CN108531650A - Apmv-1和apmv-4的快速鉴别诊断的探针引物组、试剂盒及检测 - Google Patents

Apmv-1和apmv-4的快速鉴别诊断的探针引物组、试剂盒及检测 Download PDF

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张玉霞
王友令
孟凯
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Abstract

本发明涉及一种APMV‑1和APMV‑4的快速鉴别诊断的探针引物组、试剂盒及检测方法和应用，属于生物技术领域。所述探针引物组如表中SEQ ID NO:1‑6所示；本发明提供的引物探针组具备高灵敏度、高特异性、高重复性以及宽广的动态范围等特点，使其成为基础研究、应用研究等领域有用而强大的技术。本研究用荧光探针定量PCR扩增技术实现快速对不同的APMV血清型进行鉴别诊断；可以快速可视化判断出检测结果，从检样到报告结果只需2‑3小时；检测灵敏度高，特异性强，可对感染组织中的病毒含量实现初步定量。此研究可实现对APMV‑1和APMV‑4的快速鉴别诊断，非常适合临床和基层实验室的检测应用。

Description

APMV-1和APMV-4的快速鉴别诊断的探针引物组、试剂盒及 检测
技术领域
本发明涉及一种APMV-1和APMV-4的快速鉴别诊断的探针引物组、试剂盒及检测方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
禽副粘病毒 (Avian Paramyxovirus，APMV) 属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、副粘病毒亚科 (Paramyxovirinae)、禽腮腺炎病毒属 (Avulavirus)。APMV共包括 9 个血清型，即 APMV-1～APMV-9。其中 APMV-1 主要为新城疫病毒，俗称鸡瘟病毒，是目前研究最为全面深入的一类禽副粘病毒。禽副粘病毒的基因组为单股负链 RNA，基因组共编码 6 种主要的结构蛋白，包括核蛋白 (NP)、磷蛋白 (P)、膜蛋白 (M)、融合糖蛋白 (F)、血凝素神经氨酸酶蛋白 (HN) 和大蛋白 (L)。目前APMV-1研究很多，包括生物学特性、致病性、致病机理等，但对 APMV-2～APMV-9 的研究较为缺乏。目前对它们的快速鉴别诊断未见研究报告。
现在已获悉APMV-4能从水禽中分离到，而水禽又极其容易感染APMV-1，因此存在APMV-1和APMV-4共同感染的情况。目前针对APMV-1血清型和APMV-4血清型的快速鉴别诊断方法未见研究报道。众多周知，传统的禽副粘病毒的抗体（Ab）检测方法有血凝 (HA) 和血凝抑制试验 (HI)、酶联免疫吸附试验 (ELISA) 等。抗原检测方法主要是传统的接种鸡胚或细胞进行病原分离方法。传统的病原分离方法虽然有效，缺点就是检测周期太长，至少需要3天以上，费时费力，对于疫病的及时诊断控制不利。因此，急需建立一种适合临床和基层实验室的检测应用的技术方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种APMV-1和APMV-4的快速鉴别诊断的探针引物组及其试剂盒。
本发明还提供了一种利用上述探针引物组的检测方法及应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：（权利要求书）
本发明提供了一种APMV-1和APMV-4的快速鉴别诊断的探针引物组，所述探针引物组的序列为：
APMV-1-F如SEQ ID NO:1所示；
APMV-1-R如SEQ ID NO:2所示；
APMV-1-Probe如SEQ ID NO:3所示；
APMV-4-F如SEQ ID NO:4所示；
APMV-4-R如SEQ ID NO:5所示；
APMV-4-Probe如SEQ ID NO:6所示；
具体如表中所示：
所述探针标记5'端为FAM荧光素，3'端为MGB荧光素。
本发明还提供了一种快速鉴别诊断APMV-1和APMV-4的试剂盒，包括上述的APMV-1和APMV-4相关的探针引物。
进一步的，本发明提供的试剂盒中还包括扩增反应液，其中25μL反应液中含有
2× qPCR buffer 12.5μL
Primer F (10 μM) 0.5μL
Primer R (10 μM) 0.5 μL
Probe (5 μM)1 μL
cDNA 模板2μL
补充ddH2O至25μL。
进一步的，所述扩增反应的条件为：95℃30 sec，随后 95℃ 5 sec、55℃ 10sec、72℃ 20 sec进行 40 Cycles。
进一步的，所述扩增反应结束后，将APMV1和APMV4 的质粒进行10倍稀释，分别以如下反应进行标准曲线的建立：H2O 6μL、2×buffer(QIAGEN) 10μL、Primer(up10 μM) 1μL、Primer(down10 μM) 1μL、 Probe (5 μM) 1μL、质粒 1μL，反应条件为95℃30 sec，随后95℃ 5 sec、55℃ 10sec、72℃ 20 sec进行 40 Cycles，每个稀释度设5个重复，根据数据结果，进行标准曲线的分析建立。
上述APMV1建立的标准曲线，相关系数R2为0.998，斜率为-3.269，截距为 37.709，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.269logX+37.709；APMV4建立的标准曲线，相关系数R2为0.999，斜率为-3.208，截距为 37.105，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.208logX+37.105。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒进行的检测方法，包括以下步骤：
（1） RNA 抽提质检及反转录；
（2） 荧光PCR扩增及标准品制备方法；
（3）标准曲线的建立及分析。
进一步的，所述荧光PCR扩增及标准品制备方法为：2× qPCR buffer 12.5μL、Primer F (10 μM) 0.5μL、Primer R (10 μM) 0.5 μL、Probe (5 μM)1 μL、cDNA 模板2μL、补充ddH2O至25μL。反应体系为：95℃30 sec，随后 95℃ 5 sec、55℃ 10sec、 72℃ 20 sec进行 40 Cycles，设ddH2O作为阴性对照；反应结束后观察荧光曲线；同时取5µL反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检验；以100bp DNA Ladder的Marker作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，电泳（5V/cm）电泳50min，凝胶成像系统观察结果；阳性PCR产物回收后连接pMD-18T载体，转化感受态DH5α，进行阳性转化菌的检测；使用 QIAGEN 质粒提取试剂盒提取阳性重组菌质粒，使用 Nano Drop 测定质粒浓度；以所提取的质粒10倍稀释系列（拷贝数从 n×109系列稀释到n×102）制作标准曲线。标准质粒拷贝数计算公式如下： Copy Number=质量/分子量×6.02×1023= X 6.02×1023 / (2692+片段长度)/bp×109×660。
本发明还提供了一种利用上述引物探针组或者所提供的试剂盒在快速鉴别诊断APMV-1和APMV-4中的应用。
本发明的有益效果如下：
（1）本发明提供的引物探针组具备高灵敏度、高特异性、高重复性以及宽广的动态范围等特点，使其成为基础研究、应用研究等领域有用而强大的技术。
（2）本研究用荧光探针定量PCR扩增技术实现快速对不同的APMV血清型进行鉴别诊断；可以快速可视化判断出检测结果，从检样到报告结果只需2-3小时；检测灵敏度高，特异性强，可对感染组织中的病毒含量实现初步定量。此研究可实现对APMV-1和APMV-4的快速鉴别诊断，非常适合临床和基层实验室的检测应用。
附图说明
图1为APMV-1的标准品倍比稀释的扩增结果。
图2为APMV-1的标准曲线。
图3为APMV-4的标准品倍比稀释的扩增结果。
图4为APMV-4的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1
1 方法
1.1探针和引物设计合成
从NCBI下载APMV-1血清型和APMV-4血清型的流行毒株序列，采用BioEdit软件进行比对，获取毒株序列的保守区域序列。再利用Primer ExPress 3.0软件设计实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针。探针标记5'端为FAM荧光素，3'端为MGB荧光素，如表1所示。
表1 扩增引物和探针
1.2 RNA 抽提质检及反转录
在0.2mL的病毒尿囊液中加 1mL Trizol混匀后， 加 200μL 氯仿，充分混匀，12000rpm离心5-7min。 取上清至 1.5mL Eppendorf 管加 600μL 氯仿，混匀，12000 rpm离心 5min。 取上清至 1.5mL Eppendorf 管加 500uL 异丙醇，混匀，12000 rpm离心10min。 弃上清，用 75%乙醇 1mL 冲洗，高速离心 5min。 弃上清，RNA 沉淀于空气中干燥（2-3min）。 将干燥后的 RNA 溶解于 RNA-free Water 中。 取 1μL 总 RNA 测 OD260，并定量。反转录体系： RNA 酶抑制剂(50U/μL) 0.5μL、随机引物(50pM/μL)2μL、RNA 8μL（约2μg）、5×buffer(Invitrogen) 4μL、dNTP MIX(10mM/each) 2μL、DTT 2μL、AMV(200U/uL) 1μL水浴 40℃下反应 1 h；90℃处理 5-10min；冰浴 5min，-20℃保存cDNA。
1.3 荧光PCR扩增及标准品制备方法
荧光PCR反应体系和反应条件优化如下：2× qPCR buffer 12.5μL、Primer F (10 μM)0.5μL、Primer R (10 μM) 0.5 μL、Probe (5 μM)1 μL、cDNA 模板2μL、补充ddH2O至25μL。反应体系为：95℃30 sec，随后 95℃ 5 sec、55℃ 10sec、 72℃ 20 sec进行 40 Cycles，设ddH2O作为阴性对照。反应结束后观察荧光曲线。同时取5µL反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检验。以100bp DNA Ladder的Marker作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，电泳（5V/cm）电泳50min，凝胶成像系统观察结果。阳性PCR产物回收后连接pMD-18T载体，转化感受态DH5α，进行阳性转化菌的检测。使用 QIAGEN 质粒提取试剂盒提取阳性重组菌质粒，使用Nano Drop 测定质粒浓度。以所提取的质粒10倍稀释系列（拷贝数从 n×109系列稀释到n×102）制作标准曲线。标准质粒拷贝数计算公式如下： Copy Number=质量/分子量×6.02×1023= X 6.02×1023 / (2692+片段长度)/bp×109×660
注：每个碱基的平均分子量是330(每对碱基是660)，质粒原液 X ng/μL。最终计算得出APMV1和APMV4的质粒浓度分别为5.06×1010拷贝数/μL、6.53×1010拷贝数/μL。
1.4 标准曲线的建立
APMV1和APMV4 的质粒进行10倍稀释，分别以如下反应进行标准曲线的建立：H2O 6μL、2×buffer(QIAGEN) 10μL、Primer(up10 μM) 1μL、Primer(down10 μM) 1μL、 Probe (5 μM) 1μL、质粒 1μL，反应条件为95℃30 sec，随后 95℃ 5 sec、55℃ 10sec、72℃ 20 sec进行 40 Cycles。每个稀释度设5个重复。上述qPCR扩增后系统自动分析软件进行标准曲线的分析建立。
1.5 临床应用
山东5个不同地市和实验室攻毒的 27份泄殖腔棉拭子和组织样品，接种11d日龄的SPF鸡胚，收集尿囊液进行HA和NDV的HI检测，同时用所有样品进行普通RT- PCR试验和本次建立的FQ-PCR检测，分析多种方法的符合率，阳性样品进行PCR产物的序列测定，以确定此次建立的方法是否可以特异准确的区分鉴别APMV-1和APMV-4。
二 结果
结果判定 待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现1条特定的扩增曲线，且Ct值≤32.0，则可判定为样品为阳性。 如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道无特定的扩增曲线，且Ct值＞35.0或无 Ct，则判定为阴性。APMV-1出现阳性扩增时，APMV-4未出现扩增曲线；反之亦然。
将阳性重组质粒进行10倍系列稀释，质粒终浓度调整为5.06×109～5.06×100拷贝/μL、6.53×109～6.53×100拷贝/μL，共8个稀释度，以ddH2O为阴性对照，按优化的反应条件进行敏感性试验，同时建立APMV1和APMV4 的FQ-PCR方法的标准曲线。每个稀释度均设5个重复。检测结果当APMV1模板为506拷贝/μL、APMV4的模板为653拷贝/μL时可以得到有效扩增（图1和图3）。APMV1建立的标准曲线，相关系数R2为0.998，斜率为-3.269，截距为37.709，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.269logX+37.709。APMV4建立的标准曲线，相关系数R2为0.999，斜率为-3.208，截距为 37.105，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.208logX+37.105。（图2和图4）
山东5个不同地市和实验室攻毒样的 27份泄殖腔棉拭子和组织样品进行本研究建立的FQ-PCR方法，进行鉴别比较诊断分析，并与测序结果比较。结果表明，采用本发明提供的FQ-PCR方法检测，7份为APMV1阳性，8份攻毒组织样品为APMV4阳性。血清学检测和测序比较证实以上检测结果。表明本发明建立的FQ-PCR检测方法特异性强高，该FQ-PCR方法检测结果与基因测序结果符合率为100％，可以特异准确地区分APMV1和APMV4，适合临床和基层实验室的检测应用。
核苷酸序列表
<110>山东省农业科学院家禽研究所
<120> APMV-1和APMV-4的快速鉴别诊断的探针引物组、试剂盒及检测方法和应用
<160>6
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>1
GCCCGAATAC TGTAGTCAAT 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>2
TGCTGTTATC TGTGCCGATG 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>3
ACTCAACCTG TACCTAACTG 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>4
GAGGGTTATC GCTTCAACAT 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>5
GACAGTGAAG TTTGGTGCAA 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>6
CAGACTGAAT CCAACTCATG 20

Claims (9)

1.一种APMV-1和APMV-4的快速鉴别诊断的探针引物组，其特征在于，所述探针引物组的序列为：
APMV-1-F如SEQ ID NO:1所示；
APMV-1-R如SEQ ID NO:2所示；
APMV-1-Probe如SEQ ID NO:3所示；
APMV-4-F如SEQ ID NO:4所示；
APMV-4-R如SEQ ID NO:5所示；
APMV-4-Probe如SEQ ID NO:6所示；
所述探针标记5'端为FAM荧光素，3'端为MGB荧光素。
2.一种快速鉴别诊断APMV-1和APMV-4的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1中所述的APMV-1和APMV-4相关的探针引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括扩增反应液，其中25μL反应液中含有
2× qPCR buffer 12.5μL
Primer F (10 μM) 0.5μL
Primer R (10 μM) 0.5 μL
Probe (5 μM)1 μL
cDNA 模板2μL
补充ddH2O至25μL。
4. 根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应的条件为：95℃30sec，随后 95℃ 5 sec、55℃ 10sec、 72℃ 20 sec进行 40 Cycles。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应结束后，将APMV1和APMV4的质粒进行10倍稀释，分别以如下反应进行标准曲线的建立：H2O 6μL、2×buffer(QIAGEN)10μL、Primer(up10 μM) 1μL、Primer(down10 μM) 1μL、 Probe (5 μM) 1μL、质粒 1μL，反应条件为95℃30 sec，随后 95℃ 5 sec、55℃ 10sec、72℃ 20 sec进行 40 Cycles，每个稀释度设5个重复，根据数据结果，进行标准曲线的分析建立。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述APMV1建立的标准曲线，相关系数R2为0.998，斜率为-3.269，截距为 37.709，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.269logX+37.709；APMV4建立的标准曲线，相关系数R2为0.999，斜率为-3.208，截距为 37.105，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.208logX+37.105。
7.一种利用权利要求2-6任一项所述的试剂盒进行的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1） RNA 抽提质检及反转录；
（2） 荧光PCR扩增及标准品制备方法；
（3）标准曲线的建立及分析。
8. 根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述荧光PCR扩增及标准品制备方法为：2× qPCR buffer 12.5μL、Primer F (10 μM) 0.5μL、Primer R (10 μM) 0.5 μL、Probe (5 μM)1 μL、cDNA 模板2μL、补充ddH2O至25μL。反应体系为：95℃30 sec，随后 95℃5 sec、55℃ 10sec、 72℃ 20 sec进行 40 Cycles，设ddH2O作为阴性对照；反应结束后观察荧光曲线；同时取5µL反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检验；以100bp DNA Ladder的Marker作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，电泳（5V/cm）电泳50min，凝胶成像系统观察结果；阳性PCR产物回收后连接pMD-18T载体，转化感受态DH5α，进行阳性转化菌的检测；使用QIAGEN 质粒提取试剂盒提取阳性重组菌质粒，使用 Nano Drop 测定质粒浓度；以所提取的质粒10倍稀释系列（拷贝数从 n×109系列稀释到n×102）制作标准曲线。标准质粒拷贝数计算公式如下： Copy Number=质量/分子量×6.02×1023= X 6.02×1023 / (2692+片段长度)/bp×109×660。
9.权利要求1中所述的引物探针组或者权利要求2-6中所述的试剂盒在快速鉴别诊断APMV-1和APMV-4中的应用。
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孙建伟: "《现代医学检验技术与治疗医用》", 31 May 2017, 吉林科学技术出版社 *

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