CN114703304A

CN114703304A - 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的lamp双链检测探针、冻干微球及其制备方法和检测方法

Info

Publication number: CN114703304A
Application number: CN202210344648.5A
Authority: CN
Inventors: 许世伟; 许远; 邵俊影; 吴镇宇; 王欣; 林圣博
Original assignee: Henan Zhongjian Shian Biotechnology Co ltd; Henan Guanyu Instrument Co ltd
Current assignee: Henan Zhongjian Shian Biotechnology Co ltd; Henan Guanyu Instrument Co ltd
Priority date: 2022-03-31
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2022-07-05

Abstract

本发明提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针、冻干微球及其制备方法和检测方法，属于基因检测领域。该双链检测探针包括发光探针和淬灭探针；发光探针位于FIP上，在FIP序列的5’端标记有荧光发光基团，淬灭探针与F1C的序列互补，淬灭探针的3’端标记有荧光淬灭基团。LAMP检测冻干微球包括这种双链检测探针，该冻干微球及检测方法，以唐菖蒲伯克霍尔德氏菌16‑23sRNA为检测靶标，采用双链探针‑恒温变色体系，可兼具荧光定量PCR图谱分析及肉眼观察法来判读结果，探针特异性强，变色颜色对比明显，不易产生误判，双重体系互相映照，检测的准确性高。

Description

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针、冻干微球及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的 LAMP双链检测探针、冻干微球及其制备方法和检测方法。

背景技术

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌为革兰氏阴性短杆菌、两端钝圆，无牙孢，有鞭毛，在自然界分布广泛。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌为兼性厌氧，易在食品表面生长。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌可以产生米酵菌酸引起食物中毒，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌不耐高温，很容易被高温杀死，但是它所产生的“米酵菌酸”毒素耐热，一般烹调方法不能破坏其毒性。

目前常用的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌检测方法包括显色培养基培养法、荧光定量PCR、LAMP恒温PCR法等，均可以有效地检测。但显色培养法存在耗时长、人为因素大等缺点，检测一个样本往往需要一周，还存在结果不一致性等缺陷。荧光定量PCR通量大，检测时间短，只需要2-4小时，但需要精密昂贵的仪器及专业检测人员，成本高，不利于推广。LAMP环介导恒温扩增法借助 6条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，可在等温条件下快速，高特异性和灵敏的扩增靶序列，该方法目前因其设备简单、检测时间短已广泛应用到病原菌检测领域。

环介导恒温扩增法结果判读方法主要有1：浊度法，可通过反应后肉眼观察是否存在白色絮状沉淀，判定检测结果，主观因素较强，灵敏度低。2、显色法，反应结束后加入核酸染料SYBR GREEN、HNB、钙黄绿素等，在紫外灯或肉眼条件下显示不同的颜色，结果判定简单，但需要反应结束后开盖，极易造成气溶胶污染。3、荧光检测法，该方法通过向反应体系中加入荧光染料SYBR GREEN，通过荧光PCR仪可实时观察体系中荧光变化，生成荧光曲线，通过曲线观察扩增结果，该方法闭管检测，杜绝气溶胶污染，但因SYBR GREEN染料特性，能和任意的双链DNA结合，并发生荧光，特异性低易出现假阳性。

发明内容

本发明针对现有环介导恒温扩增法结果判读上的缺陷，提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针、冻干微球及其制备方法和检测方法，其针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌16-23sRNA保守序列设计引物组和双链检测探针，能够快速、高效的检测出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌存在与否，灵敏度高，特异性强，且不易出现假阳性。

本发明通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针，其特征在于，双链检测探针包括发光探针和淬灭探针；

发光探针位于内引物FIP上，在所述内引物FIP序列的5’端标记有荧光发光基团，所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

淬灭探针与内引物FIP的5’端前20个序列互补，所述淬灭探针的3’端标记有荧光淬灭基团，淬灭探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述荧光发光基团包括FAM、VIC、 TET；

荧光淬灭基团包括TAMRA、QSY、BHQ。

第二方面，本发明提供一种用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球，冻干微球中含有如权利要求1或2的LAMP双链检测探针。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述冻干微球还包括检测引物组，检测引物组针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌16S～23S rRNA间区序列保守序列基因编码序设计，检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物 BIP；

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述双链检测探针中发光探针和淬灭探针的浓度比为1:1.2～1.8；

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述外引物F3和外引物B3的浓度均为0.15～0.25μM，内引物FIP和内引物BIP的浓度均为1.5～1.7μM。

第三方面，本发明提供一种用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球的制备方法，其包括：

将如权利要求1或2的LAMP双链检测探针、检测引物组与LAMP反应基液混合，得到扩增反应体系；

将扩增反应体系与冻干保护剂混合，逐滴滴入液氮中，控制每个液滴的体积为20～25μL，速冻成球后，冷冻干燥；

其中，检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP；

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述LAMP反应基液包括：DNA聚合酶、dNTPs、MgSO₄、显色剂、甜菜碱、pH调节剂、ddH₂O和buffer。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述扩增反应体系与冻干保护剂的体积比为14～16:11；

冻干保护剂包括海藻糖、PEG20000和甘氨酸中的至少一种。

第四方面，本发明提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测方法，其包括：

将上述冻干微球加水复溶后，形成LAMP反应体系；

将来自待测样品中的模板DNA与LAMP反应体系混合，于60～65℃下反应50～70min，进行LAMP扩增。

与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：

本发明提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针，相比于 Taqman探针及分子信标探针法，探针序列固定，无需特别设计，极大的降低了探针设计难度，降低探针合成成本，更适用于LAMP探针应用；同时，在LAMP 检测中使用这种LAMP双链检测探针，相比于SYBR Green染料法，能够简单、快速、高效的检测出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌存在与否，进而判断出检测样本中是否含有米酵菌酸毒素，特异性强，不易出现假阳性。

该试剂盒采用双链探针-恒温变色体系，可兼具荧光定量PCR图谱分析及肉眼观察法来判读结果，可适用不同的仪器，检测过程中不需要开盖，避免气溶胶污染，利于在基层使用。通过采用双链探针-恒温变色双重检测体系，探针特异性强，变色颜色对比明显，不易产生误判，双重体系互相映照，检测的准确性高。

市面上常用的试剂均为液体试剂，运输过程中需要冷链运输，运输成本高，并且试剂通常是分为不同的组分，工作人员需要根据自己的用量自己去配制的。本发明提供的这种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测试剂盒及及检测方法，采用冻干预混液形式，得到冻干微球，在检测过程中仅需将冻干微球复溶后与模板DNA混合、扩增，即可完成检测，方法简便，特异性强，能够有效避免传统检测过程中加样的繁琐过程以及加样过程中导致试剂污染、假阳性等结果。

附图说明

图1为本发明实施例1中引物及双链探针的设计原则及位置示意图；

图2为本发明实施例4中LAMP扩增结果目视图；

图3为本发明实施例4中LAMP扩增结果荧光检测图；

图4为本发明实施例5中双链探针-恒温变色扩增体系灵敏度检测图；

图5为本发明实施例6中双链探针-恒温变色扩增体系特异性检测。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1 LAMP双链检测探针以及引物设计

通过查阅文献、对比筛选出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌保守序列，应用专门的 LAMP引物设计软件对靶标序列进行引物和探针设计，在Primer-blast上对设计好的引物和探针进行分析和优化，引物及探针设计原则及位置如图1所示，最终确定的探针和引物序列如下：

探针由两部分组成，一个是发光探针，一个是淬灭探针，发光探针5’端标记荧光发光基团，如FAM、VIC、TET等，淬灭探针的3’端标记有淬灭光基团如TAMRA、QSY、BHQ等，发光探针位于FIP上，在FIP 5’端标记荧光基团，淬灭探针与F1C序列互补，在3’端标记淬灭光基团(SEQ ID NO.1)。 TGATAAGGCGGGGGTCGTTG。

外引物F3：GTTCACGCTTATCGGCTGT(SEQ ID NO.2)。

外引物B3：AAGCAGGTGCTCTCCCAG(SEQ ID NO.3)。

内引物FIP：CAACGACCCCCGCCTTATCAGACTCAGGGGTCTGTAGCT (SEQ ID NO.4)。

内引物BIP：TCCAACCAGACCCACCAATTGTGCTATGCCCCCATACAGA GA(SEQ ID NO.5)。

实施例2

本实施例提供一种用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的冻干微球，其制备方法包括：

(1)制备冻干保护剂：取70％海藻糖、8％的甘氨酸、25％的PEG20000 按照体积比2:3:6混合，得到冻干保护剂。

(2)构建扩增反应体系：

本实施例中构建的LAMP检测扩增体系总体积为15μL，将如表1所示检测引物组与如表1所示的LAMP反应基液混合，得到扩增反应体系。

表1.扩增反应体系

组分名称	浓度(μM)	加入量(μL)
			外引物F3/B3	100μM	0.05-0.1
内引物FIP/BIP	100μM	0.4-0.5
			双链检测探针	100μM	0.1-0.2
Bst DNA聚合酶	8U	1-1.5
			dNTP	10mM each	3.0-4.0
甜菜碱	5M	3-5
			显色剂	200mM	1
pH调节剂	50mm pH9.0	1.1-1.3
			Buffer	-	2.5
加水补齐至	-	15

其中，buffer为100mmKCl、100mm(NH₄)₂SO₄、100mmMgSO₄、1％ triton-100；pH调节剂为Tris-HCl。

(3)将步骤(2)得到的扩增反应体系与步骤(1)制得的冻干保护剂按照体积比15:11混合，逐滴滴入液氮中，控制每个液滴的体积为26μL，速冻成球后，将在液氮中形成的微球转移到冻干机中，于-50～60℃下进行第一次干燥10h 后，在20～30℃下进行二次升华干燥6h，即得用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的冻干微球。

实施例3建立LAMP检测反应体系

本实施例中构建的LAMP检测反应体系总体积为25μL，具体包括：

将实施例2制备的冻干微球加入26μL的水进行复溶，将从待测样品中提取的模板DNA(2μL)加入到复溶后的反应体系中，在60～65℃下反应50～70min，进行LAMP扩增；本实施例是在63℃下反应60min进行扩增的。

结果判定：

(1)目视法，直接观察颜色变化，从而判定LAMP扩增的情况及样品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的存在与否。

(2)荧光曲线法，利用荧光定量PCR仪收集发光基团荧光，给出扩增曲线，判断LAMP扩增的情况及样品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的存在与否。

实施例4样本检测

本发明提供的试剂盒检测的真实样品，适用范围包括食品样品、粪便、呕吐物、环境拭子、水样等标本或需要对细菌存在进行检测的生物样本。本实施例的检测样品为鲜银耳样品。

(1)样本处理：用无菌操作取样品25g，加入盛有225mL增菌液的500mL 三角瓶中(鲜银耳样品取1g，用剪刀剪碎，加入盛有20mL增菌液的100mL三角瓶中)放36±1℃培养48h。增菌后，取1ml增菌液，低速离心收集沉淀，加入200ul chelex100裂解液，震荡混匀，100℃煮沸5min，取上清作为待测模板 DNA。

(2)LAMP扩增：将冻干微球加入26μL的水进行复溶，将2μL的模板 DNA加入到复溶后的反应体系中，在63℃下反应60min，进行LAMP扩增。

其中，该冻干微球通过将冻干保护剂和如表2所示的扩增反应体系混合，逐滴滴入液氮中速冻成球后，将在液氮中形成的微球于-50℃下进行第一次干燥 10h后，在25℃下进行二次升华干燥6h，制备得到。

表2.LAMP检测反应体系

其中，冻干保护剂为海藻糖、甘氨酸和PEG2000按照体积比2：3：6混合所得。

buffer为100mmKCl、100mm(NH₄)₂SO₄、100mmMgSO₄、1％triton-100；显色剂为酚红。pH调节剂为Tris-HCl。

(3)结果判定：

A.目视法判定：结果如图2所示，反应结束后直接观察反应体系颜色变化，当反应体系由红色变为亮黄色(如管1和管2所示)，说明成功发生了特异性扩增，待测样本中含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌；当反应体系保持红色(如管3和管4所示)，说明未发生扩增，待测样本中不含唐菖蒲伯克霍尔德氏菌。

B.荧光曲线判定：结果如图3所示，检测到典型的扩增曲线，说明待测样本中含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，由此证实了双链探针检测的可行性。

实施例5灵敏度评价

将唐菖蒲伯克霍尔德氏菌增菌液进行十倍梯度稀释后，浓度依次为： 10⁶cfu/mL、10⁵cfu/mL、10⁴cfu/mL、10³cfu/mL、10²cfu/mL按照实施例4的样本处理和反应体系对各稀释度唐菖蒲伯克霍尔德氏菌样本进行LAMP检测，以确定检测方法的灵敏度。

结果如图4所示，由图可以看出，将唐菖蒲伯克霍尔德氏菌增菌液进行10 倍梯度稀释后，建立的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌双链探针-恒温变色检测体系灵敏度可达到10²cfu/mL。

实施例6 特异性评价

将唐菖蒲伯克霍尔德氏菌和常见的食源性微生物(大肠杆菌O157：H7、志贺氏菌、单增李斯特氏菌、副溶血弧菌、溶血链球菌、沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、铜绿假单胞杆菌等)的基因组DNA，按照实施例4的反应体系和条件进行特异性实验。

结果如图5所示，由图可以看出，只有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌对应的反应体系颜色发生变化，出现典型的荧光扩增曲线，呈现阳性反应。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南中检食安生物科技有限公司(null)

河南冠宇仪器有限公司

<120> 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针、冻干微球及其制备方法和检测方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgataaggcg ggggtcgttg 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttcacgctt atcggctgt 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagcaggtgc tctcccag 18

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caacgacccc cgccttatca gactcagggg tctgtagct 39

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccaaccaga cccaccaatt gtgctatgcc cccatacaga ga 42

Claims

1.一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针，其特征在于，所述双链检测探针包括发光探针和淬灭探针；

淬灭探针与所述内引物FIP的5’端前20个序列互补，所述淬灭探针的3’端标记有荧光淬灭基团，淬灭探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针，其特征在于，所述荧光发光基团包括FAM、VIC、TET；

所述荧光淬灭基团包括TAMRA、QSY、BHQ。

3.一种用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球，其特征在于，所述冻干微球中含有如权利要求1或2所述的LAMP双链检测探针。

4.根据权利要求3所述的用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球，其特征在于，所述冻干微球还包括检测引物组，所述检测引物组针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌16S～23S rRNA基因区间保守序列设计，所述检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP；

所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根据权利要求4所述的用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球，其特征在于，所述双链检测探针中所述发光探针和淬灭探针的浓度比为1:1.2～1.8。

6.根据权利要求4所述的用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球，其特征在于，所述外引物F3和外引物B3的浓度均为0.15～0.25μM，所述内引物FIP和所述内引物BIP的浓度均为1.5～1.7μM。

7.一种用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球的制备方法，其特征在于，其包括：

将如权利要求1或2所述的LAMP双链检测探针、检测引物组与LAMP反应基液混合，得到扩增反应体系；

将所述扩增反应体系与冻干保护剂混合，逐滴滴入液氮中，控制每个液滴的体积为23～26μL，速冻成球后，冷冻干燥；

其中，所述检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP；

所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

8.根据权利要求7所述的用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球的制备方法，其特征在于，所述LAMP反应基液包括：BST聚合酶、dNTPs、MgSO₄、显色剂、甜菜碱、pH调节剂、ddH₂O和buffer。

9.根据权利要求7所述的用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球的制备方法，其特征在于，所述扩增反应体系与所述冻干保护剂的体积比为14～16:8；

所述冻干保护剂包括海藻糖、PEG20000和甘氨酸中的至少一种。

10.一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测方法，其特征在于，其包括：

将如权利要求3～6任一项所述的冻干微球加水复溶后，形成LAMP反应体系；

将来自待测样品中的模板DNA与所述LAMP反应体系混合，于60～65℃下反应50～70min，进行LAMP扩增。