-R分别扩增LMoV的CP基因及CI200(CI基因C端600bp)片段。通过酶切共同克隆入pET-28a载体，并且中间以(Gly)₅作为柔性连接来构建表达质粒。重组质粒转化入大肠杆菌工程菌BL21，37℃培养，IPTG诱导表达，镍柱亲和层析纯化得到大小56.5kDa的融合蛋白PI200。

所述融合蛋白PI200的氨基酸序列为：

MGANETLNAGASSSTQASRSTRPEAAIDVAPQQSSEARVRDRDVDAGTVGTYQIPRLKALATKINVPKVKGRMIVNTGHLVNYNPDQTDISNTRSTQKQFETWYNAVKDEYGLNDESMALAMNGLMVWCIENGTSPNVNGVWLMMDGDQQVEFPLRPILEHAKPTLRQIMAHF SNLAEAYIEKQNLEKPYMPRYGLQRNLTDFNLARFAFDFYEVTSRTPARAKEAHFQMKTAALRGKQSKLFGLDGKVNTQDEDTERHTADDVNKNMHSLLGISMGGGGGASTMHPEVHRILTPYKLRDSEIILNKVAIPNKGLMQWPTAKEYAYQGFKMNIPDTVRLPFHSLDIPERLHERMWQIVETHKGDAGFGRITTASACKIAYTLKTDAASIQRTIHILDKLIENELKKQEYFRNITSASCSSSSFSLTTITNAIRARHIKDHTVENVSVLQAAKAQILEFKNVTFDLDHVNRMTEYGALECVQFQGNS S SVDKLAAALEHHHHHH。

所述重组蛋白PI200扩增外壳蛋白CP基因的引物设计为：

上游引物：5’-CCATGGGCGCAAATGAGACACTCAATGC-3’

Nco I

下游引物：

5’-GAATTCCCGCTAGCTCCACCTCCTCCACCCATAGAAATTCCAAGT

AAGGAGT-3’

EcoR I Nhe I (Gly)₅-Linker。

所述重组蛋白PI200扩增细胞质内含体CI基因C端600bp的引物设计为：

上游引物：5’-GCTAGCACTATGCACCCAGAGGTACA-3′

eI

下游引物：5’-GAATTCCCCTGAAATTGGACACACTCC

EcoRI

本发明中的多克隆抗体包被板，可用纯化的融合重组蛋白PI200免疫兔获得的多克隆包被酶标板制作。本发明试剂盒采用的酶标板为一种进口96孔酶标板(BIO BASIC公司)。制备步骤如下：

1)用1mg/mL的PI200融合蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔。初次免疫中，将蛋白抗原与弗氏完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射。两周后进行加强免疫，将蛋白抗原与弗氏不完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射。以后每两周加强免疫一次，在第4次加强免疫后的5～7天颈动脉采血，加入质量百分比浓度0.02％的叠氮钠，-20℃保存。所得抗血清依次通过20％、50％、33％三个饱和度的硫酸铵沉淀粗提后，透析至pH7.8的磷酸缓冲液，然后使用DE52阴离子交换柱层析法纯化。

2)将纯化的兔抗多克隆抗体用pH9.6、50mM碳酸盐缓冲液稀释为终浓度1μg/mL，加入酶标板各孔，每孔100μL，37℃孵育2小时。用洗涤缓冲液PBST冲洗酶标板，再用封闭液(含2％明胶、0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)封闭。甩干后晾干，即获得多克隆抗体包被板。

本发明提供了多克隆抗体的辣根过氧化物酶标记方法。辣根过氧化物酶(HRP)与多抗的标记比例为摩尔分子比1∶1。标记的步骤如下：

1)取HRP溶于蒸馏水，加入新配制的NaIO₄水溶液，混匀避光置4℃30min；

2)加入乙二醇水溶液0.5mL，室温避光放置30min；

3)加入含纯化抗体的水溶液，混匀并装入透析袋，对0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液透析6h；

4)加入NaBH₄水溶液，混匀，避光置4℃2h；

5)在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30min，离心，去上清，沉淀以少许pH7.4、0.02M PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜；

6)离心留上清，即酶-抗体结合物，加入等体积优质甘油，分装低温保存。

本发明试剂盒中的辅助试剂包括洗涤缓冲液、提取缓冲液、酶缓冲液、显色剂、反应终止液。一种配制辅助试剂的方法如下：

1)提取缓冲液为含0.87％硫酸钾、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、0.05％吐温-20、0.1％巯基乙醇、0.58％氯化钠、0.2％牛血清白蛋白、0.2‰叠氮钠的pH7.4的Tris盐酸缓冲液；

2)酶缓冲液为用蒸馏水配制的其内含1％聚乙二醇4000、0.5％牛血清白蛋白、0.1‰硫柳汞钠、0.5‰吐温-20的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；

3)洗涤缓冲液为含0.5‰吐温-20、pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBST)；

4)显色剂A为含1.46％磷酸氢二钠，0.93％柠檬酸，0.045％过氧化氢的水溶液。

5)显色剂B为含0.03％四甲基联苯胺，0.096％柠檬酸，0.019％乙二胺四乙二酸钠盐，2％DMSO，4％甘油的水溶液。

6)终止液为蒸馏水配制的2M H₂SO₄；

本发明试剂盒中的阳性质控品的制备，先选择百合斑驳病毒PCR阳性的百合叶片，用提取缓冲液研磨后离心留取上清即为阳性质控品。阴性质控品的制备，先选择百合斑驳病毒PCR阴性的百合叶片，用提取缓冲液研磨后离心留取上清即为阴性质控品。

本发明提供了双抗体夹心酶联免疫吸附法的检测步骤：用提取缓冲液研磨待测百合叶片样品，离心留取上清，以100μL/孔加入多克隆抗体包被板中，37℃温育30min；然后与浓度为1μg/meL的酶标抗体于37℃温育2h；显色液A、B等体积混匀后，以100μL/孔加入，37℃温育15min；加入终止液50μL/孔，置酶标仪上450nm出测量各孔OD值，根据待测样本(P)及阴性质控品(N)的A_450nm值，如果比值P/N≥2.1，则判定为阳性。

采用上述方案后，本发明组成了包含盒体、酶标板、盒内各种用液的双抗体夹心法酶联免疫检测试剂盒。应用本试剂盒进行病毒检测时采用双抗体夹心酶联免疫吸附方法，能同时检测到样本中百合斑驳病毒的外壳蛋白和细胞质内含体蛋白。应用在诊断百合属(Lilium Spp.)植物是否感染百合斑驳病毒的分析中，待测样本提取自叶片组织。

采用这种基于免疫学方法的试剂盒试进行检测具有如下优点：

①试剂盒使用基因工程表达的高纯度的重组抗原作为免疫原，能同时检测样本中纳克级水平的百合斑驳病毒抗原，灵敏度高，特异性好。

②操作简单，普通工作人员经过简单培训就可以完成。

③经济实用，对仪器要求较低，仅需要普通恒温水浴箱、酶标仪等。如只需定性检测，则可直接通过目测获得检测结果，连酶标仪都不需要。

正是基于以上优点，本发明适于作为大规模商业检测方法推广，具有良好的市场前景。

附图说明

图1 PI200蛋白的表达鉴定与纯化电泳图；

图2 LMoV病毒抗原检测试剂盒检测PI200的标准曲线图。

图中：1，蛋白Marker；2，转化pET-28a的BL21菌全菌蛋白；3，转化PI200表达质粒的BL21菌全菌蛋白；4～5，纯化的PI200蛋白。

横坐标为不同稀释度的标准品PI200蛋白，纵坐标为相应的A_450nm值

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步详细说明：

实施例1

1、LMoV重组融合蛋白PI200的制备方法：

1)Trizol法提取百合病株叶片总RNA：

A.称取百合病株叶片40mg，放入研钵中，在液氮中迅速研磨为粉末。待液氮挥发后加入Trizol(Invitrogen公司)1mL，并移入1.5mL离心管中，室温静置5分钟。

B.加入200μL氯仿，上下颠倒混匀数次，室温放置2～3分钟。4℃，12,000g离心10min。

C.取上层水相，加入500μL异丙醇，混匀于-20℃静置20min，4℃，12,000g离心10min。

D.弃去上清，沉淀用1mL 75％乙醇洗涤，4℃，7,500g离心5min。

E.风干沉淀，用20～40μL RNase-Free水溶解。-70℃保存备用。

2)引物设计：

根据已报道的LMoV序列(Genbank序列号AJ564636)，利用Oligo软件设计2对特异性引物分别扩增CP与CI200(即CI基因C端600bp)序列。为便于通过酶切构建CP与CI200融合的重组质粒，CP的5’端引入NcoI位点，3’端引入(Gly)₅-Linker、NheI、EcoRI位点。CI200的5’端引入NheI，3’端引入EcoRI位点。引物序列见下表：

3)RT-PCR扩增：

以提取总RNA为模版，参照Promega通用RibocloneR M-MLV(H-)cDNA合成系统说明书合成cDNA。再以cDNA为模板，rTaq DNA聚合酶分别扩增CP基因和CI200序列。扩增的循环参数：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec、53.5℃复性30sec、72℃延伸55sec，22个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1.5％琼脂糖胶电泳检测，并用胶回收试剂盒(U-gene公司)回收纯化。

4)重组质粒构建：

回收纯化的PCR产物CP和CI200分别连接pUCm-T，转化DH5α感受态细胞，经酶切鉴定获得重组质粒pUCm-T-CP和pUCm-T-CI200。用NcoI和EcoR I酶切pUCm-T-CP并回收CP片段，连入相同酶切处理的pET-28a(+)载体，转化DH5α感受态细胞，酶切鉴定获得重组质粒pET-28a-CP。用NheI和EcoR I从pUCm-T-CI200切下CI200片段，将其连接到重组质粒pET-28a-CP的相应位点，最终构建了pET-28a-CP-CI200重组质粒。

5)重组质粒转化大肠杆菌BL21，37℃摇床培养至0D1.2，用1mM IPTG于20℃诱导16小时。然后离心收集菌体，超声破碎后，离心收集沉淀。

6)沉淀用含5mM咪唑、8M尿素的PBS重悬，离心留上清为粗纯样品，按GE Healthcare公司的HisTrap柱操作说明书进行纯化。优化后的条件为：

A.1mL纯化柱用20mL柱平衡液(含5mM咪唑、8M尿素的PBS)平衡，控制流速1mL/s；

B.粗纯样品进样6mL，控制进样流速0.5mL/s；

C.用20mL含10mM咪唑、8M尿素的PBS洗脱液洗脱，控制流速1mL/s；

D.用含300mM咪唑、8M尿素的PBS洗脱，控制流速1mL/s，收集洗脱峰2～4mL。

7)将收集到的洗脱峰装入透析袋中，作尿素浓度梯度复性，依次对含4M尿素、2M尿素、1M尿素、0.5M尿素、0M尿素的PBS透析。离心留上清，即得到复性后的纯化的重组抗原PI200，12％SDS-PAGE胶鉴定纯度后(图1)，分装-20℃保存备用。

2、LMoV多克隆抗体制备

1)准备2～2.5kg雄性新西兰大白兔1只，将-20℃保存的1mg/mL PI200病毒重组抗原溶液与等体积福氏完全佐剂(石蜡油∶羊膜脂＝7∶1，另外加1mg/mL灭活的结核分枝杆菌成分)混合，充分乳化，经皮下多点注射做初次免疫，每点0.2mL。每只家兔免疫剂量为PI200病毒重组抗原1mg。

2)二周后，将-20℃保存的1mg/mL PI200病毒重组抗原溶液与等体积福氏不完全佐剂(石蜡油∶羊膜脂＝7∶1)混合，充分乳化，经皮下多点注射做第一次加强免疫，每点0.2mL。每只家兔免疫剂量为PI200病毒重组抗原1mg。

3)第一次加强免疫后2周，进行第二次加强免疫，剂量途径同第一次。每隔2周，重复该步骤一次至抗血清效价符合要求。

4)抗血清效价检测：第三次免疫之后10天，自免疫家兔耳缘静脉各采血200μL至无菌微量离心管中，于37℃静置2小时，然后4℃过夜。次日10,000g离心2分钟，分离血清。经免疫双扩散法检测抗体效价至1∶64以上，或使用间接ELISA法检测抗体效价至1∶20000以上，即可采血。

5)采血：于最后一次免疫后第7天，对试验动物禁食一天。家兔采用颈动脉放血法采血。

6)抗血清的分离：采集到的血样，置灭菌血清分离瓶中，37℃静置2小时，4℃静置过夜。次日用灭菌毛细管小心收集析出血清，剩余样品于3000g离心5分钟，继续收集分离出的血清。收集到的血清加入0.02％浓度的叠氮钠保存于-20℃。

7)多克隆抗体IgG的粗纯：

A.取抗血清20mL，加入等量体积PBS，冰水浴轻轻搅拌，缓慢逐滴加入4℃预冷的饱和硫酸铵10mL，使饱和度为20％，于4℃静置2小时以上或过夜。于4℃、12,000rpm离心10min，留取上清。

B.上清继续滴加30mL饱和硫酸铵，使饱和度为50％，于4℃静置2小时以上。重复上述离心步骤，弃去上清。

C.沉淀继续用20mL PBS溶解沉淀，滴加入10mL饱和硫酸铵，使饱和度为33％，4℃静置2小时。重复上述离心步骤。弃去上清，沉淀用12mL PBS溶解，4℃下对PBS透析除去残余硫酸铵，即得到初纯多克隆抗体。于-20℃保存备用。

D.取5mL初纯多抗，预先于4℃透析至pH7.8、0.02M磷酸缓冲液中。

E.准备一个1.6cm×30cm的层析柱，用经过处理的阴离子交换剂DE52(Whatman生产)50mL装柱，室温下以3倍柱床体积的pH7.8、0.02M磷酸缓冲液平衡。

F.吸去柱床表面液体，沿柱壁小心加入将预先透析的样品。打开出水口，使样品缓慢进入柱床内，并用少量洗脱液清洗柱壁，待液体进入柱床内后，以同样的平衡缓冲液洗脱，控制流速在1mL/min。检测0D280，待有吸收峰出现时收集，即为纯化的IgG。

3、多克隆抗体的辣根过氧化物酶标记

1)取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06M NaIO₄水溶液0.5mL，混匀，避光，置4℃30min；

2)加入0.16M乙二醇水溶液0.5mL，室温避光放置30min；

3)加入含20mg纯化抗体IgG的水溶液1mL，混匀，并装入透析袋，对pH9.5、0.05M碳酸盐缓冲液透析6h；

4)加入5mg/mL NaBH₄溶液0.2mL，混匀，避光置4℃2h；

5)在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30min，离心，去上清，沉淀以少许0.02M pH7.4PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜；

6)离心去除沉淀物，留取上清，即酶-抗体结合物，加pH 7.4、0.02M PBS至5mL，再加入等体积优质甘油至终浓度50％，混匀后分装于-20℃保存。

4、百合斑驳病毒的双抗体夹心检测方法

1)各种试剂溶液的配制：

A.包被液为pH9.6、50mM碳酸缓冲液(CB)；

B.封闭液为含2％明胶，0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；

C.提取缓冲液为含0.87％硫酸钾、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、0.05％吐温-20、0.1％巯基乙醇、0.58％氯化钠、0.2％牛血清白蛋白、0.2‰叠氮钠的pH7.4的Tris盐酸缓冲液；

D.酶缓冲液缓为用蒸馏水配制的其内含1％聚乙二醇4000、0.5％牛血清白蛋白、0.1‰硫柳汞钠、0.5‰吐温-20的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；

E.洗涤缓冲液为含0.5‰吐温-20、pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBST)；

F.显色剂A为含1.46％磷酸氢二钠，0.93％柠檬酸，0.045％过氧化氢的水溶液。

G.显色剂B为含0.03％四甲基联苯胺，0.096％柠檬酸，0.019％乙二胺四乙二酸钠盐，2％DMSO，4％甘油的水溶液。

H.终止液为蒸馏水配制的2M H₂S0₄；

I.阳性质控品为提取缓冲液研磨感染百合斑驳病毒的百合病株叶片制备的溶液；

J.阴性质控品为提取缓冲液研磨健康百合叶片制备的溶液。

2)样品处理：将百合新鲜叶片组织0.4g，加入2mL样品提取液在研钵中匀浆，至微量离心管中10，000g离心10分钟，保留上清液。

3)双抗夹心法检测的具体实施步骤如下：

A.包被：用CB缓冲液将兔抗多克隆抗体稀释成终浓度1μg/mL，100μL/孔包被于BioBasic公司生产的96孔酶标板上，37℃温育2小时，4℃过夜。PBST冲洗3次，甩干。

B.封闭：以封闭液200μL/孔封闭，37℃温育2小时。

C.加样：甩去封闭液，以100μL/孔待测样品加入封闭后的多抗板条孔中，同时设空白(样品提取液)100μL、阴性对照100μL、阳性对照100μL，37℃温育30分钟。PBST冲洗5次，甩干。

D.加酶标抗体：用酶缓冲液将酶标抗体稀释成终浓度0.7μg/mL的酶工作液，每孔加入100μL，37℃温育30分钟。PBST冲洗5次，甩干。

E.显色：每孔先后加入显色剂A、B各1滴，37℃避光温育15分钟。

F.终止：每孔加入1滴终止液。

G.检测：于Thermo MultiSkan酶标仪上双波长检测450nm/620nm吸收值。

4)为检测双抗夹心酶联免疫(DAS-ELISA)检测试剂盒的效果，用该试剂盒检测了60份百合叶片样品。同时用实施例1中的引物对CP-F/CP-R做了RT-PCR确定性诊断。检测结果如下：

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。

45份由RT-PCR检测阳性的样品，DAS-ELISA试剂盒检出42份阳性，3份阴性；

15份由RT-PCR检测阴性的样品，DAS-ELISA试剂盒检出1份阳性，14份阴性。

用SPSS软件对两种方法的做X²检验(McNemar Test)，P＞0.05，表明两种方法没有显著差别，同时初步得出本试剂盒的灵敏度为93.3％，特异性为93.3％。

5、双抗夹心法检测质量体系的建立

1)双抗夹心法检测百合斑驳病毒抗原PI200标准曲线的确定

将基因工程合成的PI200抗原用样品提取液分别稀释至150ng/mL、75ng/mL、37.5ng/mL、18.75ng/mL、9.37ng/mL、4.69ng/mL、2.35ng/mL、1.17ng/mL、0.58ng/mL 10个梯度浓度，并以样品提取液作为0.0ng/mL。每份不同浓度的标准品设4个平行孔。

按实施例5中介绍的方法测定A_450nm值。以标准抗原(ng/mL)为横坐标，相应A₄₅₀nm值为纵坐标制作标准曲线(附图2)。分析曲线发现，得到的标准拟合线性方程为：y＝0.0078x+0.1046，并且相关系数r＝0.9968，大于定义的0.99。因此当浓度在0.58ng/mL～150ng/mL时，有较好的线性关系。

2)样品检出限的确定

以样品提取液作为空白0.0ng/mL，测定15个空白孔，计算平均A₄₅₀nm吸光值及标准差(s)。以代入标准曲线计算对应的PI200浓度，得检出下限为0.13ng/mL。因此线性测定范围在0.13ng/mL～150ng/mL。

Claims

1.一种百合斑驳病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，包括辅助试剂：底物反应液、洗涤缓冲液、提取缓冲液、酶缓冲液、显色剂及反应终止液，其特征在于还包括用纯化的融合重组蛋白PI200免疫兔获得的百合斑驳病毒的特异性多克隆抗体包被的96孔板、相应的纯化的融合重组蛋白PI200免疫兔获得的百合斑驳病毒的特异性酶标多克隆抗体、百合斑驳病毒重组蛋白标准品PI200、质控品；所述百合斑驳病毒重组蛋白标准品PI200的氨基酸序列为：

MGANETLNAGASSSTQASRSTRPEAAIDVAPQQSSEARVRDRDVDAGTVGTYQIPRLKAL ATKINVPKVKGRMIVNTGHLVNYNPDQTDISNTRSTQKQFETWYNAVKDEYGLNDESMA LAMNGLMVWCIENGTSPNVNGVWLMMDGDQQVEFPLRPILEHAKPTLRQIMAHFSNLA EAYIEKQNLEKPYMPRYGLQRNLTDFNLARFAFDFYEVTSRTPARAKEAHFQMKTAALRG KQSKLFGLDGKVNTQDEDTERHTADDVNKNMHSLLGISMGGGGGASTMHPEVHRILTPY KLRDSEIILNKVAIPNKGLMQWPTAKEYAYQGFKMNIPDTVRLPFHSLDIPERLHERMWQI VETHKGDAGFGRITTASACKIAYTLKTDAASIQRTIHILDKLIENELKKQEYFRNITSASCSS SSFSLTTITNAIRARHIKDHTVENVSVLQAAKAQILEFKNVTFDLDHVNRMTEYGALECV QFQGNSSSVDKLAAALEHHHHHH。

2.一种如权利要求1所述检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括标准品PI200的制备、纯化的融合重组蛋白PI200免疫兔获得的百合斑驳病毒的特异性多克隆抗体的制备、相应的纯化的融合重组蛋白PI200免疫兔获得的百合斑驳病毒的特异性酶标多克隆抗体的制备、质控品的制备以及辅助试剂的制备，其中，百合斑驳病毒LMoV重组融合蛋白PI200标准品的制备，以感染百合斑驳病毒百合叶片的总RNA为模板合成cDNA，再以cDNA为模板，使用两对特异性引物CP-F/CP-R，CI200-F/CI200-R分别扩增该病毒外壳蛋白基因及细胞内含体CI基因C端600bp，中间以(Gly)₅作为柔性连接，共同克隆入pET-28a载体得到重组质粒，表达得到大小56.5kDa的融合蛋白PI200；两对引物的碱基序列分别如下：

CP-F：CCATGGGCGCAAATGAGACACTCAATGC

CP-R：GAATTCCCGCTAGCTCCACCTCCTCCACCCATAGAAATTCCAAGTAAGGAGT

CI200-F：GCTAGCACTATGCACCCAGAGGTACA

CI200-R：GAATTCCCCTGAAATTGGACACACTCC。