CN115948515A - 重组酶介导的全冻干恒温扩增体系及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组酶介导的全冻干恒温扩增体系及其制备方法和应用，涉及分子生物学检测领域，本发明全冻干恒温扩增体系包括两部分：第一部分为酶体系；第二部分为引物探针和激活体系；所述酶体系的冻干形式为冻干粉；所述引物探针和激活体系的冻干形式为冻干球。本发明通过将酶体系制备成冻干粉，将激活体系和引物探针混合制备成冻干球，提高了液体顺滑度和均质性，避免了冻干过程中全体系粘稠度高不易分散匀浆，导致结果不稳定的问题，实现了RPA全冻干，达到一步上样的操作，操作便利。本发明中包含所述全冻干恒温扩增体系的试剂盒灵敏度和特异性高。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种重组酶介导的全冻干恒温扩增体系及其制备方法和应用。
背景技术
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃-40℃左右。RPA反应速度快，用时短，特异性强。目前，RPA试剂可以以冻干粉或液体的形式保存，其中，将RPA试剂冻干预分装可以避免反复冻融导致的实验结果误差，防止酶等粘度高的组分损耗，能够常温储运，包装形式简单。
然而，由于RPA体系依赖于扩增酶及蛋白的作用，而体系中酶与蛋白在常温即可反应，为确保体系能够长期保存且保有较佳的活性，试剂的存在形式和保存条件至关重要。整个RPA恒温扩增酶体系需要激活剂激活反应，来促进多酶体系的工作，如聚乙二醇具有提高RPA扩增反应的效率，促进DNA链的合成，协助重组酶与单链蛋白功能之间的平衡等功能；金属镁离子能够促进DNA聚合酶与dNTP的结合，进入体系即开始扩增反应，促进DNA链的合成。目前较为常见的重组酶恒温扩增技术的商业体现形式为冻干+液体试剂组合(半冻干形式)，即只冻干对温度敏感的反应酶体系，将对温度耐受性高的激活体系设置为液体型试剂，常见保存于-20℃。另外还有全液体形式试剂，即所有组分均为液体，但对保存条件要求较高，需要严格保存于-20℃。但以上两种试剂形式，均存在操作较为复杂的问题。半冻干试剂在使用过程中，需要使用冻干重建剂/复融剂和激活剂作为反应必要成分，存在3次点样的步骤，且激活剂的加入量为2-3μL/孔，对实验人员和操作工具的要求较高，流程繁琐，容易导致点样误差；而在重组酶介导的恒温扩增体系中，常见的作为液体形式存在的复融剂和激活剂对体系的激活作用是即时的，即在酶体系与激活体系混合后，在常温即刻开始反应，因此在前期测试中，单纯的混合全体系后进行冻干的效果并不可观，且聚乙二醇粘稠度较高，影响全体系的均质性。
中国专利CN110305975B公开了一种快速检测鸡滑液囊支原体的RPA试剂盒及其用途，该试剂盒包含：含RPA冻干颗粒的反应管，反应缓冲液，醋酸镁，一对引物及一条探针。该试剂盒仅将扩增所需要的酶和其他一些必要的东西已经冻干保存，扩增时仍需要加入反应缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁离子起始反应，反应步骤繁琐，不方便运输及保存。
当前缺少一种能够更灵敏、更高特异性，满足快速检测需求并且全冻干的恒温扩增体系。
发明内容
除非上下文另有明确指示，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。通过端点表述的数值范围包括在对应范围内的所有数值和分数，以及所表述的端点。
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种重组酶介导的全冻干恒温扩增体系及其制备方法和应用，该全冻干恒温扩增体系由三部分组成，分别为酶体系冻干粉、激活体系冻干球和引物探针冻干球，三部分的冻干形式不同，能够提高液体顺滑度和均质性，避免了冻干过程中全体系粘稠度高不易分散匀浆，导致结果不稳定的问题，实现了RPA全冻干，达到一步上样的操作。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种全冻干恒温扩增体系，包括两部分：
第一部分为酶体系；第二部分为引物探针和激活体系；所述酶体系的冻干形式为冻干粉；所述引物探针和激活体系的冻干形式为冻干球。
优选地，所述的酶体系包括蛋白酶混合液、dNTPs、Tris缓冲buffer、激酶体系、甘露糖基甘油酸。
优选地，所述的激活体系包括聚乙二醇、海藻糖、二硫苏糖醇、乙酸镁或乙酸钾、氯化钠。
进一步优选地，所述的激活体系包括聚乙二醇、海藻糖、二硫苏糖醇、乙酸镁、氯化钠。
优选地，所述的蛋白酶混合液包括重组酶、重组调节蛋白、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶和RT酶；所述的激酶体系包括ATP、磷酸肌酸激酶和磷酸肌酸。
优选地，所述的激活体系包括1％-20％聚乙二醇、2％-10％海藻糖、1-15mM二硫苏糖醇、2-28mM乙酸镁，1-12mM氯化钠。
进一步优选地，所述的激活体系包括20％聚乙二醇、2％海藻糖、3mM二硫苏糖醇、20mM乙酸镁，4mM氯化钠。
优选地，所述引物浓度为100-800nM；所述的探针浓度为50-200nM。
进一步优选地，所述引物浓度为400nM；所述的探针浓度为150nM。
具体地，所述探针包含荧光基团和淬灭基团；所述的荧光基团包括FAM、HEX、ROX、JOE、VIC或CY5；所述的淬灭基团包括BHQ1或BHQ2。
优选地，所述的荧光基团包括FAM；所述的淬灭基团包括BHQ1。
优选地，所述的酶体系包括蛋白酶混合液、10-60mM dNTPs、10-80mM Tris缓冲buffer、激酶体系、1-5mM甘露糖基甘油酸。
进一步优选地，所述的酶体系包括蛋白酶混合液、40mM dNTPs、30mM Tris缓冲buffer、激酶体系、1mM甘露糖基甘油酸。
优选地，所述的蛋白酶混合液包括100-800ng/μL重组酶、200-800ng/μL重组调节蛋白、300-1000ng/μL单链DNA结合蛋白、20-100ng/μL链置换DNA聚合酶和160-200U RT酶；所述的激酶体系包括1-10mM ATP、40-200ng/μL磷酸肌酸激酶和20-80mM磷酸肌酸。
进一步优选地，所述的蛋白酶混合液包括200ng/μL重组酶、400ng/μL重组调节蛋白、300ng/μL单链DNA结合蛋白、60ng/μL链置换DNA聚合酶和160U RT酶；所述的激酶体系包括3mM ATP、40ng/μL磷酸肌酸激酶和40mM磷酸肌酸。
本发明还提供了一种全冻干恒温扩增试剂盒，包括上述的全冻干恒温扩增体系。
本发明还提供了一种全冻干恒温扩增体系的制备方法，所述的酶体系通过冷冻冻干处理后得到酶体系冻干粉；所述引物探针和激活体系混合后通过冷冻冻干处理后得到冻干球。
本发明还提供了一种上述的全冻干恒温扩增体系在重组酶聚合酶扩增中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的全冻干恒温扩增体系运输方便，操作便利，只需加入模板即可上机反应，无需其他繁琐步骤；
(2)本发明的全冻干恒温扩增过程对温度要求低，仅需37-42摄氏度恒温反应，对反应加热的模块要求更低；
(3)本发明中恒温扩增过程反应时间短，相对于常规PCR的1.5-3小时，该技术将反应时间缩短至15-20分钟，大大提高了检测效率；
(4)本发明的恒温扩增体系兼具高灵敏度与高特异性的优点。
附图说明
图1为全冻干体系不同测试组检测甲型流感病毒的结果图；
图2为全冻干体系不同测试组检测人合胞病毒的结果图；
图3为全冻干体系检测甲型流感病毒灵敏度的结果图；
图4为全冻干体系检测人合胞病毒灵敏度的结果图；
图5为全冻干体系、半冻干体系、液体体系检测1500拷贝/毫升的甲型流感病毒的结果图；
图6为全冻干体系、半冻干体系、液体体系检测1500拷贝/毫升的人合胞病毒的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此，描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
1.恒温扩增体系的配制
体系包括2部分：
(1)恒温扩增酶体系：包括蛋白酶混合液、40mM dNTPs、30mM Tris缓冲buffer、激酶体系、1mM甘露糖基甘油酸；所述的蛋白酶混合液包括200ng/μL重组酶、400ng/μL重组调节蛋白、300ng/μL单链DNA结合蛋白、60ng/μL链置换DNA聚合酶和160U RT酶；所述的激酶体系包括3mM ATP、40ng/μL磷酸肌酸激酶和40mM磷酸肌酸。
(2)引物探针和恒温扩增激活体系：包括400nM引物、150nM探针、20％聚乙二醇、2％海藻糖、3mM二硫苏糖醇、20mM乙酸镁，4mM氯化钠。
2.冻干分组测试
为测试全冻干体系的效果，设置实验冻干测试组如表1所示。测试组1和测试组2为冻干粉+冻干球的组合，区别在于引物探针所在体系不同，组1由酶体系冻干粉及激活体系加引物探针冻干球组成，测试组2由酶体系加引物探针的冻干粉及激活体系的冻干球组成。测试组3与测试组4为全恒温扩增体系混合冻干，区别为测试组3为冻干粉，测试组4为冻干球。
表1恒温扩增体系冻干测试表
为进一步验证测试效果，本测试以甲型流感病毒、人合胞病毒作为测试病原体进行示例。将以上配置的试剂在经-80℃冷冻干燥机负压冻干处理后，获得试剂冻干粉和冻干球，用于后续测试。
测试步骤为：
步骤1：选择通用生物(安徽)股份有限公司合成的甲型流感病毒和人合胞病毒的假病毒做为模板，利用磁珠试剂盒(来自圣湘生物科技股份有限公司，货号S10015)将上述假病毒分别进行核酸提取，得到的核酸作为反应模板。
步骤2：使用50μL甲型流感病毒和人合胞病毒假病毒核酸为模板，对上述的冻干试剂进行复融，震荡离心，确保完全复融后即刻上机，使用宏石全自动医用PCR分析系统(SLAN-96P)进行检测，程序设置为39℃，30s(采集荧光)，40个循环。
结果如图1及图2所示，通过对比不同的全冻干试剂检测效果，本案例发现，趋势一致，全混合冻干体系的测试组3及测试组4的检测效果均不佳，荧光值极低，且扩增曲线的起峰时间靠后。而分组冻干的效果呈现较好，实施例1的荧光值最高，且扩增曲线的起峰时间最靠前，而测试组2的扩增曲线起峰时间推迟并不明显，但荧光值存在明显的下降。
如测试组1所示，本发明通过对冻干试剂的分配体系进行调整，将酶体系制备成冻干粉，将激活体系和引物探针混合制备成冻干球，制备得到的冻干试剂效果优于测试例2-4。
因此，优选测试组1的冻干组合作为全冻干体系方案的实施例1。
3.灵敏度测试
为进一步测试全冻干体系的灵敏度，以甲型流感病毒、人合胞病毒作为测试病原体进行示例。以表2的方案进行体系配置及冻干，获得试剂冻干粉和冻干球，用于后续测试。
表2恒温扩增全冻干反应体系配置
其中，扩增甲型流感病毒的正反向引物、探针序列分别为：
正向引物：5’-GGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATTCCAT-3’(SEQ ID NO.1)；反向引物：5’-CAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGGTT-3’(SEQ ID NO.2)；探针：5’-TGCAGGGAAGAACGCAGATCTCGAGGCTCTCATGGAGTGGATAAAG-3’
(SEQ ID NO.3)；
所述修饰后的甲型流感病毒探针如下：
TGCAGGGAAGAACGCAGATCTCGAGGCTC[FAM-dT]C[THF][BHQ-dT]GGAGTGGATAAAG-C3Spacer，其中第30位碱基T标记荧光基团FAM，第33位碱基T标记淬灭基团BHQ1，探针序列第32位碱基A替换为四氢呋喃及3’端标记C3-spacer。
扩增人合胞病毒的正反向引物、探针序列分别为：
正向引物：5’-CAACACCCTGACAAAATCAACAATATAGTAACAA-3’(SEQ ID NO.4)；反向引物5’-GCAAGTCTGCTGGCACAGATGACTGGAACATAG-3’(SEQ ID NO.5)；探针：
5’-TTCAGTACAATGTTCTAGAAAAAGATGATGATCCTGCATCACTAACAATATG-3’
(SEQ ID NO.6)；
所述修饰后的人合胞病毒探针如下：
TTCAGTACAATGTTCTAGAAAAAGATGATGATCC[FAM-dT]G[THF]A[BHQ-dT]CACTAACAATAT-C3 Spacer，其中第35位碱基T标记荧光基团FAM，第39位碱基T标记淬灭基团BHQ1，探针序列第37位碱基C替换为四氢呋喃及3’端标记C3-spacer。
灵敏度测试步骤如下：
步骤1：选择通用生物(安徽)股份有限公司合成的甲型流感病毒和人合胞病毒的假病毒做为模板，利用磁珠试剂盒(来自圣湘生物科技股份有限公司，货号S10015)将上述假病毒分别进行核酸提取，得到的核酸分别使用去离子水稀释成对应的梯度(1500cp/mL、900cp/mL、300cp/mL、150cp/mL)作为反应模板。
步骤2：使用50μL甲型流感病毒和人合胞病毒假病毒核酸为模板，对上述的冻干试剂进行复融，震荡离心，确保完全复融后即刻上机，使用宏石全自动医用PCR分析系统(SLAN-96P)进行检测，程序设置为39℃，30s(采集荧光)，40个循环。
结果如图3及图4所示，全混合冻干体系的灵敏度检测效果呈现较好，从图3和图4可以看出实施例1可以检出300拷贝/毫升的甲型流感病毒假病毒核酸和人合胞病毒假病毒核酸，对于中高浓度的1500拷贝/毫升的核酸，实施例1的起线时间在5min左右，检出快。
具体灵敏度检出情况参考表3所示，实施例1符合要求。
表3甲型流感病毒及人合胞病毒恒温扩增全冻干体系灵敏度检测结果
| 浓度 | 甲型流感病毒检出率 | 人合胞病毒检出率 |
| 1500拷贝/毫升 | 100％(20/20) | 100％(20/20) |
| 900拷贝/毫升 | 100％(20/20) | 100％(20/20) |
| 300拷贝/毫升 | 100％(20/20) | 100％(20/20) |
| 150拷贝/毫升 | 80％(16/20) | 70％(14/20) |
对比例1半冻干体系
与实施例1相比，将冻干球的激活体系以液体型试剂形式呈现，组成仅有酶体系冻干成冻干粉的恒温扩增试剂形式，具体配置方法如表4所示：
表4恒温扩增酶体系配置表
步骤1：选择通用生物(安徽)股份有限公司合成的甲型流感病毒和人合胞病毒的假病毒做为模板，利用磁珠试剂盒(来自圣湘生物科技股份有限公司，货号S10015)将上述假病毒分别进行核酸提取，得到的核酸分别使用去离子水稀释成对应的梯度(1500cp/mL、900cp/mL、300cp/mL、150cp/mL)作为反应模板。
步骤2：参考表4配置酶体系后，进行冻干处理后备用。
步骤3：使用12.5μL复融剂(20％聚乙二醇、2％海藻糖、3mM二硫苏糖醇)及1μL引物探针(400nM引物及150nM探针)充分复融混合酶体系，在八连管管盖内加入2.5μL激活剂(20mM乙酸镁，4mM氯化钠)，余下使用模板补齐至50μL。
步骤4：充分混合离心后置于宏石全自动医用PCR分析系统SLAN-96P上，程序设置为39℃，30s(采集荧光)，40个循环。得到扩增图像后进行分析。
对比例2液体体系
与实施例1相比，取消冻干步骤，以液体型试剂形式呈现恒温扩增试剂，余下使用模板补齐至50μL，其他条件不变。
步骤1：选择通用生物(安徽)股份有限公司合成的甲型流感病毒和人合胞病毒的假病毒做为模板，利用磁珠试剂盒(来自圣湘生物科技股份有限公司，货号S10015)将上述假病毒分别进行核酸提取，得到的核酸分别使用去离子水稀释成对应的梯度(1500cp/mL、900cp/mL、300cp/mL、150cp/mL)作为反应模板。
步骤2：参考表4配置酶体系后，使用12.5μL复融剂(20％聚乙二醇、2％海藻糖、3mM二硫苏糖醇)及1μL引物探针(400nM引物及150nM探针)充分混合酶体系，在八连管管盖内加入2.5μL激活剂(20mM乙酸镁，4mM氯化钠)，余下使用模板补齐至50μL。
步骤3：充分混合离心后置于宏石全自动医用PCR分析系统SLAN-96P上，程序设置为39℃，30s(采集荧光)，40个循环。得到扩增图像后进行分析。
实施例1与对比例1和对比例2的灵敏度结果如下：
从1500拷贝/毫升的扩增图像(图5及图6)可以看到，实施例1的测试效果较好，荧光强度较强，起线时间更早，而对比例1的起线时间相对较晚，荧光值较低，而对比例2的检测效果较差，无法检出1500拷贝/毫升以下的模板。具体灵敏度检出情况参考表5所示。
表5甲型流感病毒及人合胞病毒恒温扩增全冻干体系灵敏度检测结果
实施例1可以稳定检出至300拷贝/毫升的甲型流感病毒假病毒样本和人合胞病毒假病毒样本。而对比例1对300拷贝/毫升的甲型流感病毒假病毒样本和人合胞病毒假病毒样本的检出率分别为85％和95％。对比例2对300拷贝/毫升的甲型流感病毒假病毒样本和人合胞病毒假病毒样本的检出率分别为55％和40％。由以上结果可以说明，全冻干体系的灵敏度优于半冻干体系，且明显优于液体体系。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种全冻干恒温扩增体系，其特征在于：包括两部分：
第一部分为酶体系；第二部分为引物探针和激活体系；所述酶体系的冻干形式为冻干粉；所述引物探针和激活体系的冻干形式为冻干球。
2.根据权利要求1所述的全冻干恒温扩增体系，其特征在于：所述的酶体系包括蛋白酶混合液、dNTPs、Tris缓冲buffer、激酶体系、甘露糖基甘油酸；所述的激活体系包括聚乙二醇、海藻糖、二硫苏糖醇、乙酸镁或乙酸钾、氯化钠。
3.根据权利要求2所述的全冻干恒温扩增体系，其特征在于：所述的蛋白酶混合液包括重组酶、重组调节蛋白、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶和RT酶；所述的激酶体系包括ATP、磷酸肌酸激酶和磷酸肌酸。
4.根据权利要求1所述的全冻干恒温扩增体系，其特征在于：所述引物浓度为100-800nM；所述的探针浓度为50-200nM。
5.根据权利要求2所述的全冻干恒温扩增体系，其特征在于：所述的酶体系包括蛋白酶混合液、10-60mM dNTPs、10-80mM Tris缓冲buffer、激酶体系、1-5mM甘露糖基甘油酸。
6.根据权利要求2所述的全冻干恒温扩增体系，其特征在于：所述的激活体系包括1％-20％聚乙二醇、2％-10％海藻糖、1-15mM二硫苏糖醇、2-28mM乙酸镁、1-12mM氯化钠。
7.根据权利要求3所述的全冻干恒温扩增体系，其特征在于：所述的蛋白酶混合液包括100-800ng/μL重组酶、200-800ng/μL重组调节蛋白、300-1000ng/μL单链DNA结合蛋白、20-100ng/μL链置换DNA聚合酶和160-200U RT酶；所述的激酶体系包括1-10mM ATP、40-200ng/μL磷酸肌酸激酶和20-80mM磷酸肌酸。
8.一种全冻干恒温扩增试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-7任一项所述的全冻干恒温扩增体系。
9.一种全冻干恒温扩增体系的制备方法，其特征在于：权利要求1-7任一项所述的酶体系通过冷冻冻干处理后得到酶体系冻干粉，所述的引物探针和激活体系混合后通过冷冻冻干处理后得到冻干球。
10.权利要求1-7任一项所述的全冻干恒温扩增体系在重组酶聚合酶扩增中的应用。
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