CN113564279A - 新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒检测试剂盒及方法 - Google Patents

新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒检测试剂盒及方法，具体的地，本发明经过多轮筛选验证，从大量探针集合中获得了灵敏度高、特异性强、重复性好，适用于热对流PCR并且能够进行多重检测的探针集合。使用本发明的试剂盒及检测方法，基于热对流PCR技术，实现了对目标核酸的超快速PCR扩增检测。

Description

新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物技术和分子诊断领域，具体地说，本发明涉及一种基于热对流PCR快速检测新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒的方法及试剂盒。
背景技术
2019新型冠状病毒(2019 novel corona virus，2019-nCoV)感染肺炎是新发的呼吸系统急性传染病，具有强烈传染性。
流行性感冒病毒(influenza virus)是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表种，简称流感病毒，流感病毒分为甲(Influenza Virus A，IVA)、乙(Influenza Virus B，IVB)、丙(Influenza Virus C，IVC)和丁(Influenza Virus D，IVD) 4型，流感病毒会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性流行。
其中，甲型流感病毒较容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现而引起的。流感的传染源主要是病人，其次是隐性感染者，动物亦可能成为重要贮存宿主或中间宿主。引起季节性流感的病原主要是甲型和乙型流感病毒，甲型流感病毒根据其表面(H和N)结构及其基因特性的不同，又可分成许多亚型，至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1-H16)，神经氨酸酶9 个亚型(N1-N9)。乙型流感根据其抗原性和基因特征可以分为多个抗原谱系，主要为两大谱系，代表株分别为B/Yamagata/16/88和Victoria/2/87。
甲型流感病毒和乙型流感病毒是最常见的流感病原，感染者初期症状与2019 新型冠状病毒感染症状极为相似，均会表现出发热、咳嗽等症状，因此难以从临床症状对患者进行准确的鉴别诊断。
目前使用的荧光定量PCR进行病毒种类判断，存在问题主要包括：仪器成本高、占用较大的实验室操作空间；需要集中送检，在专用的PCR实验室中进行测试，无法进行现场快速检验；实验时间长，排除核酸处理过程，扩增检测时间一般在 2h左右。上述种种原因限制了现有核酸检测产品的应用范围，无法推动诊断前移下移。因此，有必要开发针对新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒的快速检测技术。
发明内容
本发明针对新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒开发了基于热对流PCR技术的快速检测体系，以便能够高效率、高特异性、低成本的对感染患者进行检测。
在本发明的第一方面，提供了一种用于热对流PCR检测的引物对集，所述引物对集包括：
第一引物对，所述第一引物对包括：
如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第二引物对，所述第二引物对包括：
如SEQ ID NO.3所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.4所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第三引物对，所述第三引物对包括：
如SEQ ID NO.5所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.6所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
内标引物对，所述内标引物对包括：
如SEQ ID NO.7所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.8所示的反向引物。
本发明的第二方面，提供了一种用于热对流PCR检测的探针集，所述探针集包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的第一探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的第二探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的第三探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的内标探针。
在另一优选例中，各探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的 3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，各探针标记的荧光报告基团互不相同。
本发明的第三方面，提供了一种用于热对流PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含探针混合液，所述探针混合液中包含序列如SEQ ID NO.1-12所示的多核苷酸。
在另一优选例中，所述第一容器还包含三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含PCR反应酶系，所述PCR反应酶系包括热启动Taq酶、和逆转录酶C-MMLV。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阴性质控品。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阳性质控品。
本发明的第四方面，提供了一种多重检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、和乙型流感病毒核酸的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的核酸样本；
(2)制备PCR反应体系并进行PCR检测：
其中，所述PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述核酸样本可来自咽拭子样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、痰液样本、粪便样本或环境样本。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。
在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。
在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括PCR反应酶系。
在另一优选例中，所述PCR为荧光定量PCR或热对流PCR。
本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、和乙型流感病毒核酸。
在另一优选例中，所述PCR为荧光定量PCR或热对流PCR。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019新型冠状病毒阴性对照的 PCR结果；
图2：检测甲型流感病毒阳性对照的PCR结果；
图3：检测乙型流感病毒阳性对照的PCR结果；
图4：检测2019新型冠状病毒阳性对照的PCR结果。
图5：检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019新型冠状病毒典型阳性结果(绿色FAM-甲型流感病毒，青色VIC-2019新型冠状病毒，红色TexasRed-乙型流感病毒，黄色CY5-PPIA内标)。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种快速检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、和乙型流感病毒核酸的试剂盒及方法，本发明经过多轮筛选验证，从大量探针集合中获得了灵敏度高、特异性强、重复性好，适用于热对流PCR和普通荧光定量PCR，并且能够进行多重检测的探针集合。使用本发明的试剂盒及检测方法，基于热对流PCR，可实现15min完成50个循环的超快速PCR扩增检测，而且检测灵敏度与普通荧光定量PCR相当。本发明所述试剂盒的检测灵敏度可以达到500copies/mL，搭配专用的核酸释放剂，整体检测时间不超过30min,比市场中已知快速检测设备快一倍左右，检测时间比市场上同类产品缩短30-60分钟。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、 99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
热对流PCR
热对流PCR是在一个封闭的空间中，维持其上下表面温度保持不变，产生了热流体上升冷流体下降的规则滚动的斑图现象，把上下温差引起空间内流体的密度变化引起的热对流应用于DNA扩增。毛细管的下部受到不断加热影响使得其底部样品发生变性反应，同时其密度变小，浮力慢慢变大，当大于粘性力和重力后向上浮动，上升到达靠近管顶部的较低温度区域时，样品又发生退火和延伸反应，同时受到冷却影响，密度又变大，开始慢慢下沉并重复进行加热冷却过程。以这种方式，通过热对流实现PCR反应。
但是，使用热对流PCR实现稳定扩增也存在不小的困难，比如热对流流体路径很难保证使规则的，这就导致无法保证反应试剂能充分完成变形、退火和延伸三大步骤，往往存在扩增效率偏低、扩增特异性差及管间差异大等问题。因此，热对流PCR中对反应试剂特别是引物、探针等特异性试剂的设计要求更高。
目前市场上出现的热对流PCR设备有瑞基海洋生物科技股份有限公司(中国台湾地区)开发的POCKITTM核酸分析仪、阿赫姆生物系统公司(韩国)开发的热对流PCR 检测仪。
多重PCR
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一 PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
影响多重PCR反应的因素有很多，比如：
(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是 DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
试剂盒
本发明提供一种基于热对流PCR检测样品中新型冠状病毒、甲型流感病毒、和乙型流感病毒核酸的试剂盒。
具体地，本发明公开了一种快速定性检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及2019 新型冠状病毒RNA的引物、探针：
所述检测甲型流感病毒的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测甲型流感病毒的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述乙型流感病毒的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述乙型流感病毒的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述检测2019新型冠状病毒上游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO：5所示，所述检测2019新型冠状病毒下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO： 6所示，所述检测内控基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述检测内控基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
所述探针包括检测5种甲型流感病毒、2种乙型流感病毒、2019新型冠状病毒的探针和内控基因探针；所述甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019新型冠状病毒的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9-11，内控的探针核苷酸序列如SEQ ID NO： 12所示。
进一步，所述探针甲型流感病毒探针核苷酸序列的5’端标记有FAM荧光报告基团、3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团，所述探针乙型流感病毒探针核苷酸序列的 5’端标记有Tex荧光报告基团、3’端标记有BHQ2淬灭基团，所述探针2019新型冠状病毒探针核苷酸序列的5’端标记有Vic荧光报告基团、3’端标记有BHQ1，所述内标探针核苷酸序列的5’端标记有Cy5、3’端标记有BHQ2淬灭基团。
优选地，所述甲型流感病毒基因上游引物在反应体系中的终浓度为8μmol/L，所述甲型流感病毒基因下游引物在反应体系中的终浓度为8μmol/L，所述甲型流感病毒探针在反应体系中的终浓度为3μmol/L，乙型流感病毒基因上游引物在反应体系中的终浓度为20μmol/L，所述乙型流感病毒基因下游引物在反应体系中的终浓度为20μmol/L，所述乙型流感病毒探针探针在反应体系中的终浓度为10 μmol/L，2019新型冠状病毒基因上游引物在反应体系中的终浓度为20μmol/L，所述2019新型冠状病毒基因下游引物在反应体系中的终浓度为20μmol/L，所述 2019新型冠状病毒探针在反应体系中的终浓度为6μmol/L；所述内控基因上游引物在反应体系中的终浓度为5mol/L，所述内控基因下游引物在反应体系中的终浓度为5μmol/L，所述内控基因探针在反应体系中的终浓度为3μmol/L。
所述甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019新型冠状病毒基因和内控的探针序列如下表1：
表1.引物和探针序列信息
Figure BDA0003169484830000051
Figure BDA0003169484830000061
上述PCR引物和标有不同类型荧光的探针可用于甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019新型冠状病毒N基因和内控基因进行检测，根据结果扩增曲线Ct值，能够对甲型流感病毒、乙型流感病毒以及2019新型冠状病毒进行现场定性检测。
基于以上PCR引物和探针，本发明公开了一种用于甲型流感病毒、乙型流感病毒以及2019新型冠状病毒三重基因检测的试剂盒。可在一个反应管内完成甲型流感病毒、乙型流感病毒以及2019新型冠状病毒三种病原体的检测，其中甲型流感病毒覆盖常见H1N1(2009)、H3N2、H7N9、H5N1亚型、乙型流感病毒覆盖Yamagata、 Victoria型。
在一个优选地实施方式中，所述试剂盒包括用于配制PCR反应液A的试剂：探针混合液、RT-buffer、RNase-free水；用于配制PCR反应液B的试剂：Taq热启动抗体酶、逆转录酶、dNTP mix；以及对照样本和核酸释放剂。其中探针混合液如表2所示。
表2.PCR探针混合液
Figure BDA0003169484830000062
所述PCR反应液A的RT-buffer包括如下成分，如表3：
表3.RT-buffer
编号 组分 组分中的主要成分
1 RT-buffer (NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>、KCl、Tris-HCl、MgCl<sub>2</sub>
所述对照品包括如下成分，如表4：
表4.对照样本
Figure BDA0003169484830000063
所述对照品包括如下成分，如表5：
表5.核酸裂解试剂
编号 组分 组分中的主要成分
1 核酸裂解试剂 有机溶剂、胍盐、表面活性剂
所述阳性对照中含有：
检测人工合成的甲型流感病毒cDNA片段1(SEQ ID NO.13)：
ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCGTCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCAGGGAAGAACACCGATCTTGAGGCACTCATGGAATGGCTA AAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAGGGGGATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAG TGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTTAATGGGAATGGGGATCCAAACAACATGG ACAGAGCGGTCAAACTGTACAGGAAGCTAAAAAGGGA
检测人工合成的乙型流感病毒cDNA片段2(SEQ ID NO.14)：
TCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCATTAACAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCAGAAAAATTACACTGTTGGTTCGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGACTCTGCCTTGGA ATGGATAAAAAACAAAAGATGCTTAACTGATATACAGAAAGCACTAATTGGTGCCTCTATCTGCTTTTTAA AACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCTTATCGGGAATGGGAACAACAGCAACA AAAAAGAAGGGCCTGATTCTGGCTGAGAGAAAAAT
检测人工合成的2019新型冠状病毒cDNA片段3(SEQ ID NO.15)：
ATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAA AATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGA AGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAA CAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAA
检测人工合成的内参基因DNA片段4(SEQ ID NO.16)：
GGTGCCCACCAGCAGGATGGGCACATCAGGGCAGTGGTGGCACACCTCTGGATGCCACTTGTGCCGCACGTTCTCATAGGACGGCGGACTGGCAATGGAGAAACAGATGACGAAAACGTTGGTCTGAGGGTAGGAGAG TGTACGGAGGCGGTCATACTCCTCCTGGCCCGCAGTGTCCCACAGGTTCAGGTTCACTGTGCGCCCGTCAA CTGCGCTCTGCGCGCTGTAATTGTCGAACACGGTGGGGATGTACTCTTTGGGGAAAGCGTTAGTTGTGTAG CAGATGAGCAGGCACGTCTTGCCCACAGCCCCATCACCCACCACCACGCACTTGATGCTCTGCATCGTGGGTGCAGTTGCTGTAGTGGAGGCAGTGCCTCC
本发明所述试剂盒适用样本为咽拭子样本。
本发明所述试剂盒用于判定检测有效性的标准为：
每次检测均设置阴性对照组和阳性对照组，阳性质控品通道呈典型S型扩增曲线且Ct≤30。阴性质控品：无典型S型扩增曲线显示。
以上各项同时满足的条件下本次实验有效，否则全部试验应重新进行。
检测方法
本发明还公开了一种甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019新型冠状病毒定性检测的方法。
在一个优选地实施方式中，所述方法包括步骤：
1.处理待测样本并进行RNA模板提取
优选地，待测样本为咽拭子样本，取10μL咽拭子样本加入10μL裂解液专用裂解试剂提取核酸，反复吸打混合后室温静止5min；加入80μL蒸馏水，上下颠倒(或振荡数十秒)混匀后，瞬时离心12,000rpm离心2-3分钟。
2.配制反应体系，将PCR反应液A和PCR反应液B混合，加入处理后的待测样本上清液5μL，制备得到快速PCR反应液，反应体系构成如表6。
表6.反应体系
Figure BDA0003169484830000081
3.上机，使用热对流PCR仪设置退火温度为55℃，每个循环的时间为21s，进行50个循环。上机程序如表7。
表7.PCR上机程序
Figure BDA0003169484830000082
4.结果读取及分析：在仪器正常，阳性质控品和阴性质控品均正常的情况下进行结果分析
在仪器正常，甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019新型冠状病毒阴阳性质控品均正常的情况下进行结果分析
(1)Ch1通道：
阳性：待测样本检测结果Ct≤40，曲线呈S型或有明显指数增长期，判断为甲型流感阳性；
可疑：待测样本检测结果40≤Ct≤45，此时应对样本进行复检，如结果Ct值仍然存在相同的范围，曲线呈S型或有明显的指数扩增期，则判断甲型流感病毒阳性，否则为甲型流感病毒阴性；
阴性：待测样本检测结果Ct≥45或未检出，判断为甲型流感病毒阴性。
(2)Ch2通道：
阳性：待测样本检测结果Ct≤40，曲线呈S型或有明显指数增长期，判断为 2019新型冠状病毒阳性；
可疑：待测样本检测结果40≤Ct≤45，此时应对样本进行复检，如结果Ct值仍然存在相同的范围，曲线呈S型或由明显的指数扩增期，则判断为2019新型冠状病毒阳性，否则为2019新型冠状病毒阴性；
阴性：在Ct≥45或未检出，此次结果为2019新型冠状病毒阴性。
(3)Ch3通道：
阳性：待测样本检测结果Ct≤40，曲线呈S型或有明显指数增长期，判断为乙型流感阳性；
可疑：待测样本检测结果40≤Ct≤45，此时应对样本进行复检，如重读结果 Ct值仍然存在相同的范围，曲线呈S型或有明显的指数扩增期，则判断为乙型流感病毒阳性，否则为乙型流感病毒阴性；
阴性：在Ct≥45或未检出，此次结果为乙型流感病毒阴性。
本发明的有益效果在于：
(1)使用本发明的试剂盒及检测方法，基于热对流PCR，可实现15min 完成50个循环的超快速PCR扩增检测，而且检测灵敏度与普通荧光定量PCR 相当，灵敏度可达500copies/ml。结合直扩裂解法，整体检测时间不超过30min, 检测时间比市场上同类产品缩短30-60分钟。
(2)本发明的检测试剂盒，同时检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、和乙型流感病毒核酸，为多重荧光检测试剂盒。
(3)本发明经过多轮筛选验证，从大量探针集合中获得了灵敏度高、特异性强、重复性好，适用于热对流PCR和普通荧光定量PCR，并且能够进行多重检测的探针集合。
本发明适用于对新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒核酸的检测，为病毒鉴定和防控提供可靠的依据，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在疫情防控过程中，使用本发明的检测方法对环境中的病毒核酸进行检测，这些病毒核酸信息可以作为公众健康管理之需。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1试剂盒
本实施例提供了新型冠状肺炎及甲型乙型流感快速检测试剂盒的组成成分、包装及数量(24/48人份/盒)，如表8：
表8.试剂盒的组成成分、包装及数量
Figure BDA0003169484830000091
Figure BDA0003169484830000101
实施例2：灵敏度检测及最低检出率实验
灵敏度参考品由甲型流感、乙型流感以及新型冠状病毒的模板与内参基因模板(内参基因拷贝数≥106)分别按一定比例混合，混合液的甲型流感、乙型流感以及新型冠状病毒核酸浓度分别为5×108copies/mL、5×107copies/mL、 5×106copies/mL、5×105copies/mL、5×104copies/mL、5×103copies/mL、 5×102copies/mL、5×101copies/mL。其中，甲型流感、乙型流感和新型冠状病毒模板来源于人工制备的假病毒；内参基因模板来源于人工制备的质粒；阴性对照为无核酸水(Nuclease-free Water)。
取阴性对照、阳性对照及灵敏度参考品各5μL，加样至反应体系的专用 PCR管中，使每管反应液总体积为20μL。实际测得的如表9所示：
表9.灵敏度检测结果
Figure BDA0003169484830000102
Figure BDA0003169484830000111
试剂盒的灵敏度检测结果与理论值相符，灵敏度检测良好；快速PCR热对流系统可稳定检测出拷贝数分别为500copies/mL的甲型流感、乙型流感、新型冠状病毒的混合阳性样本中相应病原体类别，且阳性符合率为100％。
图1显示了检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019新型冠状病毒的典型阴性对照的PCR结果；
图2显示了检测甲型流感病毒的典型阳性对照的PCR结果；
图3显示了检测乙型流感病毒的典型阳性对照的PCR结果；
图4显示了检测2019新型冠状病毒的典型阳性对照的PCR结果。
图5显示了检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019新型冠状病毒典型阳性结果(绿色FAM-甲型流感病毒，青色VIC-2019新型冠状病毒，红色TexasRed-乙型流感病毒，黄色CY5-内标)。
实施例3：试剂盒的准确性检测
根据所测得对照样本的拷贝数，制备准确性参考品。
将甲型流感病毒、乙型流感病毒以及2019新型冠状病毒的模板与内参基因(内参基因拷贝数≥106)分别按一定比例混合，制得3000copies/mL的混合液。
每种准确性参考品做4个重复实验，共4管；取单个甲型流感病毒模板准确性参考品5μL，乙型流感病毒模板准确性参考品5μL，新型冠状病毒模板准确性参考品5μL加样至步骤二所配制的PCR反应体系的专用反应管中，使得PCR反应液的总体积为20μL。
用快速PCR热对流系统对本发明试剂盒的准确性进行检测检测结果表明，阳性质控品：呈典型S型扩增曲线且Ct≤40。阴性质控品：无典型S型扩增曲线显示。两项结果同时成立，结果数据有效。检测结果阳性率为100％，符合理论定性标准，表明本发明试剂盒的准确性检测符合要求。
实施例4：试剂盒的重复性检测
本发明试剂盒的重复性进行检测，得到结果如表10。
表10.重复性检测结果
Figure BDA0003169484830000112
Figure BDA0003169484830000121
各质控品检测结果一致，符合定量检测方法的精密度要求；另外各质控品准确性的检测结果阳性率为100％，符合理论定性标准，表明本发明试剂盒的准确性检测符合要求。
对比例1
本发明人对甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019新型冠状病毒的基因序列进行深入比对分析后，针对目标序列设计了数十对引物和数条探针，期望能够获得扩增效果好，灵敏度高，准确率高的引物组和检测探针。由于引物特异性差异、退火温度不一致、以及引物二聚体等原因，不同探针集合对于试剂检测灵敏度影响较大，很难获得较优的PCR扩增引物以及探针序列。本发明人通过大量的实验，对设计的引物和探针进行优化选择并验证，最终确定了可以用于本试剂盒所采用的引物、探针序列及其组合。实验中发现，即使在已经基本确定针对各目标核酸的引物对和探针序列的情况下，不同引物对组合进行多重扩增的效果也存在显著差异。
例如，使用如下的对照检测体系进行检测，其它检测步骤和条件同上述实施例：
对照检测体系1：
Figure BDA0003169484830000122
对照检测体系2：
Figure BDA0003169484830000131
按照实施例2的方法进行灵敏度检测，检测结果表明对照检测体系1检测低浓度核酸样本的曲线较差，无法呈现出典型的S型曲线。对照检测体系2在常规荧光定量PCR检测体系中能够进行多重检测，具有较佳的特异性和灵敏度。但是，在热对流PCR中，灵敏度仅有5×103copies/mL，灵敏度较差。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 广州达安基因股份有限公司
<120> 新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒检测试剂盒及方法
<130> 020084
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
cgagatcgcg cagagactt 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cagaggtgac aggattggtc t 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tgctttcatt aacagaagat gg 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gtgctttctg tatatcagtt aagc 24
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
ggaacttctc ctgctagaat gg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
gcagcagatt tcttagtgac ag 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ctctggatgc cacttgtgc 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
accgtgttcg acaattacag c 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
ggcactcatg gaatggctaa agac 24
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
gacctagact ctgccttgga atgga 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
tgagagcaaa atgtctggta aaggc 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
gcagtgtccc acaggttcag gttc 24
<210> 13
<211> 317
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcgtcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcgcagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gcactcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactag ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa tggggatcca aacaacatgg acagagcggt caaactgtac 300
aggaagctaa aaaggga 317
<210> 14
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
tcttaaaatg tcgctgtttg gagacacaat tgcctacctg ctttcattaa cagaagatgg 60
agaaggcaaa gcagaactag cagaaaaatt acactgttgg ttcggtggga aagaatttga 120
cctagactct gccttggaat ggataaaaaa caaaagatgc ttaactgata tacagaaagc 180
actaattggt gcctctatct gctttttaaa acccaaagac caggaaagaa aaagaagatt 240
catcacagag cccttatcgg gaatgggaac aacagcaaca aaaaagaagg gcctgattct 300
ggctgagaga aaaat 315
<210> 15
<211> 350
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc agcagtaggg gaacttctcc 60
tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct ttgctgctgc ttgacagatt 120
gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa caacaaggcc aaactgtcac 180
taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa aaacgtactg ccactaaagc 240
atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa caaacccaag gaaattttgg 300
ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat tggccgcaaa 350
<210> 16
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
ggtgcccacc agcaggatgg gcacatcagg gcagtggtgg cacacctctg gatgccactt 60
gtgccgcacg ttctcatagg acggcggact ggcaatggag aaacagatga cgaaaacgtt 120
ggtctgaggg taggagagtg tacggaggcg gtcatactcc tcctggcccg cagtgtccca 180
caggttcagg ttcactgtgc gcccgtcaac tgcgctctgc gcgctgtaat tgtcgaacac 240
ggtggggatg tactctttgg ggaaagcgtt agttgtgtag cagatgagca ggcacgtctt 300
gcccacagcc ccatcaccca ccaccacgca cttgatgctc tgcatcgtgg gtgcagttgc 360
tgtagtggag gcagtgcctc c 381
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
taagggctct gtgatgaatc tt 22
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
ttgccgaggc ttcttaga 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
agcaggatgg gcacatca 18
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
tcatctgcta cacaactaac gct 23
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
caccgatctt gaggcactca tggaa 25
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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cactgttggt tcggtgggaa ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
gctttgctgc tgcttgacag attg 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
gatgacgaaa acgttggtct gagg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ccgaggtcga aacgtacg 18
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
gctgtttgga gacacaattg c 21
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gcaacagttc aagaaattca ac 22
<210> 28
<211> 19
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
gtctacgctg cagtcctcg 19
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tgttgctgtt gttcccattc 20
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
tgtatgcttt agtggcagta cg 22
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
gatgtctttg cagggaagaa caccg 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
gaaggcaaag cagaactagc agaaa 25
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
caatggcggt gatgctgctc 20

Claims (10)

1.一种用于热对流PCR检测的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：
第一引物对，所述第一引物对包括：
如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
优选地，所述引物对集还包括：
第二引物对，所述第二引物对包括：
如SEQ ID NO.3所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.4所示的反向引物。
更优选地，所述引物对集还包括：
第三引物对，所述第三引物对包括：
如SEQ ID NO.5所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.6所示的反向引物。
最优选地，所述引物对集还包括：
内标引物对，所述内标引物对包括：
如SEQ ID NO.7所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.8所示的反向引物。
2.一种用于热对流PCR检测的探针集，其特征在于，所述探针集包括核苷酸序列如SEQID NO.9所示的第一探针；
优选地，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的第二探针；
更优选地，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的第三探针；
最优选地，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的内标探针。
3.一种用于热对流PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对集；
优选地，所述试剂盒还包括权利要求2所述的探针集。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含探针混合液，所述探针混合液中包含序列如SEQ ID NO.1-12所示的多核苷酸。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含PCR反应酶系，所述PCR反应酶系包括热启动Taq酶、和逆转录酶C-MMLV。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阴性质控品。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阳性质控品。
8.一种多重检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、和乙型流感病毒核酸的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的核酸样本；
(2)制备PCR反应体系并进行PCR检测：
其中，所述PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、权利要求1所述的引物对集、和权利要求2所述的探针集。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR为荧光定量PCR或热对流PCR。
10.权利要求1所述的引物对集、和/或权利要求2所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、和乙型流感病毒核酸。
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