CN112646932A - 一步法可视化检测新型冠状病毒核酸的引物组和试剂盒 - Google Patents

一步法可视化检测新型冠状病毒核酸的引物组和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一步法可视化检测新型冠状病毒的引物组和试剂盒，属于新型冠状病毒检测技术领域，所述引物组包括F3、B3、FIP‑1、BIP‑1、FL‑1和BL‑1；所述F3、B3、FIP‑1、BIP‑1、FL‑1和BL‑1的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示；所述试剂盒，包括所述的引物组和检测试剂，所述检测试剂包括酶检测混合液、盐酸胍和pH指示剂；所述酶检测混合液中包括Taq SSB。本发明所述引物组及试剂盒在检测的过程中，不需要核酸提取，采用浸泡于灭活型病毒保存液中的鼻/咽拭子样品即可检测；病毒RNA扩增后反应溶液颜色发生改变，通过肉眼观察即可判别结果。

Description

一步法可视化检测新型冠状病毒核酸的引物组和试剂盒
技术领域
本发明属于新型冠状病毒检测技术领域，尤其涉及一步法可视化检测新型冠状病毒的引物组和试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒的检测方法主要包含核酸检测、抗体检测、抗原检测几种方法。抗原检测检出率较低；抗体检测操作便捷、检测迅速，可作为核酸诊断的补充手段，但由于抗体检测“假阳性”和“假阴性”的局限性，不适合用于复工复产复学等普通人群筛查，也不适用于在低流行地区的流行病学调查。核酸检测目前是新型冠状病毒检测的“金标准”，具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点，能够检测到处于窗口期的患者并及早发现感染者。
新型冠状病毒(2019-nCoV)在分类学上属于冠状病毒属中的β类型冠状病毒，具有囊膜和刺突细胞学特征，基因组为线性单股正链的 RNA((+)ssRNA)病毒。病毒中特异性RNA序列是区分该病毒与其它病原体的标志物，新型冠状病毒常用的核酸诊断方法有两种：病毒核酸特异基因检测和病毒基因组测序。最常见的检测新型冠状病毒特异性核酸序列的方法是荧光定量PCR(聚合酶链式反应)，由于新型冠状病毒是RNA病毒，试剂盒检测基本都采用反转录加实时聚合酶链式反应法(RT-PCR)，扩增病原体的核酸(RNA)，同时通过荧光探针实时检测扩增产物，但该技术对检测设备或平台要求较高，高灵敏度的RT-PCR仪价格昂贵，对实验室的洁净度和操作人员要求也较高。此外，核酸检测耗时较长，考虑到样本运输、样本积压的情况，通常最快24小时才可以报告结果。
2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，即环介导等温扩增技术，英文名称为“Loop-mediatedisothermal amplification”，受到了世卫组织 WHO、各国学者和相关政府部门的关注，该技术的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，环介导等温扩增反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。
环介导等温扩增虽然存在诸多检测优势，但与逆转录技术联用检测RNA病毒时(如新型冠状病毒)，仍然存在检测时间长、污染风险增大、操作流程复杂性等技术缺陷，导致在实际应用中还存在一定的局限性。
针对机场、海关等特定场所现场检验的需求，发展具有快速、不需要大型仪器、操作简单的可视化快速新型冠状病毒核酸检测技术将带来极大的经济效益及社会效益。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一步法可视化检测新型冠状病毒的引物组和试剂盒；本发明所述引物组以新型冠状病毒2019-nCoV 的N基因为模板设计获得，具有特异性高的优点；本发明所述引物组及方法在检测的过程中，可以省略核酸提取步骤，鼻/咽拭子浸泡于灭活型病毒保存液并直接用于检测，病毒RNA扩增后反应溶液颜色发生改变，通过肉眼观察即可判别样本中是否含有目标病毒分子，从而实现对新型冠状病毒2019-nCoV核酸的快速可视化检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一步法可视化检测新型冠状病毒的引物组，包括 F3、B3、FIP-1、BIP-1、FL-1和BL-1；所述F3、B3、FIP-1、BIP-1、 FL-1和BL-1的核苷酸序列分别如SEQ IDNo.1～SEQ ID No.6所示。
本发明提供了一步法可视化检测新型冠状病毒的试剂盒，包括所述的引物组和检测试剂，所述检测试剂包括酶检测混合液、盐酸胍和 pH指示剂；所述酶检测混合液中包括Taq SSB。
优选的，所述Taq SSB的使用浓度为2～4ng/μL。
优选的，所述酶检测混合液还包括30～50mmol/L的Tris-HCl、 15～25mmol/L的(NH4)2SO4、90～110mmol/L的KCl、14～25mmol/L的 MgSO4、体积百分含量为0.1％～0.3％的Tween 20，2.5～3.0mmol/L的 dNTP、1.3～1.5mmol/L的dUTP、16～30U DNA聚合酶、15～30U的反转录酶和10～30U重组尿嘧啶-DNA糖基化酶。
优选的，所述盐酸胍的使用浓度为30～60mmol/L。
优选的，所述试剂盒还包括灭活型病毒保存液。
优选的，所述F3、B3、FIP-1、BIP-1、FL-1和BL-1的使用浓度分别为1.5～2.5μmol/L、1.5～2.5μmol/L、15～17μmol/L、15～17μmol/L、 0.3～0.5μmol/L和0.3～0.5μmol/L。
本发明提供了一步法可视化检测新型冠状病毒的引物组，包括 F3、B3、FIP-2、BIP-2、FL-2和BL-2；所述F3、B3、FIP-2、BIP-2、 FL-2和BL-2的核苷酸序列分别如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.7～SEQ ID No.10所示。
本发明还提供了另一种一步法可视化检测新型冠状病毒的试剂盒，包括所述的引物组和检测试剂，所述检测试剂包括酶检测混合液、盐酸胍和氯化血红素；所述酶检测混合液中包括Taq SSB。
优选的，所述F3、B3、FIP-2、BIP-2、FL-2和BL-2的使用浓度分别为1.5～2.5μmol/L、1.5～2.5μmol/L、15～17μmol/L、15～17μmol/L、 0.3～0.5μmol/L和0.3～0.5μmol/L。
本发明的有益效果：本发明提供的一步法可视化检测新型冠状病毒的引物组和试剂盒；所述引物组以新型冠状病毒2019-nCoV的N 基因为模板设计获得，具有特异性高的优点；所述引物组及试剂盒在检测的过程中，不需要核酸提取过程，直接采用浸泡于灭活型病毒保存液中的鼻/咽拭子样品即可检测；病毒RNA扩增后反应溶液颜色发生改变，通过肉眼观察即可判别样本中是否含有目标病毒分子。本发明提供的引物组和试剂盒对设备要求低，不需要大型仪器设备；在野外、社区、家庭、工作场所等均可操作，所述引物组和试剂盒的操作方法简单，无需复杂的培训或专业技术人员；另外所述引物组和试剂盒在检测过程中全程封闭状态，避免了气溶胶的污染，检测用时短，仅30～60min既能完成。
附图说明
图1为酚红-LAMP可视化快速新型冠状病毒核酸检测流程示意图；
图2为试剂盒中不同盐酸胍浓度对检测结果的影响；
图3为酚红-LAMP可视化快速新型冠状病毒核酸检测灵敏度分析；
图4为G四链体-LAMP可视化快速新型冠状病毒核酸检测颜色变化图；
图5为试剂盒中不同Taq SSB蛋白浓度对检测结果的影响；
图6为试剂盒中不同镁离子浓度对检测结果的影响；
图7为试剂盒中不同Bst DNA聚合酶加入量对检测结果的影响；
图8为G四链体-LAMP可视化快速新型冠状病毒核酸检测灵敏度分析(含Taq SSB蛋白)；
图9为G四链体-LAMP可视化快速新型冠状病毒核酸检测灵敏度分析(不含Taq SSB蛋白)。
具体实施方式
本发明提供了一步法可视化检测新型冠状病毒的引物组，包括 F3、B3、FIP-1、BIP-1、FL-1和BL-1；所述F3、B3、FIP-1、BIP-1、 FL-1和BL-1的核苷酸序列分别如SEQ IDNo.1～SEQ ID No.6所示；具体如下：
F3:ATTGAACCAGCTTGAGAGCA(SEQ ID No.1)；
B3:AATTTGCGGCCAATGTTTGT(SEQ ID No.2)；
FIP-1:TTGCCGAGGCTTCTTAGAAGCCAGGCCAACAACAAC AAGGC(SEQ ID No.3)；
BIP-1:AACACAAGCTTTCGGCAGACGTTGATTAGTTCCTGGT CCCCA(SEQ ID No.4)；
FL-1：AGCAGCAGATTTCTTAGTGACAGTT(SEQ ID No.5)；
BL-1：GGTCCAGAACAAACCCAAGG(SEQ ID No.6)。
本发明对所述引物的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的引物合成方法即可。
本发明还提供了一步法可视化检测新型冠状病毒的试剂盒，包括所述的引物组和检测试剂，所述检测试剂包括酶检测混合液、盐酸胍和pH指示剂；所述酶检测混合液中包括Taq SSB。
在本发明中，所述F3、B3、FIP-1、BIP-1、FL-1和BL-1的使用浓度分别优选为1.5～2.5μmol/L、1.5～2.5μmol/L、15～17μmol/L、 15～17μmol/L、0.3～0.5μmol/L和0.3～0.5μmol/L，更优选为 1.8～2.2μmol/L、1.8～2.2μmol/L、15.5～16.5μmol/L、15.5～16.5μmol/L、 0.35～0.45μmol/L和0.35～40.5μmol/L，最优选为2μmol/L、2μmol/L、 16μmol/L、16μmol/L、0.4μmol/L和0.4μmol/L。本发明对所述试剂盒中上述引物的原始浓度没有特殊限定，在使用时，采用无核酶的超纯水溶解稀释至上述浓度即可。
在本发明中，所述检测试剂包括酶检测混合液，所述酶检测混合液优选的包括TaqSSB，所述Taq SSB的使用浓度优选为2～4ng/μL，更优选为3ng/μL；本发明对所述试剂盒中Taq SSB的原始浓度没有特殊限定，在使用时，采用上述浓度即可。在本发明中，所述TaqSSB 是一种具有热稳定性、能够与单链DNA结合的蛋白质。所述Taq SSB 可以有效减少引物二聚体的生成，能够有效解决常规RT-LAMP扩增体系中引物二聚体导致的“假阳性”问题。
在本发明中，所述检测试剂优选的还包括30～50mmol/L的 Tris-HCl、15～25mmol/L的(NH4)2SO4、90～110mmol/L的KCl、 14～25mmol/L的MgSO4、体积百分含量为0.1％～0.3％的Tween 20、 2.5～3.0mmol/L的dNTP、1.3～1.5mmol/L的dUTP、16～30U DNA聚合酶、15～30U的反转录酶和10～30U重组尿嘧啶-DNA糖基化酶；更优选的还包括35～45mmol/L的Tris-HCl、18～22mmol/L的(NH4)2SO4、 95～105mmol/L的KCl、15～20mmol/L的MgSO4、体积百分含量为 0.15％～0.25％的Tween 20，2.6～2.9mmol/L的dNTP、1.35～1.45mmol/L 的dUTP、18～25U DNA聚合酶、18～25U的反转录酶和15～25U重组尿嘧啶-DNA糖基化酶；最优选的包括40mmol/L的Tris-HCl、 20mmol/L的(NH4)2SO4、100mmol/L的KCl、16mmol/L的MgSO4、体积百分含量为0.2％的Tween 20，2.8mmol/L的dNTP、1.4mmol/L 的dUTP、20U DNA聚合酶、20U的反转录酶和20U重组尿嘧啶-DNA 糖基化酶。在本发明中，所述检测试剂的pH值优选为8.7～8.9，更优选为8.8。
在本发明中，所述试剂盒还包括盐酸胍，所述盐酸胍的使用浓度优选为30～60mmol/L，更优选为35～45mmol/L，最优选为40mmol/L；在本发明中，所述盐酸胍能够有效促进LAMP的扩增效率，相对于传统的RT-LAMP，检测时间大大缩短。
在本发明中，所述试剂盒中的pH指示剂优选为酚红溶液，所述酚红溶液的质量百分含量优选为0.8％～1.2％，更优选为1％。在本发明中，所述试剂盒优选的还包括DEPC-H2O和矿物油，所述矿物油的作用是密封反应体系。
在本发明中，所述试剂盒优选的还包括灭活型病毒保存液。在本发明中，所述灭活型病毒保存液优选的包括50～100mmol/L Tris-HCl (pH7.5)、25～50mmol/L EDTA、1.2～1.8mol/L盐酸胍、2％～5％苯酚、 0.2％～0.5％8-羟基喹啉、100～200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、0.5％～1％十二烷基肌氨酸钠和0.4～1.0mg/mL蛋白酶K，更优选的包括 50mmol/LTris-HCl(pH7.5)、25mmol/L EDTA、1.5mol/L盐酸胍、 2％～5％苯酚、0.2％8-羟基喹啉、100mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、0.5％十二烷基肌氨酸钠和0.4mg/mL蛋白酶K。在本发明中，所述灭活型病毒保存液用于对采集到的病毒样品进行灭活和保存。
在本发明中，在上述引物组和检测试剂组成的反应体系中，添加 pH指示剂，在LAMP反应后，反应溶液的pH发生变化，从而反应溶液的颜色也发生变化；反应后，阳性样本的颜色由红色变为亮黄色，阴性样本的颜色仍为红色；通过肉眼观察即可判断样本中是否存在新型冠状病毒。
本发明还提供了另一种一步法可视化检测新型冠状病毒的引物组，包括F3、B3、FIP-2、BIP-2、FL-2和BL-2；所述F3、B3、FIP-2、 BIP-2、FL-2和BL-2的核苷酸序列分别如SEQID No.1、SEQ ID No.2、 SEQ ID No.7～SEQ ID No.10所示；具体如下：
F3:ATTGAACCAGCTTGAGAGCA(SEQ ID No.1)；
B3:AATTTGCGGCCAATGTTTGT(SEQ ID No.2)；
FIP-2:ACCCATCCCGCCCAACCCATTGCCGAGGCTTCTTAGA AGCCAGGCCAACAACAACAAGGC(SEQ ID No.7)；
BIP-2:ACCCATCCCGCCCAACCCAAACACAAGCTTTCGGCA GACGTTGATTAGTTCCTGGTCCCCA(SEQ ID No.8)；
FL-2:ACCCATCCCGCCCAACCCAAGCAGCAGATTTCTTAGT GACAGTT(SEQ ID No.9)；
BL-2:ACCCATCCCGCCCAACCCAGGTCCAGAACAAACCCA AGG(SEQ ID No.10)。在本发明中，所述引物FIP-2、BIP-2、FL-2 和BL-2是在引物FIP-1、BIP-1、FL-1和BL-1的5’端添加四个CCC 串联序列后获得；利用上述引物扩增后，能够获得核酸G-四链体结构。
本发明还提供了另一种一步法可视化检测新型冠状病毒的试剂盒，包括所述的引物组和检测试剂，所述检测试剂包括酶检测混合液、盐酸胍和氯化血红素；所述酶检测混合液中包括Taq SSB。
在本发明中，所述F3、B3、FIP-2、BIP-2、FL-2和BL-2的使用浓度分别优选为1.5～2.5μmol/L、1.5～2.5μmol/L、15～17μmol/L、 15～17μmol/L、0.3～0.5μmol/L和0.3～0.5μmol/L，更优选为 1.8～2.2μmol/L、1.8～2.2μmol/L、15.5～16.5μmol/L、15.5～16.5μmol/L、 0.35～0.45μmol/L和0.35～40.5μmol/L，最优选为2μmol/L、2μmol/L、 16μmol/L、16μmol/L、0.4μmol/L和0.4μmol/L。本发明对所述试剂盒中上述引物的原始浓度没有特殊限定，在使用时，采用无核酶的超纯水溶解稀释至上述浓度即可。
在本发明中，所述试剂盒中的酶检测混合液与上述提到的酶检测混合液一致，在此不再赘述。
在本发明中，所述试剂盒还包括盐酸胍，所述盐酸胍的使用浓度优选为30～60mmol/L，更优选为35～45mmol/L，最优选为40mmol/L；在本发明中，所述盐酸胍能够有效促进LAMP的扩增效率，相对于传统的RT-LAMP，检测时间大大缩短。
在本发明中，所述试剂盒还包括氯化血红素，所述氯化血红素的使用浓度优选为0.3～0.5μmol/L，更优选为0.4μmol/L。在本发明中，所述氯化血红素与核酸G-四链体结合后形成的具有过氧化物酶活性的人工模拟酶。在本发明中，所述试剂盒优选的还包括ABTS和H2O2。本发明利用所述人工模拟酶催化H2O2的活性；反应结束后，阳性样品溶液由无色变为绿色，阴性样本溶液仍为无色。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
酚红-LAMP可视化扩增检测新型冠状病毒
1、引物设计
针对新型冠状病毒的N基因优化设计了特异性新型冠状病毒环介导等温扩增引物体系，引物使用无核酶的超纯水溶解稀释至使用浓度。引物序列如下：
F3:ATTGAACCAGCTTGAGAGCA(SEQ ID No.1)；
B3:AATTTGCGGCCAATGTTTGT(SEQ ID No.2)；
FIP-1:TTGCCGAGGCTTCTTAGAAGCCAGGCCAACAACAAC AAGGC(SEQ ID No.3)；
BIP-1:AACACAAGCTTTCGGCAGACGTTGATTAGTTCCTGGT CCCCA(SEQ ID No.4)；
FL-1：AGCAGCAGATTTCTTAGTGACAGTT(SEQ ID No.5)；
BL-1：GGTCCAGAACAAACCCAAGG(SEQ ID No.6)。
2、检验流程(如图1所示)
(1)样品处理
取样后的鼻/咽拭子(鼻/咽拭子为蘸取假病毒溶液的鼻/咽拭子) 浸泡于500μL灭活型病毒保存液中(包含50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、 25mmol/L EDTA、1.5mol/L盐酸胍、3％苯酚、0.2％8-羟基喹啉、 100mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、0.5％十二烷基肌氨酸钠、0.4mg/mL 蛋白酶K)，在56℃的水浴中灭活30min，然后95℃水浴5min。
(2)试剂准备(试剂准备区)
取出2×酶检测混合液、引物混合液、盐酸胍等试剂，25℃融化，充分振荡混匀后瞬间离心，放置在4℃的冷架上或冰上。
(3)样本检测(样本处理区)
在PCR反应管中构建检测25μL反应体系：1μL待测样本核酸、12.5μL 2×酶检测混合液(40mmol/LTris-HCl、20mmol/L(NH4)2SO4、 100mmol/LKCl、16mmol/L MgSO4、0.2％(v/v)Tween 20，2.8mmol/L dNTP、1.4mmol/L dUTP、20U Bst 2.0WarmStart DNA Polymerase、20U WarmStart RTx Reverse Transcriptase、20U racil DNA Glycosylase、 3ng/μLTaqSSB，pH 8.8)、2.5μL引物混合溶液(2μmol/L F3和B3、 16μmol/LBIP-1和FIP-1、0.4μmol/LFL-1/BL-1)、40mmol/L盐酸胍(终浓度)、1μLpH指示剂(0.1wt％酚红)、补加DEPC-H2O至终体积为 25μL/管，瞬时离心，每管加入40μL矿物油，盖紧管盖。阴性对照品中不加待测样本核酸，使用同体积的DEPC-H2O替代；阳性对照使用相同体积浓度为100copies/μL的包含N基因假病毒(购自上海生工生物工程有限公司)替代。
(4)环介导等温扩增检测(核酸扩增区)
将PCR反应管置65℃恒温水浴锅或者恒温水浴杯中扩增30min，完成后反应管于25℃放置5min，观察颜色变化。如图3所示，反应后溶液从红色变为黄色，阳性样本为黄色，阴性样本为红色。
实施例2
试剂盒中不同盐酸胍浓度对扩增效率的影响检测
在PCR反应管中构建检测25μL反应体系：1μL包含N基因的假病毒(20copies/μL)、12.5μL2×酶检测混合液(40mmol/L Tris-HCl、 20mmol/L(NH4)2SO4、100mmol/LKCl、16mmol/L MgSO4、0.2％(v/v) Tween 20，2.8mmol/L dNTP、1.4mmol/L dUTP、20U Bst2.0WarmStart DNA Polymerase、20U WarmStart RTx Reverse Transcriptase、20U racilDNA Glycosylase、3ng/μL Taq SSB，pH 8.8)、2.5μL引物混合溶液 (2μmol/LF3和B3、16μmol/LBIP-1和FIP-1、0.4μmol/L FL-1/BL-1)；分别添加0，10，20，30，40，50，60，70和80mmol/L盐酸胍(终浓度)、1μLpH指示剂(0.1％酚红)，补加DEPC-H2O至终体积为25μL/ 管，瞬时离心，每管加入40μL矿物油，盖紧管盖。65℃恒温水浴锅或者恒温水浴杯中扩增，每隔5min观察颜色变化。结果如图2所示，盐酸胍浓度为0～40mmol/L时，扩增效率逐渐提高，颜色发生变化的时间逐渐缩短，在40mmol/L时LAMP效率达到最高，从70min缩短到25min，即扩增25min时即产生了颜色变化。由此可见盐酸胍能够有效促进LAMP的扩增效率，相对与传统的RT-LAMP，检测时间大大缩短。
实施例3
实施例1中引物、试剂盒的检测灵敏度分析
将各类试剂、已稀释的假病毒取出在25℃溶解，充分振荡混匀后瞬间离心，放置于4℃的冷架上或冰上备用。在PCR反应管中构建检测25μL反应体系：1μL包含N基因的假病毒(2.5copies/μL～20copies/μL)、12.5μL 2×酶检测混合液(40mmol/L Tris-HCl、20mmol/L(NH4)2SO4、100mmol/L KCl、16mmol/LMgSO4、 0.2％(v/v)Tween 20，2.8mmol/LdNTP、1.4mmol/L dUTP、20U Bst 2.0WarmStart DNA Polymerase、20U WarmStart RTx ReverseTranscriptase、20U racil DNA Glycosylase、3ng/μLTaq SSB，pH 8.8)、 2.5μL引物混合溶液(2μmol/L F3和B3、16μmol/L BIP-1和FIP-1、 0.4μmol/L FL-1/BL-1)、40mmol/L盐酸胍(终浓度)、1μLpH指示剂 (0.1％酚红)，补加DEPC-H2O至终体积为25μL/管，瞬时离心，每管加入40μL矿物油，盖紧管盖。阴性对照品中不加待测样本核酸，使用同体积的DEPC-H2O替代；阳性对照使用同体积浓度为 100copies/μL的包含N基因假病毒(购自上海生工生物工程有限公司) 替代。65℃恒温水浴锅或者恒温水浴杯中扩增30-60min，完成后反应管于25℃放置5min，观察颜色变化。结果如图3所示，实施例1中的引物组和试剂盒可以检测到2.5copies/μL含N基因的假病毒。
4、重复性实验
对同一份精密度参考品进行5天、2人、3个批号试剂检测，批内、批外精密度：日内、日间精密度：操作者内、外精密度，实验室内、间精密度的CV均不大于5.0％。
实施例4
G四链体-LAMP可视化扩增检测新型冠状病毒
1、引物设计
针对新型冠状病毒的N基因优化设计了特异性新型冠状病毒环介导等温扩增引物体系，在FIP/BIP、FL/BL的5’端加入四个CCC串联序列，引物使用无核酶的超纯水溶解稀释至使用浓度。引物序列如下：
F3:ATTGAACCAGCTTGAGAGCA(SEQ ID No.1)；
B3:AATTTGCGGCCAATGTTTGT(SEQ ID No.2)；
FIP-2:ACCCATCCCGCCCAACCCATTGCCGAGGCTTCTTAGA AGCCAGGCCAACAACAACAAGGC(SEQ ID No.7)；
BIP-2:ACCCATCCCGCCCAACCCAAACACAAGCTTTCGGCA GACGTTGATTAGTTCCTGGTCCCCA(SEQ ID No.8)；
FL-2:ACCCATCCCGCCCAACCCAAGCAGCAGATTTCTTAGT GACAGTT(SEQ ID No.9)；
BL-2:ACCCATCCCGCCCAACCCAGGTCCAGAACAAACCCA AGG(SEQ ID No.10)。
2、检测流程
取样后的鼻/咽拭子(鼻/咽拭子为蘸取假病毒溶液的鼻/咽拭子) 浸泡于500μL灭活型病毒保存液中(包含50mmol/LTris-HCl(pH7.5)、 25mmol/L EDTA、1.5mol/L盐酸胍、3％苯酚、0.2％8-羟基喹啉、 100mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、0.5％十二烷基肌氨酸钠、0.4mg/mL 蛋白酶K)，在56℃的水浴中灭活30min，然后95℃水浴5min。
取出2×酶检测混合液、引物混合液、盐酸胍等试剂，25℃融化，充分振荡混匀后瞬间离心，放置在4℃的冷架上或冰上。
将各类试剂、已稀释的假病毒取出在25℃溶解，充分振荡混匀后瞬间离心，放置于4℃的冷架上或冰上备用。在PCR反应管中构建检测25μL反应体系：1μL待检测样本、12.5μL2×酶检测混合液 (40mmol/L Tris-HCl、20mmol/L(NH4)2SO4、100mmol/L KCl、 16mmol/LMgSO4、0.2％(v/v)Tween 20，2.8mmol/L dNTP、1.4mmol/L dUTP、20U Bst 2.0WarmStartDNA Polymerase、20U WarmStart RTx Reverse Transcriptase、20U racil DNAGlycosylase、3ng/μL Taq SSB， pH 8.8)、2.5μL引物混合溶液(2μmol/L F3和B3、16μmol/LBIP-2 和FIP-2、0.4μmol/LFL-2/BL-2)、40mmol/L盐酸胍(终浓度)、补加DEPC-H2O至终体积为25μL/管，瞬时离心，每管加入40μL矿物油，盖紧管盖。
将PCR反应管置65℃恒温水浴锅或者恒温水浴杯中扩增30min，完成后反应管于25℃放置5min。
在扩增完成的LAMP体系中加入0.5μL 0.4μmol/L的氯化血红素 hemin，避光下37℃孵育60min。移取10μL上述溶液，加入45μLABTS (4mmol/L)和45μL H2O2(4mmol/L)，37℃反应8min，检测信号可通过肉眼直接观察，反应结束后，结果如图4所示，阳性样本反应液由无色变为绿色，阴性样本反应液仍为无色。
实施例5
试剂盒中不同Taq SSB浓度对检测结果的影响
将各类试剂、已稀释的假病毒取出在25℃溶解，充分振荡混匀后瞬间离心，放置于4℃的冷架上或冰上备用。在PCR反应管中构建检测25μL反应体系：1μL包含N基因的假病毒(50copies/μL)、12.5μL2×酶混合液(40mmol/L Tris-HCl、20mmol/L(NH4)2SO4、 100mmol/LKCl、16mmol/L MgSO4、0.2％(v/v)Tween 20，2.8mmol/L dNTP、1.4mmol/L dUTP、20U Bst2.0WarmStart DNA Polymerase、20U WarmStart RTx Reverse Transcriptase、20U racilDNA Glycosylase、0～5ng/μLTaq SSB，pH 8.8)、2.5μL引物混合溶液(2μmol/LF3和B3、 16μmol/LBIP-2和FIP-2、0.4μmol/L FL-2/BL-2)、40mmol/L盐酸胍(终浓度)、补加DEPC-H2O至终体积为25μL/管，瞬时离心，每管加入 40μL矿物油，盖紧管盖。
将PCR反应管置65℃恒温水浴锅或者恒温水浴杯中扩增30min，完成后反应管于25℃放置5min。
在扩增完成的LAMP体系中加入0.5μL 0.4μmol/L的氯化血红素 hemin，避光下37℃孵育60min。移取10μL上述溶液，加入45μLABTS (4mmol/L)和45μL H2O2(4mmol/L)，37℃反应8min，检测信号可通过肉眼直接观察，阳性样本反应后溶液为绿色，阴性样本反应后仍为无色。
选择420nm处的吸光度作为测量值，定义ΔA420nm＝A420nm-A0，其中A420nm为样品测量值，A0为包含N基因的假病毒浓度为0时的背景值。
固定其他成份的浓度，在上述LAMP反应体系中分别添加不同浓度的Taq SSB(具体为0、1、2、3、4和5ng/μL)，检测Taq SSB 的浓度对检测信号的影响。Taq SSB的加入能够有效减少引物二聚体的形成，减少反应体系中反应底物的消耗，提高反应效率，从而提高检测信号。如图5所示，首先随着Taq SSB浓度的升高，检测信号逐渐增强，当Taq SSB浓度为3ng/μL时信号值达到最大，随后Taq SSB 浓度的提高，检测信号逐渐降低。说明通过添加Taq SSB蛋白，即能够有效阻止非特异性扩增，也能降低和阻止引物二聚体的形成，从而提高特异性扩增效率；但随着Taq SSB浓度的进一步提高，该蛋白会与引物过多结合，阻止引物与模版的结合从而降低扩增效率，减少信号值。
试剂盒中不同镁离子浓度对检测结果的影响
将各类试剂、已稀释的假病毒取出在25℃溶解，充分振荡混匀后瞬间离心，放置于4℃的冷架上或冰上备用。在PCR反应管中构建检测25μL反应体系：1μL包含N基因的假病毒(50copies/μL)、 12.5μL2×酶混合液(40mmol/L Tris-HCl、20mmol/L(NH4)2SO4、 100mmol/L KCl、1～30mmol/L MgSO4、0.2％(v/v)Tween 20， 2.8mmol/L dNTP、1.4mmol/L dUTP、20UBst 2.0WarmStart DNA Polymerase、20UWarmStart RTx Reverse Transcriptase、20Uracil DNA Glycosylase、3ng/μLTaq SSB，pH 8.8)、2.5μL引物混合溶液(2μmol/L F3和B3、16μmol/LBIP-2和FIP-2、0.4μmol/LFL-2/BL-2)、40mmol/L 盐酸胍(终浓度)、补加DEPC-H2O至终体积为25μL/管，瞬时离心，每管加入40μL矿物油，盖紧管盖。
将PCR反应管置65℃恒温水浴锅或者恒温水浴杯中扩增30min，完成后反应管于25℃放置5min。
在扩增完成的LAMP体系中加入0.5μL 0.4μM的氯化血红素 hemin，避光下37℃孵育60min。移取10μL上述溶液，加入45μLABTS (4mM)和45μL H2O2(4mM)，37℃反应8min，检测信号可通过肉眼直接观察，阳性样本反应后溶液为绿色，阴性样本反应后仍为无色。
选择420nm处的吸光度作为测量值，定义ΔA420nm＝A420nm-A0，其中A420nm为样品测量值，A0为包含N基因的假病毒浓度为0时的背景值。
固定其他成份的浓度，在上述LAMP反应体系中分别添加不同浓度的镁离子(具体为2、5、10、14、16、18、20、25、30mmol/L)，考察镁离子浓度对检测信号的影响。镁离子的浓度能够影响Bst DNA 聚合酶的活性，从而影响扩增效率。如图6所示，随着镁离子浓度的升高，检测信号逐渐增强，当镁离子浓度为16mM时信号值达到最大，说明扩增效果最好，随后镁离子浓度升高，检测信号逐渐降低。因此镁离子的最佳浓度为16mmol/L，优化范围为14～25mmol/L。
试剂盒中不同BstDNA Polymerase浓度对检测结果的影响
将各类试剂、已稀释的假病毒取出在25℃溶解，充分振荡混匀后瞬间离心，放置于4℃的冷架上或冰上备用。在PCR反应管中构建检测25μL反应体系：1μL包含N基因的假病毒(50copies/μL)、 12.5μL2×酶混合液(40mmol/L Tris-HCl、20mmol/L(NH4)2SO4、 100mmol/L KCl、1～30mmol/L MgSO4、0.2％(v/v)Tween 20， 2.8mmol/L dNTP、1.4mmol/L dUTP、0～30U Bst 2.0WarmStart DNA Polymerase、20U WarmStart RTx Reverse Transcriptase、20U racil DNA Glycosylase、3ng/μLTaq SSB，pH 8.8)、2.5μL引物混合溶液(2μmol/L F3和B3、16μmol/LBIP-2和FIP-2、0.4μmol/L FL-2/BL-2)、40mmol/L 盐酸胍(终浓度)、补加DEPC-H2O至终体积为25μL/管，瞬时离心，每管加入40μL矿物油，盖紧管盖。
将PCR反应管置65℃恒温水浴锅或者恒温水浴杯中扩增30min，完成后反应管于25℃放置5min。
在扩增完成的LAMP体系中加入0.5μL 0.4μM的氯化血红素 hemin，避光下37℃孵育60min。移取10μL上述溶液，加入45μLABTS (4mM)和45μL H2O2(4mM)，37℃反应8min，检测信号可通过肉眼直接观察，反应后溶液从无色变为绿色，阳性样本为绿色，阴性样本为无色。
选择420nm处的吸光度作为测量值，定义ΔA420nm＝A420nm-A0，其中A420nm为样品测量值，A0为包含N基因的假病毒浓度为0时的背景值。
固定其他成份的浓度，在上述LAMP反应体系中分别添加不同量的Bst DNAPolymerase(具体浓度如下：5、10、15、20、25和30U)，考察DNA聚合酶加入量对检测信号的影响。Bst DNA Polymerase是 LAMP的核心成份，如图7所示，随着聚合酶加入量的升高，检测信号逐渐增强，当聚合酶加入量为20U时信号值达到最大，此时扩增效果最好，随后聚合酶加入量的升高，检测信号逐渐降低。因此聚合酶的最佳加入量为20U，优化范围为15～30U。
5、检测灵敏度分析(加入Taq SSB)
取出2×酶检测混合液、引物混合液、盐酸胍等试剂，25℃融化，充分振荡混匀后瞬间离心，放置在4℃的冷架上或冰上。
将各类试剂、已稀释的假病毒取出在25℃溶解，充分振荡混匀后瞬间离心，放置于4℃的冷架上或冰上备用。在PCR反应管中构建检测25μL反应体系：1μL包含N基因的假病毒(浓度分别为1、 10、15、20、40、50和100copies/μL)、12.5μL2×酶检测混合液(40mmol/LTris-HCl、20mmol/L(NH4)2SO4、100mmol/L KCl、16mmol/LMgSO4、 0.2％(v/v)Tween 20，2.8mmol/LdNTP、1.4mmol/L dUTP、20U Bst 2.0WarmStart DNA Polymerase、20UWarmStart RTx Reverse Transcriptase、20U racil DNA Glycosylase、3ng/μLTaq SSB，pH 8.8)、 2.5μL引物混合溶液(2μmol/L F3和B3、16μmol/L BIP-2和FIP-2、 0.4μmol/LFL-2/BL-2)、40mmol/L盐酸胍(终浓度)、补加DEPC-H2O 至终体积为25μL/管，瞬时离心，每管加入40μL矿物油，盖紧管盖。
将PCR反应管置65℃恒温水浴锅或者恒温水浴杯中扩增30min，完成后反应管于25℃放置5min。
在扩增完成的LAMP体系中加入0.5μL 0.4μmol/L的氯化血红素 hemin，避光下37℃孵育60min。移取10μL上述溶液，加入45μLABTS (4mmol/L)和45μL H2O2(4mmol/L)，37℃反应8min，检测信号可通过肉眼直接观察，反应结束后，阳性样本反应液由无色变为为绿色，阴性样本反应液仍为无色。
选择420nm处的吸光度作为测量值，定义ΔA420nm＝A420nm-A0，其中A420nm为样品测量值，A0为包含N基因的假病毒浓度为0时的背景值。
新型冠状病毒浓度在1copies/μL～100copies/μL之间呈现良好的线性关系(图8)，回归方程为ΔA420nm＝0.333+0.006C新型冠状病毒 (C:copies·μL-1)，线性相关系数r2为0.995。以空白的3倍标准偏差除以标准曲线的斜率得到本试剂盒的检出限为0.5copies/μL。
当反应体系中不加入Taq SSB，而且其他条件不变，N基因的假病毒浓度范围为5～500copies/μL(具体为5、50、100、200和 500copies/μL)时，呈现良好的线性关系(图9)，回归方程为ΔA420nm＝0.305+0.0008C新型冠状病毒(C:copies·μL-1)，线性相关系数r2为 0.982。以空白的3倍标准偏差除以标准曲线的斜率得到不添加Taq SSB的检出限为5copies/μL。
由此可见，本发明所述试剂盒中加入Taq SSB后，检测灵敏度比传统RT-LAMP提高了10倍，灵敏度大大增强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南超亟检测技术有限责任公司
<120> 一步法可视化检测新型冠状病毒核酸的引物组和试剂盒
<141> 2021-01-05
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
attgaaccag cttgagagca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aatttgcggc caatgtttgt 20
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ttgccgaggc ttcttagaag ccaggccaac aacaacaagg c 41
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aacacaagct ttcggcagac gttgattagt tcctggtccc ca 42
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
agcagcagat ttcttagtga cagtt 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ggtccagaac aaacccaagg 20
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
acccatcccg cccaacccat tgccgaggct tcttagaagc caggccaaca acaacaaggc 60
<210> 8
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
acccatcccg cccaacccaa acacaagctt tcggcagacg ttgattagtt cctggtcccc 60
a 61
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
acccatcccg cccaacccaa gcagcagatt tcttagtgac agtt 44
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
acccatcccg cccaacccag gtccagaaca aacccaagg 39

Claims (10)

1.一步法可视化检测新型冠状病毒的引物组，其特征在于，包括F3、B3、FIP-1、BIP-1、FL-1和BL-1；所述F3、B3、FIP-1、BIP-1、FL-1和BL-1的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1～SEQID No.6所示。
2.一步法可视化检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组和检测试剂，所述检测试剂包括酶检测混合液、盐酸胍和pH指示剂；所述酶检测混合液中包括Taq SSB。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述Taq SSB的使用浓度为2～4ng/μL。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述酶检测混合液还包括30～50mmol/L的Tris-HCl、15～25mmol/L的(NH4)2SO4、90～110mmol/L的KCl、14～25mmol/L的MgSO4、体积百分含量为0.1％～0.3％的Tween 20、2.5～3.0mmol/L的dNTP、1.3～1.5mmol/L的dUTP、16～30U DNA聚合酶、15～30U的反转录酶和10～30U重组尿嘧啶-DNA糖基化酶。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述盐酸胍的使用浓度为30～60mmol/L。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括灭活型病毒保存液。
7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述F3、B3、FIP-1、BIP-1、FL-1和BL-1的使用浓度分别为1.5～2.5μmol/L、1.5～2.5μmol/L、15～17μmol/L、15～17μmol/L、0.3～0.5μmol/L和0.3～0.5μmol/L。
8.一步法可视化检测新型冠状病毒的引物组，其特征在于，包括F3、B3、FIP-2、BIP-2、FL-2和BL-2；所述F3、B3、FIP-2、BIP-2、FL-2和BL-2的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.7～SEQ ID No.10所示。
9.一步法可视化检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述的引物组和检测试剂，所述检测试剂包括酶检测混合液、盐酸胍和氯化血红素；所述酶检测混合液中包括Taq SSB。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述F3、B3、FIP-2、BIP-2、FL-2和BL-2的使用浓度分别为1.5～2.5μmol/L、1.5～2.5μmol/L、15～17μmol/L、15～17μmol/L、0.3～0.5μmol/L和0.3～0.5μmol/L。
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LONGJIAO ZHU等: "A facile cascade signal amplification strategy using DNAzyme loop-mediated isothermal amplification for the ultrasensitive colorimetric detection of Salmonella", 《SENSORS ANDACTUATORSB:CHEMICAL》, vol. 242, 30 September 2016 (2016-09-30), pages 1 *
RAWI NADDAF等: "A Protocol for Simple, Rapid, and Direct Detection of SARS-CoV-2 from clinical samples, using Reverse Transcribed Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP)", 《BIO PROTOC.》 *
RAWI NADDAF等: "A Protocol for Simple, Rapid, and Direct Detection of SARS-CoV-2 from clinical samples, using Reverse Transcribed Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP)", 《BIO PROTOC.》, vol. 10, no. 20, 20 October 2020 (2020-10-20), pages 4 *
YINHUA ZHANG等: "Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride", 《BIOTECHNIQUES》 *
YINHUA ZHANG等: "Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride", 《BIOTECHNIQUES》, vol. 69, no. 3, 8 July 2020 (2020-07-08) *
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ZHANMIN LIU等: "A G-quadruplex DNAzyme-based LAMP biosensing platform for a novel colorimetric detection of Listeria monocytogenes", 《ANALYTICAL METHODS》, vol. 10, 15 January 2018 (2018-01-15), pages 1 *

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