CN115786544A - 一种检测牛结核分枝杆菌的试剂、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测牛结核分枝杆菌的试剂、试剂盒及检测方法，属于分子生物学检测技术领域；本发明通过杂交链式反应介导构建具备多个PAM识别位点的DNA纳米线，同时结合多个Cas12a蛋白，顺式切割后激活多重Cas12a反式切割作用，释放大量引发序列用于引发下游杂交链式反应形成G四链体‑血红素DNA酶重复串联结构，最后通过G‑四链体血红素DNA酶酶促催化扩增信号，实现了高灵敏度和高特异性的牛结核分枝杆菌高性能比色分析，本发明的方法具有高灵敏度、高特异性、操作简单等特点。本发明的试剂对牛结核分枝杆菌DNA具有较高的特异性选择，检出限为检出限为2.75aM(LOD＝3σ/S)。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测牛结核分枝杆菌的试剂、试剂盒及检测方法。
背景技术
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌(tubercle bacillus)，是引起结核病的病原体，结核分枝杆菌可分为牛分枝杆菌(牛型)、人型结核分枝杆菌(人型)、禽分枝杆菌(禽型)三种类型。其中，牛结核分支杆菌的检测方法分为传统检测方法和分子生物学检测方法，传统牛结核的诊断方法主要有四种：①根据流行病学、临床症状及病理改变对牛结核的早期诊断；②采用抗酸法进行显微镜检查，用选择性培养液进行分离，经培养、生化鉴定、PCR等方法鉴定；③应用ELISA法进行血清学检测；④应用迟发性过敏反应实验，例如在皮内注入牛结核菌素，3天后测定其肿胀情况。
目前，结核分枝杆菌分子检测主要采用PCR技术，PCR技术虽然显著提高了检测性能和效率，但是其检测灵敏度较低，易存在假阳性和假阴性的结果。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测牛结核分枝杆菌的试剂、试剂盒及检测方法，本发明具有高灵敏度和高特异性。
本发明提供了一种检测牛结核分枝杆菌的试剂，包括Cas12a、gRNA、scgRNA探针、杂交链式反应用探针和比色分析用试剂；
所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述scgRNA探针由iDNA-F、iDNA-B和Initiator组装得到；所述iDNA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述iDNA-B的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述Initiator的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述杂交链式反应用探针包括H1、H2、H3和H4；所述H1的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述H3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述H4的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述比色分析用试剂包括氯化血红素、H2O2和ABTS。
优选的，所述iDNA-F、iDNA-B和Initiator的摩尔比为(1.1～1.3)：(1.1～1.3)：1。
本发明还提供了一种检测牛结核分枝杆菌的试剂盒，包括上述方案所述的试剂。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照；所述阳性对照品包括Target探针；所述Target探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
优选的，所述Cas12a的工作浓度为5μM；所述gRNA的工作浓度为10μM。
优选的，所述H1和H2的工作浓度分别为5μM；所述H3和H4的工作浓度分别为2μM。
本发明还提供了一种基于上述方案所述试剂或者所述试剂盒的非诊断目的的牛结核分枝杆菌的检测方法，包括以下步骤：
1)分别孵育H1和H2，分别得到发夹结构的H1和H2，将待测样本、发夹结构的H1和发夹结构的H2混合，进行第一杂交链式反应，得到DNA纳米线性结构；
2)将所述DNA纳米线性结构、Cas12a、gRNA和scgRNA探针混合，进行识别切割反应，得到包含引发序列的产物；
3)分别孵育H3和H4，分别得到发夹结构的H3和H4，将所述包含引发序列的产物和发夹结构的H3、发夹结构的H4混合，进行第二杂交链式反应，得到G-四链体；
4)将所述G-四链体和氯化血红素混合，于黑暗条件下进行第一孵育，得到G-四链体-血红素DNA酶；将所述G-四链体-血红素DNA酶和H2O2、ABTS混合，进行第二孵育，得到第二孵育产物；对所述第二孵育产物进行固液分离，收集液体组分；
5)对所述液体组分进行紫外分光检测，获得在A420nm处的最大吸收峰，根据标准曲线获得待测样本中牛结核分枝杆菌的浓度值；
所述标准曲线是以牛结核分支杆菌DNA的浓度为自变量，以在A420nm处的校正后的最大吸收峰为因变量得到的标准曲线；
所述在A420nm处的校正后的最大吸收峰根据式1所示公式计算得到，ΔA420nm＝A420nm-A0，式1；其中ΔA420nm为在A420nm处的校正后的最大吸收峰；A420nm为实际测得的已知牛结核分支杆菌DNA靶标浓度的最大吸收峰，A0为结核分枝杆菌DNA靶标浓度为0时候的背景值。
优选的，所述第一杂交链式反应的反应体系以10μL计，包括以下组分：待测样品2μL、H14μL和H24μL。
优选的，所述第一杂交链式反应的反应程序为：37℃、2h。
优选的，所述识别切割反应的反应程序为：37℃、2h，75℃、15min。
本发明提供了一种检测牛结核分枝杆菌的试剂，包括Cas12a、gRNA、scgRNA探针、杂交链式反应用探针和比色分析用试剂；所述scgRNA探针由iDNA-F、iDNA-B和Initiator组装得到；所述杂交链式反应用探针包括H1、H2、H3和H4；所述比色分析用试剂包括氯化血红素、H2O2和ABTS。
本发明所述试剂用于检测牛结核分支杆菌的原理示意图如图1所示。本发明的试剂具有双重识别元件，当存在牛结核分枝杆菌DNA靶标(Target)时，靶标DNA(Target)作为引发序列，其3’端首先与H1的5’粘性末端a结合(第一重识别)，打开H1的茎部结构，暴露PAM(TTTG)位点，再与H2的粘性末端即c*区域结合打开H2的茎部结构，由此触发杂交链式反应，形成DNA纳米线形结构；所述DNA纳米线形结构包含大量由Cas12a/gRNA二元复合物特异性识别的PAM位点及由特异序列组成的重复单位。DNA纳米线形结构上的PAM位点及其特异序列重复单位与Cas12a/gRNA二元复合物识别并结合(第二重识别)，结合后同时多重激活CRISPR/Cas12a顺式切割活性，对DNA纳米线形结构完成顺式诱导切割暴露出反式切割催化位点。
CRISPR/Cas12a反式切割作用于scgRNA探针中的凸起结构，其中scgRNA探针由三条链组成，包括iDNA-F、iDNA-B和Initiator，iDNA-F、iDNA-B分别与Initiator碱基互补配对以“锁住”第二重杂交链式反应的“钥匙探针”(Initiator)，iDNA-F和iDNA-B探针中均设计了不匹配碱基序列以形成ssDNA凸起结构，其作为CRISPR/Cas12a反式切割底物。切割后由于双链Tm值降低，导致链解旋，释放Initiator用于引发与H3、H4发夹探针的杂交链式反应。
H3发夹探针中隐藏G四链体序列eh(5’-GGGTAGGGCGGGTTGGGAAA-3’，SEQ IDNO.14)，三组GGG序列位于发夹环部即h序列，一组GGG位于发夹茎部即e序列，若不存在“钥匙探针”(Initiator)可避免自发形成G-四链体结构。发夹的设计在保持自身热稳定性和保证反应顺利进行的平衡中至关重要，确保发夹亚稳态平衡条件下，在H3发夹颈部中间设计了一对不匹配碱基对G，即图中mismatch区域，让杂交链式反应更容易进行。“钥匙探针”(Initiator)存在下，H3被打开，继而打开H4，其间形成带有大量G-四链体的DNA聚合物，加入Hemin(血红素)后，形成G–四链体–血红素DNA酶，显示出类过氧化氢酶的催化活性，该酶能催化H2O2与ABTS的化学反应，产生带有绿色阳离子的自由基的ABTS·+，于420nm处有最大吸收峰。
本发明将CRISPR/Cas12a系统与杂交链式反应有效协同，弥补了常规杂交链式反应特异性和灵敏度不高的缺点，通过杂交链式反应形成多个Cas12a蛋白串联结构，多重激活切割机制，提高检测性能。此外，CRISPR/Cas12a的识别催化反式切割活性作用于特定探针scgRNA，形成“钥匙”与“锁”的关系，设计巧妙，充分利用Cas12a的高效反式切割活性，解锁scgRNA后被释放的RNA探针启动新的杂交链式反应，形成G四链体-血红素DNA酶重复串联结构，促进G四链体结构的形成，完成比色传感。另外，本发明的试剂的反应条件不需要借助昂贵变温仪器，操作简单，有效解决了目前国内外对牛结核分枝杆菌现场检测的局限性。
本发明的试剂对牛结核分枝杆菌DNA具有较高的特异性选择，检出限为2.75aM(LOD＝3σ/S)。本发明的检测方法实现了对结核分枝杆菌DNA的超灵敏和高特异性检测。
附图说明
图1为牛结核分枝杆菌检测体系原理图；
图2为牛结核分枝杆菌检测方法可行性分析结果；
图3为牛结核分枝杆菌检测体系对靶标DNA的特异性选择分析结果；
图4为不同浓度牛结核分枝杆菌DNA紫外-可见吸收曲线；
图5为牛结核分枝杆菌DNA检测信号饱和曲线；
图6为不同浓度牛结核分枝杆菌DNA响应校准曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种检测牛结核分枝杆菌的试剂，包括Cas12a、gRNA、scgRNA探针、杂交链式反应用探针和比色分析用试剂；所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGUCUGAUCCGCGAAAUUCA；所述scgRNA探针由iDNA-F、iDNA-B和Initiator组装得到；所述iDNA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：GTTCAGTTTTTATTTGTGGAGA；所述iDNA-B的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：AAGTGGTTTTATTTCTAACGT；所述Initiator的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：UCUCCACAACUGAACACGUUAGACCACUU；所述杂交链式反应用探针包括H1、H2、H3和H4；所述H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：TTATTGCGGCAGTGAATTTCGCGGATCAGACCGGGTTTTGGGTCTGATCCGCGAAATTCACTGC；所述H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：GGTCTGATCCGCGAAATTCACTGCCGCAATAAGCAGTGAATTTCGCGGATCAGACCCAAAACCC；所述H3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：AAGTGGTCTAACGTGTTCAGTTGTGGAGATGGGTAGGGCGGGTTGGGAAATTACCCATGTCCACAACTGAACACGTTAGA；所述H4的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：TCTCCACAACTGAACACGTTAGACCACTTTCTAACGTGTTCAGTTGTGGACATGGGTA；所述比色分析用试剂包括氯化血红素、H2O2和ABTS。
在本发明中，所述iDNA-F、iDNA-B和Initiator的摩尔比优选为(1.1～1.3)：(1.1～1.3)：1，更优选为1.2:1.2:1。在本发明中，所述scgRNA探针由三条链组成，包括iDNA-F、iDNA-B和Initiator，iDNA-F、iDNA-B分别与Initiator碱基互补配对以“锁住”第二重杂交链式反应的“钥匙探针”(Initiator)，iDNA-F和iDNA-B探针中均设计了不匹配碱基序列以形成ssDNA凸起结构，其作为CRISPR/Cas12a反式切割底物。切割后由于双链Tm值降低，导致链解旋，释放Initiator用于引发与H3、H4发夹探针的杂交链式反应。
在本发明中，所述iDNA-F和iDNA-B的工作浓度分别优选为4.8μM；所述Initiator的工作浓度优选为2μM；所述scgRNA优选的采用以下方法组装得到：将iDNA-F溶液、iDNA-B溶液和Initiator溶液混合，进行孵育，得到scgRNA。在本发明中，所述iDNA-F溶液和iDNA-B溶液的制备方法分别优选为：采用TE buffer将iDNA-F或iDNA-B的冻干粉配置成100μM的母液，再用反应缓冲溶液将母液稀释至工作浓度；在本发明中，所述Initiator溶液优选的采用以下方法制备得到：采用DEPC水将Initiator的冻干粉配置成20μM的母液，再用反应缓冲溶液将母液稀释至工作浓度。在本发明中，所述TE buffer以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分：10mM Tris、0.1mM EDTA；所述TE buffer的pH为8.0；在本发明中，所述反应缓冲溶液优选为Tris/HCl-Nabuffer；所述Tris/HCl-Nabuffer以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分：Tris 20mM、NaCl 400mM、30mM KCl、1mM EDTA和50mM MgCl2；所述Tris/HCl-Nabuffer的pH值优选为7.2。
在本发明中，所述孵育的反应体系以20μL计，包括以下组分：5μL4.8μM的iDNA-F、5μL4.8μM的iDNA-B和10μL 2μM的Initiator；所述孵育的程序优选为：95℃孵育5min，冷却至25℃；所述冷却的速率优选为0.1℃/s；所述scgRNA的保存温度优选为4℃。
本发明还提供了一种检测牛结核分枝杆菌的试剂盒，包括上述方案所述的试剂。
在本发明中，所述试剂盒优选的还包括阳性对照；所述阳性对照品包括Target探针；所述Target探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：GGTCTGATCCGCGAAATTCACTGCCGCAATAA；所述Target探针优选的制成溶液使用；所述Target探针的溶液的制备方法参照上述方案中所述iDNA-F溶液或iDNA-B溶液的制备方法，此处不再赘述。
在本发明中，所述Cas12a的工作浓度优选为5μM。在本发明中，所述gRNA的工作浓度优选为10μM；所述gRNA的工作液配制方法参见上述方案中Initiator溶液的制备方法，此处不再赘述。
在本发明中，所述H1和H2的工作浓度分别优选为5μM；所述H3和H4的工作浓度分别优选为2μM；所述H1、H2、H3、H4的工作液配制方法优选的参照上述方案中所述iDNA-F溶液或iDNA-B溶液的制备方法，此处不再赘述。在本发明中，所述H1、H2、H3和H4在使用前分别进行孵育，分别得到发夹结构的H1、H2、H3和H4；所述孵育的程序优选为95℃孵育5min，冷却至25℃后于25℃条件下孵育2.5h；所述冷却的速率优选为0.1℃/s；所述发夹结构的H1、H2、H3和H4的保存温度分别优选为4℃。本发明在95℃条件下孵育后缓慢进行退火形成发夹结构，能够提高发夹探针的形成比例。
在本发明中，所述H1、H2通过杂交链式反应构建成百上千的CRISPR/Cas12a识别位点，形成多个Cas12a串联结构，多重激活顺式和反式切割活性。Cas12a的反式切割活性定点作用于预先被“锁住”的scgRNA探针，scgRNA探针由两条ssDNA和一条RNA组装成带有凸起碱基结构的三链结构，两个凸起碱基结构(ssDNA)是Cas12a反式切割作用底物，切割后被释放的RNA探针作为启动下游杂交链式反应的引发序列，促进G-四链体结构的形成。
在本发明中，所述试剂或试剂盒中涉及的序列均购自于上海生工生物工程股份有限公司。在本发明中，所述试剂或试剂盒中所用溶剂均为DEPC水。
本发明还提供了一种基于上述方案所述试剂或者所述试剂盒的非诊断目的的牛结核分枝杆菌的检测方法，包括以下步骤：
1)分别孵育H1和H2，分别得到发夹结构的H1和H2，将待测样本、发夹结构的H1和发夹结构的H2混合，进行第一杂交链式反应，得到DNA纳米线性结构；
2)将所述DNA纳米线性结构、Cas12a、gRNA和scgRNA探针混合，进行识别切割反应，得到包含引发序列的产物；
3)分别孵育H3和H4，分别得到发夹结构的H3和H4，将所述包含引发序列的产物和发夹结构的H3、发夹结构的H4混合，进行第二杂交链式反应，得到G-四链体；
4)将所述G-四链体和氯化血红素混合，于黑暗条件下进行第一孵育，得到G-四链体-血红素DNA酶；将所述G-四链体-血红素DNA酶和H2O2、ABTS混合，进行第二孵育，得到第二孵育产物；对所述第二孵育产物进行固液分离，收集液体组分；
5)对所述液体组分进行紫外分光检测，获得在A420nm处的最大吸收峰，根据标准曲线获得待测样本中牛结核分枝杆菌的浓度值；
所述标准曲线是以牛结核分支杆菌DNA的浓度为自变量，以在A420nm处的校正后的最大吸收峰为因变量得到的标准曲线；
所述在A420nm处的校正后的最大吸收峰根据式1所示公式计算得到，ΔA420nm＝A420nm-A0，式1；其中ΔA420nm为在A420nm处的校正后的最大吸收峰；A420nm为实际测得的已知牛结核分支杆菌DNA靶标浓度的最大吸收峰，A0为结核分枝杆菌DNA靶标浓度为0时候的背景值。
本发明首先分别孵育H1和H2，分别得到发夹结构的H1和H2，将待测样本、发夹结构的H1和发夹结构的H2混合，进行第一杂交链式反应，得到DNA纳米线性结构。
在本发明中，所述待测样本优选为牛结核分支杆菌基因组DNA或者在从检样中提取的基因组DNA。在本发明中，所述第一杂交链式反应的反应体系以10μL计，包括以下组分：待测样品2μL、H14μL和H24μL。在本发明中，所述第一杂交链式反应的反应程序优选为：37℃、2h。在所述第一杂交链式反应后，本发明优选的还包括在第一杂交链式反应后的体系中加入和反应体系等体积的DEPC水。
得到DNA纳米线性结构后，本发明将所述DNA纳米线性结构、Cas12a、gRNA和scgRNA探针混合，进行识别切割反应，得到包含引发序列的产物。
在本发明中，所述识别切割反应的反应体系以30μL计，包括以下组分：20μL DNA纳米线性结构、2μL 10μM的gRNA、2μL 5μM的LbCas12a、2μL 10μM的scgRNA和4μL酶buffer；所述酶buffer以水为溶剂，包括以下浓度的组分：10mM NaCl、15mM MgCl2、10mM Tris-HCl、体积浓度为0.5％的Tween-20和1mM DTT；所述酶buffer的pH值为9.0；所述识别切割反应的反应程序优选为：37℃下反应4h，75℃处理15min。在37℃下反应4h，充分释放引发序列，于75℃处理15min，使Cas12a蛋白失活。
得到包含引发序列的产物后，本发明分别孵育H3和H4，分别得到发夹结构的H3和H4，将所述包含引发序列的产物和发夹结构的H3、发夹结构的H4混合，进行第二杂交链式反应，得到G-四链体。
在本发明中，所述第二杂交链式反应的反应体系以50μL计，包括以下组分：30μL包含引发序列的产物、10μL 2μM的发夹结构的H3和10μL2μM的发夹结构的H4。在本发明中，所述述第二杂交链式反应的反应程序优选为：37℃、1h。
得到G-四链体后，本发明将所述G-四链体和氯化血红素(hemin)混合，于黑暗条件下进行第一孵育，得到G-四链体-血红素DNA酶；将所述G-四链体-血红素DNA酶和H2O2、ABTS混合，进行第二孵育，得到第二孵育产物；对所述第二孵育产物进行固液分离，收集液体组分。
在本发明中，所述第一孵育的孵育体系以55μL计，包括以下组分：50μLG-四链体和5μL 20μM的hemin；所述第一孵育的孵育程序为25℃、30min；所述第二孵育的孵育体系以100μL计，包括以下组分：10μLG-四链体-血红素DNA酶、45μL 10mM H2O2和45μL 10mMABTS；所述第二孵育的孵育程序优选为25℃、8min。
在本发明中，所述固液分离优选为离心；所述离心的转速优选为8000r/min；所述离心的时间优选为3～8min，更优选为5min。
收集液体组分后，本发明对所述液体组分进行紫外分光检测，获得在A420nm处的最大吸收峰，根据标准曲线获得待测样本中牛结核分枝杆菌的浓度值；所述标准曲线是以牛结核分支杆菌DNA的浓度为自变量，以在A420nm处的校正后的最大吸收峰为因变量得到的标准曲线；所述在A420nm处的校正后的最大吸收峰根据式1所示公式计算得到，ΔA420nm＝A420nm-A0，式1；其中ΔA420nm为在A420nm处的校正后的最大吸收峰；A420nm为实际测得的已知牛结核分支杆菌DNA靶标浓度的最大吸收峰，A0为结核分枝杆菌DNA靶标浓度为0时候的背景值。在本发明中，式1所示公式进一步优选为ΔA420nm＝0.0356C(牛结核分枝杆菌DNA)+0.1084，线性相关系数R2＝0.9901，检出限为2.75aM(LOD＝3σ/S)。
本发明的方法充分发挥CRISPR-Cas12a的高特异性、恒温反应、低成本、免标记等优势，通过杂交链式反应介导构建具备多个PAM识别位点的DNA纳米线，同时结合多个Cas12a蛋白，顺式切割后激活多重Cas12a反式切割作用，释放大量引发序列用于引发下游杂交链式反应形成G四链体-血红素DNA酶重复串联结构，最后通过G-四链体血红素DNA酶酶促催化扩增信号，实现了高灵敏度和高特异性的牛结核分枝杆菌高性能比色分析，本发明的方法具有高灵敏度、高特异性、操作简单等特点。
本发明的方法构建了可结合多个Cas12a蛋白的DNA纳米线性结构，顺式切割后产生大量具有反式切割活性CRISPR/Cas12a复合大分子，实现了高灵敏和高特异性的检测性能。高灵敏度的实现原理是：成百上千个具备PAM位点的重复序列可同时结合多个Cas12a蛋白，能够发挥多重CRISPR/Cas12a顺式和反式切割作用的信号放大功能，切割释放的引发序列引发杂交链式反应形成G四链体-血红素DNA酶重复串联结构，-四链体-血红素DNA酶酶促信号扩增，以构建四重信号放大体系，显著提高灵敏度。高特异性的实现原理是：本发明的方法具有双重识别作用，靶标作为介导杂交链式反应的引发序列，只有完成多个碱基识别互补配对才能完成打开发夹并构建DNA纳米线，同时Cas12a的识别效应具有区分单碱基错配能力，可提高检测特异性，解决序列错配等问题。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本实施例涉及到的探针均购自上海生工生物工程股份有限公司，如表1所示。
表1本发明所用探针及序列
注：SM1-SM4为采用单碱基替换的特异性序列，被替换碱基采用下划线表示.
1、实验步骤
(1)探针序列预处理
①Target探针：用TE-buffer(10mM Tris，0.1mM EDTA，pH 8.0)将冻干粉配置成100μM的母液。用反应缓冲溶液(pH 7.2，Tris/HCl-Na buffer:Tris 20mM、NaCl 400mM、30mM KCl、1mM EDTA和50mM MgCl2)将母液稀释至不同浓度。
②Initiator：用DEPC水将其冻干粉配置成20μM的母液。用反应缓冲溶液((pH7.2，Tris/HCl-Nabuffer:Tris 20mM、NaCl 400mM、30mM KCl、1mM EDTA和50mM MgCl2))将母液稀释至工作浓度2μM。
③iDNA-F、iDNA-B：用TEbuffer(10mM Tris，0.1mM EDTA，pH 8.0)将冻干粉均配置成100μM的母液。用反应缓冲溶液将母液均稀释至工作浓度4.8μM。
④scgRNA：取5μL4.8μM的iDNA-F、5μL4.8μM的iDNA-B与10μL 2μM的Initiator在200μL的离心管中混匀，iDNA-F、iDNA-B与Initiator摩尔比为1.2：1.2：1，95℃孵育5min，然后缓慢降温至室温，降温速率为0.1℃/s，充分组装形成三链结构，所形成的scgRNA探针溶液体积为20μL，4℃保存备用。
⑤gRNA：用DEPC水将其冻干粉配置成20μM的母液。用反应缓冲溶液将母液稀释至工作浓度10μM。
⑥H1、H2、H3、H4探针：用TE buffer将冻干粉均配置成100μM的母液。用反应缓冲溶液将H1、H2母液均稀释至工作浓度5μM，H3、H4母液均稀释至工作浓度2μM，使用前分别移取100μL溶液于不同200μL离心管中，进行孵化形成发夹结构：95℃孵育5min，然后以降温速率为0.1℃/s缓慢降至室温，且于室温下孵育2.5h。
⑦SM1、SM2、SM3、SM4探针：用TE buffer将冻干粉均配置成100μM的母液。用反应缓冲溶液将SM1、SM2、SM3、SM4母液稀释均至工作浓度。
(2)杂交链式反应形成具备多个PAM识别位点的DNA纳米线形结构
取2μL不同浓度的Target、4μLH1、4μLH2于200μL离心管混匀，反应总体积为10μL，于37℃反应2h，此反应步骤结束后，往体系中补加10μLDEPC水，反应体积为20μL。
(3)Cas12a进行识别切割反应
在上述体系中加入2μL 10μM的gRNA、2μL 5μM的LbCas12a、2μL 10μM的scgRNA、4μL酶buffer(pH 9.0，10mM NaCl、15mM MgCl2、10mM Tris-HCl、0.5％Tween-20、1mM DTT)混匀，在37℃下反应2h，然后75℃处理15min，使Cas12a蛋白失活，反应总体积30μL。
(4)杂交链式反应形成G-四链体：
往上述体系中加入10μL 2μM H3、10μL 2μM H4并混匀，在37℃下反应1h，反应总体积50μL。
(5)G–四链体–血红素DNA酶的形成和比色分析
将上述反应体系置于黑暗条件下，加入5μL 20μM hemin，避光孵化30min，使其形成G–四链体–血红素DNA酶。取10μL置于新灭菌离心管中，加入45μL 10mM H2O2和45μL 10mMABTS，充分搅拌，常温孵育8min，之后离心分离，取上清液50μL，于UV–1800紫外分光光度计进行检测，在A420nm处有最大吸收峰(定义ΔA420nm＝A420nm－A0，其中A420nm为样品的测量值，A0为牛结核分枝杆菌DNA靶标浓度为0时候的背景值)。
2、牛结核分枝杆菌检测方法可行性分析
为了考察本方法对牛结核分枝杆菌目标DNA检测的可行性，设计了5组实验进行验证，对关键影响因素进行分析。如图2所示，第1组为正常实验组，第2组为空白，第3组不加H1，第4组不加Cas12a酶，第5组不加H3，所涉及变量均采用加入与其等体积反应缓冲溶液作为替代。可行性实验组别的靶标浓度为100pM。
2～5组未说明的条件都与实验组保持一致。由于少量游离的引发序列触发了下游的杂交链式反应，形成了G–四链体–血红素DNA酶，第2～4组产生了一定的背景值。第5组不加H3不能形成G-四链体结构，在A420nm处的信号值较低。该结果证明只有当牛结核分枝杆菌靶标存在时，信号值较高，该体系可用于牛结核分枝杆菌的检测。
3、牛结核分枝杆菌检测体系对靶标的特异性分析
为了考察该传感技术检测牛结核分枝杆菌的特异性，对靶标序列的不同位置进行了单碱基替换，分别为SM-1、SM-2、SM-3、SM-4，与牛结核分枝杆菌DNA进行对照，浓度均为100pM，以此验证以CRISPR/Cas12a为核心识别元件的序列特异性。在同一最优条件下，分别在A420nm处测得各自信号值(背景值A0为牛结核分枝杆菌DNA浓度为0时所测的信号值)，6次平行实验，如图3所示，加入100pM Target DNA反应完成后的信号值ΔA420nm明显高于等浓度的进行碱基替换的目标序列，实验表明，该技术对牛结核分枝杆菌DNA具有较高的特异性选择。
4、定量分析
在最优实验条件下，实现对牛结核分枝杆菌DNA标准样品的定量检测。图4为浓度分别为0、10aM、20aM、50aM、100aM、1fM、10fM、50fM、100fM、1pM牛结核分枝杆菌DNA的紫外-可见吸收曲线。如图5)所示，当牛结核分枝杆菌DNA低于0.1pM时，在ΔA420nm处的吸收峰随着牛结核分枝杆菌DNA浓度的增加而增大，在0.1pM以后趋于饱和，达到最高吸收峰值，随后信号值总体趋于稳定。如图6所示，牛结核分枝杆菌DNA浓度在20aM～50fM之间有较好的线性趋势，且曲线回归方程为ΔA420nm＝0.0356C(牛结核分枝杆菌DNA)+0.1084，线性相关系数R2＝0.9901，检出限为2.75aM(LOD＝3σ/S)。该检测方法实现了对牛结核分枝杆菌DNA的高灵敏检测，牛结核分枝杆菌DNA浓度(20aM、50aM、100aM、1fM、10fM、50fM)均平行重复6次实验。
5、血液中牛结核分枝杆菌检测
为考察该方法在实际样品检测中的检测性能，采用加标法(灭活菌加入法)模拟实际样本进行检测。以含有108CFU/mL的灭活牛结核分枝杆菌菌液为母液，加入牛血中，提取并制备牛结核分枝杆菌DNA浓度分别为10fmol/L、1fmol/L、100amol/L的实际样品。实验结果如表所示，实际样品检测的平均回收率为97％～98％之间，相对标准偏差(RSD)在0.95％～6.45％之间。说明该传感技术对牛血样品中的牛结核分枝杆菌有较好的检测性能。
表2血浆样品中加标回收实验结果
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种检测牛结核分枝杆菌的试剂，包括Cas12a、gRNA、scgRNA探针、杂交链式反应用探针和比色分析用试剂；
所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述scgRNA探针由iDNA-F、iDNA-B和Initiator组装得到；所述iDNA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述iDNA-B的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述Initiator的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述杂交链式反应用探针包括H1、H2、H3和H4；所述H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述H3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述H4的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述比色分析用试剂包括氯化血红素、H2O2和ABTS。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述iDNA-F、iDNA-B和Initiator的摩尔比为(1.1～1.3)：(1.1～1.3)：1。
3.一种检测牛结核分枝杆菌的试剂盒，包括权利要求1或2所述的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照；所述阳性对照品包括Target探针；所述Target探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述Cas12a的工作浓度为5μM；所述gRNA的工作浓度为10μM。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述H1和H2的工作浓度分别为5μM；所述H3和H4的工作浓度分别为2μM。
7.一种基于权利要求1或2所述试剂或者权利要求3～6任意一项所述试剂盒的非诊断目的的牛结核分枝杆菌的检测方法，包括以下步骤：
1)分别孵育H1和H2，分别得到发夹结构的H1和H2，将待测样本、发夹结构的H1和发夹结构的H2混合，进行第一杂交链式反应，得到DNA纳米线性结构；
2)将所述DNA纳米线性结构、Cas12a、gRNA和scgRNA探针混合，进行识别切割反应，得到包含引发序列的产物；
3)分别孵育H3和H4，分别得到发夹结构的H3和H4，将所述包含引发序列的产物和发夹结构的H3、发夹结构的H4混合，进行第二杂交链式反应，得到G-四链体；
4)将所述G-四链体和氯化血红素混合，于黑暗条件下进行第一孵育，得到G-四链体-血红素DNA酶；将所述G-四链体-血红素DNA酶和H2O2、ABTS混合，进行第二孵育，得到第二孵育产物；对所述第二孵育产物进行固液分离，收集液体组分；
5)对所述液体组分进行紫外分光检测，获得在A420nm处的最大吸收峰，根据标准曲线获得待测样本中牛结核分枝杆菌的浓度值；
所述标准曲线是以牛结核分支杆菌DNA的浓度为自变量，以在A420nm处的校正后的最大吸收峰为因变量得到的标准曲线；
所述在A420nm处的校正后的最大吸收峰根据式1所示公式计算得到，ΔA420nm＝A420nm-A0，式1；其中ΔA420nm为在A420nm处的校正后的最大吸收峰；A420nm为实际测得的已知牛结核分支杆菌DNA靶标浓度的最大吸收峰，A0为结核分枝杆菌DNA靶标浓度为0时候的背景值。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述第一杂交链式反应的反应体系以10μL计，包括以下组分：待测样品2μL、H14μL和H24μL。
9.根据权利要求7或8所述的检测方法，其特征在于，所述第一杂交链式反应的反应程序为：37℃、2h。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述识别切割反应的反应程序为：37℃、2h，75℃、15min。
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|---|---|---|---|---|
| CN113897417A (zh) * | 2021-11-23 | 2022-01-07 | 湖南超亟检测技术有限责任公司 | 一组检测牛结核杆菌的探针、检测试剂盒和检测方法 |
| CN116732211A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-09-12 | 湖南工程学院 | 基于8-17脱氧核酶与CRISPR-Cas13a反式切割检测牛结核分枝杆菌的探针组及方法 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102628085A (zh) * | 2012-04-24 | 2012-08-08 | 武汉大学 | 结核分枝杆菌利福平耐药突变可视化检测探针及其应用 |
| CN102827836A (zh) * | 2012-06-11 | 2012-12-19 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种寡核苷酸探针以及用其对靶分子进行检测的方法 |
| WO2018107129A1 (en) * | 2016-12-09 | 2018-06-14 | The Broad Institute, Inc. | Crispr effector system based diagnostics |
| US20180298445A1 (en) * | 2017-03-15 | 2018-10-18 | The Broad Institute, Inc. | Crispr effector system based diagnostics |
| WO2020124050A1 (en) * | 2018-12-13 | 2020-06-18 | The Broad Institute, Inc. | Tiled assays using crispr-cas based detection |
| CN112063691A (zh) * | 2020-09-18 | 2020-12-11 | 湖北医药学院 | 一种基于g4-血红素dna酶系统检测单链靶核酸序列的方法 |
| CN113286884A (zh) * | 2018-08-07 | 2021-08-20 | 博德研究所 | 新型cas12b酶和系统 |
| CN114032339A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-02-11 | 湖南工程学院 | 一种检测鼻咽癌的超支化杂交链式反应信号放大体系、试剂盒和检测方法 |
| CN114921576A (zh) * | 2022-06-29 | 2022-08-19 | 湖南工程学院 | 一种检测牛结核分枝杆菌的试剂、试剂盒及检测方法 |
-
2022
- 2022-08-19 CN CN202210997542.5A patent/CN115786544B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102628085A (zh) * | 2012-04-24 | 2012-08-08 | 武汉大学 | 结核分枝杆菌利福平耐药突变可视化检测探针及其应用 |
| CN102827836A (zh) * | 2012-06-11 | 2012-12-19 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种寡核苷酸探针以及用其对靶分子进行检测的方法 |
| WO2018107129A1 (en) * | 2016-12-09 | 2018-06-14 | The Broad Institute, Inc. | Crispr effector system based diagnostics |
| US20180298445A1 (en) * | 2017-03-15 | 2018-10-18 | The Broad Institute, Inc. | Crispr effector system based diagnostics |
| CN113286884A (zh) * | 2018-08-07 | 2021-08-20 | 博德研究所 | 新型cas12b酶和系统 |
| WO2020124050A1 (en) * | 2018-12-13 | 2020-06-18 | The Broad Institute, Inc. | Tiled assays using crispr-cas based detection |
| CN112063691A (zh) * | 2020-09-18 | 2020-12-11 | 湖北医药学院 | 一种基于g4-血红素dna酶系统检测单链靶核酸序列的方法 |
| CN114032339A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-02-11 | 湖南工程学院 | 一种检测鼻咽癌的超支化杂交链式反应信号放大体系、试剂盒和检测方法 |
| CN114921576A (zh) * | 2022-06-29 | 2022-08-19 | 湖南工程学院 | 一种检测牛结核分枝杆菌的试剂、试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| S. CICERI 等: "Biocatalytic synthesis of two pharmacologically active compounds: (S)-pramipexole and its enantiomer, dexpramipexole", IRIS, pages 5805 - 5824 * |
| 宋禹昊等: "CRISPR/Cas 系统及其在结核分枝杆 菌研究中的应用", 畜牧兽医学报, vol. 51, no. 11, pages 2613 - 2621 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113897417A (zh) * | 2021-11-23 | 2022-01-07 | 湖南超亟检测技术有限责任公司 | 一组检测牛结核杆菌的探针、检测试剂盒和检测方法 |
| CN113897417B (zh) * | 2021-11-23 | 2023-09-29 | 湖南超亟检测技术有限责任公司 | 一组检测牛结核杆菌的探针、检测试剂盒和检测方法 |
| CN116732211A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-09-12 | 湖南工程学院 | 基于8-17脱氧核酶与CRISPR-Cas13a反式切割检测牛结核分枝杆菌的探针组及方法 |
| CN116732211B (zh) * | 2023-08-09 | 2023-10-27 | 湖南工程学院 | 基于8-17脱氧核酶与CRISPR-Cas13a反式切割检测牛结核分枝杆菌的探针组及方法 |
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