CN104122391B - 一种百合隐症病毒和百合斑驳病毒复合胶体金免疫层析检测试剂卡及制备方法 - Google Patents

一种百合隐症病毒和百合斑驳病毒复合胶体金免疫层析检测试剂卡及制备方法 Download PDF

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Abstract

一种百合隐症病毒和百合斑驳病毒复合胶体金免疫层析检测试剂卡及制备方法，该试剂卡包括试剂卡槽、衬板、样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，其中胶体金结合垫上含有复合金标探针，衬板固定于试剂卡槽中，样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次排列连接于衬板上表面，硝酸纤维素膜上设有2条检测线和1条对照线，2条检测线上分别包被的是兔抗LSV和LMoV多克隆抗体，对照线上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体；该LSV和LMoV复合胶体金免疫层析检测试剂卡的制备方法主要是将兔抗LSV和LMoV多克隆抗体分别包被于免疫层析膜上，同时用其制成复合胶体金结合垫；该试剂卡可同时检测LSV和LMoV，且准确率高、特异性强，无需特殊的设备和仪器。

Description

一种百合隐症病毒和百合斑驳病毒复合胶体金免疫层析检测试剂卡及制备方法
技术领域
本发明涉及一种检测试剂卡及制备方法，具体的是一种用复合胶体金免疫层析法快速检测百合隐症病毒(LSV)和百合斑驳病毒(LMoV)的试剂卡及其制备方法。
背景技术
百合(Liliumspp)是世界著名的球根花卉，栽培历史悠久，集观赏、食用和药用于一体。荷兰作为世界上最大的花卉种植大国，截止2005年，其百合种球种植面积达3800hm2，占全球总面积的72％，每年生产22.1亿个百合种球，其中约1.0亿个出口到中国。而在中国，食用和药用百合产业发展较好，主要产区在甘肃、湖南和湖北。对于切花百合，我国上世纪80年代末就开始了切花生产，但由于百合种球繁育技术以及病毒检测等技术的落后，导致自繁种球增重慢，种球小而不充实，感病严重，出苗不整齐，使得我国自繁种球一直难以实现商业化生产，生产中使用的90％以上的种球依赖进口，耗资巨大。更重要的是进口种球价格高，病毒病却没有保障，导致我国百合切花生产成本居高不下而切花质量却参差不齐，严重影响了我国切花百合产业的健康、高效发展。
目前文献报道侵染百合的病毒有20多种，其中百合隐症病毒(Lilysymptomlessvirus，LSV)和百合斑驳病毒(Lilymottlevirus，LMoV)是发生最普遍、危害最严重的两种病毒，其他病毒均为局部地区发生。百合病毒大多是以复合侵染的形式存在，导致比单一侵染更加严重的症状。通常感病植株矮化严重，叶片和茎杆畸形生长，鳞茎变小，产量下降，严重时减产60％以上，品种变劣，种质明显退化，给百合种植业造成严重的经济损失。我国百合产区病毒病发生范围广、为害严重，云南、甘肃、江苏等百合产区病毒病的自然发病率一般在20％～30％，有的达70％以上，严重者可高达100％。病毒病已成为危害百合生产的主要病害，也是限制我国百合生产和切花出口的重要原因之一。
目前与百合病毒相关的研究主要集中在病毒脱除和病毒检测上，病毒检测研究虽然有电子显微镜技术、酶联免疫法(ELISA)以及分子生物学技术(RT-PCR和基因芯片技术)等的相关报道，但都还停留在研究和实验室阶段，无法满足百合种植现场及田间快速检测的需求，从而无法掌握百合病毒感染的准确信息。此外，包括ELISA和RT-PCR等方法在内的传统实验室检测方法都存在程序复杂，检测费用高、对仪器设备和检测条件要求高，需要长期经验积累和具有专业操作技能的人员才能完成等实际问题，因此使用范围受到很大的局限性。
胶体金免疫层析是以硝酸纤维素膜为载体，通过液体的渗移，利用抗原抗体的结合，以及胶体金呈现颜色反应来检测抗原或抗体。该方法可以避免以上几种检测方法的缺点，以其特异性强、成本低、操作简便、不需任何仪器、适合现场快速检测等优点已被广泛接受，已用于多种植物病毒的检测等，包括马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草斑驳病毒、南瓜花叶病毒等。更重要的是，该方法可以一次加样、同时检测两种甚至多种病毒，是ELISA等传统方法无法做到的。作为一种快速筛查的手段，既可节省检测成本，又可用于广大基层单位开展百合病毒的检测和防控工作中，具有重要的经济价值和社会价值。但是至今国内外还没有用胶体金免疫层析法同时检测LSV和LMoV的相关报道，LSV和LMoV复合胶体金免疫层析检测试剂卡更是无人研制，很难满足国内观赏及食用百合的病毒检测需求。因此建立科学、快速、灵敏、稳定、易操作的可同时检测LSV和LMoV的检测方法及试剂卡，是生产百合脱毒株的基础，是提高百合产量和品质的前提。
发明内容
本发明的目的是提供一种用胶体金免疫层析法快速检测LSV和LMoV的试剂卡及其制备方法。本发明试剂卡检测快速，检测准确率高、特异性强，携带方便，操作简便，检测重复性好，无需任何仪器和设备。
本发明的技术方案为：
一种百合隐症病毒和百合斑驳病毒复合胶体金免疫层析检测试剂卡，包括：试剂卡槽(1)，衬板(11)，样品垫(7)，胶体金结合垫(8)，硝酸纤维素膜(9)，吸水滤纸(10)，试剂卡槽(1)包括上壳体和下壳体，上壳体和下壳体通过卡扣连接，上壳体设有第一孔洞(2)和第二孔洞(3)，样品垫(7)置于第一孔洞(2)下方，硝酸纤维素膜(9)置于第二孔洞(3)下方，胶体金结合垫(8)上含有复合金标探针，衬板(11)固定于试剂卡槽(1)中，样品垫(7)、胶体金结合垫(8)、硝酸纤维素膜(9)和吸水滤纸(10)依次排列连接于衬板(11)上表面，硝酸纤维素膜(9)上设有检测线(4)、(5)和对照线(6)，检测线(4)上包被的是兔抗LSV多克隆抗体，检测线(5)上包被的是兔抗LMoV多克隆抗体，对照线(6)上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，兔抗LSV多克隆抗体合适包被量为2.0～2.5μg蛋白，兔抗LMoV多克隆抗体合适包被量为1.5～2.0μg蛋白，LSV和LMoV金标探针合适抗体标记量均为18μg／mL，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5～3.0μg蛋白。
其中在用所述试剂卡检测时，在所述第一孔洞(2)处加入少量百合样品的待检溶液，对比检测线(4)、(5)和对照线(6)的颜色，即可判定被检测百合是否感染了百合隐症病毒和百合斑驳病毒。
其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞(2)处5～10分钟后，若待检溶液中仅含有LSV，检测样品经过所述复合胶体金结合垫时，LSV与复合金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述检测线(4)和(5)方向渗移，当接触到所述检测线(4)时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当接触到所述检测线(5)时不发生反应，复合金标多克隆抗体继续向所述对照线(6)方向渗移，当接触到所述对照线(6)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当检测线(5)没有颜色变化而检测线(4)和对照线(6)出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒。
其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞(2)处5～10分钟后，若待检溶液中仅含有LMoV，检测样品经过所述复合胶体金结合垫时，LMoV与复合金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述检测线(4)和(5)方向渗移，当接触到所述检测线(4)时不发生反应，当接触到所述检测线(5)时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与检测线(5)结合的复合物继续向所述对照线(6)方向渗移，当接触到所述对照线(6)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当检测线(4)没有颜色变化而检测线(5)和对照线(6)出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合斑驳病毒。
其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞(2)处5～10分钟后，若待检溶液中同时含有LSV和LMoV，检测样品经过所述复合胶体金结合垫时，LSV和LMoV与复合金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述检测线(4)和(5)方向渗移，当接触到所述检测线(4)和(5)时分别发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与检测线(4)和(5)结合的复合物继续向所述对照线(6)方向渗移，当接触到所述对照线(6)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当检测线(4)、(5)以及对照线(6)均出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒和百合斑驳病毒。
其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞(2)处5～10分钟后，若待检溶液中不含LSV和LMoV，检测样品经过所述复合胶体金结合垫时，则不能与复合金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述检测线(4)和(5)时不发生反应，复合金标多克隆抗体继续向所述对照线(6)方向渗移，当接触到所述对照线(6)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当检测线(4)和(5)没有颜色变化而仅对照线(6)出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染百合隐症病毒和百合斑驳病毒。
一种百合隐症病毒和百合斑驳病毒复合胶体金免疫层析检测试剂卡的制备方法，按以下步骤进行：1、兔抗LSV和LMoV多克隆抗体的制备：分别从感染了LSV和LMoV的百合叶片中提取总RNA进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，扩增LSV和LMoV的CP基因片段。通过酶切克隆至pET-28a载体。重组质粒转化入大肠杆菌BL21，37℃培养，IPTG诱导表达，镍柱亲和层析纯化分别获得大小为32.0、30.0kDa的LSVCP和LMoVCP基因工程融合蛋白。分别用1mg／mL的LSVCP和LMoVCP基因工程融合蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔，获得抗血清。所得抗血清依次通过20％、50％、33％三个饱和度的硫酸铵沉淀粗提后，透析至pH7.8的磷酸缓冲液，然后使用DE52阴离子交换柱进行纯化分别获得兔抗LSV和LMoV多克隆抗体IgG；2、胶体金标记兔抗LSV和LMoV多克隆抗体的方法：分别取半径为30nm的胶体金10mL、兔抗LSV和LMoV多克隆抗体各180μg，在PH7.5的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，且使得终浓度为1％，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为复合胶体金-抗体结合物；3、复合胶体金结合垫的制备：用1／10标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮复合胶体金-抗体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37℃烘干，制成复合胶体金结合垫；4、免疫层析膜的包被：检测线(4)上包被的是兔抗LSV多克隆抗体，检测线(5)上包被的是兔抗LMoV多克隆抗体，对照线(6)上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体；5、复合试剂卡的组装：将聚氯乙烯衬板作为支撑载体固定于试剂卡槽下壳体中，然后样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次排列连接于衬板上表面，再将试剂卡槽上壳体与下壳体通过卡扣连接，就得到LSV和LMoV复合胶体金免疫层析检测试剂卡。
本发明的试剂卡具有以下优点：
检测时，吸取少量百合样品的待检测溶液，滴在试剂卡槽上壳体第一孔洞处，对比检测线和对照线的颜色，即可判定百合植株是否感染了LSV和LMoV。
1、检测快速：检测时间只需5～10分钟，可以满足现场检测的需要。
2、检测准确率高、特异性强：本反应与其他百合主要病毒没有交叉反应，检测灵敏度高，可同时检测LSV和LMoV。
3、携带方便，操作简便：本发明不需要借助其他仪器设备，适合广大基层单位开展百合病毒的检测和防控工作，也适合百合生产的企业、公司以及百合种植的农户使用。
附图说明
图1为本发明百合隐症病毒和百合斑驳病毒复合胶体金免疫层析检测试剂卡平面结构示意图
图2为本发明百合隐症病毒和百合斑驳病毒复合胶体金免疫层析检测试剂卡内部结构示意图
具体实施方式
如图1和图2所示的LSV和LMoV复合胶体金免疫层析检测试剂卡，包括试剂卡槽1，衬板11，样品垫7，胶体金结合垫8，硝酸纤维素膜9，吸水滤纸10，其中试剂卡槽1包括上壳体和下壳体，上壳体和下壳体通过卡扣连接，上壳体设有第一孔洞2和第二孔洞3，样品垫7置于第一孔洞2下方，硝酸纤维素膜9置于第二孔洞3下方，胶体金结合垫8上含有复合金标探针，衬板11固定于试剂卡槽1中，样品垫7、胶体金结合垫8、硝酸纤维素膜9和吸水滤纸10依次排列连接于衬板11上表面，硝酸纤维素膜9上设有检测线4、5和对照线6，检测线4上包被的是兔抗LSV多克隆抗体，检测线5上包被的是兔抗LMoV多克隆抗体，对照线6上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，兔抗LSV多克隆抗体合适包被量为2.0～2.5μg蛋白，兔抗LMoV多克隆抗体合适包被量为1.5～2.0μg蛋白，LSV和LMoV金标探针合适抗体标记量均为18μg／mL，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5～3.0μg蛋白。
其中，样品垫和胶体金结合垫材质均为玻璃纤维素膜，衬板为聚氯乙烯材质做成，起支持作用。
本发明试剂卡的制备方法：
1、本发明中兔抗LSV和LMoV多克隆抗体的制备方法
分别从感染了LSV和LMoV的百合叶片中提取总RNA进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，扩增LSV和LMoV的CP基因片段。通过酶切克隆至pET-28a载体。重组质粒转化人大肠杆菌BL21，37℃培养，IPTG诱导表达，镍柱亲和层析纯化获得大小32.0、30.0kDa的LSVCP和LMoVCP基因工程融合蛋白。分别用1mg／mL的LSVCP和LMoVCP基因工程融合蛋白作为免疫原分别免疫新西兰大白兔。初次免疫中，将蛋白抗原与弗氏完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射。两周后进行加强免疫，将蛋白抗原与弗氏不完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射。以后每两周加强免疫一次，在第4次加强免疫后的5～7天颈动脉采血，静至，离心，收集到的血清加入质量百分比浓度0.02％的叠氮钠，-20℃保存。所得抗血清依次通过20％、50％、33％三个饱和度的硫酸铵沉淀粗提后，透析至pH7.8的磷酸缓冲液，然后使用DE52阴离子交换柱进行纯化而获得兔抗LSV和LMoV多克隆抗体IgG。
2、胶体金标记兔抗LSV和LMoV多克隆抗体的方法
分别取半径为30nm的胶体金10mL、兔抗LSV和LMoV多克隆抗体各180μg，在PH7.5的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，使得终浓度为1％，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及去凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为复合胶体金-抗体结合物。
3、复合胶体金结合垫的制备
用1／10标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮复合胶体金-抗体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37℃烘干，制成复合胶体金结合垫。
4、免疫层析膜的包被
检测线(4)上包被的是兔抗LSV多克隆抗体，检测线(5)上包被的是兔抗LMoV多克隆抗体，对照线(6)上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，每条线宽2mm，兔抗LSV多克隆抗体合适包被量为2.0～2.5μg蛋白，兔抗LMoV多克隆抗体合适包被量为1.5～2.0μg蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5～3.0μg蛋白。
5、复合胶体金试剂卡的组装
聚氯乙烯衬板作为支撑载体固定于试剂卡槽下壳体中，然后样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次排列连接于聚氯乙烯衬板上表面，再将试剂卡槽上壳体与下壳体通过卡扣连接。
6、复合胶体金试剂卡的使用及结果判定
吸取少量百合样品的待检测溶液，滴在试剂卡槽上壳体第一孔洞2处，由于毛细效应液体往前移动，若待检溶液中仅含有LSV，检测样品经过所述复合胶体金结合垫时，LSV与复合金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述检测线(4)和(5)方向渗移，当接触到所述检测线(4)时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当接触到所述检测线(5)时不发生反应，复合金标多克隆抗体继续向所述对照线(6)方向渗移，当接触到所述对照线(6)时与固定在对照线(6)上的羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当检测线(5)没有颜色变化而检测线(4)和对照线(6)出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒。
若待检溶液中仅含有LMoV，检测样品经过所述复合胶体金结合垫时，LMoV与复合金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述检测线(4)和(5)方向渗移，当接触到所述检测线(4)时不发生反应，当接触到所述检测线(5)时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与检测线(5)结合的复合物继续向所述对照线(6)方向渗移，当接触到所述对照线(6)时与固定在对照线(6)上的羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当检测线(4)没有颜色变化而检测线(5)和对照线(6)出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合斑驳病毒。
若待检溶液中含有LSV和LMoV，检测样品经过所述复合胶体金结合垫时，LSV和LMoV与复合金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述检测线(4)和(5)方向渗移，当接触到所述检测线(4)和(5)时分别发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与检测线(4)和(5)结合的复合物继续向所述对照线(6)方向渗移，当接触到所述对照线(6)时与固定在对照线(6)上的羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当检测线(4)、(5)和对照线(6)均出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒和百合斑驳病毒。
若待检溶液中不含LSV和LMoV，检测样品经过所述复合胶体金结合垫时，则不能与复合金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述检测线(4)和(5)时不发生反应，复合金标多克隆抗体继续向所述对照线(6)方向渗移，当接触到所述对照线(6)时与固定在对照线(6)上的羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当检测线(4)和(5)没有颜色变化而仅对照线(6)出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染百合隐症病毒和百合斑驳病毒。
上述实施例可以看出，本发明可对LSV和LMoV同时进行检测，一般人员不需专门培训即可操作，5～10分钟就可出结果，从而达到快速、简便、及时检测这两种病毒的目的。

Claims (1)

1.一种百合隐症病毒和百合斑驳病毒复合胶体金免疫层析检测试剂卡的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
①兔抗LSV和LMoV多克隆抗体的制备：分别从感染了LSV和LMoV的百合叶片中提取总RNA进行逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR），扩增LSV和LMoV的CP基因片段；通过酶切克隆至pET－28a载体；重组质粒转化入大肠杆菌BL21，37℃培养，IPTG诱导表达，镍柱亲和层析纯化分别获得大小为32.0、30.0kDa的LSVCP和LMoVCP基因工程融合蛋白；分别用1mg/mL的LSVCP和LMoVCP基因工程融合蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔，获得抗血清；所得抗血清依次通过20%、50%、33%三个饱和度的硫酸铵沉淀粗提后，透析至pH7.8的磷酸缓冲液，然后使用DE52阴离子交换柱进行纯化分别获得兔抗LSV和LMoV多克隆抗体IgG；
②胶体金标记兔抗LSV和LMoV多克隆抗体的方法：分别取半径为30nm的胶体金10mL、兔抗LSV和LMoV多克隆抗体各180μg，在pH7.5的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）作为稳定剂，且使得终浓度为1%，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为复合胶体金－抗体结合物；
③复合胶体金结合垫的制备：用1/10标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮复合胶体金－抗体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37℃烘干，制成复合胶体金结合垫；
④免疫层析膜的包被：在硝酸纤维素膜上分别包被兔抗LSV和LMoV多克隆抗体检测线（4）、（5）和羊抗兔IgG纯化抗体对照线（6），每条线宽2mm，兔抗LSV多克隆抗体包被量为2.0～2.5μg蛋白，兔抗LMoV多克隆抗体包被量为1.5～2.0μg蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体包被量为2.5～3.0μg蛋白；
⑤复合试剂卡的组装：将聚氯乙烯衬板作为支撑载体固定于试剂卡槽下壳体中，然后样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次排列连接于聚氯乙烯衬板上表面，再将试剂卡槽上壳体与下壳体通过卡扣连接，就得到LSV和LMoV复合胶体金免疫层析检测试剂卡；其中上壳体设有第一孔洞和第二孔洞，样品垫置于第一孔洞下方，硝酸纤维素膜置于第二孔洞下方；所述LSV和LMoV分别为百合隐症病毒和百合斑驳病毒。
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