CN107488745A

CN107488745A - 一种用于新城疫病毒检测的试剂、检测方法及应用

Info

Publication number: CN107488745A
Application number: CN201710775069.5A
Authority: CN
Inventors: 林彦星; 蔡良语; 秦智锋; 曹琛福; 陈兵; 马岚; 曾少灵; 孙洁; 陶虹; 郑晓聪; 刘建利; 唐金明; 吕建强; 杨俊兴; 花群义
Original assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University; Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine; Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University; Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine; Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2017-08-31
Publication date: 2017-12-19

Abstract

本申请公开了一种用于新城疫病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请的新城疫病毒检测试剂，包括引物对和探针，引物对上下游引物分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或者其反向互补序列；SEQ ID No.3所示的探针序列中，第30碱基修饰6‑荧光基团‑dT，第31碱基替换为dSpacer，第32碱基修饰荧光淬灭基团‑dT，3’端修饰C3 Spacer。本申请的试剂，能通过重组酶聚合酶扩增对新城疫病毒进行灵敏、特异、高效检测。与现有检测方法相比，本申请的试剂和检测方法，时间短，易操作，可快速得出结论，适于现场检测，对新城疫病毒的快速防控具有重大意义。

Description

一种用于新城疫病毒检测的试剂、检测方法及应用

技术领域

本申请涉及新城疫病毒检测领域，特别是涉及一种用于新城疫病毒检测的试剂、检测方法及应用。

背景技术

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种禽类急性、高度接触性传染病。该病常呈败血症，以高热、呼吸困难、下痢、神经机能紊乱、黏膜和浆膜出血为特征，具有很高的发病率和死亡率，我国农业部将其列为一类动物疫病。NDV为副黏病毒科副黏病毒属的禽副黏病毒I型(APM-I)，是一种具有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA病毒。NDV基因组长约15.2kbp，其中NP、P、M、F、HN和L基因分别编码病毒的六种特异性结构蛋白。M基因长为1095bp，保守性高，其编码的M蛋白(即基质蛋白)位于囊膜的内层，在RNA的合成和病毒的自身装配上起重要的作用。病禽是主要的传染源，NDV存在于病禽的所有组织器官、体液、分泌物和排泄中，以脑、脾、肺含毒量最高，以骨髓含毒时间最长。在自然条件下NDV主要通过呼吸道、消化道，也可经眼结膜、破损的皮肤或泄殖腔粘膜侵入宿主。ND是危害我国禽业养殖最重要的传染病之一，建立快速高效的检测方法对该病的防控具有重要的现实意义。

病毒基因组检测是动物疫病病原检测最常用的方法之一，目前使用最广泛的NDV检测技术是常规RT-PCR和实时荧光RT-PCR。虽然实时荧光RT-PCR法相对于常规RT-PCR法更为快速，但检测时间至少需要一小时，并且需要在实时荧光PCR仪上进行检测，不利于疫病的快速检测和防控。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于新城疫病毒检测的试剂、检测方法及应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于新城疫病毒检测的试剂，该试剂包括引物对和探针，探针在引物对的扩增靶标区域内，引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-TCTATCTGTTGGGCTCAGTGATGTGCTCGGACCCT-3’

Seq ID No.2：5’-TCCAGAGTATCTTGGCAACCTGGGGAGAGGCATTT-3’

Seq ID No.3：

5’-AGGTGCACGGACTAAGCTACTTGCTCCTTTCTTCTCTAGCAGTGGGA-3’

其中，SEQ ID No.3所示的探针序列中，第30个碱基修饰6-荧光基团-dT，第31个碱基替换为碱基类似物，第32个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，3’端修饰C3 Spacer。

需要说明的是，本申请的试剂中，引物对和探针是针对新城疫病毒设计的，特别用于重组酶聚合酶扩增的引物和探针。重组酶聚合酶扩增，缩写RPA，是英国TwistDx公司开发的一种新型的核酸等温扩增技术；该技术的关键之一是设计合适的扩增引物对和探针。但是，常用的PCR引物对和探针并不适合RPA；常规PCR的引物相对太短、重组效率低；常规的探针系统，与RPA也不兼容。因此，无法通过常规的引物或探针设计软件直接输出适用于RPA的引物对和探针。目前设计RPA引物对和探针，主要根据TwistDx公司网站上提供的筛选指南，例如引物长度一般为30～35bp，引物设计应尽量避免易形成二级结构、引物-引物相互作用、发夹结构，扩增产物不超过500bp，探针长度一般为46-52bp，且在碱基类似物5’端至少有30个碱基等原则，人工设计大量的特异性引物和探针进行试验筛选，以获得扩增效率高、灵敏度高、特异性强的引物和探针。本申请的一种实现方式中，针对不同的靶标设计了20条上游引物、16条下游引物和4条探针进行试验筛选，最终筛选出Seq ID No.1所示序列和SeqID No.2所示序列的引物对和SEQ ID No.3所示序列的探针，作为本申请的新城疫病毒检测试剂。

还需要说明的是，RPA的原理是采用三个酶，在恒温下使一对引物对靶标进行指数扩增；本申请的试剂中，考虑到通过荧光检测的方式对RPA扩增产物进行检测，因此，在一对特异性引物的基础上提供了相应的特异性探针。可以理解，RPA扩增产物也可以采用其它方式，例如侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等进行检测；因此，如果不采用荧光检测，则可以不使用SEQ ID No.3所示序列的探针。也就是说，本申请的试剂中，可以单独使用SeqID No.1和Seq ID No.2所示序列的引物，也可以与探针一起使用，具体使用方式可以根据检测条件和环境选择。本申请的一种实现方式中，由于采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪，优选的将引物和探针一起使用，通过荧光法对RPA扩增产物进行检测。

优选的，6-荧光基团-dT为6-FAM-dT。

优选的，碱基类似物为dSpacer。

优选的，荧光淬灭基团-dT为BHQ1-dT。

需要说明的是，根据探针的设计原则，只需要在碱基类似物的两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团即可，本申请的优选方案中，优选的使用FAM荧光基团和BHQ1荧光淬灭基团。可以理解，荧光基团的选择是根据所使用的荧光检测仪的荧光通道进行的，不同的荧光检测仪具有检测一种或多种荧光基团的通道，例如FAM、TET、JOE、HEX、CY3、CY5等；而荧光淬灭基团则是根据荧光基团进行选择的，荧光淬灭基团的吸收光谱只要能够覆盖荧光基团的发射光谱即可，不只限于BHQ1。

优选的，本申请用于新城疫病毒检测的试剂中，还包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。

需要说明的是，本申请的试剂，是特别针对新城疫病毒的重组酶聚合酶扩增检测设计的，因此，为了使用方便，试剂中完全可以进一步的包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。其中，反应液在本申请的一种实现方式中为Rehydration Buffer，酶可以是混合有多种酶的RPA冻干酶粉，反应添加剂在本申请的一种实现方式中采用的是MgAc。

本申请的另一面公开了本申请的用于新城疫病毒检测的试剂在新城疫病毒检测中的应用。

本申请的另一面公开了本申请的用于新城疫病毒检测的试剂在制备新城疫病毒检测试剂盒或设备中的应用。

本申请的再一面公开了一种用于新城疫病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于新城疫病毒检测的试剂。

本申请的再一面公开了一种新城疫病毒的检测方法，包括采用本申请的用于新城疫病毒检测的试剂，对待测样品的核酸进行重组酶聚合酶扩增检测，并采用荧光检测仪收集荧光。

需要说明的是，本申请的检测方法，通过重组酶聚合酶扩增对新城疫病毒进行快速检测，一方面，重组酶聚合酶扩增检测速度快，只需要十几二十分钟就可以完成检测；另一方面，整个检测只需要在相对较低的恒温下就可以完成，例如采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪即可。因此，本申请检测方法特别适合于新城疫病毒的现场快速检测，为疫病的快速检测和防控提供有力的科学依据。

优选的，重组酶聚合酶扩增的反应条件为，40℃恒温反应20分钟。

需要说明的是，RPA所采用的酶的活性在37℃左右，RPA通常十几分钟或者在十分钟内就可以完成检测；但是，本申请优选的方案中，为了保障检测结果的准确性，优选在40℃恒温反应20分钟。

本申请的有益效果在于：

本申请用于新城疫病毒检测的试剂，能够通过重组酶聚合酶扩增，对新城疫病毒进行敏感、特异、高效的检测。采用本申请的试剂进行新城疫病毒检测，与现有的常规PCR或实时荧光PCR方法相比，本申请的试剂和检测方法，检测时间短，且操作简单方便，可很快做出结果判定，特别适用于现场检测，这对于新城疫病毒的快速防控，减少经济损失，最大限度的保障生产安全具有重大意义。

附图说明

图1是本申请实施例中新城疫病毒特异性检测结果；

图2是本申请实施例中新城疫病毒灵敏度检测结果，其中A图为RPA灵敏度检测结果图，B图为作为对照的新城疫病毒通用型核酸检测试剂盒的灵敏度检测结果图。

具体实施方式

重组酶聚合酶扩增，缩写RPA，是一种新型的等温核酸扩增技术，该技术主要依赖三种酶：单链DNA结合蛋白(缩写SSB)、重组酶、链置换DNA聚合酶。反应体系中增加反转录酶则可以对RNA模板进行一步法快速扩增。RPA最佳反应温度范围是37℃左右，反应时间少于二十分钟，甚至可以在十分钟内完成反应。引物和探针的设计对于RPA来说至关重要。引物一般为30～35bp，引物设计应尽量避免易形成二级结构、引物-引物相互作用、发夹结构；探针中含有一个碱基类似物，通常是dSpacer或THF，并且在其两侧连接dT-荧光基团和对应的dT-淬灭基团。另外，在3’端连接一个基团，如C3-spacer或磷酸盐，以阻止任何可能的聚合酶延伸探针。RPA中探针的作用原理是，探针与靶标序列退火杂交结合之后，在双链情况下探针的碱基类似物可使DNA修复酶III与之结合，并在该位置处切断探针，使得荧光基团和淬灭基团分离，产生荧光；产生荧光的总量与靶标序列的数量呈正比，从而达到实时监测的效果。并且，实时荧光RPA可在一个便携式的常温等温扩增荧光检测仪上进行，在十几分钟内就可以获得检测结果，极大简化了反应程序，缩短了检测时间。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、材料与方法

1.供试核酸

本例实验用模板具体包括NDV中强毒株核酸、NDV弱毒株核酸、禽流感病毒(缩写AIV)的H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2亚型核酸、传染性支气管炎病毒(缩写IBV)核酸。本例所用的病毒核酸均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心提供和保藏。

2.主要的试剂和仪器

病毒RNA抽提试剂盒MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit(AM1836)及全自动磁珠提取纯化系统，美国Thermo公司产品。超微量核酸蛋白浓度分析仪，英国BioDrop公司产品。TwistAmp exo RT kit，英国TwistDx公司产品。等温扩增仪T16-ISO，澳大利亚Axxin公司产品。一步法荧光定量RT-PCR试剂盒、7500实时荧光PCR仪，美国ABI公司产品。新城疫病毒通用型核酸检测试剂盒，该试剂盒采用PCR荧光探针法进行检测，试剂盒为深圳澳东检验检测科技有限公司产品。

3.核酸的提取

使用Thermo病毒RNA抽提试剂盒MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit(AM1836)及磁珠纯化系统提取病毒核酸，BioDrop超微量核酸蛋白浓度分析仪测定核酸浓度。

4.RPA引物和探针的设计与筛选

根据NCBI GenBank中已发表的新城疫病毒M基因序列和F基因序列，应用DNASTARMegAlign软件的序列比对功能设计了多条特异性的引物探针，设计好引物和探针后，通过BLAST比对确定其特异性，然后再用于后续试验筛选，引物和探针具体序列如表1所示。所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1供试引物和探针

表1中，SEQ ID No.3所示序列的nd-1706-P2探针中，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第31个碱基替换为dSpacer，第32个碱基修饰BHQ1-dT，3’端修饰C3 Spacer。SEQ ID No.18所示序列的ND-RPA-P1探针中，第31个碱基修饰6-FAM-dT，第32个碱基替换为dSpacer，第34个碱基修饰BHQ1-dT，3’端修饰C3 Spacer。SEQ ID No.19所示序列的ND-RPA-P2探针中，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第31个碱基替换为dSpacer，第32个碱基修饰BHQ1-dT，3’端修饰C3Spacer。SEQ ID No.40所示序列的nd-1706-P1探针中，第31个碱基修饰6-FAM-dT，第32个碱基替换为dSpacer，第33个碱基修饰BHQ1-dT，3’端修饰C3 Spacer。

5.反应体系和反应条件

本例采用TwistAmp exoRT Kit试剂盒进行RPA扩增。

反应体系为50μL。将Rehydration Buffer 29.5μL，两条浓度为10μM的引物各2.1μL，浓度为10μM的探针0.6μL，DEPC水11.2μL，核酸模板2μL混合均匀后加入到RPA冻干酶粉的反应管中，混匀，最后加入浓度为280mM的MgAc溶液2.5μL，混匀。将上述反应管置于等温扩增仪中，40℃反应4分钟，取出混合，再继续反应16分钟，反应过程中实时读取荧光信号。

其中，两条浓度为10μM的引物是指上游引物和下游引物。

6.引物和探针筛选

在筛选的过程中，由于引物的数量比较多，相应RPA探针固定不变，先采用其中一条正向引物，对反向引物进行筛选，然后再根据筛选出来的反向引物，再去筛选正向引物。引物和探针筛选采用“5.反应体系和反应条件”。每条探针筛选出最佳的上下游引物组合后，再采用相同的判断方法，比较不同探针的扩增效果，以获得最佳的新城疫病毒检测用引物探针组合。

7.特异性试验

采用筛选的引物和探针组合，按“5.反应体系和反应条件”，对NDV中强毒株核酸、NDV弱毒株核酸、H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2亚型核酸、IBV核酸模板进行检测。并设置一个空白水对照。

8.灵敏性和重复性试验

本例将NDV弱毒株核酸按10倍梯度稀释至10^-6，采用各梯度浓度的稀释核酸模板，按“5.反应体系和反应条件”进行RPA试验，试验中设置一个水空白对照，以测试引物探针的灵敏性。并采用相同的梯度稀释核酸模板与购自深圳澳东的“新城疫病毒通用型核酸检测试剂盒”进行灵敏性比较。同时，各梯度浓度的稀释核酸用RPA重复检测六次分析其稳定性。

9.临床样品检测

采用本例筛选出的引物和探针，对45份经测试验证过的NDV阳性样品，以及120份经测试验证过的NDV阴性样品，按照“5.反应体系和反应条件”进行检测。并设置一个水空白对照。45份NDV阳性样品和120份NDV阴性样品均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心提供和保藏。

二、结果和分析

1.引物和探针筛选

经过筛选，本例最终从表1的引物探针中，筛选出Seq ID No.1所示序列的正向引物nd-1706-F5、Seq ID No.2所示序列的反向引物nd-1706-R6和Seq ID No.3所示序列的探针nd-1706-P2，该引物探针组合可用于对NDV进行特异性检测。

2.特异性试验结果

特异性检测结果如图1所示，图中，曲线1为NDV中强毒株核酸的检测结果、曲线2为NDV弱毒株核酸的检测结果、曲线3-9分别为AIV H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2亚型核酸、IBV核酸和水空白对照的检测结果。可见，仅NDV核酸有荧光曲线，呈阳性；而其它病原核酸和水空白对照都没有荧光曲线，呈阴性。因此，本例的引物和探针能同时对NDV中强毒株核酸、NDV弱毒株核酸进行特异性检测，与AIV H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2亚型核酸、IBV核酸无交叉反应，具有良好的特异性。

3.灵敏性和重复性试验结果

灵敏性检测结果如图2所示，图2中，A图为RPA灵敏性试验，B图为新城疫病毒通用型核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法)灵敏性试验。A图中，曲线1至曲线7依序为NDV弱毒株10倍梯度稀释核酸，稀释度分别为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6，曲线8为水空白对照。B图中，曲线1至曲线7依序为NDV弱毒株10倍梯度稀释核酸，稀释度分别为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6，曲线8为试剂盒中阳性对照，曲线9为试剂盒中阴性对照。测得所提取NDV弱毒株核酸浓度为0.3μg/mL。可见，本例中RPA最低可以检测到所提取NDV弱毒株10^-4稀释度，对应的核酸浓度为30pg/μL，灵敏度比新城疫病毒通用型核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法)低两个数量级。但是，从反应条件可知，本例的NDV检测方法，检测时间短，不需要大型仪器设备，大大缩短了检测时间，提升了检测效率。另外，各梯度浓度的稀释核酸用本例RPA方法重复检测六次结果一致，均可观察到相应的荧光曲线，说明本例RPA方法重复性良好。

4.临床样品检测结果

临床样品检测结果显示，采用本例的引物和探针，仅45份NDV阳性样品出现扩增曲线，250份NDV阴性样品均无扩增曲线出现，检测准确性达100％。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

深圳市检验检疫科学研究院

清华大学深圳研究生院

<120> 一种用于新城疫病毒检测的试剂、检测方法及应用

<130> 17I24841

<160> 40

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctatctgtt gggctcagtg atgtgctcgg accct 35

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccagagtat cttggcaacc tggggagagg cattt 35

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<212> DNA

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<400> 3

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<212> DNA

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attgtagtaa caggagataa ggcagtcaat gtata 35

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gtggacacag acccttggat cttgcggatg gagtc 35

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caaccccaag agctacactg ccaataacag cacct 35

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acagcttcat tggttgcagc aatgctctcc ttaag 35

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cattgacaaa ctgctgcatc ttcccaactg ccact 35

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acctcgtctc agacagggtc aatcatagtc aagtt 35

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tctcagacag ggtcaatcat agtcaagttg ctccc 35

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tcaatcatag tcaagttgct cccgaatatg cccag 35

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cgtctcagac agggtcaatc atagtcaagt tgctcccgaa tatgccca 48

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ttggaggcat ataacagaac actgactact ttgctcactc ctcttgg 47

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gcagtcaatg tatacacctc gtctcagaca gggtc 35

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tatacacctc gtctcagaca gggtcaatca tagtc 35

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agacagggtc aatcatagtc aagttgctcc cgaat 35

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aagttgctcc cgaatatgcc cagagataag gaggc 35

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atgcccagag ataaggaggc atgtgcaaaa gcccc 35

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gctgttgcaa ccccaagagc tacactgcca ataac 35

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caccccacaa tacaggatcc agcgtcttga ttcgt 35

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<210> 37

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ggacactccc taagcagagc attgcggaag agagt 35

<210> 38

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gtgcgcggtc tggctccaga gtatcttggc aacct 35

<210> 39

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ctccgcaggt gcgcggtctg gctccagagt atctt 35

<210> 40

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

actcggtatt tatcaccacc tacgggttca tctttcaagt tgggaat 47

Claims

1.一种用于新城疫病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物对和探针，所述探针在引物对的扩增靶标区域内，所述引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，所述引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq IDNo.3所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-TCTATCTGTTGGGCTCAGTGATGTGCTCGGACCCT-3’

Seq ID No.2：5’-TCCAGAGTATCTTGGCAACCTGGGGAGAGGCATTT-3’

Seq ID No.3：

5’-AGGTGCACGGACTAAGCTACTTGCTCCTTTCTTCTCTAGCAGTGGG A-3’

其中，SEQ ID No.3所示的探针序列中，第30个碱基修饰6-荧光基团-dT，第31个碱基替换为碱基类似物，第32个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，3’端修饰C3Spacer。

2.根据权利要求1所述的用于新城疫病毒检测的试剂，其特征在于：所述6-荧光基团-dT为6-FAM-dT。

3.根据权利要求1所述的用于新城疫病毒检测的试剂，其特征在于：所述碱基类似物为dSpacer。

4.根据权利要求1所述的用于新城疫病毒检测的试剂，其特征在于：所述荧光淬灭基团-dT为BHQ1-dT。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用于新城疫病毒检测的试剂，其特征在于：还包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。

6.根据权利要求1-5任一项所述的用于新城疫病毒检测的试剂在新城疫病毒检测中的应用。

7.根据权利要求1-5任一项所述的用于新城疫病毒检测的试剂在制备新城疫病毒检测试剂盒或设备中的应用。

8.一种用于新城疫病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1-5任一项所述的用于新城疫病毒检测的试剂。

9.一种新城疫病毒的检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1-5任一项所述的用于新城疫病毒检测的试剂，对待测样品的核酸进行重组酶聚合酶扩增检测，并采用荧光检测仪收集荧光。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述重组酶聚合酶扩增的反应条件为，40℃恒温反应20分钟。