CN113817870B - 同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用 - Google Patents

同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用。该引物组合物能够同时实现对人副流感病毒1型、2型、3型、4a型和4b型，以及人呼吸道合胞病毒的A型和B型的检测分型，为病毒感染后的针对性治疗提供了有力的基础；各引物对不仅对相应病毒的检测特异性强，而且对其他常见的呼吸道相关病毒(如甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、鼻病毒、偏肺病毒、冠状病毒、博卡病毒以及肺炎衣原体、肺炎支原体)也不存在特异性扩增，不会出现假阳性结果；经检测，本发明的引物组合物对上述呼吸道相关病毒的最低检出限可达1.0×101copies/μL，灵敏度高。

Description

同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用。
背景技术
人呼吸道合胞病毒(HRSV)和人副流感病毒(HPIVs)是引起儿童和高危成人下呼吸道疾病的主要病原体，目前尚缺乏有效的治疗药物和病毒疫苗。
其中，副流感病毒是属于副黏病毒属的一类有包膜的单股负链RNA病毒，主要引起婴幼儿及儿童严重的下呼吸道感染疾病。根据遗传性和抗原性，副流感病毒可以分为1型、2型、3型和4型，1-3型副流感病毒是较为常见的引起婴幼儿急性呼吸道感染的重要病原体，4型仅会引起症状较轻的婴幼儿呼吸道感染，且4型又可进一步分为4a型和4b型。
而人呼吸道合胞病毒是属于肺病毒属的一类有包膜的单股负链RNA病毒，在一些地区，2岁以下儿童至少发生过一次HRSV感染；近年来，大量研究发现人呼吸道合胞病毒也可以引起成年人、老年人以及免疫力低下患者感染。根据抗原性不同，人呼吸道合胞病毒大致可以分为A型和B型两大亚型，A型和B型的主要抗原蛋白G蛋白存在明显差异(A型与B型氨基酸差异约50％)，这会导致G蛋白辅助病毒黏附宿主细胞能力的改变，且流行病学调查发现，在不同地区的不同时间段，A型和B型会呈现出明显的交替流行状态，偶尔呈共循环流行状态。
人副流感病毒和人呼吸道合胞病毒所引起的感染症状较为相似，仅依靠临床症状及常规的检测方法进行病毒病原的确定并不可靠。因此早期快速对呼吸道病毒感染的病原进行分型诊断能够及时指导临床治疗，为合理选择抗病毒药物提供依据，避免药物滥用。
如公开号为CN111808997A的中国发明专利申请公开了一种检测10种呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法，该组合物能够用于同时检测新型冠状病毒2019-nCoV、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感病毒3型、人副流感病毒4型、甲型流感病毒、人呼吸道合胞病毒和偏肺病毒这十种呼吸道相关病毒；但不能同时对人呼吸道合胞病毒的A型和B型进行分型，也不能对人副流感病毒的4a型和4b型进行分型。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用，该引物组合物能够同时实现对人副流感病毒1型、2型、3型、4a型和4b型，以及人呼吸道合胞病毒的A型和B型的检测分型，特异性强、灵敏度高。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
上述同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物包括：
①用于检测人副流感病毒1型的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的反向引物；
②用于检测人副流感病毒2型的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.3所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.4所示核苷酸序列的反向引物；
③用于检测人副流感病毒3型的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.5所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.6所示核苷酸序列的反向引物；
④用于检测人副流感病毒4a型的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.7所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.8所示核苷酸序列的反向引物；
⑤用于检测人副流感病毒4b型的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.9所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.10所示核苷酸序列的反向引物；
⑥用于检测人呼吸道合胞病毒A型的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.11所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.12所示核苷酸序列的反向引物；
⑦用于检测人呼吸道合胞病毒B型的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.13所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.14所示核苷酸序列的反向引物。
本发明的引物组合物能够同时实现对人副流感病毒1型、2型、3型、4a型和4b型，以及人呼吸道合胞病毒的A型和B型的检测分型，为病毒感染后的针对性治疗提供有力基础；各引物对不仅对相应病毒的检测特异性强，而且对其他常见的呼吸道相关病毒(如甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、鼻病毒、偏肺病毒、冠状病毒、博卡病毒以及肺炎衣原体、肺炎支原体)也不存在特异性扩增，不会出现假阳性结果；经检测，本发明的引物组合物对上述呼吸道相关病毒的最低检出限可达1.0×101copies/μL，灵敏度高。
在上述的同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物中，所有引物对中，反向引物的5’端均添加有荧光报告基团。
基于此，本发明还提供了上述的同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物在制备呼吸道相关病毒分型检测试剂盒中的应用；
以及一种呼吸道相关病毒分型检测试剂盒，该试剂盒中即包含有上述的同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物。
作为优选，上述的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒内还含有用于扩增人RNA内参基因B2M和IC的引物对。对待测样品中的人RNA内参基因B2M和IC进行同步扩增，则能够通过对人RNA内参B2M基因和IC的监测实现对样本提取过程和PCR扩增过程的质量控制。
作为进一步优选，在上述的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒中，用于扩增人RNA内参基因B2M的引物对包括具有如SEQ ID No.15所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ IDNo.16所示核苷酸序列的反向引物；
用于扩增IC基因的引物对包括具有如SEQ ID No.17所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.18所示核苷酸序列的反向引物；
上述引物对中的正向引物的5’端添加有荧光报告基团。
上述的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒中还含有阳性对照，所述的阳性对照为包含有人副流感病毒1型L基因、人副流感病毒2型L基因、人副流感病毒3型N基因、人副流感病毒4a型L基因、人副流感病毒4b型L基因、人呼吸道合胞病毒A型L基因、人呼吸道合胞病毒B型L基因和人RNA内参B2M基因序列的重组假病毒。
作为优选，本发明的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒为荧光多重反转录PCR试剂盒；试剂盒中还含有PCR反应液和RT-PCR酶系，所述的PCR反应液包括dNTPs、dUTP、Mg2+和缓冲液；所述的RT-PCR酶系包括UNG酶、逆转录酶和热启动DNA聚合酶。
本发明中，dUTP和UNG酶组成了PCR反应体系中的防污染体系，该dUTP-UNG酶防污染体系能够有效避免气溶胶污染影响PCR结果，从根本上避免假阳性结果的出现。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明的引物组合物能够同时实现对人副流感病毒1型、2型、3型、4a型和4b型，以及人呼吸道合胞病毒的A型和B型的检测分型，为病毒感染后的针对性治疗提供了有力的基础；各引物对不仅对相应病毒的检测特异性强，而且对其他常见的呼吸道相关病毒(如甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、鼻病毒、偏肺病毒、冠状病毒、博卡病毒以及肺炎衣原体、肺炎支原体)也不存在特异性扩增，不会出现假阳性结果；经检测，本发明的引物组合物对上述呼吸道相关病毒的最低检出限可达1.0×101copies/μL，灵敏度高。
(2)本发明的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒对人副流感病毒1型、2型、3型、4a型和4b型，以及人呼吸道合胞病毒的A型和B型的检测周期短，并且采用了dUTP-UNG酶防污染体系，该dUTP-UNG酶防污染体系能够有效避免气溶胶污染影响PCR结果，从根本上避免假阳性结果的出现。
附图说明
图1为采用本发明呼吸道相关病毒分型检测试剂盒对人副流感病毒1型的检测结果；
其中，huRNA表示人RNA内参B2M基因，IC表示反应内参；HPIV1表示人副流感病毒1型，下同；
图2为采用本发明呼吸道相关病毒分型检测试剂盒对人副流感病毒2型的检测结果；
其中，HPIV2表示人副流感病毒2型；
图3为采用本发明呼吸道相关病毒分型检测试剂盒对人副流感病毒3型的检测结果；
其中，HPIV3表示人副流感病毒3型；
图4为采用本发明呼吸道相关病毒分型检测试剂盒对人副流感病毒4a型的检测结果；
其中，HPIV4a表示人副流感病毒4a型；
图5为采用本发明呼吸道相关病毒分型检测试剂盒对人副流感病毒4b型的检测结果；
其中，HPIV4b表示人副流感病毒4b型；
图6为采用本发明呼吸道相关病毒分型检测试剂盒对人呼吸道合胞病毒A型的检测结果；
其中，HRSV-A表示人呼吸道合胞病毒A型；
图7为采用本发明呼吸道相关病毒分型检测试剂盒对人呼吸道合胞病毒B型的检测结果；
其中，HRSV-B表示人呼吸道合胞病毒B型。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1
分别针对人副流感病毒1型L基因、人副流感病毒2型L基因、人副流感病毒3型N基因、人副流感病毒4a型L基因、人副流感病毒4b型L基因、人呼吸道合胞病毒A型L基因、人呼吸道合胞病毒B型L基因、人RNA内参B2M基因和人RNA内参IC基因设计特异性引物，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成；获得的九组引物对的核苷酸序列信息见表1。
表1各引物对的核苷酸序列信息
采用表1所示的引物组合物制备本发明的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒，该试剂盒中包含有RT-PCR反应液、引物组合物、RT-PCR酶系、阳性对照以及阴性对照。其中，引物组合物的组成如表2所示，RT-PCR反应液的试剂组成如表3所示，RT-PCR酶系的组成如表4所示；阳性对照为包含有人副流感病毒1型L基因、人副流感病毒2型L基因、人副流感病毒3型N基因、人副流感病毒4a型L基因、人副流感病毒4b型L基因、人呼吸道合胞病毒A型L基因、人呼吸道合胞病毒B型L基因和人RNA内参B2M基因序列的重组假病毒，阴性对照为RNase-freeH2O。
表2本实施例呼吸道相关病毒分型检测试剂盒的引物组合物组成(50人份)
表3本实施例呼吸道相关病毒分型检测试剂盒中RT-PCR反应液试剂组成(50人份)
表4本实施例呼吸道相关病毒分型检测试剂盒中RT-PCR酶液的组成(50人份)
采用已通过测序验证后确诊的病毒阳性样本S1-S7(其中，S1样本为人副流感病毒1型阳性样本，S2为人副流感病毒2型阳性样本，S3为人副流感病毒3型阳性样本，S4为人副流感病毒4a型阳性样本，S5为人副流感病毒4b型阳性样本，S6为人呼吸道合胞病毒A型阳性样本，S7为人呼吸道合胞病毒B型样本)对本实施例呼吸道相关病毒分型检测试剂盒对各病毒的分型效果进行验证，验证方法为：
(1)核酸提取：在全自动核酸提取仪上，使用核酸提取试剂同时对样本S1～S7进行核酸自动提取，将完成提取的核酸样本置于-20℃保存备用；
(2)多重RT-PCR：先根据表5配制RT-PCR反应体系，将配制好的体系振荡、混匀、离心后置于PCR仪上，再根据表6所示的反应程序进行多重RT-PCR；而后准备电泳样品，每个电泳孔分别加入Hi-Di 8.7μL、SIZE-500 0.3μL和PCR产物1μL，混匀后离心备用；
表5 RT-PCR反应体系(单次反应)
试剂 加样量(μL)
RT-PCR反应液 10
引物组 4
RT-PCR酶液 1
模板核酸/阳性对照/阴性对照 5
体系总体积 20
表6 RT-PCR扩增程序
(3)毛细管电泳：将样品板置于3500DX基因分析仪中，选择“fragment”电泳方法进行电泳，具体操作方法详见3500DX操作说明书；
(4)结果分析：毛细管电泳结果如图1至图7所示，根据以下判断标准对图1至图7所示的电泳结果进行分析：
若特征靶点的峰高大于500RFU，则判定为阳性结果，并判断人副流感病毒或人呼吸道合胞病毒型别；若特征靶点的峰高小于等于300RFU，则判定为阴性结果；若特征靶点的峰高大于300RFU并小于等于500RFU，则判定为灰区，需要重新取样并再次检测，若结果为阳性或灰区，则判定为阳性结果，并判断人副流感病毒或人呼吸道合胞病毒型别，否则判定为阴性结果。根据上述判断标准和图1至图7所示的毛细管电泳结果可以看出，本实施的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒对所有检测靶点扩增良好，扩增产物长度与预期长度一致，各个产物和引物间无明显干扰，特异性强。
实施例2
临床收集除上述实施例1中所示7种病毒以外的其他常见呼吸道病毒感染阳性样本S8-S17(见表7)，所有样本均已采用宁波海尔施基因科技有限公司13种呼吸道病原体多重检测试剂盒(国械注准20183400518)检测确诊，采用本发明的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒对样本S8-S17进行检测(检测方法与实施例1相同)，以验证本发明的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒的特异性。
表7临床呼吸道病毒感染阳性样本信息
样本编号 病毒感染种类
S8 甲型流感病毒H1N1
S9 甲型流感病毒H3N2
S10 乙型流感病毒
S11 腺病毒
S12 鼻病毒
S13 偏肺病毒
S14 普通冠状病毒
S15 博卡病毒
S16 肺炎衣原体
S17 肺炎支原体
检测结果显示，本发明的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒对样本S8-S17的检测结果均为阴性，即在样本S8-S17中huRNA和IC均正常出峰，但均未检出任何人副流感病毒或人呼吸道合胞病毒；表明本发明的试剂盒对其他常见呼吸道病毒具有较好的特异性，在RT-PCR过程中不会因为非特异性扩增而造成假阳性结果的出现。
实施例3
将测定浓度和纯度后的包含人副流感病毒1型L基因、人副流感病毒2型L基因、人副流感病毒3型N基因、人副流感病毒4a型L基因、人副流感病毒4b型L基因、人呼吸道合胞病毒A型L基因、人呼吸道合胞病毒B性L基因的重组质粒分别进行2倍梯度稀释，得到从1×101～6.4×102copies/μL共7个稀释度的阳性质粒作为标准模板；而后利用本发明的试剂盒，采用实施例1中相同的方法对上述阳性质粒进行多重RT-PCR反应，获得每一个浓度的阳性重组质粒荧光信号值(见表8)。
表8不同浓度阳性重组质粒荧光信号值(RFU)汇总表
注：由于检测平台原因，当荧光信号值大于30000时，检测平台将无法准确识别荧光信号强度。
由表8可见，本发明的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒能够在1.0×101copies/μL浓度水平上稳定检出各阳性重组质粒，且最低荧光信号强度(HRSV_A)已经接近判读阈值，故推定试剂盒最低检出限为1.0×101copies/μL。
序列表
<110> 宁波海尔施基因科技有限公司
首都儿科研究所
<120> 同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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gtggccgctt ttctggattc at 22

Claims (10)

1.同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物，其特征在于，包括：
①用于检测人副流感病毒1型的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的反向引物；
②用于检测人副流感病毒2型的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.3所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.4所示核苷酸序列的反向引物；
③用于检测人副流感病毒3型的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.5所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.6所示核苷酸序列的反向引物；
④用于检测人副流感病毒4a型的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.7所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.8所示核苷酸序列的反向引物；
⑤用于检测人副流感病毒4b型的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.9所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.10所示核苷酸序列的反向引物；
⑥用于检测人呼吸道合胞病毒A型的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.11所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.12所示核苷酸序列的反向引物；
⑦用于检测人呼吸道合胞病毒B型的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.13所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.14所示核苷酸序列的反向引物。
2.如权利要求1所述的同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物，其特征在于，所有引物对中，反向引物的5’端均添加有荧光报告基团。
3.如权利要求1或2所述的同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物在制备呼吸道相关病毒分型检测试剂盒中的应用。
4.一种呼吸道相关病毒分型检测试剂盒，其特征在于，包含有如权利要求1或2所述的同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物。
5.如权利要求4所述的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒，其特征在于，还含有用于扩增人RNA内参基因B2M和IC的引物对。
6.如权利要求5所述的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒，其特征在于，用于扩增人RNA内参基因B2M的引物对包括具有如SEQ ID No.15所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQID No.16所示核苷酸序列的反向引物；
该正向引物的5’端添加有荧光报告基团。
7.如权利要求5所述的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒，其特征在于，用于扩增IC基因的引物对包括具有如SEQ ID No.17所示核苷酸序列的正向引物和具有如SEQ ID No.18所示核苷酸序列的反向引物；
该正向引物的5’端添加有荧光报告基团。
8.如权利要求4-7中任意一项所述的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒，其特征在于，还含有阳性对照，所述的阳性对照为包含有人副流感病毒1型L基因、人副流感病毒2型L基因、人副流感病毒3型N基因、人副流感病毒4a型L基因、人副流感病毒4b型L基因、人呼吸道合胞病毒A型L基因、人呼吸道合胞病毒B型L基因和人RNA内参B2M基因序列的重组假病毒。
9.如权利要求4-7中任意一项所述的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒，其特征在于，为荧光多重反转录PCR试剂盒。
10.如权利要求9所述的呼吸道相关病毒分型检测试剂盒，其特征在于，还含有PCR反应液和RT-PCR酶系，所述的PCR反应液包括dNTPs、dUTP、Mg2+和缓冲液；所述的RT-PCR酶系包括UNG酶、逆转录酶和热启动DNA聚合酶。
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