CN111118212B - 检测新城疫病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及检测新城疫病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法。含有新城疫病毒RNA片段的待测物通过利用该引物和探针可通过反转录重组酶介导等温核酸扩增技术在等温条件下进行大量扩增，操作简单，所需时间短，特异性好、灵敏度高的优点。

Description

检测新城疫病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及检测新城疫病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法。
背景技术
新城疫(Newcastle Disease，ND)又名伪鸡瘟，是由新城疫病毒(NDV)感染引起的以消化道和呼吸道为主要传播途径的一种禽类急性、高度接触性传染病，传播速度快，一年四季均可发病，对世界范围内的禽类养殖业危害极大。NDV主要感染禽类，一般鸡最常见，雏鸡最易感。患病鸡临床表现为体温上升、呼吸急促、咳嗽、排黄绿色甚至灰白色水样粪便，产蛋鸡产蛋率下降，软壳蛋比例增加，即使恢复后也会对鸡的生长发育有影响，因此给养殖业带来严重的经济损失。
ND的临床症状与低致病性禽流感、传染性喉气管炎、传染性支气管炎等相似，都表现为呼吸困难，临床诊断容易混淆。目前，国内外已经建立多种NDV检测方法，血清学的方法包括血凝血抑试验、琼脂扩散试验、中和试验、免疫荧光试验、免疫组化技术、酶联免疫吸附试验等，分子生物学诊断方法包括：常规PCR、实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)、环介导等温核酸扩增技术等。其中，以PCR和RFQ-PCR是最常规的临床检测方法，但二者均需要昂贵的PCR仪，且所需的检测时间较长，对操作人员有较高的技术要求。
发明内容
针对现有PCR和RFQ-PCR所需的检测时间较长、对操作人员技术要求较高的问题，本发明提供了用于检测新城疫病毒的引物和探针组合。
以及，本发明还提供了一种检测新城疫病毒的试剂盒。
以及，本发明还提供了检测新城疫病毒的方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
用于检测新城疫病毒的引物和探针组合，所述引物的序列(如SEQ ID NO.1～2所示)为：
上游引物：5′-ACGTCTTTATTACTCCTGAGCTTGTCATTGTGA-3′；
下游引物：5′-TGATTACCTAAGTCCTTTGCCAGAGCATCTACT-3′；
所述探针的序列(如SEQ ID NO.3所示)为：5′-AAGTTCACATGCCTCACCCAGGAACTTGTA-THF-TGATGTATGCGGATA-3′。
含有新城疫病毒RNA片段的待测物利用上述引物可通过反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)在等温条件下进行大量扩增，不需对NDV模板反转录，操作简单，在23min内即可完成目的基因片段的扩增。其最低检测限可达到100拷贝/μL，是常规PCR法(103拷贝/μL)灵敏度的10倍。同时对其他类症禽病病原体核酸无交叉反应，表现良好特异性。
其探针基于上述下游引物而设计，探针上距离5′端30bp位置有一个碱基缺口，并以四氢呋喃(THF)残基修饰(SEQ ID NO.3中R即为THF)，当探针为单链时核酸内切酶不识别，只有当探针和上述引物扩增所得的扩增产物中的目的片段结合后核酸内切酶才开始工作，从而可提高该检测方法的特异性，使其他病毒对检测结果无干扰。
以及，本发明实施例还提供了一种检测新城疫病毒的试剂盒，包含上述引物和探针组合。使用该试剂盒进行新城疫病毒的检测对检测设备和操作人员要求低，操作简便，检测成本低，并具有特异性好、灵敏度高的优点。
优选地，所述探针5′端以荧光基团修饰，所述下游引物的5′端以生物素修饰，扩增完成后可通过侧向流试纸条进行现场检测，从而能够简便、快捷地诊断新城疫病毒。
优选地，所述试剂盒还包括荧光基础缓冲液和乙酸镁。二者均可选择用于RT-RAA核酸扩增的市售试剂，如江苏奇天基因生物科技有限公司的RT-RAA核酸扩增试剂。
优选地，所述试剂盒还包括胶体金侧向流免疫层析试纸条(LFD)。将RT-RAA和LFD进行结合，无需传统的琼脂糖电泳即可实现检测结果的可视化，扩增反应产物只需要滴加到试纸条上3min内即可观察结果，即使在极端恶劣的野外条件下，该试剂盒借助人体的温度也可实现快速检测。
以及，本发明实施例还提供了一种检测新城疫病毒的方法，具体操作为：提取待测物的基因组，用上述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，扩增完成后用所述胶体金侧向流免疫层析试纸条检测扩增产物。该方法用上述试剂盒可实现新城疫病毒的快速检测，反应简单、快速，不需要高温循环，适合临床现场检测，为鸡新城疫防控提供了技术支持。
优选地，所述重组酶介导等温扩增的反应体系为：
反应温度为37～39℃，反应时间23～40min。该扩增的反应体系简单、反应条件参数少，易于操作和控制，能够在临床现场进行检测，对试验场地要求低。
优选地，所述反应时间为23～25min。
优选地，用所述胶体金侧向流免疫层析试纸条进行扩增产物检测。将LFD与RT-RAA结合后构成的RT-RAA-LFD检测方法能够方面、快捷地检测出待测物中的NDV。
附图说明
图1为本发明实施例3中各待测物的特异性检测结果；
图2为本发明实施例3～8中NDV的LFD试纸条检测结果；
图3为本发明检验例1中常规PCR检测NDV敏感性测试结果。
图4为本发明检验例1中RT-RAA-LFD检测NDV敏感性测试结果。
图5为本发明检验例1中RFQ-PCR检测NDV敏感性测试结果，其中1为阴性对照，2-8依次为100拷贝/μL-106拷贝/μL。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了用于检测新城疫病毒的引物和探针组合，序列分别为：
上游引物：5′-ACGTCTTTATTACTCCTGAGCTTGTCATTGTGA-3′；
下游引物：5′-TGATTACCTAAGTCCTTTGCCAGAGCATCTACT-3′；
探针：5′-AAGTTCACATGCCTCACCCAGGAACTTGTA-THF-TGATGTATGCGGATA-3′。
实施例2
本发明实施例提供了一种检测新城疫病毒的试剂盒，具体包括：
(1)等温扩增引物和探针：序列分别为：
上游引物：5′-ACGTCTTTATTACTCCTGAGCTTGTCATTGTGA-3′；
下游引物：5′-TGATTACCTAAGTCCTTTGCCAGAGCATCTACT-3′；
探针：5′-AAGTTCACATGCCTCACCCAGGAACTTGTA-THF-TGATGTATGCGGATA-3′。
(2)荧光基础缓冲液、乙酸镁(均为江苏奇天基因生物科技有限公司的RT-RAA核酸扩增试剂)。
实施例3
本发明实施例提供了一种检测新城疫病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。
各待测物分别为：
NDV和禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)均为河北农业大学实验室保存，鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus，ILTV)AV195和鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)AV1511购买于中国兽医药品监察所。阴性对照(N)用纯水代替模板。步骤具体如下：
(1)重组酶介导等温核酸扩增反应
用DNA/RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)分别提取NDV、AIV、IBV的RNA以及ILTV的DNA，将其反转录所得cDNA为模板，按以下反应体系及反应条件进行重组酶介导等温扩增反应：
反应条件为：39℃反应30min。
(2)扩增产物检测
取10μL的步骤(1)所得扩增产物滴加到LFD试纸条(购自杭州优思达生物科技公司，设有FAM抗体检测线和Biotin抗体质控线)的检测区，并将试纸条插入加有100μL Tris缓冲液(25mmol/L Tris、150mmol/L NaCl和0.05％Tween-20)的EP管内，3min后观察结果。
试纸条判定标准：出现两条红带为阳性，且两条带一条位于质控区，一条位于检测区，阳性结果表明样本中含有NDV核酸片段；如果质控区出现一条红带，检测区没有红带，表示为阴性，阴性结果表明不含有NDV片段。
结果如图1所示，只有含新城疫病毒RNA片段的待测物呈现阳性结果，其他病毒均呈现阴性结果，可见本发明提供的检测新城疫病毒的方法具有良好的特异性。
实施例4
本发明实施例提供了一种检测新城疫病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。
NDV标准毒株同实施例3。步骤具体如下：
(1)重组酶介导等温核酸扩增反应
用DNA/RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取待测物的RNA，将其反转录所得cDNA为模板，按以下反应体系及反应条件进行重组酶介导等温扩增反应：
反应条件为：37℃反应23min。
(2)扩增产物检测同实施例3。
实施例5
本发明实施例提供了一种检测新城疫病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。
NDV标准毒株同实施例3。步骤具体如下：
(1)重组酶介导等温核酸扩增反应
用DNA/RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取待测物的基因组，将其反转录所得cDNA为模板，按以下反应体系及反应条件进行重组酶介导等温扩增反应：
反应条件为：37℃反应23min。
(2)扩增产物检测同实施例3。
实施例6
本发明实施例提供了一种检测新城疫病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。
NDV标准毒株同实施例3。步骤具体如下：
(1)重组酶介导等温核酸扩增反应
用DNA/RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取待测物的基因组，将其反转录所得cDNA为模板，按以下反应体系及反应条件进行重组酶介导等温扩增反应：
反应条件为：37℃反应23min。
(2)扩增产物检测同实施例3。
实施例7
本发明实施例提供了一种检测新城疫病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。
NDV标准毒株同实施例3。步骤具体如下：
(1)重组酶介导等温核酸扩增反应
反应体系同实施例3，反应条件为：39℃反应23min。
(2)扩增产物检测同实施例3。
实施例8
本发明实施例提供了一种检测新城疫病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。
NDV标准毒株同实施例3。步骤具体如下：
(1)重组酶介导等温核酸扩增反应
反应体系同实施例3，反应条件为：37℃反应25min。
(2)扩增产物检测同实施例3。
实施例3～8中NDV的LFD试纸条检测结果如图2所示。
检验例1
本检验例对上述新城疫病毒的检测方法进行了敏感性实验。
1、常规PCR法敏感性检测
以100～107拷贝/μL质粒为模板，设置阴性水对照(N)。按以下反应体系进行PCR扩增：
反应程序为：94℃，5min；94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。通过2％琼脂糖电泳观察结果。
2、RFQ-PCR敏感性检测
以100～106拷贝/μL质粒为模板，设置阴性水对照(N)，进行PCR扩增。
RFQ-PCR为25μL体系为：TB Green Premix DimerEraser(2X)12μL，上、下游引物(10μM)各0.75μL，模板2μL，其余用纯化水补齐。反应程序为：95℃30s，95℃5s，55℃30s，72℃30s，40个循环后观察结果。
3、RT-RAA-LFD敏感性检测
以100～106拷贝/μL质粒为模板，设置阴性水对照(N)，反应体系和条件及扩增产物检测方法同实施例3。
结果如图3～5所示，常规RT-PCR检出限为103拷贝/μL(如图3所示)；RT-RAA-LFD检出限为102拷贝/μL(如图4所示)，RFQ-PCR敏感性为10拷贝/μL(如图5所示)。RT-RAA-LFD方法敏感性是常规PCR的10倍。
检验例2
用实施例3中的检测方法和常规PCR、RFQ-PCR方法分别检测临床诊断中疑似NDV病料86份，以常规PCR为标准，比较三种方法的符合率。结果如表1所示。
表1三种方法临床检测结果(n＝86)
结果表明本研究建立的RT-RAA-LFD方法符合率为95.35％，可用于NDV的现场检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北农业大学
<120> 检测新城疫病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法
<130> 2019.12.29
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 上游引物
<400> 1
acgtctttat tactcctgag cttgtcattg tga 33
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 下游引物
<400> 2
tgattaccta agtcctttgc cagagcatct act 33
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 探针
<400> 3
aagttcacat gcctcaccca ggaacttgta rtgatgtatg cggata 46

Claims (2)

1.一种非诊断目的的检测新城疫病毒的方法，其特征在于，具体操作为：提取待测物的基因组，用检测新城疫病毒的试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，扩增完成后用胶体金侧向流免疫层析试纸条检测扩增产物；所述试剂盒包含用于检测新城疫病毒的引物和探针组合以及胶体金侧向流免疫层析试纸条，所述引物和探针组合用于通过反转录重组酶介导等温核酸扩增技术检测新城疫病毒，所述引物的序列为：
上游引物：5´-ACGTCTTTATTACTCCTGAGCTTGTCATTGTGA -3´；
下游引物：5´-TGATTACCTAAGTCCTTTGCCAGAGCATCTACT -3´；
所述探针的序列为：5´-AAGTTCACATGCCTCACCCAGGAACTTGTA-THF-TGATGTATGCGGATA-3´；
所述探针5´端以荧光基团修饰，所述下游引物的5´端以生物素修饰；
所述重组酶介导等温扩增的反应体系为：
反应温度为37~39℃，反应时间23~40min。
2.根据权利要求1所述的非诊断目的的检测新城疫病毒的方法，其特征在于，所述反应时间为23~25min。
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