CN114540516B

CN114540516B - 金黄色葡萄球菌的lamp双链检测探针、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN114540516B
Application number: CN202210220526.5A
Authority: CN
Inventors: 许世伟; 王群智; 许远; 邵俊影; 吴镇宇; 王欣; 林圣博
Original assignee: Henan Zhongjian Shian Biotechnology Co ltd
Current assignee: Henan Zhongjian Shian Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-03-08
Filing date: 2022-03-08
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2042-03-08
Also published as: CN114540516A

Abstract

本发明提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP双链检测探针、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。该双链检测探针包括发光探针和淬灭探针；发光探针包括依次连接的保守序列和环引物LF，保守序列的5’端标记有荧光发光基团；淬灭探针与发光探针的保守序列互补，淬灭探针的3’端标记有荧光淬灭基团。LAMP检测试剂盒包括这种双链检测探针，该试剂盒及检测方法，以金黄色葡萄球菌isdD基因为检测靶标，采用双链探针‑恒温变色体系，可兼具荧光定量PCR图谱分析及肉眼观察法来判读结果，探针特异性强，变色颜色对比明显，不易产生误判，双重体系互相映照，检测的准确性高。

Description

金黄色葡萄球菌的LAMP双链检测探针、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌的LAMP双链检测探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，是一种无芽孢、鞭毛、乳酸发酵、兼性厌氧的球状细菌，为一种常见的食源性致病微生物，常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、疮口中，环境中也无处不在，往往对人体造成侵害。

目前常用的金黄色葡萄球菌检测方法包括显色培养基培养法、荧光定量PCR、LAMP恒温PCR法等，均可以有效地检测。但显色培养法存在耗时长、人为因素大等缺点，检测一个样本往往需要一周，还存在结果不一致性等缺陷。荧光定量PCR通量大，检测时间短，只需要2-4小时，但需要精密昂贵的仪器及专业检测人员，成本高，不利于推广。LAMP环介导恒温扩增法借助6条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，可在等温条件下快速，高特异性和灵敏的扩增靶序列，该方法目前因其设备简单、检测时间短已广泛应用到病原菌检测领域。

环介导恒温扩增法结果判读方法主要有1：浊度法，可通过反应后肉眼观察是否存在白色絮状沉淀，判定检测结果，主观因素较强，灵敏度低。2、显色法，反应结束后加入核酸染料SYBR GREEN、HNB、钙黄绿素等，在紫外灯或肉眼条件下显示不同的颜色，结果判定简单，但需要反应结束后开盖，极易造成气溶胶污染。3、荧光检测法，该方法通过向反应体系中加入荧光染料SYBR GREEN，通过荧光PCR仪可实时观察体系中荧光变化，生成荧光曲线，通过曲线观察扩增结果，该方法闭管检测，杜绝气溶胶污染，但因SYBR GREEN染料特性，能和任意的双链DNA结合，并发生荧光，特异性低易出现假阳性。

发明内容

本发明针对现有环介导恒温扩增法结果判读上的缺陷，提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP双链检测探针、试剂盒及检测方法，其针对金黄色葡萄球菌的isdD基因设计引物组和双链检测探针，能够快速、高效的检测出金黄色葡萄球菌存在与否，灵敏度高，特异性强，且不易出现假阳性。

本发明通过以下技术方案实现：

一方面，本发明提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP双链检测探针，双链检测探针包括发光探针和淬灭探针；

发光探针包括依次连接的保守序列和环引物LF，保守序列的5’端标记有荧光发光基团，发光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

淬灭探针与发光探针的保守序列互补，淬灭探针的3’端标记有荧光淬灭基团，淬灭探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述荧光发光基团包括FAM、VIC、TET；优选为，FAM。

荧光淬灭基团包括TAMRA、QSY、BHQ，优选为TAMRA。

具体地：

发光探针：FAM-ACGCAGAGGACCCGCATGCCAATGCGGATGCGCATGCCGACAACAAGACAGTAATAAAAAG(SEQ ID NO.1)；

淬灭探针：TCGGCATGCGCATCCGCATTGGCATGCGGGTCCTCTGCG T-TAMRA(SEQ IDNO.2)。

第二方面，本发明提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其包括上述LAMP双链检测探针。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述试剂盒还包括检测引物组，检测引物组针对金黄色葡萄球菌的isdD基因编码序列设计，检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP；

外引物F3的核苷酸序列为GCCTTTTTACTGAAAAAGGATT，如SEQ ID NO.3所示；

外引物B3的核苷酸序列为GTAACGCTTTTTCTTTTTCAACT，如SEQ ID NO.4所示；

内引物FIP的核苷酸序列为ATGCTTTAGGTCGCTCATTTTCAATTATTCCTGTACAAAAAGATAAAGTG，如SEQ ID NO.5所示；

内引物BIP的核苷酸序列为ATAGCCCTCCAACAGTAAAAAAGGTGATTTTTCATCTTTATGTTTCGGT，如SEQ ID NO.6所示。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述双链检测探针中发光探针和淬灭探针的浓度比为1:1.2～1.8。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述外引物F3和外引物B3的浓度均为0.15～0.25μM，内引物FIP和内引物BIP的浓度均为1.5～1.7μM。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述试剂盒还包括以下一种或多种组分：DNA聚合酶、dNTPs、显色剂、甜菜碱、pH调节剂、ddH₂O、阳性对照品、阴性对照品。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述显色剂为酚红、甲酚或中性红。

第三方面，本发明还提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其包括：利用外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP以及发光探针和淬灭探针在LAMP反应体系下，扩增目的基因；

发光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

淬灭探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，在上述LAMP反应体系配制之前，还包括将发光探针和淬灭探针混合，于92～97℃下加热4～6min后，置于冰上骤冷。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述LAMP反应温度为60～65℃下，反应时间为50～70min。

与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：

本发明提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP双链检测探针，相比于Taqman探针及分子信标探针法，探针序列固定，无需特别设计，极大的降低了探针设计难度，降低探针合成成本，更适用于LAMP探针应用；同时，在LAMP检测中使用这种LAMP双链检测探针，相比于SYBRGreen染料法，特异性强，无假阳性。

分子生物学方面常用来检测金黄色葡萄球菌的目的基因多为nuc耐热核酸酶基因、脱氢酶基因aroE等，但现实研究过程中发现其他菌种也具有nuc等基因，存在假阳性隐患，本申请通过比对筛选出金黄色葡萄球菌特异性靶点基因isdD基因，IsdD是金黄色葡萄球菌细胞膜表面的一种蛋白，是金黄色葡萄球菌ISD系统中的重要成员，在转运铁离子过程中发挥着重要作用，具有高度菌种特异性，适合作为检测靶标。

该试剂盒及检测方法，以金黄色葡萄球菌isdD基因为检测靶标，这种isdD基因相比于nuc基因兼具特异性及保守型，所设计引物具有良好的特异性，和其它种属细菌的同源性非常低，无交叉反应。同时，采用双链探针-恒温变色体系，可兼具荧光定量PCR图谱分析及肉眼观察法来判读结果，可适用不同的仪器，检测过程中不需要开盖，避免气溶胶污染，利于在基层使用。通过采用双链探针-恒温变色双重检测体系，探针特异性强，变色颜色对比明显，不易产生误判，双重体系互相映照，检测的准确性高。

说明书附图

图1为本发明实施例1中引物及双链探针的设计原则及位置示意图；

图2为本发明实施例3中LAMP扩增结果目视图；

图3为本发明实施例3中LAMP扩增结果荧光检测图；

图4为本发明实施例4中双链探针-恒温变色扩增体系灵敏度检测图；

图5为本发明实施例5中双链探针-恒温变色扩增体系特异性检测。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1LAMP双链检测探针以及引物设计

通过查阅文献、对比筛选出金黄色葡萄球菌特有的特异性靶点基因isdD基因，应用专门的LAMP引物设计软件以isdD基因为靶标序列进行引物和探针设计，在Primer-blast上对设计好的引物和探针进行分析和优化，引物及探针设计原则及位置如图1所示，最终确定的探针和引物序列如下：

发光探针由两部分组成，5’端为一段30-45bp的保守序列，在保守序列的5’端标记荧光发光基团，如FAM、VIC、TET等，3’端为环引物LF，核苷酸序列为：FAM-ACGCAGAGGACCCGCATGCCAATGCGGATGCGC ATGCCGA-CAACAAGACAGTAATAAAAAG(SEQ ID NO.1)；其中环引物LF的序列为CAACAAGACAGTAATAAAAAG(SEQ ID NO.7)。

淬灭探针的3’端标记有淬灭光基团如TAMRA、QSY、BHQ等，并和发光探针的5’端的保守序列互补：TCGGCATGCGCATCCGCATTGGCATGCGGGTCCTCTGCG T-TAMRA(SEQ ID NO.2)。

外引物F3：GCCTTTTTACTGAAAAAGGATT(SEQ ID NO.3)。

外引物B3：GTAACGCTTTTTCTTTTTCAACT(SEQ ID NO.4)。

内引物FIP：ATGCTTTAGGTCGCTCATTTTCAATTATTCCTGTACAAAAAGATAAAGTG(SEQ IDNO.5)。

内引物BIP：ATAGCCCTCCAACAGTAAAAAAGGTGATTTTTCATCTTTATGTTTCGGT(SEQ IDNO.6)。

实施例2建立金黄色葡萄球菌的LAMP检测反应体系

本实施例中构建的LAMP检测反应体系总体积为25μL，将待测样品的模板DNA加入到如表1所示的LAMP反应体系中，在60-65℃下，反应50-70min。

表1.LAMP反应体系

其中，buffer为100mmKCl、100mm(NH₄)₂SO₄、100mmMgSO₄、1％triton-100)；pH调节剂为Tris-HCl。

结果判定：

(1)目视法，直接观察颜色变化，从而判定LAMP扩增的情况及样品中金黄色葡萄球菌的存在与否。

(2)荧光曲线法，利用荧光定量PCR仪收集发光基团荧光，给出扩增曲线，判断LAMP扩增的情况及样品中金黄色葡萄球菌的存在与否。

实施例3样本检测

本发明提供的试剂盒检测的真实样品，适用范围包括食品样品、粪便、呕吐物、环境拭子、水样等标本或需要对细菌存在进行检测的生物样本。

(1)样本处理：增菌后，取1ml增菌液，低速离心收集沉淀，加入200ul chelex100裂解液，震荡混匀，100℃煮沸5min，取上清作为待测模板DNA。

(2)LAMP扩增：采用如表2所示的LAMP检测反应体系，反应温度为63℃，反应时间为60min。

表2.LAMP检测反应体系

(3)结果判定：

A.目视法判定：结果如图2所示，反应结束后直接观察反应体系颜色变化，当反应体系由红色变为亮黄色(如管1和管5所示)，说明成功发生了特异性扩增，待测样本中含有金黄色葡萄球菌；当反应体系保持红色(如管2～4和管6～8所示)，说明未发生扩增，待测样本中不含金黄色葡萄球菌。

B.荧光曲线判定：结果如图3所示，检测到典型的扩增曲线，说明待测样本中含有金黄色葡萄球菌，由此证实了双链探针检测的可行性。

实施例3灵敏度评价

将金黄色葡萄球菌增菌液进行十倍梯度稀释后，浓度依次为：10⁶cfu/mL、10⁵cfu/mL、10⁴cfu/mL、10³cfu/mL、10²cfu/mL按照实施例2的样本处理和反应体系对各稀释度金黄色葡萄球菌样本进行LAMP检测，以确定检测方法的灵敏度。

结果如图4所示，由图可以看出，将金黄色葡萄球菌增菌液进行10倍梯度稀释后，建立的金黄色葡萄球菌双链探针-恒温变色检测体系灵敏度可达到10²cfu/mL。

实施例4特异性评价

将金黄色葡萄球菌和常见的食源性微生物(大肠杆菌O157：H7、志贺氏菌、单增李斯特氏菌、副溶血弧菌、溶血链球菌、沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、铜绿假单胞杆菌等)的基因组DNA，按照实施例2的反应体系和条件进行特异性实验。

结果如图5所示，由图可以看出，只有金黄色葡萄球菌对应的反应体系颜色发生变化，出现典型的荧光扩增曲线，呈现阳性反应。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南中检食安生物科技有限公司(null)

<120> 金黄色葡萄球菌的LAMP双链检测探针、试剂盒及检测方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgcagagga cccgcatgcc aatgcggatg cgcatgccga caacaagaca gtaataaaaa 60

g 61

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcggcatgcg catccgcatt ggcatgcggg tcctctgcgt tamra 45

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcctttttac tgaaaaagga tt 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtaacgcttt ttctttttca act 23

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgctttagg tcgctcattt tcaattattc ctgtacaaaa agataaagtg 50

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atagccctcc aacagtaaaa aaggtgattt ttcatcttta tgtttcggt 49

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caacaagaca gtaataaaaa g 21

Claims

1.一种金黄色葡萄球菌的LAMP双链检测探针，其特征在于，所述双链检测探针包括发光探针、淬灭探针、外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP；

所述发光探针包括依次连接的保守序列和环引物LF，所述保守序列的5’端标记有荧光发光基团，所述发光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述淬灭探针与所述发光探针的保守序列互补，所述淬灭探针的3’端标记有荧光淬灭基团，所述淬灭探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的LAMP双链检测探针，其特征在于，所述荧光发光基团包括FAM、VIC、TET；

所述荧光淬灭基团包括TAMRA、QSY、BHQ。

3.一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的LAMP双链检测探针。

4.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测引物组，所述检测引物组针对金黄色葡萄球菌的isdD基因编码序列设计，所述检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP；

所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述双链检测探针中所述发光探针和淬灭探针的浓度比为1:1.2～1.8。

6.根据权利要求4所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述外引物F3和外引物B3的浓度均为0.15～0.25μM，所述内引物FIP和所述内引物BIP的浓度均为1.5～1.7μM。

7.根据权利要求3～6任一项所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下一种或多种组分：DNA聚合酶、dNTPs、显色剂、甜菜碱、pH调节剂、ddH₂O、阳性对照品、阴性对照品。

8.一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其特征在于，其包括：利用外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP以及发光探针和淬灭探针在LAMP反应体系下，扩增目的基因；

所述发光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述淬灭探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

其中，所述LAMP检测方法是以非疾病诊断的目的检测。

9.根据权利要求8所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其特征在于，在所述LAMP反应体系配制之前，还包括将所述发光探针和淬灭探针混合，于92～97℃下加热4～6min后，置于冰上骤冷。

10.根据权利要求8所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP反应的反应温度为60～65℃下，反应时间为50～70min。