CN103667524B - 一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用 - Google Patents
一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分析检测领域,涉及一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用。一种用于新城疫病毒class I检测的实时荧光定量RT-PCR试剂盒,包含:上游引物CNPIF:SEQ ID NO.1,下游引物CNPIR:SEQ ID NO.2,以及TaqMan探针CNPIP:5′-JOE-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-TAMRA-3′。本发明选取Class I NP基因保守区设计引物和探针,首次报告建立了一种新的基于NP基因的检测新城疫病毒class I的RRT–PCR试剂盒以及方法,具有高灵敏度、高特异性、搞重复性的优点。
Description
技术领域
本发明属于分析检测领域,涉及一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用。
背景技术
新城疫(Newcastle disease,ND)是唯一分布五大洲的O IE A类传染病,我国ND疫情十分严重,仍然是养鸡业发展最直接的威胁[1],可对家禽生产造成严重损失[2]。
新城疫病毒(NDV),是新城疫的病原,属禽副粘病毒1型(AMPV-1),有囊膜,基因组为单股负链RNA,大小约15kb,编码6种蛋白质,包括RNA聚合酶(L),血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN),融合蛋白(F),基质蛋白(M),磷蛋白(P)和核蛋白(N)。新城疫病毒分离株根据对鸡致病严重程度可分为三个主要致病型(毒力型)[2]:Lentogenic株是低致病力型,可造成鸡轻微呼吸道或肠道感染;Mesogenic株是中等致病力型,主要引起呼吸系统疾病;Velogenic株是高致病力型,造成高死亡率,基于病理表现被进一步分为嗜神经或嗜内脏型。高毒力型NDV属于必须报告的O IE A类传染病,它的发生可导致检疫和贸易禁运。NDV只有一个血清型,但是分为2类:class I、class I I,绝大多数常见的都是class II,可分成I-IV10个基因型。class II与class I核酸差异较大。
目前,用鸡胚进行病毒分离,然后用新城疫特异性抗体做血凝抑制试验代表病毒检测的参考标准[3]。虽然病毒分离是一个敏感和特异性的方法,但由于NDV毒力差异大,低毒和无毒株普遍存在,加之弱毒疫苗的普遍使用,对分离毒株血凝抑制试验结果必须结合毒力鉴定才能确诊,一般需要数天才能完成[1]。
将荧光定量RT-PCR应用于新城疫病毒的检测已有报道。Mark G.Wise等「2」建立了RRT-PCR技术检测鸟类临床标本新城疫病毒。检测采用单管水解探针,引物和探针根据M基因保守区序列设计,可检测到大约1000拷贝病毒基因组RNA和10EID50病毒。Beate M.Crossley等「7」建立了高通量的检测外来NDV的RRT-PCR方法。L.Mia Kim等「8」建立了新城疫病毒L基因基础上的RRT-PCR技术,对Mark G.Wise等建立的新城疫病毒M基因RRT–PCR是一个有力的补充。但目前尚未有有关新城疫病毒NP基因RRT–PCR检测的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足,提供一种用于新城疫病毒class I检测的RT-PCR试剂盒。
本发明的另一目的是提供该试剂盒的应用。
本发明的又一目的是提供一种实时荧光定量检测新城疫病毒class I的方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现:
一种用于新城疫病毒class I检测的实时荧光定量RT-PCR试剂盒,包含:上游引物CNPIF:5′-CCTCAACTTATTACAACCTC-3′(SEQ ID NO.1),下游引物CNPIR:5′-TACAGATGCCATACCCATTGC-3′(SEQ ID NO.2),以及TaqMan探针CNPIP:5′-JOE-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-TAMRA-3′(SEQ ID NO.3)。
所述的试剂盒还包含102、103、104、105、106、107、108拷贝/μL的NP基因阳性质粒作为标准品模板。
所述的NP基因阳性质粒是以pGEM-T载体为出发载体,在其EcoR V位点插入序列如SEQ IDNO.4所示的NP基因所得
所述的试剂盒还包含~TaqMan Universal PCR Master Mix Kit为美国ABI公司产品。
本发明所述的试剂盒在实时荧光定量检测新城疫病毒class I中的应用。
一种实时荧光定量检测新城疫病毒class I的方法,将标准品模板和待测样品DNA模板以及分别置于各自的反应体系中,并同时置入PCR仪进行扩增,扩增完毕后由PCR仪自动得出检测结果,其中
进入PCR仪的标准品模板的反应体系为25μl:其中ABI TaqMan Universal PCR Master Mix加入量为12.5μl,模板加入量为3μl,上游引物和下游引物在体系中的终浓度均为0.5μmol/L,探针在体系中的终浓度为0.5μmol/L,其余为无菌去离子水;
进入PCR仪的待测样品DNA模板的反应体系为25μl:其中ABI TaqMan Universal PCR MasterMix加入量为12.5μl,模板加入量为3μl,上游引物和下游引物在体系中的终浓度均为0.5μmol/L,探针在体系中的终浓度为0.5μmol/L,其余为无菌去离子水;
其中所述的上游引物CNPIF:5′-CCTCAACTTATTACAACCTC-3′(SEQ ID NO.1),下游引物CNPIR:5′-TACAGATGCCATACCCATTGC-3′(SEQ ID NO.2),以及TaqMan探针CNPIP:5′-JOE-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-TAMRA-3′(SEQ ID NO.3);
PCR仪中的反应程序为:95℃预变性10min,然后95℃15s,60℃1min43个循环;荧光信号的收集及数据的采集定在60℃。检测结束,根据噪音情况设定和调整基线及阈值,并利用随机软件进行分析,建立标准曲线,根据荧光曲线和Ct值判断结果。
有益效果:
本发明基于NP基因相对比F基因更保守。Class I分离株NP基因之间氨基酸序列的同源性在93.0%-99.5%之间,Class I毒株与Class II毒株NP蛋白同源性在88.2%-92.5%之间;选取Class I NP基因保守区设计引物和探针,首次报告建立了一种新的基于NP基因的检测新城疫病毒class I的RRT–PCR试剂盒以及方法,具有高灵敏度、高特异性、搞重复性的优点。本发明方法对Mark G.Wise等建立的新城疫病毒M基因RRT–PCR也是一个重要的补充。这两个方法结合可以快速检测所有class I和class II新城疫病毒并初步分群。随着NDV分子生物学研究的不断深入,NDV基因序列及功能得到不断的揭示,ND分子生物学检测技术将得到进一步的补充和完善。
附图说明
图1荧光定量RT-PCR扩增动力学曲线
图中,从左至右依次为稀释度102~108的NP基因克隆阳性质粒的扩增曲线。
图2RRT-PCR标准曲线
具体实施方式
实施例1NP基因阳性质粒的构建
化学合成SEQ ID NO.4所示的NP基因511-1274bp获得目的片段,纯化后TA克隆连接到pGEM‐T载体(Promega公司产品)上,转化至E.coli DH5α中,小提质粒,经PCR和酶切鉴定,挑取阳性克隆经测序验证后,抽提纯化质粒DNA,测其核酸浓度,计算出拷贝数,以此作为荧光定量RT-PCR质粒标准品。SEQ ID NO.4所示的NP基因511-1274bp片段也可通过PCR方式扩增得到,以新城疫病毒JS‐10‐06株基因组为模板,经RT-PCR扩增得到。
实施例2
根据GenBank上5株class I NDV NP基因序列,结合本实验室分离鉴定测序的8株classI NDV NP基因序列(表1),选取保守区(靠近5′端)设计引物。采用LASERGENE软件包(DNASTARInc.,Madison,WI,USA)和Primer Premier5.0软件(Premier Biosoft International,PaloAlto,CA)设计和分析引物,合成NDV的1对特异引物及相应的探针,并在NCBI上进行了BLAST比对验证。扩增片段位于NDV class I国际标准分离株DE-R49-99NP基因的800-1086bp,长度为287bp,探针位于NP基因970-990bp,上、下游引物及探针如下所示:
CNPIF:5′-CCTCAACTTATTACAACCTC-3′(SEQ ID NO.1),(800-819bp)
CNPIR:5′-TACAGATGCCATACCCATTGC-3′(SEQ ID NO.2),(1066-1086bp)
Probe:(JOE)5′-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-3′(TAMRA)(SEQ ID NO.3)(970-990bp);
探针为TaqMan探针,5′端标记的荧光报告基团是JOE,3′端标记的荧光淬灭基团为TAMRA,探针命名为:CNPIP。引物由上海生工有限公司合成,探针由大连宝生物工程有限公司合成。
表1本实验所用NDV标准参考分离株及其它禽病毒株
aL,弱毒;M,中等毒力;V,强毒.NA,不可用.
实施例3
标准品模板的稀释用紫外分光光度计分别测定NP基因阳性重组质粒在260和280nm处的吸光度,并根据公式计算重组质粒的DNA浓度与纯度。将重组质粒进行10倍梯度稀释,以102、103、104、105、106、107、108拷贝/μL作为标准品模板,利用实施例2设计合成的引物对以及探针进行实时荧光定量RT-PCR,RRT-PCR反应体系为:12.5μl ABI TaqManUniversal PCR Master Mix,0.5μmol/L(体系中的终浓度)上游引物,0.5μmol/L(体系中的终浓度)下游引物,0.5μmol/L(体系中的终浓度)探针,模板3μl,加无菌去离子水至反应总体积25μl;反应程序为95℃预变性10m in,然后95℃15s,60℃1min43个循环。利用随机软件进行分析,建立标准曲线,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系(图1和2)。从图1可见,当标准质粒(NP基因阳性重组质粒)浓度≥1.0copies/μl时仍可出现典型扩增曲线。从图2可见,在较广的范围内(1.0×102-1.0×108copies/μl)C t值与质粒拷贝数的对数之间呈现很好的线性关系,相关系数R2=0.99。将其检测限的Ct值通过标准曲线换算成拷贝数约为1copy/μl,相当于1个NDV颗粒。
分子拷贝数(个/mL)=DNA质量浓度/DNA分子量
DNA分子量=DNA碱基数×324.5
DNA质量浓度=260nm吸光度×50μg/mL×稀释倍数×6.02×1023
实施例4
特异性试验
以AIV、EDS76、IBDV、IBV、ILTV、FPV等常见其它禽病病毒及NDV class II核酸(表1)和健康鸡组织RNA、水为模板,进行荧光定量PCR,反应体系及反应程序同实施例3。结果AIV、EDS76、IBDV、IBV、ILTV、FPV等常见其它禽病病毒及NDV class II核酸、健康鸡组织RNA、水显示没有发现有效扩增。而NDV class I光信号明显。
重复性试验
批内重复性试验:分别取等量的3份不同滴度(102、104、106拷贝/μL)的重组质粒进行荧光定量PCR检测,每份样品做5个重复;批间重复性试验:取以上3份样品,在同一反应条件下进行5次独立的荧光定量PCR检测。结果,批内变异系数CV为0.43%—0.99%,批间变异系数为0.95%—1.39%,表明误差都非常小,扩增效率稳定。数据见表2和表3。
表2用荧光定量RT-PCR检测3份不同病毒含量标准品的批内和批间重复检测结果
表3用荧光定量RT-PCR检测3份不同病毒含量标准品的批间重复检测结果
实施例5
用表1中所列毒株接种SPF鸡胚,收集尿囊液进行血凝试验[1](Hemagglutination test,HA)和NDV血凝抑制试验[1](Hemagglutination inhibition test,HI),同时用样品做RRT-PCR试验,计算2种方法的符合率。RRT-PCR与病毒分离结果见表1,可见2种方法检测33株NDV符合率为100.0%。
参考文献
[1]殷震,刘景华.动物病毒学,第二版.北京:科学出版社,1997,329‐330。
Claims (4)
1.一种用于新城疫病毒class I检测的实时荧光定量RT-PCR试剂盒,其特征在于包含:上游引物CNPIF:SEQ ID NO.1, 下游引物CNPIR:SEQ ID NO.2,以及TaqMan探针CNPIP:5′- JOE-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC- TAMRA -3′。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于所述的试剂盒还包含102 、103 、104 、105 、106、107、108拷贝/μL 的NP基因阳性质粒作为标准品模板。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于所述的NP基因阳性质粒是以pGEM-T载体为出发载体,在其EcoR V位点插入序列如SEQ ID NO.4所示的NP基因所得。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于所述的试剂盒还包含TaqMan Universal PCR Master Mix Kit 为美国ABI 公司产品。
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