CN114958975A - 重组酶介导的等温核酸扩增组合产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种重组酶介导的等温核酸扩增组合产品；改产品包含一个或多个反应容器，以及封装于所述反应容器内的冻干的重组酶介导的等温核酸扩增所需的酶组分和除酶以外的反应液组分，它们的活性成分符合重组酶介导的等温核酸扩增反应所需的比例；所述反应液组分包括：ATP、ATP再生体系所用试剂、pH调节剂、dNTP、BSA和/或PEG、DTT以及水；其中所述酶组分为独立的冻干剂，所述反应液组分以两部分独立的冻干剂的形式被封存，其中一部分包括ATP再生体系所用试剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种重组酶介导的等温核酸扩增组合产品。
背景技术
反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(Reverse Transcription RecombinaseAided Amplification，RT-RAA)，是在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的一种新型的等温核酸快速检测技术。该方法先利用反转录酶将RNA转录成DNA，再利用从细菌或真菌等中获得的重组酶，在常温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧光探针的标记和核酸外切酶酶切，可以实现定时定量的结果分析。
现有的RT-RAA检测方案存在如下缺陷：
1)需要提取后才能检测，耗时耗力，不利于快速现场检测；2)现有RT-RAA扩增体系，至少包括3种组分：酶冻干粉、检测缓冲溶液、乙酸镁，移液步骤较多，耗时耗力，不利于实现现场快速检测；3)现有RT-RAA扩增体系，依然需要冷链运输才能保证产品性能稳定，跨境运输成本很高，也难以进行现场常温操作；4)扩增产物胶体金试纸条检测时需要开盖，易污染环境，造成假阳性，难以进行产业化。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种重组酶介导的等温核酸扩增组合产品，其包含一个或多个反应容器，以及封装于所述反应容器内的冻干的重组酶介导的等温核酸扩增所需的酶组分和除酶以外的反应液组分，它们的活性成分符合重组酶介导的等温核酸扩增反应所需的比例；
所述反应液组分包括：ATP、ATP再生体系所用试剂、pH调节剂、dNTP、BSA和/或PEG、DTT以及水；
其中所述酶组分为独立的冻干剂，所述反应液组分以两部分独立的冻干剂的形式被封存，其中一部分包括ATP再生体系所用试剂，优选至少包括镁离子。
可选的，如上所述的组合产品，所述镁离子以醋酸镁溶液的形式被冻干。
可选的，如上所述的组合产品，还包含用于检测核酸扩增产物的试纸条。
可选的，如上所述的组合产品，所述试纸条包括样品垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上设置有检测区和质检区；
其中：
所述样品垫包被有标记胶体金的抗体，所述抗体用于结合核酸扩增产物上的第一标记物；
所述检测区固定包被有针对所述抗标记物；所述抗标记物用于结合核酸扩增产物上的第二标记物；
所述质检区固定包被有针对所述抗体的二抗。
可选的，如上所述的组合产品，还包含授权公告号为CN212357257U的中国专利文献所披露的用于核酸扩增物快速检测的防污染检测装置，所述试纸条以检测内芯的形式封存于所述检测装置中。
可选的，如上所述的组合产品，还包含免提取核酸释放剂，其为工作浓度在以下范围的溶液：
Tween-20：0.3％～0.7％(v/v)；
LLS：0.02％～0.06％(m/v)；
EDTA：0.3mM～0.7mM；
以及缓冲组分；其pH＝7.3～7.7。
可选的，如上所述的组合产品，其特征在于，还包含引物和探针。
可选的，如上所述的组合产品，所述引物和探针为：
上游引物：CAGGGAATGGATAATCTTGCCTGCGAAGATC；
下游引物：ATTTGCTGGTTTAAGTATAATGTCTCCTACA；
探针：GTGGAAAATCCTACCATACAGAAAGACGTT(THF)TTGAGTGTAATGTGAA。
可选的，如上所述的组合产品，所述探针、所述上游引物及所述下游引物中，至少其中一个标记有生物素；
可选的，如上所述的组合产品，在所述探针、所述上游引物及所述下游引物中，至少其中一个标记有第一标记物；
所述探针、所述上游引物及所述下游引物中，至少其中一个标记有第二标记物；
所述第一标记物与所述第二标记物不同。
可选的，如上所述的组合产品，所述探针3’端包含不可延伸的封闭部分。
根据本发明的第二方面，还涉及包含如上所述组合产品的试剂盒。
本发明的有益效果为：
本发明通过将RT-RAA扩增所需酶、缓冲液、醋酸镁分别冻干为三个冻干微芯，解决了三组分无法混合，一旦混合即开始等温扩增问题。实现了三步移液变一步移液检测，简化了操作，缩短整个检测时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中引物RT-RAA扩增产物电泳图；
图2为本发明一个实施例中针对ORF2和3的荧光扩增曲线图；
图3为本发明一个实施例中现有RT-RAA-nfo产品常温运输1个月后的测试结果；
图4为本发明一个实施例中冻干试剂1个月性能测试结果；
图5为本发明一个实施例中冻干试剂12个月性能测试结果；
图6为本发明一个实施例中不同扩增时间对下限检出影响；
图7为本发明一个实施例中唾液样本检测结果；
图8为本发明一个实施例中痰液样本检测结果。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明涉及一种重组酶介导的等温核酸扩增组合产品，包含一个或多个反应容器，以及封装于所述反应容器内的冻干的重组酶介导的等温核酸扩增所需的酶组分和除酶以外的反应液组分，它们的活性成分符合重组酶介导的等温核酸扩增反应所需的比例；
所述反应液组分包括：ATP、ATP再生体系所用试剂、pH调节剂、dNTP、BSA和/或PEG、DTT以及水；
其中所述酶组分为独立的冻干剂，所述反应液组分以两部分独立的冻干剂的形式被封存，其中一部分包括ATP再生体系所用试剂，优选至少包括镁离子。
本发明通过将RT-RAA扩增所需酶、缓冲液、醋酸镁分别冻干为三个冻干微芯，解决了三组分无法混合，一旦混合即开始等温扩增问题。实现了三步移液变一步移液检测，简化了操作，缩短整个检测时间。
冻干组分还可实现常温运输、使用，有效期12个月以上，大大降低了跨境运输成本，降低了试剂运输对环境要求，真正可实现现场检测。
在一些实施方式中，所述酶组分包括能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、辅助蛋白、核酸外切酶(特别是核酸外切酶III)以及反转录酶；所述辅助蛋白用于改变重组酶-引物复合体解离及重新结合的可逆反应过程，使反应向更有利于等温核酸扩增进行。
在一些实施方式中，所述重组酶选自uvsX、RecA(如SC-recA或BS-recA)中的至少一种。
在一些实施方式中，所述单链DNA结合蛋白为gp32。
在一些实施方式中，所述链置换DNA聚合酶选自BSu DNA聚合酶和/或Sau DNA聚合酶。
在一些实施方式中，所述辅助蛋白选自uvsY、recB、recC中的至少一种。
在一些实施方式中，所述ATP再生体系所用试剂选自镁离子、磷酸肌酸及其平衡离子、肌酸激酶、肌激酶、焦磷酸酶、蔗糖以及蔗糖磷酸化酶中的多种。
在一些实施方式中，所述镁离子以醋酸镁溶液的形式被冻干。
在一些实施方式中，还包含用于检测核酸扩增产物的试纸条。
在一些实施方式中，所述试纸条包括样品垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上设置有检测区和质检区；
其中：
所述样品垫包被有标记胶体金的抗体，所述抗体用于结合核酸扩增产物上的第一标记物；
所述检测区固定包被有针对所述抗标记物；所述抗标记物用于结合核酸扩增产物上的第二标记物；
所述质检区固定包被有针对所述抗体的二抗。
在一些实施方式中，所述抗体为荧光物质的抗体；在一些实施方式中，所述抗标记物为亲和素。
在一些实施方式中，还包含授权公告号为CN212357257U的中国专利文献所披露的用于核酸扩增物快速检测的防污染检测装置，所述试纸条以检测内芯的形式封存于所述检测装置中。
本发明RT-RAA扩增产物，无需开盖，和杂交稀释液一起安装在配套密闭反应装置上，可实现现场快速、防污染检测，反应时间仅需5～10分钟；并且整个RT-RAA检测时间可以小于30分钟。
在一些实施方式中，还包含免提取核酸释放剂，其为工作浓度在以下范围的溶液：
Tween-20：0.3％～0.7％(v/v)；
LLS(十二烷基硫酸)：0.02％～0.06％(m/v)；
EDTA：0.3mM～0.7mM；
以及缓冲组分；其pH＝7.3～7.7。
在一些实施方式中，免提取核酸释放剂为工作浓度在以下范围的溶液：
Tween-20：0.4％～0.6％(v/v)；
LLS(十二烷基硫酸)：0.03％～0.05％(m/v)；
EDTA：0.4mM～0.6mM；
以及缓冲组分；其pH＝7.3～7.7。
如本文使用的术语“缓冲组分”指水溶液或组合物，当酸或碱加入该溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此，显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH，例如pH7–pH 9。一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH(参见例如，Mohan，Buffers，A guide for the preparation and use of buffers in biological systems，CALBIOCHEM，1999)。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。
在一些实施方式中，缓冲组分选自工作浓度为20mM～40mM的Tris-HCl。
本发明所提供的免提取核酸释放剂，既可裂解病毒释放核酸，又不影响下游RT-RAA扩增，可节省核酸提取费用，缩短整个检测时间。
在一些实施方式中，还包含引物和探针。
在一些实施方式中，所述组合产品用于检测病毒，优选SARS-CoV-2。
在一些实施方式中，所述引物和探针为：
上游引物：CAGGGAATGGATAATCTTGCCTGCGAAGATC；
下游引物：ATTTGCTGGTTTAAGTATAATGTCTCCTACA；
探针：GTGGAAAATCCTACCATACAGAAAGACGTT(THF)TTGAGTGTAATGTGAA。
上述引物和探针组合，能够通过外投假病毒到正常人口咽拭子样本中，检测下限50copy/ml，并且检测其它冠状病毒、呼吸道病原体检测特异性100％，检测5大类13种食材样本，符合率100％。
在一些实施方式中，在所述探针、所述上游引物及所述下游引物中，至少其中一个标记有第一标记物；
所述探针、所述上游引物及所述下游引物中，至少其中一个标记有第二标记物；
所述第一标记物与所述第二标记物不同；
在一些实施方式中，所述第一标记物为生物素；
在一些实施方式中，所述第二标记物为荧光物质。
在一些实施方式中，荧光物质选自FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY3、Texas Red、TFAM、SYBR Green I、VIC以及JOE中的任一种。
在一些实施方式中，所述探针3’端包含不可延伸的封闭部分。
封闭的基团可以选自氨基、磷酸化、间臂(Spacer)、生物素等修饰方式；也可以通过将荧光基团、淬灭基团等标记与3’末端从而实现封闭。在一些实施方式中，所述间臂修饰选自乙二醇、C9间臂(Spacer 9)、C18间臂(Spacer 18)、双脱氧间臂[1’,2’-Dideoxyribose(dSpacer)]、C3间臂(C3 Spacer)中的任一种。
本发明还涉及包含如上所述组合产品的试剂盒。
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品(例如，包装或容器)，其包括如本文所述的组合产品。试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及如上所述的包含引物和探针的组合产品或试剂盒在检测SARS-CoV-2中的用途。
这样的用途可以是诊断或非诊断目的。
这样的用途可以用于诊断新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
上述用途的受试者可以指患者或怀疑携带有SARS-CoV-2的动物，特别是哺乳动物，例如蝙蝠、果子狸；优选为灵长类动物，更优选为人。
检测SARS-CoV-2所用的样本优选为受试者的上呼吸道标本(如咽拭子、鼻拭子等)、下呼吸道标本(如呼吸道吸取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、深咳痰液等)、眼结膜拭子、粪便标本、抗凝血和血清标本等。临床标本应尽量采集病例发病早期的呼吸道标本(尤其是下呼吸道标本)和发病7天内急性期血清以及发病后第3～4周的恢复期血清。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例
1.免提取核酸释放剂，配方如下所示：
Tris-HCl：30mM；
Tween-20：0.5％(v/v)；
LLS：0.04％；
EDTA：0.5mM；
pH：7.5。
2.RT-RAA检测试剂。
由外购自杭州众测生物科技有限公司，RT-RAA-nfo产品制备得到。
杭州众测现有RT-RAA-nfo产品组成为，酶干粉、A buffer、B buffer。
将酶干粉、A buffer、B buffer做成三个冻干微球，封装于EP管中，冻干微球委托方为上海简逸生物。RT-RAA试剂由三管合并为一管，即简化了移液步骤，又提高了加入样本的体积，又能实现常温运输使用。
3.新型冠状病毒检测引物探针序列序列筛选
根据SAR-CoV-2基因组序列NCBI Reference Sequence:NC_045512.2，选择保守区进行引物探针设计，引物探针序列如下：
其中THF为四氢呋喃，PHO为磷酸基团。
引物探针合成自通用生物系统(安徽)有限公司，使用杭州众测基础性RT-RAA试剂，引物稀释为10um,上下游引物分别加入2ul。水浴锅，42℃扩增30分钟。扩增后的产物使用
PCR&DNA Cleanup Kit NEB#T1030，进行纯化，纯化后2％琼脂糖凝胶电泳，100V，跑40min，引物RT-RAA扩增产物电泳图如图1所示，观察电源条带大小，亮度。选择条带最亮的ORF2/3作为候选检测引物。
使用杭州众测荧光法RT-RAA，对比ORF引物2/3检测性能，上下游引物2ul/反应，探针0.6ul/反应，使用1000拷贝体外转录制备的RNA标准品。在罗氏480PCR仪上42℃，扩增30分钟。
引物探针组合扩增效率比较
从图2可知，ORF3单位时间内荧光信号累积量高于ORF3，即ORF3引物探针组合扩增效率优于ORF2，因此选择ORF3引物探针组合作为新冠病毒核酸检测引物探针。
4.不同冻干形式产品检测流程及常温稳定性对比
4.1检测流程对比
杭州众测现有RT-RAA-nfo产品组成为，酶干粉、A buffer、B buffer,检测步骤为36ul A buffer加入酶干粉粉饼，溶解干粉，然后加入10ul样本，再加入B buffer进行温育扩增。
本发明将酶干粉、A buffer、B buffer做成冻干微球，冻干微球委托方为上海简逸生物。RT-RAA试剂由三管合并为一管，即简化了移液步骤，又提高了加入样本的体积(从10ul提高到50ul，更有利于新冠病毒检出)，又能实现常温运输使用。
4.2常温稳定性对比
1)现有RT-RAA-nfo产品常温运输、静置稳定性评价
常温运输1个月测试如图3所示。
2)本发明稳定性评价结果如图4～图5所示
5.等温扩增时间优化
本发明定位为新冠核酸快检产品，需尽可能缩短反应所需时间，因此需要摸索确定不影响检测下限的最短的等温扩增时间。外投假病毒67copy/ml，分别扩增15分钟，20分钟，30分钟。结果如图6所示，根据上述结果，确定等温扩增时间为20分钟。
6.核酸胶体金密闭反应装置
引用本公司实用新型专利，授权公告号CN212357257U。核酸胶体金试纸条外购于尼沃诺斯生物工程有限公司，密闭反应装置由本公司委托昆山祥宝加工完成，核酸胶体金试纸条、密闭反应装置组装在本公司完成。
7.配套便携式恒温仪、离心机
8.整体检测实施方案
1)取口咽、鼻咽拭子样本，或用口咽拭子蘸取唾液、痰液，放入样本核酸释放剂中，搅动拭子15次，充分裂解病毒释放核酸
2)取处理后的样本50ul加入含RT-RAA-nfo冻干微芯的检测管内，充分溶解干粉，放置再金属浴上42℃，温育20分钟
3)取出核酸胶体金密闭反应装置，将反应管和杂交液管依次安装在密闭反应装置对应孔位上，采用按压或离心方式使液体流到试纸条上
4)室温静置5-10分钟后观察结果，C/T两条线为阳性，仅有C线为阴性，没有C线无无效结果。
整个检测流程耗时小于30min。
9.检测下限
采用上述整体实施方案，评价检测下限，分别检测两个外投假病毒50copy/ml，2个NTC。
外投假病毒50copy/ml可检出，检测下限可低至50copy/ml。
10.检测特异性
分析特异性主要包括：1：阴性参考品进行检测，不得检测出阳性；2：对出现在相应临床标本中的可能产生交叉反应的常见病原体进行了检测验证，结果显示冠状病毒(包括SARS、MERS、229E、OC43、HKUI\NL63)、流感病毒、肺炎链球菌、EBV均为阴性；3：ORF检测人类基因组DNA/RNA，为阴性4：干扰物质检测评价。
10.1材料和方法
10.1.1检测样品准备
1)选取10例特异性参考品一份；
2)选取交叉特异性病原体灭活样本一份；
3)取人类基因组DNA/RNA样本一份；
4)需验证评价的干扰物质如下，一份。
10.1.2实验方法
1)使用本试剂盒检测10份特异性参考品，阴性符合率100％
2)交叉特异性病原体灭活样本，检测结果为阴性
3)人类基因组DNA/RNA样本，检测结果为阴性
4)评价各个干扰物质对检测结果的影响，给出检测注意事项
10.2特异性试验结果数据
表1阴性参考品结果汇总
| 名称 | 结果判读 | 是否符合 |
| 阴性参考品 | 阴性 | 符合 |
| 阴性参考品 | 阴性 | 符合 |
| 阴性参考品 | 阴性 | 符合 |
| 阴性参考品 | 阴性 | 符合 |
| 阴性参考品 | 阴性 | 符合 |
| 阴性参考品 | 阴性 | 符合 |
| 阴性参考品 | 阴性 | 符合 |
| 阴性参考品 | 阴性 | 符合 |
| 阴性参考品 | 阴性 | 符合 |
| 阴性参考品 | 阴性 | 符合 |
| 阴性参考品 | 阴性 | 符合 |
表2交叉特异性结果汇总
表3人基因组DNA/RNA检测结果
| ORF | |
| 人血细胞基因组DNA | 阴性 |
| 人血细胞RNA | 阴性 |
表4干扰物质评价
| 物质 | 实验组 | 对照组 |
| 粘蛋白 | 阳性 | 阳性 |
| 血液(人类) | 阳性 | 阳性 |
| 鼻腔喷雾剂或滴鼻剂 | 阳性 | 阳性 |
| 鼻用皮肤类固醇 | 阳性 | 阳性 |
| 过敏性症状缓解药物 | 阳性 | 阳性 |
| 抗病毒药物 | 阳性 | 阳性 |
| 抗生素 | 阳性 | 阳性 |
| 全身性抗菌药 | 阳性 | 阳性 |
11.食材样本检测
食材样本种类繁多，基质多样，免提取检测可能会影响本发明检出效果。因此在江苏省疾控进行了食材样本检测评价，和金标准PCR做对比。
表5检测评价的食材样本情况
使用口咽拭子在食材表面取样，放入样本核酸释放剂中，下面操作同本发明步骤8中的方案，检测一批，然后再食材表面滴加假病毒后，再用口咽拭子在食材表面取样检测，检测结果如下表：
表6食材样本检测结果
| 食材编号 | 食材名称 | 检测结果 | 涂假病毒后检测结果 |
| 1 | 生菜 | 阴性 | 阳性 |
| 2 | 番茄 | 阴性 | 阳性 |
| 3 | 苹果 | 阴性 | 阳性 |
| 4 | 百叶 | 阴性 | 阳性 |
| 5 | 鸭腿 | 阴性 | 阳性 |
| 6 | 鸡胸肉 | 阴性 | 阳性 |
| 7 | 牛肉 | 阴性 | 阳性 |
| 8 | 猪小排 | 阴性 | 阳性 |
| 9 | 鲳鱼 | 阴性 | 阳性 |
| 10 | 巴沙鱼 | 阴性 | 阳性 |
| 11 | 三文鱼 | 阴性 | 阳性 |
| 12 | 鲍鱼 | 阴性 | 阳性 |
| 13 | 鳕鱼 | 阴性 | 阳性 |
上述结果和江苏省疾控PCR结果符合率100％。表面本发明方案未受主要食材类型基质影响，可用于上述食材样本污染新冠病毒的检测。
12.口咽、鼻咽样本检测
为了评价本发明方案对人干扰新冠病毒检出情况，在重庆公卫入组阳性样本50例，阴性样本30例，具体入组样本情况如下表：
表7入组病例信息表
按本发明步骤8中的方案进行检测，检测结果和金标准PCR方法对比结果如下：
表8和金标准PCR方法检测结果对比四格表
灵敏度：50/50＝100％
特异性：30/30＝100％
总体符合率：(50+30)/80＝100％
PPV:50/50＝100％
NPV:30/30＝100％
Kappa:1
上述结果显示，本发明方案和新冠核酸检测金标准RT-qPCR检测一致性100％
本发明方案检测结果和临床诊断结果对比分析：
表9和临床诊断结果对比四格表
上述结果显示本发明方案在不同临床分型、不同发病时间、不同病程阶段阳性检出率均为100％。
13.唾液样本检测
将假病毒样本外投如唾液样本中，按本发明步骤8中的方案进行检测评价，结果如图7所示。
唾液样本最低检测下限为10拷贝/份唾液。
14.痰液样本检测
将假病毒样本外投如痰液样本中，按本发明步骤8中的方案进行检测评价，结果如图8所示。
唾液样本最低检测下限为200拷贝/份痰液。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种重组酶介导的等温核酸扩增组合产品，其特征在于，包含一个或多个反应容器，以及封装于所述反应容器内的冻干的重组酶介导的等温核酸扩增所需的酶组分和除酶以外的反应液组分，它们的活性成分符合重组酶介导的等温核酸扩增反应所需的比例；
所述反应液组分包括：ATP、ATP再生体系所用试剂、pH调节剂、dNTP、BSA和/或PEG、DTT以及水；
其中所述酶组分为独立的冻干剂，所述反应液组分以两部分独立的冻干剂的形式被封存，其中一部分包括ATP再生体系所用试剂，优选至少包括镁离子。
2.根据权利要求1所述的组合产品，其特征在于，所述镁离子以醋酸镁溶液的形式被冻干。
3.根据权利要求1所述的组合产品，其特征在于，还包含用于检测核酸扩增产物的试纸条。
4.根据权利要求3所述的组合产品，其特征在于，所述试纸条包括样品垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上设置有检测区和质检区；
其中：
所述样品垫包被有标记胶体金的抗体，所述抗体用于结合核酸扩增产物上的第一标记物；
所述检测区固定包被有针对所述抗标记物；所述抗标记物用于结合核酸扩增产物上的第二标记物；
所述质检区固定包被有针对所述抗体的二抗。
5.根据权利要求3所述的组合产品，其特征在于，还包含授权公告号为CN212357257U的中国专利文献所披露的用于核酸扩增物快速检测的防污染检测装置，所述试纸条以检测内芯的形式封存于所述检测装置中。
6.根据权利要求1所述的组合产品，其特征在于，还包含免提取核酸释放剂，其为工作浓度在以下范围的溶液：
Tween-20：0.3％～0.7％(v/v)；
LLS：0.02％～0.06％(m/v)；
EDTA：0.3mM～0.7mM；
以及缓冲组分；其pH＝7.3～7.7。
7.根据权利要求1～6任一项所述的组合产品，其特征在于，还包含引物和探针。
8.根据权利要求7所述的组合产品，其特征在于，所述引物和探针为：
上游引物：CAGGGAATGGATAATCTTGCCTGCGAAGATC；
下游引物：ATTTGCTGGTTTAAGTATAATGTCTCCTACA；
探针：GTGGAAAATCCTACCATACAGAAAGACGTT(THF)TTGAGTGTAATGTGAA。
9.根据权利要求7或8所述的组合产品，其特征在于，在所述探针、所述上游引物及所述下游引物中，至少其中一个标记有第一标记物；
所述探针、所述上游引物及所述下游引物中，至少其中一个标记有第二标记物；
所述第一标记物与所述第二标记物不同；
可选的，所述第一标记物为生物素；
可选的，所述第二标记物为荧光物质；
优选的，所述探针3’端包含不可延伸的封闭部分。
10.包含权利要求1～9任一项所述组合产品的试剂盒。
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| CN116064746A (zh) * | 2022-09-16 | 2023-05-05 | 上海伯杰医疗科技股份有限公司 | 用于核酸扩增的微球制剂、扩增方法及在联合检测中的应用 |
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