CN113897417A - 一组检测牛结核杆菌的探针、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

一组检测牛结核杆菌的探针、检测试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一组检测牛结核杆菌的探针、检测试剂盒和检测方法，涉及结核杆菌检测技术领域。本发明所述探针和试剂盒，在液相体系中通过杂交链式反应形成三链DNA，发生荧光共振能量转移，通过荧光信号变化实现定量。利用本发明所述检测试剂盒可实现血液中牛结核杆菌的无蛋白酶体系的高灵敏检测，具有不依赖复杂设备、成本低等特点。本发明所述检测试剂盒和检测方法，荧光淬灭率随目标核酸浓度的降低而逐渐减少，在0.1～10amol/L的范围内呈现良好的线性关系，回归方程为y＝0.0104x+0.1337，线性相关系数R2＝0.98，检出限为0.013amol/L(S/N＝3)。

Description

一组检测牛结核杆菌的探针、检测试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于结核杆菌检测技术领域，具体涉及一组检测牛结核杆菌的探针、检测试剂盒和检测方法。
背景技术
牛结核病是由牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis，结核杆菌)感染引起的一种慢性消耗性人兽共患传染病，是牛的成长过程中常见的一种慢性传染病，不仅影响牛的健康生长，还会对环境造成污染。目前，世界上对牛结核病的防控主要基于“检测-扑杀”的策略。皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验是OIE推荐的牛结核病诊断方法，但是二者均无法区分结核病牛的感染期，且阳性牛的淘汰也会造成相应的经济损失。
近年来，随着分子生物学技术的发展以及结核杆菌特异性核苷酸序列分析所取得的成果，通过基因扩增进行结核杆菌的鉴定已成为该类菌鉴定最可靠的技术方法之一。2003年，王仲元等用3套分枝杆菌特异引物，在同一退火温度下同时扩增菌株的基因组DNA，一次性将结核分枝杆菌、牛分枝杆菌与非结核分枝杆菌区别开，取得了很好的效果，特异性达到100％，灵敏度为10ng/反应。2007年，谢芝勋等根据牛布鲁氏菌具有种特异性的BCSP-31K基因和牛分枝杆菌23S rRNA基因，设计并合成了两对分别扩增牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的特异性引物，建立了PCR同时快速检测鉴别以上两种病原体的方法。2013年，张喜悦等用MYCGEN引物检测临床分离菌株，扩增有1030bp片段的目的基因，证实分离菌株属于MTC(mycobacterium tuberculosis complex)群。2016年，岳筠等选择牛分枝杆菌保守基因区域合成特异性引物，构建了可检测牛分枝杆菌病原核酸的PCR方法，均具有良好的敏感性和特异性，可用于鲜乳样本的检测。2019年，Barandiaran等分别用PCR方法和细菌分离培养法检测了266份猪组织样本中的牛型分枝杆菌，结果显示PCR方法的灵敏度(82.9％)高于细菌分离培养的灵敏度(79.9％)，两种方法的特异性几乎相同，证实PCR可以作为一种检测猪的牛型分枝杆菌的快检方法。
国内外用于诊断牛结核病的检测方法大体上可分为三大类：(1)基于细菌学检测方法，如细菌染色涂片镜检、细菌培养和细菌接种易感动物试验等；(2)基于免疫学的检测方法，如结核菌素皮内变态反应试验、IFN-γ释放试验和胶体金试验等；(3)基于分子生物学的诊断技术，如基因芯片、核酸探针、PCR等方法。
以上牛结核病检测方法都需要耗费较多的人力和时间，检出时间长，操作麻烦，许多因素都可以降低该方法的敏感性和特异性，易造成假阳性或假阴性结果，不适合对大群牛检疫。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一组检测牛结核杆菌的探针、检测试剂盒和检测方法，具有灵敏度高、检测稳定性好、特异性强，不依赖复杂设备、省时省力，适用于大面积检测，适宜于广泛推广。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一组检测牛结核杆菌的探针，包括：具有发夹结构的探针MB、具有发夹结构且带荧光受体基团的探针H1、具有发夹结构的探针H2、带荧光供体基团的探针TFO；
所述探针MB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述探针H1的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针TFO的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述探针MB、探针H1和探针H2的制备方法，均包括：将制备原料寡核苷酸与PBS缓冲液混合，依次在95℃孵育10min，70℃孵育5min，50℃孵育30min，30℃孵育10min，25℃放置30min。
优选的，所述荧光受体基团包括TAMRA，所述荧光供体基团包括FAM。
本发明还提供了一种牛结核杆菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包括上述探针，还包括阳性对照和阴性对照；
所述阳性对照包括一支强阳性对照和五支不同浓度的阳性对照；所述强阳性对照的浓度为1fmol/L，所述不同浓度的阳性对照的浓度分别为0.1amol/L、0.4amol/L、1amol/L、4amol/L和10amol/L；
所述阴性对照为PBS。
优选的，所述特异性靶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了一种非治疗目的的检测牛结核杆菌的检测方法，包括以下步骤：(1)分别将样品、不同浓度的阳性对照和阴性对照与具有发夹结构的探针MB混合，85℃加热5min，25℃静置25min，得第一混合液；
(2)将所述第一混合液与具有发夹结构且带荧光受体基团的探针H1和具有发夹结构的探针H2混合，37℃孵育2h，得第二混合液；
(3)将所述第二混合液与带荧光供体基团的探针TFO混合，25℃静置1h，测定混合溶液的荧光强度，根据荧光淬灭率F％测算牛结核杆菌的含量；
F％＝(F0-F1)/F0×100％式I，其中F0表示以阴性对照为样本时检测溶液的荧光强度，F1表示以不同浓度阳性对照为样本时检测溶液的荧光强度。
优选的，步骤(1)所述样品包括全血。
优选的，步骤(1)所述具有发夹结构的探针MB的浓度为50nmol/L；
步骤(2)所述具有发夹结构且带荧光受体基团的探针H1和具有发夹结构的探针H2的浓度均为100nmol/L；
步骤(3)所述带荧光供体基团的探针TFO的浓度为250nmol/L。
优选的，步骤(2)和步骤(3)所述混合均在避光条件下操作。
优选的，步骤(3)中利用荧光淬灭率构建线性回归方程：y＝0.0104x+0.1337，线性相关系数R2＝0.98，其中x为目标DNA浓度，y为荧光淬灭率。
有益效果：本发明提供了一组检测牛结核杆菌的探针和检测试剂盒，所述探针和检测试剂盒的检测原理如图1所示，在目标牛结核杆菌DNA的存在下，MB的发夹结构被打开，由于其被打开后的单链结构和带有荧光受体基团的发夹探针H1(H1-TAMRA)、普通发夹探针H2互补，从而触发H1、H2的杂交链式反应HCR过程，产生dsDNA。加入带荧光供体的探针TFO后，带荧光供体基团的探针TFO(TFO-FAM)与上述HCR产物杂交形成三链DNA(嘧啶-嘌呤-嘧啶Y.R.Y)，TFO-FAM和H1-TAMRA上的荧光供体和荧光受体相互靠近，产生了荧光共振能量转移FRET过程，致使荧光供体基团FAM的绿光减弱，从而发生荧光淬灭，根据荧光信号值的变化情况可进行定量分析。本发明所述检测试剂盒和检测方法，荧光淬灭率随目标核酸浓度的降低而逐渐减少，在0.1～10amol/L的范围内呈现良好的线性关系，回归方程为y＝0.0104x+0.1337，线性相关系数R2＝0.98，检出限为0.013amol/L(S/N＝3)。
附图说明
图1为本发明的实验原理图；
图2为HCR时间与淬灭率的关系图；
图3为TFO-FAM浓度与淬灭率的关系图；
图4为DNA浓度与淬灭率的关系曲线及线性拟合图；
图5为DNA类型与淬灭率的关系图。
具体实施方式
本发明提供了一组检测牛结核杆菌的探针，包括：具有发夹结构的探针MB、具有发夹结构且带荧光受体基团的探针H1、具有发夹结构的探针H2、带荧光供体基团的探针TFO；
所述探针MB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述探针H1的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针TFO的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明中，所述检测试剂盒中各种探针的核苷酸序列如表1所示。
表1各探针的核苷酸序列
Figure BDA0003369795880000041
本发明所述探针MB、探针H1和探针H2的制备方法相同，优选均包括：将制备原料寡核苷酸与PBS缓冲液混合，依次在95℃孵育10min，70℃孵育5min，50℃孵育30min，30℃孵育10min，25℃放置30min。本发明在制备得到对应的探针MB、探针H1和探针H2后，再将探针H1与荧光受体基团结合，将探针TFO与荧光供体基团结合。
本发明对所述荧光受体基团和荧光供体基团的种类并没有特殊限定，在实施例中，所述荧光受体基团优选包括TAMRA，所述荧光供体基团优选包括FAM，但是不能将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明还提供了一种包含上述探针的检测试剂盒，所述检测试剂盒中优选还包括独立包装的阳性对照(靶基因序列)和阴性对照；所述阳性对照优选为牛结核杆菌的特异性靶基因，包括一支强阳性对照(浓度为1fmol/L)，五支阳性对照(浓度为0.1amol/L、0.4amol/L、1amol/L、4amol/L、10amol/L)；
所述阴性对照为PBS。本发明所述特异性靶基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了一种非治疗目的的检测牛结核杆菌的检测方法，包括以下步骤：(1)分别将样品、不同浓度的阳性对照和阴性对照与具有发夹结构的探针MB混合，85℃加热5min，25℃静置25min，得第一混合液；
(2)将所述第一混合液与具有发夹结构且带荧光受体基团的探针H1和具有发夹结构的探针H2混合，37℃孵育2h，得第二混合液；
(3)将所述第二混合液与带荧光供体基团的探针TFO混合，25℃静置1h，测定混合溶液的荧光强度，根据荧光淬灭率F％测算牛结核杆菌的含量；
F％＝(F0-F1)/F0×100％式I，其中F0表示以阴性对照为样本时检测溶液的荧光强度，F1表示以不同浓度阳性对照为样本时检测溶液的荧光强度。
本发明分别将样品、不同浓度的阳性对照和阴性对照与具有发夹结构的探针MB混合，85℃加热5min，25℃静置25min，得第一混合液。本发明所述不同浓度的阳性对照优选包括设置0.1～100amol/L的梯度浓度。在本发明中，所述的浓度均为将对应的探针溶解于PBS缓冲液中所形成的浓度。本发明实施例中，优选取5μL 1nmol/L的样品与5μL探针MB(50nmol/L)混合，85℃加热5min，25℃静置25min。本发明所述样品优选包括全血。
得第一混合液后，本发明将所述第一混合液与具有发夹结构且带荧光受体基团的探针H1和具有发夹结构的探针H2混合，37℃孵育2h，得第二混合液。
本发明所述具有发夹结构且带荧光受体基团的探针H1和具有发夹结构的探针H2的浓度优选均为100nmol/L，且在所述混合时需要在避光条件下操作。
得第二混合液后，本发明将所述第二混合液与带荧光供体基团的探针TFO混合，25℃静置1h，测定混合溶液的荧光强度，根据荧光淬灭率F％测算牛结核杆菌的含量。在本发明中，所述带荧光供体基团的探针TFO的浓度优选为250nmol/L，且在所述混合时优选在避光条件下操作。
在本发明中，在阳性对照浓度为0.1～10amol/L的范围内呈现良好的线性关系，回归方程为y＝0.0104x+0.1337，线性相关系数R2＝0.98，检出限为0.013amol/L(S/N＝3)，其中x为目标DNA浓度，y为荧光淬灭率，只需要将测定出的荧光淬灭率代入上述回归方程即可测定DNA浓度。
下面结合实施例对本发明提供的一组检测牛结核杆菌的探针、检测试剂盒和检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1)均采用逐步缓慢退火方法制备发夹探针(MB，H1-TAMRA和H2)，将寡核苷酸溶解在PBS(10mmol/L，0.1mol/L氯化钠，pH 6.0)中，然后于PCR仪中95℃孵育10min，70℃孵育5min，50℃孵育30min，30℃孵育10min，最后于25℃放置30min；
2)取5μL 1nmol/L的目标DNA与5μL MB(50nmol/L)混合，85℃加热5min，25℃静置25min。将5μL H1-TAMRA(100nmol/L)和5μL H2(100nmol/L)加入到上述混合物中(避光操作)，37℃孵育2h。加入5μLTFO-FAM(250nmol/L，避光操作)，25℃静置1h。最后，测定溶液荧光值，计算荧光减少值△F＝F0-F1，F％＝(F0-F1)/F0×100％式I，其中F0表示以阴性对照为样本时检测溶液的荧光强度，F1表示以不同浓度靶DNA为样本时检测溶液的荧光强度。
1、不同杂交链式反应时间和不同TFO-FAM浓度对试剂盒的影响
分别设定杂交链式反应的时间为1h、1.5h、2h、2.5h和3h，目标DNA浓度设定为1nmol/L，TFO浓度设定为250nmol/L，其余条件不变来进行探究；加入TFO-FAM后，与HCR产物形成三链DNA，荧光供体FAM和荧光受体TAMRA相互靠近而发生荧光共振能量转移，从而产生荧光淬灭。为了探究达到最佳淬灭效果时的TFO-FAM浓度，分别设定其为150nmol/L、200nmol/L、250nmol/L、300nmol/L、350nmol/L，目标DNA浓度设定为1nmol/L，其余条件不变来进行探究。
结果如图2所示，当HCR反应时间为2h时，荧光淬灭率为69.24％，呈现出最佳淬灭效果。反应时间60min、90min、2.5h、3h时，荧光淬灭率分别为31.51％、46.06％、50.17％、27.83％；如图3所示，当TFO浓度为250nmol/L时，会呈现出最佳淬灭效果，淬灭率是64.58％。TFO浓度为150nmol/L、200nmol/L、300nmol/L、350nmol/L时，荧光淬灭率分别为27.37％、48.92％、54.29％、48.56％。
2、灵敏度和特异性检测
1)灵敏度实验
用不同浓度的目标DNA(0.1-100amol/L)研究该体系的敏感性。取5μL不同浓度的目标DNA与5μLMB(50nmol/L)混合，85℃加热5min，25℃静置25min。将5μL H1-TAMRA(100nmol/L)和5μL H2(100nmol/L)加入到上述混合物中(避光操作)，37℃孵育2h。加入5μLTFO-FAM(250nmol/L，避光操作)，25℃静置1h。最后，测定溶液荧光值。
结果如图4所示，在最佳实验条件下，实验组荧光淬灭率随目标核酸浓度的降低而逐渐减少。在0.1～10amol/L的范围内呈现良好的线性关系，回归方程为y＝0.0104x+0.1337，线性相关系数R2＝0.98，检出限为0.013amol/L(S/N＝3)。
2)特异性实验
分别取5μL 1amol/L的单碱基错配(MT1)、双碱基错配(MT2)、三碱基错配(MT3)序列和非互补序列(NCT)与5μLMB(50nmol/L)混合，85℃加热5min，25℃静置25min。将5μL H1-TAMRA(100nmol/L)和5μL H2(100nmol/L)加入到上述混合物中(避光操作)，37℃孵育2h。加入5μLTFO-FAM(250nmol/L，避光操作)，25℃静置1h。最后，测定溶液荧光值。
结果如图5所示，进行单碱基错配(MT1)、双碱基错配(MT2)、三碱基错配(MT3)、非互补序列(NCT)实验，发现单碱基错配的荧光淬灭率最高，双碱基错配、三碱基错配次之，非互补序列的荧光淬灭率和空白对照近似，基本不发生淬灭。以此证明了该实验体系在识别牛结核杆菌方面的高度特异性。
3、实际样本的检测
采用灭活菌加入法模拟实际样本进行检测：以含有108CFU/mL的灭活牛结核杆菌菌液为母液，分别构建灭活牛结核杆菌浓度为3×105CFU/L、6×105CFU/L、3×106CFU/L的牛全血样本，如果每个灭活牛结核杆菌提取1个靶DNA分子，则对应的牛结核杆菌DNA浓度为0.5amol/L、1amol/L、5amol/L。
1)分别取1.5mL上述牛全血样本加入到离心管中，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用PBS溶液洗涤2次，离心收集沉淀物，供提取DNA用；
2)向上述收集的沉淀物中加1mL 5％NaOH(1.25mol/L)并振荡混合，室温静置10min；
3)12000rpm离心5min，弃上清，沉淀物用1mLTE溶液(10mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的EDTA，pH＝7.8)悬浮，离心收集菌体；
4)用400μLTE溶液悬浮，加入20μL溶菌酶(50mg/mL)，60℃水浴60min；
5)加入15μL蛋白酶K(20mg/mL)和50μL 10％SDS溶液，60℃水浴60min；
6)加入500μL的Tris饱和酚，摇匀(10min)；
7)12000rpm、4℃条件下离心7min，取上清；
8)配制Tris饱和酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1；
9)加入Tris饱和酚、氯仿、异戊醇(25:24:1)混合液450μL，摇匀10min；
10)12000rpm、4℃条件下离心7min，取上清，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液400μL(氯仿:异戊醇＝24:1)，混匀后静置分层；
11)12000rpm、4℃条件下离心7min，取上清，加入2.5倍经过-20℃冷冻过的100％的酒精；
12)将样品取出，12000rpm、4℃条件下离心7min，弃上清，白色沉淀加入400μL的经过-20℃冷冻的75％酒精洗涤三次；
13)加入50μLTE溶液溶解，然后95℃加热5～10min，再在冰上快速冷却，使得DNA成单链用于后续扩增及检测。
结果如表2所示，检测生物实际样本中的靶核酸准确度高，稳定可靠。
表2实际样本的检测结果(n＝3)
Figure BDA0003369795880000081
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南超亟检测技术有限责任公司
<120> 一组检测牛结核杆菌的探针、检测试剂盒和检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagagagaac aagcaggaat ttctgacaaa tctgatcctc tccgtctgca caaattcctg 60
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattcctgct tgttctctct taagagaaag agagaacaag ca 42
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagagagaac aagcaggaat ttgcttgttc tctctttctc tt 42
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgctgctca gccagcactc gccccttcat c 31

Claims (10)

1.一组检测牛结核杆菌的探针，包括：具有发夹结构的探针MB、具有发夹结构且带荧光受体基团的探针H1、具有发夹结构的探针H2、带荧光供体基团的探针TFO；
所述探针MB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述探针H1的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针TFO的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针MB、探针H1和探针H2的制备方法，均包括：将制备原料寡核苷酸与PBS缓冲液混合，依次在95℃孵育10min，70℃孵育5min，50℃孵育30min，30℃孵育10min，25℃放置30min。
3.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述荧光受体基团包括TAMRA，所述荧光供体基团包括FAM。
4.一种检测牛结核杆菌的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括权利要求1～3任一项所述的探针，还包括阳性对照和阴性对照；
所述阳性对照包括一支强阳性对照和五支不同浓度的阳性对照；所述强阳性对照的浓度为1fmol/L，所述不同浓度的阳性对照的浓度分别为0.1amol/L、0.4amol/L、1amol/L、4amol/L和10amol/L；
所述阴性对照为PBS。
5.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，所述特异性靶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
6.一种非治疗目的的检测牛结核杆菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别将样品、不同浓度的阳性对照和阴性对照与具有发夹结构的探针MB混合，85℃加热5min，25℃静置25min，得第一混合液；
(2)将所述第一混合液与具有发夹结构且带荧光受体基团的探针H1和具有发夹结构的探针H2混合，37℃孵育2h，得第二混合液；
(3)将所述第二混合液与带荧光供体基团的探针TFO混合，25℃静置1h，测定混合溶液的荧光强度，根据荧光淬灭率F％测算牛结核杆菌的含量；
所述荧光淬灭率F％由式I得到：
F％＝(F0-F1)/F0×100％式I，其中F0表示以阴性对照为样本时检测溶液的荧光强度，F1表示以不同浓度阳性对照为样本时检测溶液的荧光强度。
7.根据权利要求6所述检测方法，其特征在于，步骤(1)所述样品包括全血。
8.根据权利要求6所述检测方法，其特征在于，步骤(1)所述具有发夹结构的探针MB的浓度为50nmol/L；
步骤(2)所述具有发夹结构且带荧光受体基团的探针H1和具有发夹结构的探针H2的浓度均为100nmol/L；
步骤(3)所述带荧光供体基团的探针TFO的浓度为250nmol/L。
9.根据权利要求6所述检测方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述混合均在避光条件下操作。
10.根据权利要求6所述检测方法，其特征在于，步骤(3)中利用荧光淬灭率构建线性回归方程：y＝0.0104x+0.1337，线性相关系数R2＝0.98，其中x为目标DNA浓度，y为荧光淬灭率。
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