CN102965435A - 一种通用的CaMV 35S启动子定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通用的CaMV（花椰菜花叶病毒）35S启动子定量检测方法，涉及分子生物学及转基因检测技术领域。本定量检测方法是：①收集CaMV35S启动子增强子保守区序列；②利用该序列特征设计引物探针；③PCR扩增；④建立标准曲线；⑤定量体系的精确性验证。本发明避免了现有一些CaMV35S启动子检测方法存在的检测引物/探针与检测靶标序列不完全匹配的问题；避免了现有一些CaMV35S启动子检测方法存在的两侧引物结合位点数不同而引起的多条扩增产物的问题；适用于含有CaMV35S启动子的转基因油菜、水稻、大豆等转基因作物的定量检测。

Description

一种通用的CaMV 35S启动子定量检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学及转基因检测技术领域，尤其涉及一种通用的CaMV（花椰菜花叶病毒）35S启动子定量检测方法。 

具体地说，本发明是比对收集到的不同来源的CaMV 35S启动子序列得到增强子序列中较长的保守区，设计以增强子保守区为检测靶标序列的引物探针，筛选出特异性强、灵敏度高的CaMV 35S启动子检测方法。其应用是该方法可适用于CaMV 35S启动子筛查原件的的检测，并解决了原有CaMV 35S启动子检测系统中一些检测方法存在的与检测靶标的匹配性不完全匹配以及存在多条扩增产物等一些无法解决的问题。 

背景技术

近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获准种植和生产，有的被加工成食品、饲料或用作食品添加剂。由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，30多个国家和地区相继实施转基因产品标识制度。 

转基因检测方法，根据检测靶标的不同，分为载体特异性检测、转化事件特异性检测和筛查检测的方法。 

载体特异性检测方法利用基因元件之间的边界序列特征，能够有效鉴定使用类似基因元件的不同构建体，而且存在序列信息容易获得的特点，因此被很多研究者所使用。但是，由同一构建体可能获得不止一个不同特性的转化株，甚至可能被转化到不同的物种中，而这些转化株未必全部经过了安全评估。因此载体特异性检测方法不能识别不同的转基因品系，也不能判别该转基因品系是否已经过安全评估。 

事件特异性检测的基础是转基因构建体在基因组DNA序列上的整合位点具 有高度特异性，即使是相同的载体多次转化，整合的位置和整合位点特征也是不可重复的。因此，根据不可重复的整合位点特征序列，开发出了事件特异性的检测方法。与前两种方法相比，事件特异性检测具有最高的特异性，最适合做转基因产品的定性和定量检测。但转基因构建体的完整信息通常难以获得，而已知序列基因元件可能距边界有相当的距离，而且在整合的过程中，载体和基因组之间可能发生复杂的重组，因此，分离旁侧序列成为事件特异性检测的关键。 

筛查方法具有最低的特异性，其追求的是对不同转基因品种的高覆盖率。因此转基因筛查方法往往选择最常用的转基因元件作为筛查靶标。来自CaMV的35S蛋白基因启动子和来自农杆菌Ti质粒NOS基因的终止子是最为常用的转基因元件。这两个元件广泛存在于各种商业化转基因作物和各种用于研究的转基因载体系统。因为以上原因，CaMV 35S启动子和NOS终止子是应用最广泛的最基本的筛查元件。在众多的法规和研究论文中，不同机构和研究者提够了各种不同的筛查检测方法。但是，在我们的实践中，我们发现与NOS终止子的检测方法相比，CaMV 35S启动子的很多方法在很多品种的检测中存在这样那样的问题。事实上CaMV 35S启动子是被改造得最为严重的转基因元件之一，不同转基因品种中的CaMV 35S启动子的序列可能千差万别。利用某一方法对不同品种中的CaMV 35S启动子进行检测也可能产生完全不同的检测结果，造成阴性结果、非特异扩增和灵敏度下降等严重问题。以上问题影响了CaMV 35S启动子作为筛查元件的可靠性，并给转基因筛查工作造成了困难。 

发明内容

本发明的目的就在于克服现有转基因筛查技术中CaMV 35S启动子检测方法在检测工作中存在的不足，提供一种通用的CaMV 35S启动子定量检测方法。 

本发明的目的是这样实现的： 

一、一种通用的CaMV 35S启动子定量检测方法 

本方法包括下列步骤： 

①收集CaMV 35S启动子增强子保守区序列： 

收集GMDD（GMO Detection Method Database，转基因检测方法数据库，http://gmdd.shgmo.org/）所公布的不同转化事件来源的CaMV 35S启动子序列， 通过其序列比对结果，以其增强子序列的保守区为检测靶标，其序列特征是： 

由来源于野生型CaMV 35S启动子第7018至7344个碱基组成，如图1所示： 

②利用该序列特征设计引物探针： 

a、合成引物序列如下： 

35SEnhF187：5’CATCATTGCGATAAAGGAAAGGC 3’和35SEnhR311：5’TGCTTTGAAGACGTGGTTGGA 3’； 

b、合成TaqMan探针序列如下： 

35SEnhFP230：5’FAM－CCGACAGTGGTCCCAAAGATGG－BHQ13’； 

③PCR扩增： 

提取样品总DNA，分别利用上述引物35SEnhF187/35SEnhR311和探针35SEnhFP230组合进行荧光定量PCR扩增； 

④建立标准曲线： 

以含有CaMV 35S启动子的转基因油菜OXY235基因组DNA为研究模型，利用相同浓度非转基因油菜基因组DNA稀释至不同含量，以100ng的混和油菜基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应并建立标准曲线； 

⑤定量体系的精确性验证： 

以标准曲线为参照测定含有OXY235基因组DNA的混和油菜基因组DNA样品中CaMV 35S启动子的量。 

工作机理： 

本检测方法的建立必须包括特异性分析、灵敏度分析以及将待测样品的Ct值代入已知浓度DNA建立的标准曲线，根据标准曲线计算出待测样品Ct值对应的拷贝数来进行精确性验证，本方法均有涉及并且经实验验证，具有很高的精确度。 

二、应用 

应用于含有CaMV 35S启动子的转基因作物的定量检测 

已经实验验证的可进行定量检测的转基因作物包括：转基因油菜OXY235和Topas19/2；转基因水稻科丰6号和克螟稻；转基因大豆A2704-12和A5547-127。 

与现有CaMV 35S启动子检测方法相比，本发明具有下列优点和积极效果： 

1、避免了现有一些CaMV 35S启动子检测方法存在的检测引物/探针与检测 靶标序列不完全匹配的问题； 

2、避免了现有一些CaMV 35S启动子检测方法存在的两侧引物结合位点数不同而引起的多条扩增产物的问题； 

3、适用于含有CaMV 35S启动子的转基因油菜、水稻、大豆等转基因作物的定量检测。 

附图说明

图1是CaMV 35S启动子增强子序列的保守区序列结构图； 

图2是本方法定量检测引物探针及其位置图； 

图3是本方法检测不同浓度转基因油菜OXY235定量扩增曲线图； 

图4是本方法检测不同浓度转基因油菜OXY235定量扩增标准曲线图； 

图5是本方法检测转基因油菜OXY235定量扩增曲线图； 

图6是本方法检测转基因油菜Topas19/2定量扩增曲线图； 

图7是本方法检测转基因水稻科丰6号定量扩增曲线图； 

图8是本方法检测转基因水稻克螟稻定量扩增曲线图； 

图9是本方法检测转基因大豆A2704-12定量扩增曲线图； 

图10是本方法检测转基因大豆A5547-127定量扩增曲线图。 

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明详细说明： 

一、定量检测方法 

1、准备工作：利用SDS法提取转基因作物DNA模板 

先将20%SDS预热到65°C，取15ml SDS抽提buffer（0.1TrisHCl,0.05MEDTA,1M NaCl pH8.0）加入到50ml离心管，再加入2.5μlβ巯基乙醇，混匀；液氮研磨3g左右的转基因油菜OXY235叶片和Topas19/2叶片;转基因水稻科丰6号种子和克螟稻种子；转基因大豆A2704-12种子和A5547-127种子，将粉末转至50ml含抽提buffer的50ml离心管中，在振荡器上振荡混匀，加入2ml预热的20%SDS，混匀，65°C水浴至少30分钟，其间要轻轻摇动试管；水浴后，迅速将离心管置于冰上，加入3ml 3MKAc，混匀，在冰上放置30分钟；4°C 5000g 离心5min；将上清转移到新的50ml离心管中，加入2/3体积的异丙醇，混匀，-20°C放置30min以上；6000g，4°C离心15min，倒掉上清，用75%乙醇洗一遍，真空干燥，用超纯水溶解DNA，溶解后，将溶液转移到15ml的离心管中；按DNA溶解体积的1%加蛋白酶K，55°C水浴30min；加入等体积苯酚，混匀，轻摇30min，8000g离心10min；转移上清至新的tube中，加等体积的苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），轻摇20min，8000g离心15min；转移上清至新的tube中，加等体积的氯仿-异戊醇（24:1）,轻摇20min，8000g离心15min；吸取上清，每管加入5μl RNase,混匀，37°C水浴1hr降解RNA；用等体积的苯酚抽提一次，轻摇20min,8000g离心15min；转移上清至新的离心管中，加等体积的氯仿-异戊醇（24:1）,轻摇20min，8000g离心15min；吸上清加入1/10体积3MNaAC,混匀，加入等体积异丙醇，-20°C放置30min，沉淀DNA；6000g，4°C离心15min，倒掉上清，用75%乙醇洗2遍，离心去掉75%乙醇，真空干燥；干燥后，用超纯水溶解DNA备用。 

2、具体操作： 

收集GMDD所公布的不同转化事件来源的CaMV 35S启动子序列，通过其序列比对结果，以其增强子序列的保守区，如图1所示，为检测靶标合成引物，合成引物序列如下：35SEnhF187：5’CATCATTGCGATAAAGGAAAGGC 3’和35SEnhR311：5’TGCTTTGAAGACGTGGTTGGA 3’；合成TaqMan探针序列如下：35SEnhFP230：5’FAM－CCGACAGTGGTCCCAAAGATGG－BHQ 13’； 

利用本发明中所提供序列设计的CaMV 35S启动子定量PCR检测方法 

合成引物序列如下：35SEnhF187：5’CATCATTGCGATAAAGGAAAGGC 3’和35SEnhR311：5’TGCTTTGAAGACGTGGTTGGA 3’。合成TaqMan探针序列如下：35SEnhFP230：5’FAM－CCGACAGTGGTCCCAAAGATGG－BHQ13’。 

针对CaMV 35S启动子增强子保守区的序列设计引物、探针组合用于荧光定量PCR分析。荧光定量PCR分析在一台CFX96Real-Time System(Bio-Rad,Hercules,USA)上进行，检测及分析软件为CFX Manager Version 1.6(Bio-Rad,Hercules,USA)。 

转基因油菜OXY-235基因组DNA被相同浓度非转基因油菜DNA稀释至不同含量，以100ng的混和油菜基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。不同稀释 倍数，分别含100，20，4，0.8，0.16ng OXY235基因组DNA的混和DNA样品被用于建立标准曲线。所有的荧光定量反应都重复4次。 

CaMV 35S启动子定量检测反应体积25μl，含模板DNA1μl，其他组分含量为：1x TaqMan Universal Master,引物35SEnhF187和35SEnhR311800μM,探针35SEnhFP230400μM。 

TaqMan反应条件为：95°C 2分钟预变性以后，进行50次PCR循环：95°C15秒变性，60°C 1分钟退火及延伸，收集荧光信号。 

根据标准曲线优化的结果，利用与建立标准曲线相同的PCR反应条件，以标准曲线为参照测定含有OXY-235基因组DNA的混和油菜基因组DNA样品中OXY-235基因组DNA的量。取100ng基因组DNA为模板，利用不同含量标准样品做标准曲线，根据获得的标准曲线和转基因样品的Ct值，计算CaMV 35S启动子基因组DNA的质量，从而计算出CaMV 35S启动子在样品中的含量。所有荧光定量反应都重复4次。 

二、定量检测方法的应用 

上述，可进行定量检测的转基因作物包括：转基因油菜OXY235和Topas19/2；转基因水稻科丰6号和克螟稻；转基因大豆A2704-12和A5547-127。 

实验方法： 

针对CaMV 35S启动子增强子保守区的序列设计引物引物35SEnhF187和35SEnhR311、探针35SEnhFP230组合用于荧光定量PCR检测。 

转基因油菜OXY235和Topas19/2；转基因水稻科丰6号和克螟稻；转基因大豆A2704-12和A5547-127的初始模板浓度均稀释为20ng/μl。 

CaMV 35S启动子定量检测反应体积25μl，含模板DNA1μl，其他组分含量为：1x TaqMan Universal Master,引物35SEnhF187和35SEnhR311800μM,探针35SEnhFP230400μM。 

TaqMan反应条件为：95°C 2分钟预变性以后，进行50次PCR循环：95°C15秒变性，60°C 1分钟退火及延伸，观察扩增情况。所有荧光定量反应都重复4次。 

三、实验结果 

1）CaMV 35S启动子PCR扩增 

利用引物35SEnhF187和引物35SEnhR311扩增出约125bp的片段。 

2）利用本发明中所提供序列设计的CaMV 35S启动子定量PCR检测方法 

利用如图2所示的引物探针组合，进行荧光定量PCR反应。根据梯度稀释模板，4次重复获得的荧光曲线信息，如图3所示。 

为了验证本研究中建立的定量方法的精确性，我们使用了从标准转基因油菜OXY-235产品中提取的基因组DNA用非转基因油菜基因组DNA稀释至一定含量，并以不含转基因油菜OXY-235基因组DNA的相同量基因组DNA做对照，作为实时荧光定量PCR反应的模板，并根据相同条件下获得针对CaMV 35S启动子的特异性荧光定量PCR反应的标准曲线，计算不同样品中转基因油菜基因组DNA的含量。如图4所示，其R²值为0.993，表明外源基因的拷贝数与荧光强度都具有良好的对应关系，适合用于外源基因的精确定量。 

以不含转基因植物的非转基因植物基因组DNA为模板，没有扩增产物被检测到。对于混和实验样品，用本研究中建立CaMV 35S启动子荧光定量检测方法来检测，都和理论值非常接近，误差小于15％。 

以转基因油菜OXY235和Topas19/2；转基因水稻科丰6号和克螟稻；转基因大豆A2704-12和A5547-127这六种含有CaMV 35S启动子的基因组DNA为模板，都有扩增曲线被观察到，如图5-10所示，其荧光定量扩增Ct值均处于阳性的范围内，如下表所示，说明本方法在转基因检测领域具有广泛应用性。 

从以上结果可以看出，本发明为CaMV 35S启动子的定量检测分析提供了一种基于简单、可靠的测定方法，可以用于不同来源、不同含量CaMV 35S启动子的混和产品中的定量检测。本发明为转基因标识提供了一种有用的参考，对转基因产品的控制提供了必要的手段。 

序列表

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>一种通用的CaMV 35S启动子定量检测方法

<140>

<141>

<160> 3

 

<210> 1

<211> 23

<212> 合成引物

<400>

35SEnhF187：5’CATCATTGCGATAAAGGAAAGGC 3’

 

<210> 2

<211> 21

<212> 合成引物

<400>

35SEnhR311：5’TGCTTTGAAGACGTGGTTGGA 3’

 

<210> 3

<211> 22

<212> 合成探针

<400>

35SEnhFP230：5’FAM－CCGACAGTGGTCCCAAAGATGG－BHQ1 3’。

Claims (1)

1.一种通用CaMV 35S启动子定量检测方法，其特征在于：

①收集CaMV 35S启动子增强子保守区序列：

收集GMDD（GMO Detection Method Database，转基因检测方法数据库，http://gmdd.shgmo.org/）所公布的不同转化事件来源的CaMV 35S启动子序列，通过其序列比对结果，以其增强子序列的保守区为检测靶标，其序列特征是：

由来源于野生型CaMV 35S启动子第7018至7344个碱基组成，如图1所示：

②利用该序列特征设计引物探针：

a、合成引物序列如下：

35SEnhF187：5’CATCATTGCGATAAAGGAAAGGC 3’和35SEnhR311：5’TGCTTTGAAGACGTGGTTGGA 3’；

b、合成TaqMan探针序列如下：

35SEnhFP230：5’FAM－CCGACAGTGGTCCCAAAGATGG－BHQ13’；

③PCR扩增：

提取样品总DNA，分别利用上述引物35SEnhF187/35SEnhR311和探针35SEnhFP230组合进行荧光定量PCR扩增；

④建立标准曲线：

以含有CaMV 35S启动子的转基因油菜OXY235基因组DNA为研究模型，利用相同浓度非转基因油菜基因组DNA稀释至不同含量，以100ng的混和油菜基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应并建立标准曲线；

⑤定量体系的精确性验证：

以标准曲线为参照测定含有OXY235基因组DNA的混和油菜基因组DNA样品中CaMV 35S启动子的量。

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