CN1485442A - 荧光pcr定量检测含有花椰菜花叶病毒35s启动子转基因大豆探针序列及试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种荧光PCR定量检测含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因大豆探针序列及试剂盒，所述的探针序列包括：序列TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC向上游位移5个碱基、向下游位移5个碱基的区域内形成的探针序列。试剂盒包括：核酸提取试剂，核酸扩增试剂，定量标准品，其中，核酸扩增试剂包括：35SPCR反应液、lecPCR反应液、Taq酶、UNG等，标准品包括35S不同浓度的阳性品以及阴性对照品。本发明的优点是对转基因作物检测灵敏度可达0.1％，具有良好的灵敏度和特异性。定量偏差为5％－20％，检测效率已达核酸扩增检测领域里的该项目的国际水平。采用了植物内源基因Lectin作为内标，避免核酸提取造成的误差及假阴性的产生。实行了实时监测，大大节省检测时间，节约人力物力。

Description

荧光PCR定量检测含有花椰菜花叶病毒35S 启动子转基因大豆探针序列及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种荧光PCR定量检测含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因大豆探针序列及试剂盒。

背景技术

据国际农业生物技术应用咨询服务中心(ISAAA)统计，2001年全世界转基因作物种植面积为5260万公顷，十多个国家已种植转基因作物，其中99％的转基因作物种植在美国、阿根廷、加拿大和中国，已批准商品化转基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、香石竹、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜、菊苣等，已批准商业化种植的已近90种。据估计，用这些转基因作物生产加工的食品全世界有近万种。

对转基因产品的安全性，特别是转基因食品对人和动物的健康及对生态环境的影响，自转基因技术出现以来，就一直是世界各国及联合国等国际组织关心的焦点问题，2000年联合国通过了“生物安全议定书”，该议定书对除了药物以外的所有进出境活性转基因生物有关过境、审批、检测、风险评估和管理、赔偿责任等做出了详细的规定，其中最重要的措施之一就是对转基因产品要进行检验，以明确其种类，确定是否为已批准的或已获得许可的转基因产品，以防止一些具有风险的转基因产品任意扩散，造成不可挽回的损失。2001年欧盟要求对转基因食品进行标识管理，并提出只要不是有意污染，食品中含有不超过1％的转基因产品(阈值)则不用标识，这样转基因产品检测不但需要定性，还需要定量检测。不同国家阈值大小不一样，从1-5％不等。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，并于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法。目前全世界36个国家和地区出台了各种转基因产品有关的法律法规。总之，转基因产品的研究、生产、销售都要在政府有关部门的许可和监督下，在特定的环境和地点进行。

虽然联合国所属机构(FAO、WHO等)及一些地区性国际组织在召集建立世界统一的检测技术和方法标准，但由于对于转基因产品的安全性、风险管理措施及其它利益等方面的不一致，目前各国尚难达成一致的意见。综合世界各国转基因产品的检测技术，根据检测目标主要分成下面三个类型：检测插入的外源基因，检测外源基因表达物(RNA或蛋白质)，检测插入外源基因对受体生物基因表达的影响(主要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对整个代谢产物的影响)。由于第三类型的检测成本高、所需时间长，并且被认为重要性较低，目前对这方面的检测在实际工作中较少涉及。在前两种类型的检测工作中所涉及的检测目标包括三种类型：DNA、RNA和蛋白质。对于蛋白质的检测主要用血清学方法，由于有些转基因产品不表达蛋白质或表达量不稳定，血清学检测方法仅在个别转基因产品检测中应用。对于DNA和RNA的检测主要采用PCR及直接核酸杂交等基因诊断技术。基因扩增诊断方法到目前为止已经历了以下几个方面的发展：PCR/电泳检测、传统杂交或测序；PCR-ELISA；实时荧光PCR。

目前已商品化的7种转基因大豆中，有六种(GTS 40-3-2；G94-1，G94-19，G168；W62，W98；A2704-12，A2704-21，A5547-35；A5547-127；GU262)

6种含35S启动子序列的转基因大豆名称如下：

1.Round up soybean

2.high oleic acid soybean event 260-05

3.GRS lines W62 and W98 Soybean

4.GRS lines A2704-12，A2704-21，and A5547-35

5.A5547-127

6.GU262 Soybean

含有插入的花椰菜花叶病毒35S启动子序列和大豆内源基因lectin序列，可供作为检测的靶序列。

花椰菜花叶病毒的英文名称为Cauliflower Mosaic Virus(简写为CaMV)，35S是其基因组转录出的一个蛋白分子，35S启动子经常在转基因操作中被用作目的基因的启动子。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种荧光PCR定量检测含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因大豆探针序列及试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

荧光PCR定量检测含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因大豆探针序列包括：序列TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC向上游位移5个碱基、向下位移个碱基的区域内形成的序列。

  试剂盒组成

核酸提取试剂

核酸扩增试剂

 35s PCR反应液(定量)

 lec PCR反应液

 Taq酶(5U/ul)

 UNG(1U/ul)

定量标准品

 35s-STND1(5.0％)

 35s-STND2(2.0％)

 35s-STND3(1.0％)

 35s-STND4(0.5％)

 35s-STND5(0.1％)

 35s-定量阴性对照

全基因序列见附录一

DNA核酸提取方法可使用传统的植物DNA提取方法，例如CTAB法，也可采用Promega公司的Wizard Magnetic DNA Purification System for Food试剂盒(Cat FF3750，200tests)。

本试剂盒采用PCR方法结合荧光探针的扩增双检测技术，在同一试管中以Fam和Tet两种荧光通道信号分别追踪35S启动子序列和内源基因lectin序列的扩增动力学变化，为消除DNA样品上样量的差异，以ΔCt值(Fam-Ct值与Tet-Ct值之差)对梯度GMO含量的标准品做标准曲线，获得待测样本的GMO含量。

附图说明：

图1为荧光PCR定量检测含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因

(目的基因35s启动子)的扩增图

图2为荧光PCR定量检测含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因

(内标基因lectin)的扩增图

图1中，阳性样品0.1％，0.5％，1.0％，2.0％5.0％Fluka大豆标准品，待测样品1，阴性样品为0％Fluka大豆标准品和阴性对照，每个样品均有一个重复.图1中，1，3为0.1％Fluka大豆标准品，2为0.5％Fluka大豆标准品，4，5为0％Fluka大豆标准品，

图2中，阳性样品0.1％，0.5％，1.0％，2.0％5.0％Fluka大豆标准品，待测样品1，阴性对照，(阴性样品为空白对照)，每个样品均有一个重复.图2中，7，8为0％Fluka大豆标准品，6，9为0.1％Fluka大豆标准品，10为0.5％Fluka大豆标准品，

具体实施方式

引物、探针设计：

对GMO中选用的多种花椰菜花叶病毒35S启动子序列(包括花椰菜花叶病毒35S启动子的天然序列以及人工改建序列)、lectin基因序列进行比较，选择其中缺乏二级结构且保守的基因区设计多对引物及探针。引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。根据上述原则设计出的引物、探针如下：

35s启动子：

上游引物：35s7185；35s7190；35s7201；35s7240；35s7248；

下游引物：35s7250r；35s7260r；35s7282r；35s2r；35s7306r；35s7345r；35s7365r

探针：6153；35S FAM-BHQ；35S FAM-TAMRA；35S 7275FAM；35S 7273FAM-BHQ；35S7270FAM；35S7248Famb

lectin基因：

上游引物：687；720；1020；1123；1169；1170；1263；

下游引物：1119；1137；1166；1296；1312；1366；1375；1441；1612；

探针：7105；7106；lec1205tet；lec1215tet；lec1230tet；

反应体系的建立

反应体系的建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得：用已购买的Fluka大豆标准品，以Promega提取试剂盒提取基因组核酸，再分别用外源性EPSPS基因和内源性lectin基因区域的最长的扩增片段的引物进行PCR扩增。扩增产物用1×TE进行10倍梯度稀释，选取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7共5个稀释度为系列阳性模板，作为以后反应体系优化时的模板。

引物、探针的筛选：

引物筛选实验中将上述上游引物和下游引物结合特异的探针，任意配对进行实验。荧光PCR仪采用PE7700荧光PCR仪。所采用的PCR反应体系如下表所示。

PCR反应体系

组分	终浓度
		10×PCR反应液	1×
dNTP(含dUTP)	0.2mmol/L
		Taq酶	2Unit
Mg2+浓度	2.5mmol/L
		引物(上游)	0.2umol/L
引物(下游)	0.2umol/L
		探针	0.1umol/L
模板DNA	2ul
		补、DEPC水至	40ul

PCR条件的选择：依据本公司以往的经验，PCR条件的选择如下：

         94℃：3min；

         

在同样的模板量、同样的反应条件下，以外源性35S启动子和内源性lectin基因的特异荧光探针信号所获得的Ct值和Rn值为指标(这两者能反映扩增片断的量和质)，比较不同引物对组合的扩增情况。选择Ct值和Rn值高者，做为待选的DNA/PCR检测的引物对。

从多次重复实验中选定下述最佳引物/探针组合为最佳组合：

最佳引物/探针组合

	上游引物	下游引物	探针
				外源性35s启动子区域	35s7248	35s2r	35s7270Fam
内源基因lectin序列区域	1169u	1312r	Lec1205tet

35s启动子最佳引物/探针序列如下：

引物：上游引物：35s7248：CGACAGTGGTCCCAAAGA

      下游引物：35s2r：AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC

探针序列：35s7270Fam：Fam-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-tamralectin基因最佳引物/探针序列如下：

上游引物：lec1169u：cctcctcgggaaagttacaa

下游引物：lec1312r：gggcatagaaggtgaagtt

探针：lec1205Tet：tet-ccctcgtctcttggtcgcgccctct-tamra

用选出的最佳上下游引物及探针对进行PCR反应体系的优化。

引物和探针浓度的优化

实验中将引物浓度从0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L递增，探针浓度从0.025umol/L至0.2umol/L以0.025umol/L递增。对引物和探针不同浓度的配比进行了比较。最佳引物和探针终浓度结果如下表：

                    最佳引物和探针终浓度

	引物，探针	最佳终浓度(μM)
			外源性35s启动子区域	上游引物  35s7248	0.2
下游引物  35s2r	0.2
		探针      35s7270Fam		0.1
内源基因lectin序列区域	上游引物  1169u				0.2
		下游引物  1312r	0.2
	探针      Lec1205tet			0.1

镁离子浓度的优化

实验中将镁离子浓度从1.0mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L递增。从多次重复实验中选定2.5mmol/L MgCl₂为试剂盒反应体系镁离子浓度。

Taq酶用量的优化

Taq酶用量(以单位U计)的优化实验结果，选定2U Taq酶作为试剂盒中使用Taq酶量。

dNTP浓度的优化

dNTP浓度的优化实验中选定0.2mmol/L作为试剂盒dNTP的终浓度。

综合以上反应体系优化实验结果，优化后的PCR反应体系见下表。

          优化后的PCR反应体系

组分	终浓度
		10×PCR反应缓冲液(pH＝8.9)	1×
Mg2+浓度	2.5mmol/L
		dNTP(含dUTP)	0.2mmol/L
Taq酶	2U
		引物(上游)	0.2umol/L
引物(下游)	0.2umol/L
		探针	0.1umol/L
模板	2ul
		补水至	40ul

DNA提取方法：采用传统的植物DNA提取方法：CTAB

双检系统的合一

方法：先确立外源性35s启动子扩增系统(见上述)，然后逐一加入lectin系统的模板、引物和探针，结果发现，两系统合并之后，各自的Ct值大约后延一个单位，Rn值有所下降，见下表：双检系统优化表

Fam系统	Tet系统	35s启动子模板	Lec模板	Fam-Ct(Rn)		Tet-Ct(Rn)
								+	+	+		28.3(525)	28.3(600)	40.0	40.0

+	+		+  40.0	40.0	25.7(445)	25.9(680)
							+	+	+	+  28.4(410)	28.3(570)	25.1(415)	24.3(725)
+		+	27.4(670)	26.6(820)	40.0	40.0
								+		+  40.0	40.0	24.4(785)	24.6(710)

为观察两系统合并后对实际定量的影响，用fluka大豆标准品对外源基因和内标基因进行测定比较，结果见下表：

             双检合一系统中Fam和Tet通道的Ct值

	0.0％	0.1％	0.5％	1.0％	2.0％	5.0％
							Fam-Ct	40.0	32.9	30.6	29.4	28.5	27.3
Tet-Ct	22.3	21.8	22.6	22.0	21.7	22.5

为减少上样的DNA模板量的差异，采用以ΔCt值(Fam-Ct值与Tet-Ct值之差)对梯度GMO含量的标准品做标准曲线，得到：y＝-3.5127x+0.37 R²＝0.9724，提示该双检合一系统可以用于定量检测。

反应体系的优化组合

综上所述，在反应体系的建立所进行的各环节的优化实验结果，本荧光检测试剂盒主要应包括以下几个步骤：①大豆DNA的提取；②PCR反应；③PCR扩增及荧光信号收集。

以上3个步骤中所涉及到的反应体系和反应条件优化结果总结如下。大豆DNA的提取

样本量：最小100mg，或者用标准规定量。

使用CTAB法、磁珠法或其它更有效的办法。

PCR反应

PCR反应体系：见下表：

         优化后的PCR反应体系

组分                       终浓度
	10×PCR反应缓冲液(pH＝8.9) 1×
Mg2+浓度                  2.5mmol/L
	dNTP(含dUTP)               0.2mmol/L
Taq酶                      2U
	35s启动子上游引物          0.2umol/L
35s启动子下游引物          0.2umol/L
	35s启动子探针              0.1umol/L
Lectin上游引物lec1169      0.2umol/L
	Lectin下游引物lec1312      0.2umol/L
Lectin探针lec1205tet       0.1umol/L
	模板                       5ul
补水至                     40ul

PCR反应循环参数如下：

       37℃：5min   95℃：4min

       95℃：15sec  60℃：60sec 40个循环  60℃末收集荧光

试剂盒组成

组成成份(48tests/盒)    体积
	CTAB法核酸提取试剂CTAB缓冲液            40ml×1管CTAB沉淀缓冲液        40ml×1管沉淀溶解液              24ml×1管
核酸扩增试剂35s PCR反应液(定量) 1ml×1管lec PCR反应液       1ml×1管Taq酶(5U/ul)        20ul×1管UNG(1U/ul)          5ul×1管
	定量标准品35s-STND1(5.0％)    30ul×1管35s-STND2(2.0％)    30ul×1管35s-STND3(1.0％)    30ul×1管35s-STND4(0.5％)    30ul×1管35s-STND5(0.1％)    30ul×1管35s-定量阴性对照    30ul×1管

表中，UNG为一种酶(尿嘧啶-N-糖苷酶Uracil-N-glycosylase)自备设备及试剂

水浴锅，离心机；氯仿、异丙醇(-20℃预冷)、70％乙醇(-20℃预冷)

适用仪器

PE Gene Amp7700荧光PCR检测仪或其他合适的荧光PCR仪CTAB法样本处理试剂配方：CTAB缓冲液           20g CTAB/L，1.4M NaCl，0.1M Tris/HCl，20mM EDTA(ph＝8.0)CTAB沉淀缓冲液           5g CTAB/L，0.04M NaCl沉淀溶解液               1.2M NaCl

纯化水的制备

用自来水一次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水，贮于无菌瓶中。

35s定量PCR反应液配方

试剂成份    稀释度 终浓度
	10×buffer         2ul
25mM MgCl2        2ul
	100mM dATP         0.04ul
100mM dCTP         0.04ul
	100mM dGTP         0.04ul
100mM dUTP         0.04ul
	35s上游引物  10uM  0.46mM

35s下游引物  10uM   0.46uM
	35s探针      1/10   0.23uM
加水至              17.3ul

              Lec-PCR反应液配方

试剂成份    库位号    稀释度     终浓度
	10×buffer                       2ul
25mM MgCl2                      2ul
	100mM dATP                       0.04ul
100mM dCTP                       0.04ul
	100mM dGTP                       0.04ul
100mM dUTP                       0.04ul
	Lec1169u     (A2041)    10uM     0.46mM
Lec1312r     (A1984)    10uM     0.46uM
	Lec1205Tet   (1979-1)   10uM     0.23uM
加水至                           17.3ul

定量标准品和阴性对照品的制备

定量标准品的制备

购买欧盟的Fluka公司的0.1％，0.5％，1.0％，2.0％和5.0％转基因大豆粉(Cat#89305)，用Promega试剂盒(Wizard Magnetic DNA Purification System for Food，Promega Cat#A7710)提取DNA.，-20℃保存备用。

阴性对照的制备

购买市场上的非转基因大豆，洗净、烘干，磨成粉，用合格的《转基因大豆荧光PCR定量检测试剂盒(35S启动子序列检测)》试剂盒提取基因组DNA，做PCR扩增，平行做3个复管，如果检测结果为35S起动子序列检测为阴性，GMO含量＜0.1％，视为合格非转基因大豆粉。用CTAB法大量提取基因组DNA，-20℃保存备用。使用方法

1. 样本核酸提取

1.1 CTAB法提取DNA

1.1.1 称取100mg充分粉碎后的大豆样品放入2ml离心管中，加800ul CTAB缓冲液，混

     匀后于65℃温育30分钟；

1.1.2 15500g离心10分钟，转移上层液至含400ul氯仿的管中，混匀30秒，再以15500g

     离心10分钟直至液相分层，吸取上层液至干净离心管中；

1.1.3 加入2V CTAB沉淀缓冲液，室温下温育60分钟；

1.1.4 混合液以15500g离心5分钟，弃上清；

1.1.5 加入500ul沉淀溶解液溶解沉淀，并加入500ul氯仿，混匀30秒后以15500g离心10分钟；

1.1.6 转移上清至另一新管中，加入0.6倍体积异丙醇，充分混匀后15500g离心10分钟，弃上清液；

1.1.7 加入70％乙醇500ul于含有沉淀的小管中，小心混匀洗涤管壁后离心10分钟(15500g)，弃上清；

1.1.8 室温干燥，然后将DNA溶解在100ul无菌去离子水中(如果样本DNA当天不使用，请

      于-20℃保存)。

1.2 Promega法提取DNA的步骤(备选)

    原方法样本称取量为200mg。根据本公司的经验，此量极难混匀，故将样本称取量改为100mg，其后的试剂用量和操作则完全按原方法进行(如果样本DNA当天不使用，请于-20℃保存)。

2. 核酸扩增

2.1 试剂配制(PCR前准备区)

  从试剂盒中取出各管试剂，室温融化，2000rpm离心5秒。

  设所需要的管数为n(n＝样本数×3+2管阴性对照+10管定量标准品)。这里每个样本要做3个平行管，每个定量标准品及1个阴性对照品则只做两个平行管。每个测试反应体系配制如下表：

    反应体系        35s-PCR反应液      Lec-PCR反应液      Taq酶       UNG

    40ul            17.3ul             17.3ul             0.4ul       0.06ul

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向设定的n个PCR反应管中分别加入35ul，转移至样本处理区。

2.2 加样(样本处理区)

若样本DNA保存在-20℃，先置室温解冻。

在设定的n个PCR反应管中，分别加入样本DNA溶液各5ul；0.1％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％定量标准品以及阴性对照品各5ul；盖好PCR反应管盖，转移至检测区，置于定量PCR检测仪上并记录样本摆放顺序。

2.3 PCR扩增(检测区)

2.3.1. 循环条件设置

37℃：5min；95℃：4min；

95℃：15sec，60℃：1min，40个循环。反应体系设为40ul。

2.3.2. 仪器检测通道选择

    所有PCR反应管荧光信号收集分别设为Fam和Tet荧光通道。

    具体设置方法请参照仪器使用说明书。

3.质控标准

3.1 定量标准品、阴性对照品的lectin内源基因Tet荧光通道Ct值应在18至25之间，

    否则需重做PCR反应。

3.2 待测大豆DNA样品的lectin基因Tet荧光通道Ct值应在18至25之间；否则，样

    本DNA提取过程有误，需从样本DNA提取开始重做。

3.3 阴性对照品35s起动子序列的检测结果应为阴性；否则需重做PCR反应。

3.4 标准曲线的拟和度(R平方值)应大于等于0.90，否则应重做PCR反应。

4. 结果分析

4.1 无论Fam荧光通道或Tet荧光通道，基线都取3～15个循环的荧光信号；阈值设定原

    则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，使阴性对照品成阴性结果

    为准。

4.2 记录每个定量标准品以及每个待测样品的Fam荧光通道的Ct值和Tet荧光通道的Ct

    值，并分别计算出定量标准品在Fam和Tet荧光通道Ct值的平均值。将各标准品的

    平均Ct值和各待测样品的Ct值输入到所配软件的相应位置，软件会自动计算出标准

    品和待测样本的ΔCt值。根据标准品的已知GMO含量和所得的ΔCt值之间的对应关

    系，软件可计算出回归曲线方程。

4.3 根据此回归方程，软件可通过每个待测样品的ΔCt值自动计算其GMO的含量，并在表

    格的对应位置显示结果。

4.4 GMO含量的报告方式：

    如果某待测样品的GMO含量计算值在0.1～5.0％之间，按实际值报告；

    如果某待测样品的GMO含量计算值小于0.1％，报告GMO低于检测限；

    如果某待测样品的GMO含量计算值大于5.0％，报告GMO大于5.0％；

试剂盒使用注意事项

有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管理规范执行。

储存条件及有效期

本试剂盒中样本处理试剂在室温保存；核酸扩增试剂-20℃保存；避免反复冻融.有效期为一年，连续生产的三批试剂盒自检定合格之日起试剂盒要求的储存温度下保存，每个月按成品检定规程检测一次，一直到14个月时，各项指标均合格，因此确定试有效期为12个月(请于有效期内使用)。

实施例1

定量检测：选取待检样品，以Promega磁珠法提取基因组DNA，具体为：称重100mg植物材料，置于2ml离心管中；加入500ul Lysis Buffer A和5ul RNase A，与材料混匀；加入250ul Lysis Buffer B，混匀，室温放置10分钟；加入750ul沉淀缓冲液，混匀后高速离心(13000×g)10分钟；吸取上清于干净的2ml离心管中，加入50ul磁粉液，混匀；混合液中加入0.8体积异丙醇，混匀，室温放置5分钟；将离心管置于磁架上1分钟，去澄清液；取出离心管，再加入250ul Lysis Buffer B，混匀后置于磁架上1分钟，去澄清液；用1ml 70％乙醇清洗磁粉，置于磁架上1分钟，去澄清液；步骤重复2次；取出离心管，于65℃干浴锅中干燥5分钟或室温下干燥15-30分钟；离心管中加入100ul去离子水，混匀后于65℃干浴锅中孵育5分钟，再移至磁架上1分钟，吸取澄清液于0.5ml干净离心管中，做为DNA模板备用。

用本试剂盒做荧光PCR定量检测，荧光PCR仪采用PE7700。其结果如下表：

本试剂盒做荧光PCR定量检测标准品及样品ct值

样品	0.0％	0.1％	0.5％	1.0％	2.0％	5.0％	样1	样2
									Ct值	40.0	32.6	30.4	29.4	28.1	27.5	29.5	28.3
GMO含量							1.05％	2.38％

从上述数据得到的回归曲线是y＝-0.302x+6.9517；相关性r²＝0.997；再用1.0％和2.0％的标准品当做被测样品，测得的GMO含量分别为1.05％和2.38％，定量偏差为5％-20％(欧盟的GENESCAN公司同类检测定量偏差为≤20％)，提示该试剂盒的检测效率已达到核酸扩增检测领域里的该项目的国际水平。具体见图一：

试剂盒性能测试

试剂盒灵敏度为：0.1％GMO大豆。

试剂盒标准曲线拟合度≥0.95。

试剂盒精密性

公司中3位技术熟练的操作人员在3个不同时间，各做3次精密性检测实验(总计9次)，每次平行处理10份精密性参比品。对每10次所得的Ct值用Microsoft Excel分析软件进行统计学处理，得出平均值和10个Ct值的CV值，实验结果显示，Ct值的CV值在5。0％以下，表明该试剂盒有良好的精密性，结果见下表：

               大豆定量结果表

样品         Fam(Ct)  Tet(Ct)  ΔCt    GMO含量S1(1.0％)    27.52    19.35    8.17    1.03％S2(1.0％)    28.24    21.09    7.15    0.99％S3(2.0％)    27.62    21.57    6.05    2.02％S4(1.0％)    28.97    21.96    7.01    1.08％S5(0.5％)    28.24    20.61    7.63    0.45％

试剂盒特异性

该试剂盒对阴性大豆、玉米、油菜、马铃薯标本均无非特异性扩增，表明该试剂盒具有良好的特异性。

发明的效果：对经过反复筛选确立的试剂盒进行测试。

以符合国际标准的Fluka大豆标准品0.1％转基因大豆提取的DNA做模板，得到的Ct值在29.0-33.0之间，这是目前不同荧光测定仪器的可靠检测下限；而0.1％的检测灵敏度已经达到了目前国际同类产品的检测标准。

用于作定量检测，定量偏差为5％-20％(欧盟的GENESCAN公司同类检测定量偏差为≤20％)，提示本试剂盒的检测效率已达到核酸扩增检测领域里的该项目的国际水平。

实施例2

利用试剂盒中的引物、探针用作杂交探针检测含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因大豆。

PCR-ELISA的方法原理简介

该实验要设计一对PCR引物和一条探针，它们均与模板DNA链互补，且探针的结合部位在引物结合部位之间。将PCR的一条引物5’端标记上荧光素(Fluorescein)，进行PCR扩增，得到的扩增产物带有荧光素标记。同时将探针的5’端标记上生物素(Biotin)，酶联板上包被有亲和素(Ayidin)，通过生物素与亲和素的亲和作用，将探针包被在酶联板上。检测时，将扩增产物变性成单链，在酶联板上与探针进行特异的结合，洗板，再加入辣根过氧化物酶偶联的荧光素抗体，通过显色剂显色，在酶标板上读取OD值，根据OD值判断样品的阴阳性。

实施内容：

将上述探针35s7270FAM的5’端标记生物素，3’端不做标记；将引物35s2r的5’端标记上荧光素。预先将探针包被在有亲和素的酶联板上。

按常规方法(CTAB法或磁珠法)提取样本中的DNA。由10×PCR缓冲液、dNTPs、Mg²⁺、Taq酶、上下游引物、H₂O，以及DNA模板组成PCR反应体系，进行扩增。

扩增结束后，将扩增产物变性成单链，加到包被了探针的酶联板上，如果有特异性扩增，扩增产物中的一条链与探针杂交，洗板，加入酶联荧光素抗体，洗板，加入显色剂，显色10分钟，停止显色，在酶标仪上读取OD值，根据OD值判断样本的阴阳性。下表是一次的实验结果：

样本      100％GMO    5％GMO    2％GMO    1％GMO    0.5％GMO   0.1％GMO   0.0％GMO

          大豆        大豆      大豆      大豆      大豆       大豆       大豆

OD值      ＞3.000     2.364     1.881     1.487     0.957      0.347      0.132

结果判断  +           +         +         +         +          +          -

样本      GMO油菜    GMO玉米    GMO番茄   土豆      白玉米     空白对照

OD值      ＞3.000    ＞3.000    ＞3.000   0.142     0.158      0.112

结果判断  +          +          +         -         -

实验结果表明：只要含有35s启动子序列的转基因作物经该系统检测结果均为阳性，而不含有35s启动子序列的作物经该系统检测均为阴性

本发明的优点

1.本试剂盒对于转入35s启动子的转基因作物检测灵敏度可达0.1％，说明本试剂盒具有良好的灵敏度。

2.本试剂盒对于非转基因的农产品如大豆、玉米等均无扩增信号，说明本试剂盒具有良好的特异性。

3.用本试剂盒做荧光PCR定量检测，定量偏差为5％-20％(欧盟的GENESCAN公司同类检测定量偏差为≤20％)，提示该试剂盒的检测效率已达到核酸扩增检测领域里的该项目的国际水平。

4.由于本试剂盒采用了荧光PCR作为检测方法，整个反应均闭管进行，避免了其他核酸检测方法如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性。

5.由于本试剂盒采用了植物内源基因Lectin作为内标，避免了核酸提取的对定量造成的误差及假阴性的产生。

6.由于本方法对PCR产物实行了实时监测，大大节省了检测时间，节约了人力物力.

备注：

以英文字母表示的引物探针的名称、引物探针的序列/基因的名称等大小写通用；

Ct值的英文全称“Threshold Cycles”，意指荧光值超过阈值时所处的循环数。在不同荧光PCR仪上有不同的名称，但含意是一样的。附录一35S基因全序列CCCCAGATTAGCCTTTTCAATTTCAGAAAGAATGCTAACCCACAGATGGTTAGAGAGGCTTACGCAGCAGGTCTCATCAAGACGATCTACCCGAGCAATAATCTCCAGGAAATCAAATACCTTCCCAAGAAGGTTAAAGATGCAGTCAAAAGATTCAGGACTAACTGCATCAAGAACACAGAGAAAGATATATTTCTCAAGATCAGAAGTACTATTCCAGTATGGACGATTCAAGGCTTGCTTCACAAACCAAGGCAAGTAATAGAGATTGGAGTCTCTAAAAAGGTAGTTCCCACTGAATCAAAGGCCATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGC CGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC

                          35s7248              35s7270FamGTGGAAAAA GAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTA

              35s2rAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAGGATCCATAGATCTGATAACAAAGATGAG

                   序列表<110>国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所深圳市匹基生物工程股份有限公司<120>荧光PCR定量检测含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因大豆探针序列及试剂盒<130><160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>1tggaccccca cccacgagga gcatc                                           25<210>2<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>2cgacagtggt cccaaaga                                                   18<210>3<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>3aagacgtggt tggaacgtct tc                                              22<210>4<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>4ccctcgtctc ttggtcgcgc cctct                                           25<210>5<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>5cctcctcggg aaagttacaa                                               20<210>6<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>6gggcatagaa ggtgaagtt                                                19

Claims (5)

1、一种荧光PCR定量检测含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因大豆探针序列，其特征在于所述的探针序列包括：序列TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC向上游位移5个碱基、向下游位移5个碱基的区域内形成的探针序列。

2、据权利要求1所述的一种荧光PCR定量检测含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因大豆探针序列，其特征在于所述的探针序列为TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC。

3、一种根据权利要求2所述的一种荧光PCR定量检测含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因大豆探针序列做成的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒的组成为：

  核酸提取试剂

  核酸扩增试剂

      35s PCR反应液

      lec PCR反应液

      Taq酶(5U/ul)

      UNG(1U/ul)

  定量标准品

      35s-STND1(5.0％)

      35s-STND2(2.0％)

      35s-STND3(1.0％)

      35s-STND4(0.5％)

      35s-STND5(0.1％)

      35s-定量阴性对照

其中PCR反应液的上游引物序列CGACAGTGGTCCCAAAGA

         下游引物序列：AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC

所述的lectin基因最佳引物/探针序列如下：

    上游引物序列：cctcctcgggaaagttacaa

    下游引物序列：gggcatagaaggtgaagtt

    探针：ccctcgtctcttggtcgcgccctct

4、根据权利要求3所述的一种荧光PCR定量检测含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因大豆探针序列做成的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒的组成为：

CTAB法核酸提取试剂

  CTAB缓冲液                       40ml×1管

  CTAB沉淀缓冲液                   40ml×1管

  沉淀溶解液                       24ml×1管

核酸扩增试剂

    35s PCR反应液                  1ml×1管

    lec PCR反应液                  1ml×1管

    Taq酶(5U/ul)                   20ul×1管

    UNG(1U/ul)                     5ul×1管

定量标准品

35s-STND1(5.0％)                        30ul×1管

35s-STND2(2.0％)                        30ul×1管

35s-STND3(1.0％)                        30ul×1管

35s-STND4(0.5％)                        30ul×1管

35s-STND5(0.1％)                        30ul×1管

35s-定量阴性对照                        30ul×1管

其中35s定量PCR反应液配方

试剂成份                               终浓度或体积

10×buffer                             2ul

25mM MgCl₂                            2ul

100mM dATP                             0.04ul

100mM dCTP                             0.04ul

100mM dGTP                             0.04ul

100mM dUTP                             0.04ul

35s上游引物                            0.46mM

35s下游引物                            0.46uM

35s探针                                0.23uM

加水至                                 17.3ul

Lec-PCR反应液配方

试剂成份                               终浓度或体积

10×buffer                            2ul

25mM MgCl₂                           2ul

100mM dATP                            0.04ul

100mM dCTP                            0.04ul

100mM dGTP                            0.04ul

100mM dUTP                            0.04ul

Lec上游引物                           0.46mM

Lec下游引物                           0.46uM

Lec探针                               0.23uM

加水至                                17.3ul

5、权利要求2所述的一种荧光PCR定量检测含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因大豆探针，其特征在于所述的探针用作杂交探针检测含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因大豆。