CN1793858A - 同步检测百合斑驳病毒、百合无症病毒和黄瓜花叶病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同步检测百合斑驳病毒(LMoV)、百合无症病毒(LSV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的方法，属植物保护领域。其方案是，通过提取总RNA、多重RT－PCR以及电泳检测等步骤，在同一反应管及同一个热循环条件下对百合感染的LMoV、LSV和CMV三种病毒中的1～3种进行扩增，并通过凝胶电泳进行分离和检测。该方法除了具有普通RT－PCR具有的快速、特异、灵敏的优点外，主要是实现了三种病毒同步检测，降低了成本。
Description
技术领域：
本发明涉及一种同步检测侵染百合的百合斑驳病毒(LMoV)、百合无症病毒(LSV)以及黄瓜花叶病毒(CMV)三种主要病毒的多重RT-PCR方法，属植物保护领域。
背景技术：
百合是集观赏、食用、药用于一身的重要经济作物，尤其是切花百合颜色鲜艳、气质高雅，并带有独特的香味，已成为国际上最重要的观赏花卉之一，具有很高的经济价值。近年来，随着人民生活水平的不断提高，对鲜切花特别是百合的需求量不断增加，百合的种植规模日益扩大。然而由于不规范的生产方式及长期无性繁殖使病毒不断积累，百合的病毒病害发生日趋严重，极大的降低了百合的产量和品质，给百合种植业造成巨大的经济损失。据报道侵染百合的病毒有10多种，分布广，危害大，为害严重的主要有百合斑驳病毒(LMoV)、百合无症病毒(LSV)和黄瓜花叶病(CMV)等，而且这三种病毒常复合侵染，引起叶片花叶、坏死、畸形及花朵碎色等症状，严重地降低了百合的商品性和观赏性。通常百合病毒的感染率在30-40％，有的高达100％，给百合造成的危害更大。到目前为止，国际上尚无治疗病毒病害的特效药剂，因此百合病毒检测尤其是对三种主要病毒的检测和监测，对于识别病毒病害和防止病毒的传播流行具有重要的实际意义，是生产上对百合病毒病害进行综合治理的重要措施之一。
通常检测百合病毒的方法有指示植物法、电镜技术、酶联免疫吸附技术和分子生物学技术等。相比较而言，指示植物法虽然简单，但是检测周期长，最短也要10～20天，而且灵敏度非常低，还受到季节、环境以及病毒性质等方面的影响，因此已经很少用于百合病毒的检测。免疫电镜的出现极大的促进了电镜技术在百合病毒检测方面的应用，但是电子显微镜价格昂贵，制样技术复杂，不易掌握，不适合作为百合病毒检测的普通方法。目前应用最为广泛的检测百合病毒的方法是酶联免疫吸附法(ELISA)和分子生物学技术。较之指示植物法和电镜技术，ELISA方法检测周期较短，灵敏度高，可以检测到纳克(ng)级水平的病害。分子生物学技术，特别是RT-PCR技术不但操作简单，而且特异性、灵敏度较ELISA方法高，可以检测到飞克(fg)级水平的病毒。但是ELISA方法和普通RT-PCR的方法每次只能检测一种病毒，对于多种病毒复合侵染百合的情况，则需要针对每种病毒进行单独检测，既浪费时间，又加大了检测成本的投入。此外，普通的RT-PCR扩增过程中对于每种病毒都需要分别设计上游和下游引物，导致检测成本升高，而且提高了非特异性检测的发生几率。
发明内容：
本发明克服了传统方法在检测多种病毒复合侵染百合的不足，提供了一种同步、快速、灵敏、特异的检测百合上发生的LMoV、LSV和CMV三种病毒的方法。
本发明的步骤是：
1)设计引物：
(a)设计检测LMoV、LSV两种病毒的下游通用引物LMSV：
LMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G(b)设计检测LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下：
| 引物名称 | 引物序列 |
| LMoV-FLSV-F | 5-AAGAAGCACGCTGGACTGC-35-ATCGGAGGCCGCTCTTCG-3 |
(c)设计检测CMV的上、下游引物，引物序列如下：
| 引物名称 | 引物序列 |
| CMV-FCMV-R | 5-TCGTCCGCGTCGCGGTTC-35-TGGGAATCCCTTGGTGCTC-3 |
(d)确定每对引物扩增片段大小：
| 引物名称 | 引物序列 | 扩增片段大小 | 所检测病毒 |
| LMoV-FLMSVLSV-FLMSVCMV-FCMV-R | 5-AAGAAGCACGCTGGACTGC-35-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-35-ATCGGAGGCCGCTCTTCG-35-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-35-TCGTCCGCGTCGCGGTTC-35-TGGGAATCCCTTGGTGCTC-3 | 1153bp736bp590bp | LMoVLSVCMV |
2)总RNA提取：
(a)称取百合叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂研磨，研磨液倒入1.5mL离心管中；
(b)加入400μL氯仿，混匀后静置5min；
(c)12,000rpm离心10min；
(d)上清移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；
(e)12,000rpm离心10min；
(f)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；
(g)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；
3)RT-PCR：
(a)RNA变性：RNA 3μL，LMSV 1μL，CMV 1μL和7.5μL ddH2O混匀，70℃保温10min，之后迅速冰浴；
(b)反转录：向上述管中按以下体系加入试剂，振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA；
| 试剂 | 体积 |
| AMV BufferAMV(5u/μL)dNTPs(10mmol/L)RNase Inhibitor(40u/μL) | 4μL1μL2μL0.5μL |
(c)PCR：取一新PCR管，按下表体系加入各试剂：
| 试剂 | 体积 |
| ddH2O10×PCR BuffrMgCl2(25mmol/L)dNTPs(10mmol/L)LMSV(20μmol/L)LSV5(20μmol/L)LMoV5(20μmol/L)CMV5(20μmol/L)CMV3(20μmol/L)cDNATaq酶(5u/μL) | 30μL5μL3μL2.5μL2μL1μL1μL1μL1μL2μL1.5μL |
| 总体积 | 50μL |
设置PCR程序为：94℃4min，94℃1min、53℃～60℃1min、72℃2min，扩增25～40个循环，72℃延伸10min后4℃保存；
4)电泳检测：配制0.8％～2％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；
5)检测结果分析：根据电泳胶上扩增条带的有无及大小确定百合感染的病毒种类；通过观察，若凝胶中存在大小为1153bp的核酸片段，则说明样品中含有LMoV；若凝胶中存在大小为736bp的核酸片段，则说明样品中含有LSV；若凝胶中存在大小为590bp的核酸条带，则说明样品中含有CMV。
其中，所述的PCR退火温度为53℃～60℃，也可以为56℃～58℃；所述的PCR循环可以为25～40个循环，也可以为26～29个循环；所述的琼脂糖浓度可以为0.8％～2％，也可以为0.9％～1.2％。
本发明的有益效果是能够极大的节约时间和成本。由于LMoV和LSV序列的3’端均带有一个poly(A)结构，因此可以据此设计一条带Oligo d(T)的引物作为同时检测LMoV和LSV共用的下游通用引物，减少了引物的数量，而且极大的降低了引物间的相互作用，而且增加了检测的特异性。此外，本发明克服了传统RT-PCR一个体系一次只能检测一种病毒的局限，在一个体系中可以同时检测三种病毒，与传统RT-PCR相比，最多能够节约三分之二的检测时间和试剂成本。
附图说明：
图1是百合斑驳病毒、百合无症病毒和黄瓜花叶病毒的电泳检测图。
具体实施方式：
实例一：
以已知的复合感染了LMoV、LSV和CMV三种病毒的百合植株为材料，以健康百合植株为阴性对照，用本方法进行检测。
1)设计引物：
(a)设计检测LMoV、LSV两种病毒的下游通用引物LMSV：
LMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G
(b)设计检测LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下：
| 引物名称 | 引物序列 |
| LMoV-FLSV-F | 5-AAGAAGCACGCTGGACTGC-35-ATCGGAGGCCGCTCTTCG-3 |
(c)设计检测CMV的上、下游引物，引物序列如下：
| 引物名称 | 引物序列 |
| CMV-FCMV-R | 5-TCGTCCGCGTCGCGGTTC-35-TGGGAATCCCTTGGTGCTC-3 |
(d)确定每对引物扩增片段大小：
| 引物名称 | 引物序列 | 扩增片段大小 | 所检测病毒 |
| LMoV-FLMSVLSV-FLMSVCMV-FCMV-R | 5-AAGAAGCACGCTGGACTGC-35-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-35-ATCGGAGGCCGCTCTTCG-35-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-35-TCGTCCGCGTCGCGGTTC-35-TGGGAATCCCTTGGTGCTC-3 | 1153bp736bp590bp | LMoVLSVCMV |
2)总RNA提取：
(a)称取百合叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂研磨，研磨液倒入1.5mL离心管中；
(b)加入400μL氯仿，混匀后静置5min；
(c)12,000rpm离心10min；
(d)上清移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；
(e)12,000rpm离心10min；
(f)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；
(g)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；
3)RT-PCR：
(a)RNA变性：RNA3μL，LMSV1μL，CMV1μL和7.5μL ddH2O混匀，70℃保温10min，之后迅速冰浴；
(b)反转录：向上述管中按以下体系加入试剂，振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA；
| 试剂 | 体积 |
| AMV BufferAMV(5u/μL)dNTPs(10mmol/L)RNase Inhibitor(40u/μL) | 4μL1μL2μL0.5μL |
(c)PCR：取一新PCR管，按下表体系加入各试剂：
| 试剂 | 体积 |
| ddH2O10×PCR BufferMgCl2(25mmol/L)dNTPs(10mmol/L)LMSV(20μmol/L)LSV5(20μmol/L)LMoV5(20μmol/L)CMV5(20μmol/L)CMV3(20μmol/L)cDNATaq酶(5u/μL) | 30μL5μL3μL2.5μL2μL1μL1μL1μL1μL2μL1.5μL |
| 总体积 | 50μL |
设置PCR程序为：94℃4min，94℃1min、58℃1min、72℃2min，扩增29个循环，72℃延伸10min后4℃保存；
4)电泳检测：配制1.2％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；
5)电泳检测结果：感染了LMoV、LSV和CMV三种病毒的百合叶片中检测出了1153bp、736bp和590bp的三条核酸条带，说明通过本发明可同步检测出LMoV、LSV和CMV三种病毒；健康对照中未检测到任何条带，说明不含有这三种病毒任何一种。
实例二：
以已知的分别感染了LMoV、LSV或CMV的百合植株进行检测，并以健康百合为阴性对照。
1)设计引物：
(a)设计检测LMoV、LSV两种病毒的下游通用引物LMSV：
LMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G
(b)设计检测LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下：
| 引物名称 | 引物序列 |
| LMoV-FLSV-F | 5-AAGAAGCACGCTGGACTGC-35-ATCGGAGGCCGCTCTTCG-3 |
(c)设计检测CMV的上、下游引物，引物序列如下：
| 引物名称 | 引物序列 |
| CMV-FCMV-R | 5-TCGTCCGCGTCGCGGTTC-35-TGGGAATCCCTTGGTGCTC-3 |
(d)确定每对引物扩增片段大小：
| 引物名称 | 引物序列 | 扩增片段大小 | 所检测病毒 |
| LMoV-FLMSVLSV-FLMSVCMV-FCMV-R | 5-AAGAAGCACGCTGGACTGC-35-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-35-ATCGGAGGCCGCTCTTCG-35-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-35-TCGTCCGCGTCGCGGTTC-35-TGGGAATCCCTTGGTGCTC-3 | 1153bp736bp590bp | LMoVLSVCMV |
2)总RNA提取：
(a)称取百合叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂研磨，研磨液倒入1.5mL离心管中；
(b)加入400μL氯仿，混匀后静置5min；
(c)12,000rpm离心10min；
(d)上清移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；
(e)12,000rpm离心10min；
(f)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；
(g)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；
3)RT-PCR：
(a)RNA变性：RNA3μL，LMSV1μL，CMV1μL和7.5μL ddH2O混匀，70℃保温10min，之后迅速冰浴；
(b)反转录：向上述管中按以下体系加入试剂，振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA；
| 试剂 | 体积 |
| AMV BufferAMV(5u/μL)dNTPs(10mmol/L)RNase Inhibitor(40u/μL) | 4μL1μL2μL0.5μL |
(c)PCR：取一新PCR管，按下表体系加入各试剂：
| 试剂 | 体积 |
| ddH2O10×PCRBufferMgCl2(25mmol/L)dNTPs(10mmol/L)LMSV(20μmol/L)LSV5(20μmol/L)LMoV5(20μmol/L)CMV5(20μmol/L)CMV3(20μmol/L)cDNATaq酶(5u/μL) | 30μL5μL3μL2.5μL2μL1μL1μL1μL1μL2μL1.5μL |
| 总体积 | 50μL |
设置PCR程序为：94℃4min，94℃1min、56℃1min、72℃2min，扩增26个循环，72℃延伸10min后4℃保存；
4)电泳检测：配制0.9％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；
5)电泳检测结果：在单独感染了LMoV的百合中检测到了大小为1153bp的核酸条带，说明通过本发明可以特异的检测出LMoV；在单独感染了LSV的百合中检测到了大小为736bp的核酸条带，说明通过本发明可以特异检测出LSV；在单独感染了CMV的百合中检测到了590bp的核酸条带，说明通过本发明可以特异检测出CMV；健康对照中没检测出任何条带，说明该样品种不含这三种病毒任何一种。
实例三：
以已知的复合感染了LMoV和LSV的百合植株、复合感染了LSV和CMV的百合植株以及复合感染了LMoV和CMV的百合植株为材料，以健康百合植株为阴性对照，用本方法进行检测。
1)设计引物：
(a)设计检测LMoV、LSV两种病毒的下游通用引物LMSV：
LMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G
(b)设计检测LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下：
| 引物名称 | 引物序列 |
| LMoV-FLSV-F | 5-AAGAAGCACGCTGGACTGC-35-ATCGGAGGCCGCTCTTCG-3 |
(c)设计检测CMV的上、下游引物，引物序列如下：
| 引物名称 | 引物序列 |
| CMV-FCMV-R | 5-TCGTCCGCGTCGCGGTTC-35-TGGGAATCCCTTGGTGCTC-3 |
(d)确定每对引物扩增片段大小：
| 引物名称 | 引物序列 | 扩增片段大小 | 所检测病毒 |
| LMoV-FLMSVLSV-FLMSVCMV-FCMV-R | 5-AAGAAGCACGCTGGACTGC-35-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-35-ATCGGAGGCCGCTCTTCG-35-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-35-TCGTCCGCGTCGCGGTTC-35-TGGGAATCCCTTGGTGCTC-3 | 1153bp736bp590bp | LMoVLSVCMV |
2)总RNA提取：
(a)称取百合叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂研磨，研磨液倒入1.5mL离心管中；
(b)加入400μL氯仿，混匀后静置5min；
(c)12,000rpm离心10min；
(d)上清移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；
(e)12,000rpm离心10min；
(f)弃上清，沉淀用1mL70％乙醇洗涤，干燥10min；
(g)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；
3)RT-PCR：
(a)RNA变性：RNA3μL，LMSV1μL，CMV1μL和7.5μL ddH2O混匀，70℃保温10min，之后迅速冰浴；
(b)反转录：向上述管中按以下体系加入试剂，振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA；
| 试剂 | 体积 |
| AMV BufferAMV(5u/μL)dNTPs(10mmol/L)RNase Inhibitor(40u/μL) | 4μL1μL2μL0.5μL |
(c)PCR：取一新PCR管，按下表体系加入各试剂：
| 试剂 | 体积 |
| ddH2O10×PCR BufferMgCl2(25mmol/L)dNTPs(10mmol/L)LMSV(20μmol/L)LSV5(20μmol/L)LMoV5(20μmol/L)CMV5(20μmol/L)CMV3(20μmol/L)cDNATaq酶(5u/μL) | 30μL5μL3μL2.5μL2μL1μL1μL1μL1μL2μL1.5μL |
| 总体积 | 50μL |
设置PCR程序为：94℃4min，94℃1min、57℃1min、72℃2min，扩增28个循环，72℃延伸10min后4℃保存；
4)电泳检测：配制1％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；
5)电泳检测结果：在复合感染了LMoV和LSV的百合中检测到了1153bp和736bp的两条核酸条带，说明通过本发明可以同步检测出LMoV和LSV两种病毒；在感染了LSV和CMV两种病毒的叶片中检测到了736bp和590bp的两条核酸条带，说明通过本发明可以同步检测出LSV和CMV两种病毒；在感染了LMoV和CMV两种病毒的百合叶片中检测到了1153bp和590bp的两条核酸条带，说明通过本发明可以同步检测出LMoV和CMV两种病毒；在健康对照中未检测到任何条带，说明该样品种不含有这三种病毒任何一种。
利用此方法在不同情况下对百合斑驳病毒(LMoV)、百合无症病毒(LSV)和黄瓜花叶病毒(CMV)进行了检测。从实验结果看出，无论是在一种病毒单独侵染，还是在两种或是三种病毒复合侵染的情况下，均能在电泳图中特定位置检测到相应的病毒扩增产物，而且阴性对照无非特异性结果发生，因此该方法可以被应用于百合植株上发生的LMoV、LSV和CMV三种主要病毒的同步检测。
Claims (4)
1、一种同步检测LMoV、LSV和CMV三种病毒的方法，其步骤如下：
1)设计引物：
(a)设计检测LMoV、LSV两种病毒的下游通用引物LMSV：
LMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G
(b)设计检测LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下：
引物名称
引物序列
LMoV-FLSV-F
5-AAGAAGCACGCTGGACTGC-35-ATCGGAGGCCGCTCTTCG-3
(c)设计检测CMV的上、下游引物，引物序列如下：
引物名称
引物序列
CMV-FCMV-R
5-TCGTCCGCGTCGCGGTTC-35-TGGGAATCCCTTGGTGCTC-3
(d)确定每对引物扩增片段大小：
引物名称
引物序列
扩增片段大小
所检测病毒
LMoV-FLMSVLSV-FLMSVCMV-FCMV-R
5-AAGAAGCACGCTGGACTGC-35-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-35-ATCGGAGGCCGCTCTTCG-35-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-35-TCGTCCGCGTCGCGGTTC-35-TGGGAATCCCTTGGTGCTC-3 1153bp736bp590bp LMoVLSVCMV
2)总RNA提取：
(a)称取百合叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂研磨，研磨液倒入1.5mL离心管中；
(b)加入400μL氯仿，混匀后静置5min；
(c)12,000rpm离心10min；
(d)上清移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；
(e)12,000rpm离心10min；
(f)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；
(g)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；
3)RT-PCR：
(a)RNA变性：RNA 3μL，LMSV 1μL，CMV 1μL和7.5μL ddH2O混匀，70℃保温10min，之后迅速冰浴；
(b)反转录：向上述管中按以下体系加入试剂，振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA；
试剂
体积
AMV BufferAMV(5u/μL)dNTPs(10mmol/L)RNase Inhibitor(40u/μL)
4μL1μL2μL0.5μL
(c)PCR：取一新PCR管，按下表体系加入各试剂：
试剂
体积
ddH2O10×PCR BufferMgCl2(25mmol/L)dNTPs(10mmol/L)LMSV(20μmol/L)LSV5(20μmol/L)LMoV5(20μmol/L)CMV5(20μmol/L)CMV3(20μmol/L)cDNATaq酶(5u/μL)
30μL5μL3μL2.5μL2μL1μL1μL1μL1μL2μL1.5μL
总体积
50μL
设置PCR程序为：94℃ 4min，94℃ 1min、53℃～60℃ 1min、72℃ 2min，扩增25～40个循环，72℃延伸10min后4℃保存；
4)电泳检测：配制0.8％～2％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；
5)检测结果分析：根据电泳胶上扩增条带的有无及大小确定百合感染的病毒种类；通过观察，若凝胶中存在大小为1153bp的核酸片段，则说明样品中含有LMoV；若凝胶中存在大小为736bp的核酸片段，则说明样品中含有LSV；若凝胶中存在大小为590bp的核酸条带，则说明样品中含有CMV。
2、根据权利要求1所述的同步检测LMoV、LSV和CMV三种病毒的方法中所用的PCR扩增方法，其特征是退火温度为56℃～58℃。
3、根据权利要求1所述的同步检测LMoV、LSV和CMV三种病毒的方法中所用的PCR扩增方法，其特征是扩增26～29个循环。
4、根据权利要求1所述的同步检测LMoV、LSV和CMV三种病毒的方法中所用的电泳检测方法，其特征是配制的琼脂糖凝胶的浓度为0.9％～1.2％。
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| CNB2005100487263A CN100538339C (zh) | 2005-12-22 | 2005-12-22 | 同步检测百合斑驳病毒、百合无症病毒和黄瓜花叶病毒的方法 |
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2005
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