CN111926113A

CN111926113A - 一种用于快速检测禽呼肠孤病毒的引物组和探针、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111926113A
Application number: CN202010673545.4A
Authority: CN
Inventors: 马磊; 朱孟杰; 连凯琪; 张明亮
Original assignee: Anyang Institute of Technology
Current assignee: Anyang Institute of Technology
Priority date: 2020-07-14
Filing date: 2020-07-14
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2040-07-14
Also published as: CN111926113B

Abstract

本发明公开了一种用于快速检测禽呼肠孤病毒的引物组和探针、试剂盒及方法，使用本发明提供的引物组和探针进行的逆转录重组酶聚合酶扩增方法在39℃恒温条件下进行扩增反应，扩增反应可以通过荧光曲线实时观察，20分钟即可完成扩增反应出具结果，是目前所有核酸扩增技术中出具结果速度最快的。本发明还提供了一种快速检测禽呼肠孤病毒（ARV）的试剂盒。本发明提供的禽呼肠孤病毒（ARV）的检测方法及试剂盒操作简便快速，特异性高，检测效果特异性好，检测灵敏度达到1×10²拷贝/μL。

Description

一种用于快速检测禽呼肠孤病毒的引物组和探针、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于核酸检测技术研发领域，具体涉及一种用于快速检测禽呼肠孤病毒的引物组和探针、试剂盒及方法。

背景技术

禽呼肠孤病毒(ARV)是禽类主要传染性病毒之一，可以导致感染的禽类发生多种疾病。ARV可感染鸡、火鸡、鹅、鸭、鹧鸪等多种鸟类，引起关节炎/腱鞘炎、肠道疾病、呼吸系统疾病、中枢神经系统疾病等多种疾病综合征等。ARV在家禽和野生鸟类的的分离在世界多个国家都有报告。养殖场商品肉鸡ARV与其他病原菌共感染，导致饲料转化率低、增重低、适销性降低，造成巨大的经济损失。为了加强对ARV感染的监测和诊断，一种简单、灵敏、有效的检测方法是有效控制和预防ARV进一步扩大感染的关键。

病毒分离是临床样本中诊断ARV的经典检测方法。病毒在单层细胞中培养需要5-7天的时间才能产生病毒细胞病变效应。此外，通常需要2到3个连续的细胞传代来确认假阳性结果。与细胞培养法相比，分子诊断技术更灵敏、快速，比如常用的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)，但需要精密的热循环设备和精细的操作规程。环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)技术不要热循环设备，恒温下可以完成反应，但仍需一小时左右才能得到结果。RPA技术是2006年发明的一项恒温扩增技术，但它在过去几年中引起了人们的极大关注。RPA反应由三种核心蛋白启动：重组酶、链置换DNA聚合酶和单链DNA结合蛋白。最适反应温度是37℃~42℃。大量研究表明RPA技术已成功应用于细菌、病毒和寄生虫的快速检测。RPA产品的终点检测可通过核酸电泳和侧流层析试纸进行。与电泳和试纸条相比，基于探针的RPA反应可以在不到20分钟的时间内得到检测结果，不需要其他额外处理。

目前，在世界范围內，还没有关于使用RPA技术对ARV进行快速检测的报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种用于快速检测禽呼肠孤病毒的引物组和探针、试剂盒及方法，可以通过逆转录重组酶聚合酶扩增方法检测样本中是否含有ARV，实现对ARV的快速检测，不需要温度循环仪等仪器，仅需要一个恒温荧光检测仪，成本相比温度循环仪低很多，可以实现对ARV的现地检测，对于养殖场中ARV的防控具有重要的意义。

本发明的目的是以下述方式实现的：一种用于快速检测禽呼肠孤病毒的引物组和探针，其特征在于：包括：用于扩增ARV特异性序列的引物对F1和R1；和靶基因序列互补的探针；所述用于检测ARV的引物和探针是针对禽呼肠孤病毒基因组的S1基因设计的。

引物的核苷酸碱基序列如下所示：

F1：5’- TTCTCAACGAGTTTCTTTAACATCATACT -3’(SEQ ID NO.1)

R1：5’- ATGTCACTTAAATCGAAGGTTAATAACACG-3’(SEQ ID NO.2)。

该探针的序列如下：

ACTAATGCAATTTCGGTGGATGGCACGGGG(dT-FAM)(THF)C(dT-BHQ1)AACGGATCATCTGAT(C3-spacer) (SEQ ID NO.3)。

所述探针序列中标记的荧光基团为选自FAM、JOE 、HEX、VIC、CY5、TET中的一种，淬灭基团为选自TAMRA、MGB、BHQ中的一种。

一种快速检测禽呼肠孤病毒的RT-RPA试剂盒，该试剂盒包括：(1)所述权利要求1-4中任一权利要求的引物组和探针；(2)扩增靶基因序列的重组酶聚合酶试剂；（3）配置RT-RPA扩增反应体系的其他物质：模板、MgOAc (200nM )、再水化缓冲液。

一种快速检测禽呼肠孤病毒的方法，包括如下步骤：

（1）以抽提的样本RNA为模板，使用权利要求1-4所描述的引物组和探针配制RT-RPA反应体系；

（2）将反应管置于恒温荧光检测仪中进行逆转录重组酶聚合酶扩增，实时检测荧光信号，如果有指数级增长的荧光信号曲线，则说明样本中含有ARV。

步骤（1）中的RT-RPA反应体系，加入含有干粉酶的反应管，反应体系中的其他物质为：

再水化缓冲液 40.7μL

上游引物(10μM ) 2.1 μl

下游引物(10μM ) 2.1 μL

探针(10μM ) 0.6 μL

模板 2 μL

MgOAc (200nM ) 2.5 μL

总体积 50 μL

步骤（2）的RT-RPA扩增条件为：恒温39℃反应20min。

相对于现有技术，本发明提供的引物组和探针可对禽呼肠孤病毒（ARV）进行检测判定，提供的包含上述引物组和探针的试剂盒使用逆转录重组酶聚合酶扩增方法对禽呼肠孤病毒（ARV）进行检测判定，通过荧光曲线实时观察，20分钟即可完成扩增反应出具结果，是目前所有核酸扩增技术中出具结果速度最快的。探针的加入使得可以实时监测扩增产物，达到实时监测的目的。本发明提供的禽呼肠孤病毒（ARV）的检测方法及试剂盒操作简便快速，特异性高，检测效果特异性好，检测灵敏度达到1×10²拷贝/μL。

本发明提供的试剂盒采用的扩增方法是恒温条件下即可进行，无需昂贵的仪器，一台轻便的荧光检测仪就可以进行反应，使得该种检测方法可以在基层相关单位进行推广。

附图说明

图1是RT-RPA方法检测特异性实验结果图；

图2是RT-RPA灵敏度实验结果图，从左到右1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10² 、1.0×10¹、1.0×10⁰拷贝/μl 的标准品的扩增结果；

图3是RT-RPA检测临床检测实验结果和荧光定量PCR(qRT-PCR)进行比较图。横坐标是qRT-PCR检测临床样本得到的CT值，纵坐标是RT-RPA检测临床样本出现阳性结果的时间结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。本申请中未指明来源的实验所用病毒或者细菌均保存于安阳工学院生物与食品工程学院/河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室。

实施例1特异性引物的设计

本发明根据已经公开发表的ARV基因组（ARV S1133毒株，序列信息位于Genbank数据库中，序列ID: MG822668.1)序列，根据特定的引物设计准则进行引物的设计。设计原则主要包括以下几点：引物长度30bp左右，5’端避免连续的鸟嘌呤碱基，扩增产物长度最好为100-200bp，引物避免连续碱基防止发生发卡结构。本发明通过对所设计的多个引物对进行RT-RPA实验，比较不同引物对的扩增效果，筛选出一对敏感性和特异性较好的引物对，其序列如下：

F1：5’- TTCTCAACGAGTTTCTTTAACATCATACT -3’(SEQ ID NO.1)

R1：5’- ATGTCACTTAAATCGAAGGTTAATAACACG-3’(SEQ ID NO.2)

扩增片段长度为184bp。

探针序列如下：ACTAATGCAATTTCGGTGGATGGCACGGGG(dT-FAM)(THF)C(dT-BHQ1)AACGGATCATCTGAT(C3-spacer)

实施例 2：用于检测ARV的RT-RPA试剂盒的建立

试剂盒包括以下组分：

（1）实施例1所最终得到的引物组和探针：

F1：5’- TTCTCAACGAGTTTCTTTAACATCATACT -3’(SEQ ID NO.1)

R1：5’- ATGTCACTTAAATCGAAGGTTAATAACACG-3’(SEQ ID NO.2)

探针序列如下：

ACTAATGCAATTTCGGTGGATGGCACGGGG(dT-FAM)(THF)C(dT-BHQ1)AACGGATCATCTGAT(C3-spacer)

（2）目的基因扩增的重组酶聚合酶试剂，该重组酶聚合酶试剂购自英国twistDx公司；

（3）配置RT-RPA扩增反应体系的其他物质：模板、MgOAc (200nM )、再水化缓冲液。

配制如下反应体系：反应体系中所含有的上游引物、下游引物是本申请中F1：5’-TTCTCAACGAGTTTCTTTAACATCATACT -3’(SEQ ID NO.1)

R1：5’- ATGTCACTTAAATCGAAGGTTAATAACACG-3’(SEQ ID NO.2)。

再水化缓冲液 40.7μL

上游引物(10μM ) 2.1 μl

下游引物(10μM ) 2.1 μL

探针(10μM ) 0.6 μL

模板 2 μL

MgOAc (200nM ) 2.5 μL

总体积 50 μL

反应体系加入含有干粉酶的反应管，干粉酶为目的基因扩增的重组酶聚合酶试剂，该重组酶聚合酶试剂购自英国twistDx公司，干粉酶具体为重组酶、单链结合蛋白和聚合酶三种蛋白质冻干品。

实施例3 RT-RPA检测方法的建立

1、RNA标准模板的制备

将ARV S1133毒株(购于中国兽医药品监察所)感染鸡肝癌细胞(LMH细胞，购于中国兽医药品监察所)后，待细胞病变达到80%，收集该病毒液，提取RNA，以S1基因序列设计引物，上游引物：5’-ACTGTCATTGACTTCGAACG-3’ (SEQ ID NO.4),下游引物: 5’-CTCGAGTACACCCCATACGC-3’ (SEQ ID NO.5)，该区域涵盖了RT-RPA扩增序列。用One StepRT-PCR Kit试剂盒（Takara公司）进行RT-PCR。

反应体系为：Enzyme Mix 1μl，2×RT-PCR Buffer 12.5μl，上下游引物(10μM )各1μl， RNA 3 μl，加蒸馏水至25μl。

RT-PCR反应条件：50℃逆转录反应30分钟，94℃预变性2分钟，一个循环94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃40秒，共30个循环，最后72℃ 延伸10分钟。PCR 产物进行纯化后与pGEM-T Easy 载体进行连接，连接产物转化DH5α感受态细胞（北京天根生化科技有限公司），通过测序鉴定阳性重组质粒。

将阳性重组质粒进行体外转录，使用试剂盒Ribomax^TM Large Scale RNAProduction Systems（Promega公司）建议进行操作，获得体外转录RNA就是阳性对照，根据分光光度计测定的RNA浓度计算拷贝数。

2、RT-RPA扩增

按照RT-RPA试剂的生产商(英国twistDx公司)建议，配制如下反应体系：反应体系中所含有的上游引物、下游引物是本申请中F1：5’- TTCTCAACGAGTTTCTTTAACATCATACT -3’(SEQID NO.1)

R1：5’- ATGTCACTTAAATCGAAGGTTAATAACACG-3’(SEQ ID NO.2)。

再水化缓冲液 40.7μL

上游引物(10μM ) 2.1 μl

下游引物(10μM ) 2.1 μL

探针(10μM ) 0.6 μL

模板 2 μL

MgOAc (200nM ) 2.5 μL

总体积 50 μL

反应体系加入含有干粉酶的反应管，干粉酶为重组酶聚合酶试剂，该重组酶聚合酶试剂购自英国twistDx公司，干粉酶具体为重组酶、单链结合蛋白和聚合酶三种蛋白质冻干品。

反应体系配制完成后，将反应管立刻置于恒温荧光检测仪中，实时检测荧光信号，反应条件设置为39℃反应20分钟。根据仪器检测到的荧光信号，观察是否生成荧光信号曲线。

结果判断标准如下：

1）在20分钟内，有指数级增长的扩增曲线生成，样本为阳性；

2）在20分钟内，没有指数级增长的扩增曲线生成，样本为阴性。

实施例4 RT-RPA检测方法特异性实验

分别将传染性法氏囊病病毒、网状内皮组织增生病病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、马立克氏病病毒、鸡贫血病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体和滑膜支原体的核酸作为模板，使用RT-RPA检测。将ARV核酸和水分别作为阳性对照和阴性对照。结果如图1所示，只有ARV生成荧光曲线，其他病原和水对照都没有扩增曲线，说明该检测方法特异性良好。

实施例5 RT-RPA检测方法敏感性实验

将实施例3中制备的RNA阳性对照使用超纯水进行10倍倍比稀释，10⁶-10⁰拷贝/μl共7个稀释度用于RT-RPA敏感性的检测。结果如图2所示，该RT-RPA可以检测到10²个拷贝的模板，说明该方法的敏感性较好。

实施例6 临床样品的验证

2019年5月15日-17日，连凯琪，张明亮从山东潍坊昱合畜禽有限公司位于潍坊市的养殖场中收集86个鸡腱样本。将样本分别加入1.5毫升微型离心管，再加入500微升磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline），使用电动研磨棒将组织制备匀浆，将匀浆高速离心后获得上清液，使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（来自于北京天根生化科技有限公司）提取上清中的核酸。分别使用RT-RPA和荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)检测样本核酸。结果：RT-RPA检测阳性38例，阴性48例。qRT-PCR结果显示，41例阳性，45例阴性，具体如表1所示。两者的符合率高达96.5%。RT-RPA检测临床检测实验结果和荧光定量PCR(qRT-PCR)进行比较图为图3，横坐标是qRT-PCR检测临床样本得到的CT值，纵坐标是RT-RPA检测临床样本出现阳性结果的时间结果。

磷酸缓冲盐溶液的配置方法：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：0.24g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)：1.44g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)：0.2g，加去离子水约800毫升充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L，浓盐酸的质量浓度为30-36%。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，应当指出，对于本领域的及任何熟悉本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理、整体构思前提下，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变、修饰、替代、组合、简化，及作出的若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 安阳工学院

<120> 一种用于快速检测禽呼肠孤病毒的引物组和探针、试剂盒及方法

<130> 0001

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ttctcaacga gtttctttaa catcatact 29

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgtcactta aatcgaaggt taataacacg 30

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

actaatgcaa tttcggtgga tggcacgggg tctaacggat catctgat 48

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

actgtcattg acttcgaacg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctcgagtaca ccccatacgc 20

Claims

1.一种用于快速检测禽呼肠孤病毒的引物组和探针，其特征在于：包括：用于扩增ARV特异性序列的引物对F1和R1；和靶基因序列互补的探针；所述用于检测ARV的引物和探针是针对禽呼肠孤病毒基因组的S1基因设计的。

2.根据权利要求1所述的用于快速检测禽呼肠孤病毒的引物组和探针，其特征在于：引物的核苷酸碱基序列如下所示：

F1：5’- TTCTCAACGAGTTTCTTTAACATCATACT -3’(SEQ ID NO.1)

R1：5’- ATGTCACTTAAATCGAAGGTTAATAACACG-3’(SEQ ID NO.2)。

3.根据权利要求1所述的用于快速检测禽呼肠孤病毒的引物组和探针，其特征在于：该探针的序列如下：

4.根据权利要求3所述的用于快速检测禽呼肠孤病毒的引物组和探针，其特征在于：所述探针序列中标记的荧光基团为选自FAM、JOE 、HEX、VIC、CY5、TET中的一种，淬灭基团为选自TAMRA、MGB、BHQ中的一种。

5.一种快速检测禽呼肠孤病毒的RT-RPA试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：(1)所述权利要求1-4中任一权利要求的引物组和探针；(2)扩增靶基因序列的重组酶聚合酶试剂；（3）配置RT-RPA扩增反应体系的其他物质：模板、MgOAc (200nM )、再水化缓冲液。

6.一种快速检测禽呼肠孤病毒的方法，其特征在于：包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的快速检测禽呼肠孤病毒的方法，其特征在于：步骤（1）中的RT-RPA反应体系，加入含有干粉酶的反应管，反应体系中的其他物质为：

再水化缓冲液 40.7μL

上游引物(10μM ) 2.1 μl

下游引物(10μM ) 2.1 μL

探针(10μM ) 0.6 μL

模板 2 μL

MgOAc (200nM ) 2.5 μL

总体积 50 μL。

8.根据权利要求6所述的快速检测禽呼肠孤病毒的方法，其特征在于：步骤（2）的RT-RPA扩增条件为：恒温39℃反应20min。