CN105255864A - Dna条形码结合二代高通量测序快速鉴别a型流感病毒亚型的引物组和方法 - Google Patents

Dna条形码结合二代高通量测序快速鉴别a型流感病毒亚型的引物组和方法 Download PDF

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CN105255864A CN201510665904.0A CN201510665904A CN105255864A CN 105255864 A CN105255864 A CN 105255864A CN 201510665904 A CN201510665904 A CN 201510665904A CN 105255864 A CN105255864 A CN 105255864A
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孙涛
尹伟力
房保海
岳志芹
梁成珠
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Abstract

本发明公开了一种DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型方法用的引物组和方法，包括下列步骤：（1）基因组提取及反转录；（2）引物设计与PCR扩增；（3）Ion？Torrent测序；（4）生物信息学分析；（5）系统进化分析与遗传距离计算。本发明通过对16种不同地域和亚型的A型流感病毒材料的序列进行分析，发现了可区分各亚型的DNA条码；利用DNA条形码技术思路，采用传统RT-PCR检测方法，优选touch-down程序可以快速判定有无流感病毒，并能同时测定A型流感病毒的亚型及致病型，是一种更简单，更快速流感分型诊断程序。

Description

DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型的引物组和方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型方法用的引物组和方法，属于生物基因工程领域。
背景技术：
根据流感病毒表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，A型流感病毒可分为18种HA亚型和11种NA亚型。但由于病毒依赖于RNA的RNA聚合酶缺少校对功能，导致其在复制过程中基因组的突变率较高。统计数据表明，我国已新发现包括H10N8、H5N2、H7N9在内的三种新发亚型禽流感病毒的感染，每年爆发的数量和季节性的差异也表明流感在不同宿主间交叉传播也愈加频繁。而传统的基于核酸扩增的鉴定手段往往不能快速的给予核酸信息，给病毒的全面准确检测带来了极大的挑战。
目前，二代高通量测序技术越来越广泛用于病原基因的分析，是大规模监测病毒基因组进化的重要手段。在流感病毒的研究上，传统方法分析鉴定病毒通常采用Hoffmann等设计的方法扩增流感病毒基因组全长，或者以病毒特异引物扩增分型基因片段，进行Sanger法克隆测序，该方法耗时长，劳动力成本高，不适合大规模检测使用。而二代高通量测序不需要大肠杆菌系统进行DNA模板扩增。其基本测序方法是将基因组DNA随机切割成小片段DNA分子，然后在体外给这些小片段分子的末端连接上接头制成文库避免了Sanger测序法所需的繁琐克隆过程。同时，DNA条形码技术的便捷性大大适应了二代测序技术的发展，可无需扩增全长进定，且引物使用简单，只需通过使用一段标准DNA片段,在二代测序技术的辅助下，即可通过测序获取相应的型别信息。
研究人员曾用coI基因鉴别出了含禽流感病毒的26种野生鸟类，能准确的识别鸟类宿主禽流感病毒的脱落、研究候鸟流感流行病学的规律和宿主种群生态学。但对病毒亚型本身的条码技术开发尚未见相应报道。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题利用DNA条形码理念，寻找A型流感病毒适合的条形码序列，一方面足够保守能够利用条码引物进行A型流感病毒的大范围扩增，另一方面具备足够的变异能够区分密切相关的亚型。同时对扩增的条码片段进行高通量测序技术，以开发更加广谱、便捷的通用流感分型检测技术。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
本发明提供了DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型方法用的引物组，引物序列如下：
(1)
HA-barcoding-F：GGAATGATHGAYGGNTGGTATGGCA
HA-barcoding-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTGCA
(2)
NA-barcoding-F：GTAAAACGACGGCCAGTGRACHCARGARTCIKMR
NA-barcoding-R：CAGGAAACAGCTATGACCCIIKCCARTTRTCYCTR。
利用上述本发明提供的引物组，还提供一种DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型的方法，包括下列步骤：
(1)基因组提取及反转录
(2)引物设计与PCR扩增
(3)Ion Torrent测序
(4)生物信息学分析
(5)系统进化分析与遗传距离计算。
所述的基因组提取及反转录具体步骤为：
按QIAGen RNA提取试剂盒操作步骤提取RNA，每份病毒RNA样品溶解于50μL的RNase水，12000rpm离心2min，立即开始反转录，以U125’-agcaaaagcagg-3’为引物，参照TaKaRa公司1st strand cDNA Synthesis Kit cDNA试剂盒使用说明加入试剂，RT反应条件为：30℃10min，42℃40min，70℃15min，-80℃保存。
所述的引物设计与PCR扩增具体步骤为：
在NCBI流感病毒库中，下载16种HA亚型和9种NA亚型的全长序列，同一区域同一年代只选一株为代表，设计DNA条形码引物，设计的引物和预期目的片段大小具体见下表：
利用HA条码引物进行PCR，设置程序为：94℃2min，30个循环{94℃1min，52℃，1min，72℃3min}，68℃10min；
扩增NA基因的保守条码片段，因扩增产物G+C含量百分比不同，退火温度会有差异，故PCR反应采用touch-down程序：
94℃2min；
{94℃30S，53℃30S每个循环递减1℃直到45℃；68℃45S}；8个循环
{94℃30S，50℃30S，68℃45S}；30个循环
68℃10min；
-20℃保存。
所述的Ion Torrent测序具体步骤为：
上述样本全部扩增完毕后，进行电泳鉴定，用PCR纯化试剂盒进行纯化。分别取100ng纯化产物，HA扩增产物用Ion ShearTM Plus Reagent Kit进行酶切打断5min(因测序范围足够，NA扩增产物不需酶切)，酶切产物需加入1.8倍体积XP Beads纯化，然后HA扩增产物加入Ion X pressTM Barcode 1接头，NA扩增产物加入Ion X pressTM Barcode 2接头，E-Gel胶选择片段(约330bp)构建文库。用PCR扩增试剂盒进行文库扩增，IonLibraryqPCR Mix鉴定文库质量。取70μL终浓度为50pmol/μL的工作文库Ion ChefSystem上机,进行油包水PCR和碱裂解法制备单链模板，最后将带有模板的微粒溶液自动点样至314芯片中，上机Ion torrent PGM进行高通量测序。
所述的生物信息学分析具体步骤为：
上机测序后经PGM测序仪自动运行得到的测序结果，解析为sff格式的原始文件fastq格式的测序序列数据。将fastq格式的测序序列进行过滤，筛除低质量序列、过段序列及错误序列。选取GenBank中批量下载的各亚型流感病毒HA\NA全基因序列作为参考序列，将测序数据使用CLC Genomic Worbench软件比对到参考序列中，通过覆盖参考序列的序列数量、比例以及参考序列被覆盖的长度判断样品中是否有对应亚型的病毒。
所述的系统进化分析与遗传距离计算具体步骤为：
构建系统发育树，将测定的序列与GenBank中参考序列在MEGA5.0的CLAST中比对，除去两条引物之外的序列，基于邻接法(neighbor-joining method)构建系统进化树，并且计算遗传距离。运算次数为1000，核酸替换模型为采用国际提倡的K-2P，K2P距离与P距离相比考虑了转换和颠换的替代率，是在变异很小时区分物种的最佳模型也是生物条形码联盟推荐使用的距离计算模型。
本发明的有益效果：
极其多样的流感病毒亚型广泛存在于我们周围的环境和动物体内，其中很多亚型种类为人类所未知，而发现未知病毒亚型常常受制于病毒常规检测技术的局限性。传统的流感病毒测序，通常采用HA、NA基因的特异引物获取相应亚型的基因片段，进行克隆，选择阳性克隆进行Sanger法测序，然后进行序列的比对，方法操作比较繁琐、费时，而且需要大量的优化，产物得率较低且杂带较多，不适于实际的常规监测或诊断。自从2005年高通量测序仪问世以来，高通量测序技术不断发展，从通量到读长得到了极大的改善，具有标准化流水作业的文库构建流程，避免了常规试验中的细菌转化、培养以及单克隆的挑选，而且短时间内可以获得大量有效的数据。
本发明通过对16种不同地域和亚型的A型流感病毒材料的序列进行分析，发现了可区分各亚型的DNA条码。研究人员曾提出利用条形码序列有效进行鉴别的关键点是种间的遗传距离必须大于种内，且距离差异大约为10倍。本发明中的HA型间平均遗传距离为0.550，高于型内平均遗传距离0.032。NA型间平均遗传距离为0.585，均高于型内遗传距离0.150。分析系统树显示，各亚型均能自成一支形成单系。
本发明利用DNA条形码技术思路，采用传统RT-PCR检测方法，优选touch-down程序可以快速判定有无流感病毒，并能同时测定A型流感病毒的亚型及致病型，是一种更简单，更快速流感分型诊断程序。
附图说明：
图1是包含16种HA亚型的16株不同实验株HA条码区段的RT-PCR扩增结果。M DNA MarkerDL 2000；1. H1N1；2. H2N9；3. H3N8；4. H4N1；5. H5N1；6. H6N5；7. H7N2；8. H8N4；9. H9N2；10. H10N7；11. H11N6.；12. H12N5；13. H13N6；14. H14N5；15. H15N8；16. H16N3。
图2是包含9种NA亚型的16株不同实验株的NA条码区段的RT-PCR扩增结果。从左到右依次为MarkerDL 2000；1. H1N1；2. H4N1；3. H5N1；4. H7N2；5. H9N2；6. H16N3；7. H8N4；8. H6N5；9. H12N5；10. H14N5；11. H11N6；12. H13N6；13. H10N7；14. H3N8；15. H15N8；16. H2N9；MarkerDL2000。
图3是HA核酸文库及不同稀释度标准样品的扩增曲线。1:6.8pM标准品扩增曲线2:0.68pM标准品扩增曲线3:0.068pM标准品扩增曲线HA：目标检测文库扩增曲线。
图4是NA核酸文库及不同稀释度标准样品的扩增曲线。1:6.8pM标准品扩增曲线2:0.68pM标准品扩增曲线3:0.068pM标准品扩增曲线NA：目标检测文库扩增曲线。
图5是Ion Torrent测序仪读取序列数。
图6是HA亚型间遗传距离。
图7是NA亚型间遗传距离。
具体实施方式：
本实施例提供一种利用DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型方法。
1材料和方法
1.1毒株材料(09pdm猪流感H1N1，马流感H3N8，禽流感H2N9、H4N1、H5N1、H7N2、H9N2、H13N6、H16N3)灭活样本由本实验室保存，H6N5、H8N4、H10N8、H11N6、H12N5、H14N5、H15N8核酸样本由吉林出入境检疫检疫局惠赠(详见下表)
NO. Isolate Acc.no.
1 A/swine/Shandong/01/2009(H1N1) KM368313
2 A/duck/Nanchang/4-190/2000(H2N9) CY117211
3 A/equine/Haerbin/01/2010(H3N8) KM892526
4 A/duck/Hong Kong/951/1980(H4N1) AB292404
5 A/chicken/Shandong/K01/2004(H5N1) DQ767725
6 A/duck/Guangxi/1455/2004(H6N5) HM144533
7 A/duck/Hong Kong/293/78(H7N2) CY006029
8 A/mallard/Wisconsin/426/1979(H8N4) CY180660
9 A/chicken/Shandong/sx01/2008(H9N2) KM977625
10 A/duck/Guangdong/E1/2012(H10N8) JQ924786
11 A/mallard/California/6720/2009(H11N6) CY120526
12 A/thick-billed murre/Canada/1813/2011(H12N5) CY149620
13 A/Mongolian gull/Mongolia/401/2007(H13N6) GQ907310
14 A/mallard/Astrakhan/263/1982(H14N5) CY130094
15 A/duck/Australia/341/83(H15N8) L43916
16 A/mallard/Quebec/02916-1/2009(H16N3) CY125606
1.2分子生物学试剂XP Reagent为Thermo公司产品；Rneasy Mini Kit为QIAGen公司产品；1st strand cDNA Synthesis Kit cDNA反转录试剂盒、EX-Taq聚合酶、Solution Ⅰ连接酶、Agarose Gel DNA Extration Kit试剂盒购自TaKaRa公司；Ion ShearTMPlus Reagent Kit、Ion X pressTM Barcode X、PCR SuperMix、Library Ampl ificationPrimer Mix、Ion LibraryqPCR Mix试剂盒均为Life Technologies公司产品。
1.3主要仪器StepOne PLUS荧光PCR仪购自ABI公司。Ion Chef System核酸前处理仪，Ion Torrent测序仪购自美国Thermo公司。
1.4基因组提取及反转录按QIAGen RNA提取试剂盒操作步骤提取RNA，每份病毒RNA样品溶解于50μL的RNase水，12000rpm离心2min，立即开始反转录，以U12 5’-agcaaaagcagg-3’为引物[14]，参照TaKaRa公司1st strand cDNA Synthesis Kit cDNA试剂盒使用说明加入试剂，RT反应条件为：30℃10min，42℃40min，70℃15min，-80℃保存。1.5引物设计与PCR扩增在NCBI流感病毒库中，批量下载16种HA亚型和9种NA亚型的全长序列，同一区域同一年代只选一株为代表，通过MEGA5.0软件的Align模块比对所有HA亚型全长基因，寻找流感病毒HA和NA的标志序列，设计DNA条形码引物(见下表)并送invitrogen公司合成。利用HA条码引物进行PCR，设置程序为：94℃2min，30个循环{94℃1min，52℃，1min，72℃3min}，68℃10min；扩增NA基因的保守条码片段，因扩增产物G+C含量百分比不同，退火温度会有差异，故PCR反应采用touch-down程序：94℃2min，{94℃30S，53℃30S每个循环递减1℃直到45℃；68℃45S}8个循环。{94℃30S，50℃30S，68℃45S}30个循环，68℃10min。-20℃保存。
设计的引物和预期目的片段大小
1.6Ion Torrent测序上述样本全部扩增完毕后，进行电泳鉴定，用PCR纯化试剂盒进行纯化。分别取100ng纯化产物，HA扩增产物用Ion ShearTM Plus Reagent Kit进行酶切打断5min(因测序范围足够，NA扩增产物不需酶切)，酶切产物需加入1.8倍体积XP Beads纯化，然后HA扩增产物加入Ion X pressTM Barcode 1接头，NA扩增产物加入Ion X pressTMBarcode 2接头，E-Gel胶选择片段(约330bp)构建文库。用PCR扩增试剂盒进行文库扩增，Ion LibraryqPCR Mix鉴定文库质量。取70μL终浓度为50pmol/μL的工作文库Ion Chef System上机,进行油包水PCR和碱裂解法制备单链模板，最后将带有模板的微粒溶液自动点样至314芯片中，上机Ion torrent PGM进行高通量测序。
1.7生物信息学分析上机测序后经PGM测序仪自动运行得到的测序结果，解析为sff格式的原始文件fastq格式的测序序列数据。将fastq格式的测序序列进行过滤，筛除低质量序列、过段序列及错误序列。选取GenBank中批量下载的各亚型流感病毒HA\NA全基因序列作为参考序列，将测序数据使用CLC Genomic Worbench软件比对到参考序列中，通过覆盖参考序列的序列数量、比例以及参考序列被覆盖的长度判断样品中是否有对应亚型的病毒。
1.8系统进化分析与遗传距离计算构建系统发育树，将测定的序列与GenBank中参考序列在MEGA5.0的CLAST中比对，除去两条引物之外的序列，基于邻接法(neighbor-joiningmethod)构建系统进化树，并且计算遗传距离。运算次数为1000，核酸替换模型为采用国际提倡的K-2P，K2P距离与P距离相比考虑了转换和颠换的替代率，是在变异很小时区分物种的最佳模型也是生物条形码联盟推荐使用的距离计算模型。
2结果
2.1条形码引物扩增结果16种不同血凝素亚型的毒株RT-PCR均能扩增出640bp的目的片段，15株毒株样本的9种神经氨酸酶亚型均能扩增出约253bp的条带，1％的凝胶电泳与预期大小相符。条带见图1和图2。
2.2文库的鉴定分别取5μL 500倍稀释后的扩增样本，使用Ion LibraryqPCRMix荧光定量法进行浓度测定，标准品梯度稀释成6.8pM～0.068pM的标准品，每个梯度做两个平行，进行实时荧光RT-PCR检测，根据质粒拷贝数与Ct值的相关性，由SDS软件2.1得HA样品的标准曲线为Y＝-3.315X+17.284相关度R2＝0.996(图3)。目标检测文库检测浓度约为163pM。NA样品的标准曲线为Y＝-3.315X+17.284相关度R2＝0.996(图4)。目标检测文库检测浓度约为700pM符合上机要求，结果如下：
2.3 Ion Torrent测序测得17.7M数据(图5所示)，其中与16种HA亚型条码基因匹配reads数为1725436，与9种NA亚型样本匹配reads数为910438。
2.4生物信息学分析
分别选择与每个HA结合的不同NA亚型代表株和与每个NA结合的不同HA亚型构建N-J进化树，所有A型流感病毒的HA和NA序列均有一个共同的祖先，HA和NA亚型均能形成各自独立的分支。
2.5遗传距离计算
如图6-7所示，采用MEGA5.0中的Distance模块，Variance Estimation Method设置为Bootstrap method，1000次，核苷酸替换模型为P-distance。计算H1-H16亚型型内平均遗传距离分别为：0.135、0.091、0.143、0.122、0.109、0.094、0.148、0.089、0.111、0.140、0.148、0.127、0.156、0.054、0.071，部分亚型遗传距离变化范围较大，可能由这些亚型宿主范围广，遗传变异复杂，多个分支并存所致。而如H14、H15仅在野生鸟类分离到变化幅度较小。HA型间平均距离为0.55。
N1-N9亚型内的平均遗传距离分别为：0.145、0.109、0.141、0.167、0.183、0.169、0.165、0.163、0.114。亚型间遗传距离平均值为0.585。
核苷酸序列表
<110> 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> DNA 条形码结合二代高通量测序快速鉴别 A 型流感病毒亚型的引物组和方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(25)
<223> 用于扩增AIV-HA的上游引物
<400> 1
GGAATGATHGAYGGNTGGTATGGCA 25
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(38)
<223> 用于扩增AIV-HA的下游引物
<400> 2
ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTGCA 38
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(34)
<223> 用于扩增AIV-NA的上游引物
<400> 3
GTAAAACGACGGCCAGTGRACHCARGARTCIKMR 34
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(35)
<223> 用于扩增AIV-NA的下游引物
<400> 4
CAGGAAACAGCTATGACCCIIKCCARTTRTCYCTR 35

Claims (7)

1.DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型方法用的引物组，其特征在于，引物序列如下：
（1）
HA-barcoding-F：GGAATGATHGAYGGNTGGTATGGCA
HA-barcoding-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTGCA
（2）
NA-barcoding-F：GTAAAACGACGGCCAGTGRACHCARGARTCIKMR
NA-barcoding-R：CAGGAAACAGCTATGACCCIIKCCARTTRTCYCTR。
2.DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型的方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）基因组提取及反转录
（2）引物设计与PCR扩增
（3）Ion Torrent 测序
（4）生物信息学分析
（5）系统进化分析与遗传距离计算。
3.根据权利要求2所述的鉴别A型流感病毒亚型的方法，其特征在于，所述的基因组提取及反转录具体步骤为：
按QIAGen RNA提取试剂盒操作步骤提取RNA，每份病毒RNA样品溶解于50μL的RNase水，12000rpm离心2min，立即开始反转录，以U12 5’- agcaaaagcagg-3’为引物，参照TaKaRa公司1st strand cDNA Synthesis Kit cDNA试剂盒使用说明加入试剂，RT反应条件为：30℃10min，42℃40min，70℃15min，-80℃保存。
4.根据权利要求2所述的鉴别A型流感病毒亚型的方法，其特征在于，所述的引物设计与PCR扩增具体步骤为：
在NCBI流感病毒库中，下载16种HA亚型和9种NA亚型的全长序列，同一区域同一年代只选一株为代表，设计DNA条形码引物，
引物序列如下：
（1）
HA-barcoding-F：GGAATGATHGAYGGNTGGTATGGCA
HA-barcoding-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTGCA
（2）
NA-barcoding-F：GTAAAACGACGGCCAGTGRACHCARGARTCIKMR
NA-barcoding-R：CAGGAAACAGCTATGACCCIIKCCARTTRTCYCTR；
利用HA条码引物进行PCR，设置程序为：94℃2min，30个循环｛ 94℃ 1min， 52℃，1min， 72℃ 3min｝，68℃10min；
扩增NA基因的保守条码片段，PCR反应采用touch-down程序：
94℃2min；
｛ 94℃ 30S， 53℃ 30S每个循环递减1℃ 直到45℃；68℃ 45S｝；8个循环
｛ 94℃ 30S，50℃ 30S， 68℃ 45S｝；30个循环
68℃10min；
-20℃保存。
5.根据权利要求2所述的鉴别A型流感病毒亚型的方法，其特征在于，所述的Ion Torrent 测序具体步骤为：
扩增完毕后，进行电泳鉴定，用PCR纯化试剂盒进行纯化；
分别取100ng 纯化产物，HA扩增产物用Ion ShearTM Plus Reagent Kit进行酶切打断5min，NA扩增产物不需酶切，酶切产物需加入1.8倍体积AMPure® XP Beads纯化，然后HA扩增产物加入 Ion X pressTM Barcode 1接头，NA扩增产物加入 Ion X pressTM Barcode 2接头，E-Gel胶选择片段构建文库；
用Platimun® PCR扩增试剂盒进行文库扩增，Ion Library TaqMan® qPCR Mix鉴定文库质量；
取70μL终浓度为50pmol/µL的工作文库Ion Chef System上机，进行油包水PCR和碱裂解法制备单链模板，最后将带有模板的微粒溶液自动点样至314芯片中，上机Ion torrent PGM进行高通量测序。
6.根据权利要求2所述的鉴别A型流感病毒亚型的方法，其特征在于，所述的生物信息学分析具体步骤为：
上机测序后经PGM测序仪自动运行得到的测序结果，解析为sff格式的原始文件fastq格式的测序序列数据；
将fastq格式的测序序列进行过滤，筛除低质量序列、过段序列及错误序列；
选取GenBank中批量下载的各亚型流感病毒HA\NA全基因序列作为参考序列，将测序数据使用CLC Genomic Worbench 软件比对到参考序列中，通过覆盖参考序列的序列数量、比例以及参考序列被覆盖的长度判断样品中是否有对应亚型的病毒。
7.根据权利要求2所述的鉴别A型流感病毒亚型的方法，其特征在于，所述的系统进化分析与遗传距离计算具体步骤为：
构建系统发育树，将测定的序列与GenBank中参考序列在MEGA5.0的CLAST中比对，除去两条引物之外的序列，基于邻接法构建系统进化树，并且计算遗传距离；运算次数为1000，核酸替换模型为采用国际提倡的K-2P。
CN201510665904.0A 2015-10-15 2015-10-15 Dna条形码结合二代高通量测序快速鉴别a型流感病毒亚型的引物组和方法 Pending CN105255864A (zh)

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