CN116516061A - 一种基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步快速检测方法，属于生物技术领域。CRISPR/Cas13a可以靶向RNA，通过合理设计crRNA，使Cas13a/crRNA特异性识别RNA，激活Cas13a的反式切割活性，导致引物发卡被Cas13a切割从而释放出引发链。随后，该引发链触发无酶催化发卡自组装放大反应，实现病毒RNA的超灵敏检测。本发明与常规核酸检测技术相比具有如下优点：(1)检测耗时短，整个反应在30分钟内即可完成；(2)直接进行一步法检测，无需分步进行，避免了反复开盖导致的气溶胶污染和假阳性结果；以上优点为核酸检测提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明属于医学生物技术领域，涉及一种基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步快速检测方法。
背景技术
病毒是一种严格的细胞寄生生物，只能依靠宿主进行增殖，具有非生命与生命两种不同的状态，能够感染所有的生命形式，如动物、植物、细菌、真菌及古生菌等。因此，发展高效、快速的检测方法是预防病毒性人类疾病和植物病害的主要手段。由于宿主不同，病毒的检测方法亦有所不同，但大致可分为以下两类，一类为免疫检测方法，一类为分子生物学方法。免疫学检测主要通过抗原与抗体的特异性反应，进而实现对病毒的鉴定。分子生物学方法是基于病毒核酸的分析方法，主要有聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、核酸依赖性扩增检测技术(NASBA)等一系列分子生物学分析方法。其中，PCR方法具有灵敏度高、可定量分析等优点，广泛应用于病毒的检测。
肠道病毒(enterovirus,EV)归属于微小核糖核酸病毒科的肠道病毒属。目前已经报道的EV有116种血清型，分属于15个组：EV-A至EV-L，以及鼻病毒A-C组。埃可病毒11型属于EV-B组肠道病毒，是最常见的肠道病毒之一，绝大多数重症或致死性肠道病毒感染均是由埃可病毒11型所致，特别是新生儿，因免疫系统尚未完善，可通过胎盘、产道感染或因家属、医护人员手部卫生不达标等原因导致交叉感染，容易引起病房内的暴发流行，造成严重后果。1977年至今，国外已报道多起新生儿病房内埃可病毒11型的暴发，死亡率高；国内目前多为散发病例，存在新生儿院内感染的隐患。目前临床常用的埃可病毒11型检测方法是利用聚合酶链式反应(PCR)扩增VP1区序列后进行测序鉴定，但该方法检测周期较长(约2～3天)、操作过程复杂、扩增过程还需要酶参与。
因此，开发一种快速、特异、灵敏的病毒RNA诊断技术刻不容缓。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步快速检测方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步快速检测方法，包括如下步骤：
(1)根据待检RNA的序列设计crRNA；设计发卡探针H1、发卡探针H2和引物发卡-12；
所述的发卡探针H1的寡核苷酸序列为：5’-ATTGGCACCCGCAATAGGATTAATAGCAGGATTGCGGGTGCCAAT-3’，其中5’端修饰有荧光染料，3’端修饰有猝灭基团；
所述的发卡探针H2的寡核苷酸序列为：5’-AGGATTAATAGCAGGATTGGCACCCGCAATCCTGCTATTAATCCTATTGCGGG-3’；
所述的引物发卡-12的寡核苷酸序列为5’-TAGCAGGATTGCGGrUrUrUrUrUATTGGCACCCGCAATCCTGCTA-3’。
(2)配制包含Cas13a、crRNA、引物发卡-12、待检样品、发卡探针H1、发卡探针H2和缓冲溶液的反应体系进行扩增反应。所述的缓冲溶液优选为50mM Tris-HCl。所述的反应的条件优选为25～45℃反应10～60分钟。
(3)在步骤(2)的反应液中加入水转入荧光比色皿中，或直接将反应液转入荧光比色皿中，设置激发波长为485nm，测量其在发射波长505～550nm范围的荧光光谱图。
(4)定性检测：如果荧光强度有增加则待检样品中含待检RNA。
定量检测：将荧光强度的增加值代入到定量检测待检RNA的工作曲线中，得到待检RNA的含量。所述的定量检测待检RNA的工作曲线为根据荧光强度的增加值与待检RNA浓度的对数的关系作出的线性曲线。
所述荧光强度的增加值为存在待检RNA时的荧光强度值减去无待检RNA时的荧光强度值。
在一些实施方案中，步骤(2)中的反应体系如下：1μL 500nM Cas13a、2.5μL 200nMcrRNA、1μL 2.5μM引物发卡-12，5μL待检RNA、2μL 5μM H1、4μL 10μM H2和34.5μL缓冲溶液。
在一些实施方案中，所述的病毒为埃可病毒11型时，crRNA的寡核苷酸序列可为：5’-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACUGCAUUUAUAUAUUGACACAACC-3’或5’-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACCAUAGUGAUCAACAGCUUCCAGC-3’。
上述检测方法为非疾病诊断的目的。
一种快速检测病毒RNA的试剂盒，包含Cas13a、crRNA、引物发卡-12、发卡探针H1、发卡探针H2。
本发明的原理：发卡探针H1的两端分别修饰了荧光染料FAM和猝灭剂BHQ1，该探针作为荧光信号分子。引物发卡-12在环上修饰5个尿嘧啶核苷酸(rU)，作为CRISPR/Cas13a的反式切割底物。当CRISPR/Cas13a与靶标RNA结合后，Cas13a蛋白被激活并转化为非特异性RNA内切酶，从而对引物发卡-12进行非特异性切割，从而释放出引发链。该引发链可以触发催化发卡自组装放大反应，即该引发链可以通过碱基互补配对打开发卡H1，形成引发链/H1复合物；引发链/H1复合物暴露出的碱基序列可以打开发卡H2，由于H1和H2之间互补配对的碱基更多，导致H2可以替代引发链，形成更加稳定的H1/H2复合物；而被替换下来的引发链又继续触发下一个循环的催化发卡自组装放大过程，从而引起信号的不断增强，实现RNA的超灵敏检测。
本发明与常规核酸检测技术相比具有如下优点：(1)检测耗时短，整个反应在30分钟内即可完成；(2)直接进行一步法检测，无需分步进行，避免了反复开盖导致的气溶胶污染和假阳性结果；(3)检测灵敏度高；以上优点为核酸检测提供了新的思路。
附图说明
图1是实施例1中定量检测VP1 RNA的工作曲线。
图2是实施例1中对临床样本的检测结果。
图3是实施例2中定量检测RdRP RNA的工作曲线。
图4是实施例2中对临床样本的检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
选取埃可病毒11型RNA基因组中的VP1区的部分序列作为靶标，其序列为5’-GGUUGUGUCAAUAUAUAAAUGCA-3’，根据该序列设计crRNA，具体寡核苷酸序列为5’-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACUGCAUUUAUAUAUUGACACAACC-3’。设计发卡探针H1、发卡探针H2、引物发卡-12，各寡核苷酸序列如下：
发卡探针H1：5’-ATTGGCACCCGCAATAGGATTAATAGCAGGATTGCGGGTGCCAAT-3’，其中5’端修饰有荧光染料FAM，3’端修饰有猝灭基团BHQ1；
发卡探针H2：5’-AGGATTAATAGCAGGATTGGCACCCGCAATCCTGCTATTAATCCTATTGCGGG-3’；
引物发卡-12：5’-TAGCAGGATTGCGGrUrUrUrUrUATTGGCACCCGCAATCCTGCTA-3’，其包含的5个尿嘧啶核苷酸(rU)，可以作为CRISPR/Cas13a的反式切割底物；引发链5’-ATTGGCACCCGCAATCCTGCTA-3’可以触发催化发卡自组装放大。
将合成的发卡探针H1和H2用离心机在4000rpm条件下离心30～60秒，再分别加入缓冲溶液使H1的终浓度为5μM，H2的终浓度为10μM。H1和H2溶液分别置于95℃水浴加热5分钟，然后置于室温下冷却1小时。使用离心机在4000rpm条件下，将合成的引物发卡-12和crRNA离心30～60秒，然后分别加入缓冲溶液使引物发卡-12的终浓度为2.5μM，crRNA的终浓度为200nM。引物发卡-12溶液置于76℃水浴加热5分钟，随后置于室温下冷却1小时。所述的缓冲溶液为50mM Tris-HCl(50mM NaCl，10mM MgCl2，pH＝8.0)。
一步法反应体系总体积为50μL，其中包含1μL 500nM Cas13a、2.5μL 200nMcrRNA、1μL 2.5μM引物发卡-12、5μL不同浓度的VP1 RNA、2μL 5μM H1、4μL 10μM H2和34.5μL缓冲溶液，该反应体系置于37℃鼓风干燥箱中反应30分钟。反应完毕后向该体系中加入50μL纯水，然后转移到微量荧光比色皿中，设置激发波长为485nm，测量该反应体系在520nm处的荧光强度值。根据荧光强度的增加值与VP1 RNA浓度的对数关系作出线性曲线。
图1为定量检测VP1 RNA的工作曲线。本方法用于埃可病毒11型RNA VP1区的定量检测，检测范围是500aM-5nM，检测限为152aM。整个反应可在30分钟内完成。
在进行实际样品检测时，先将唾液样本进行处理以使核糖核酸酶失活，具体过程为：向唾液样本中加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液，EDTA和TCEP的终浓度分别为1mM和100mM，然后将上述混合液转入水浴锅中50℃加热5分钟，随后转移到95℃加热5分钟。处理好的唾液样本溶液加入无酶的纯水稀释100倍，分别选取了三种不同浓度的VP1 RNA加入到处理好的唾液样品中，按照上述一步法反应进行操作，测量其荧光强度，然后将得到的荧光强度增加值代入工作曲线即可进行定量分析。结果如表1所示，回收率在78.0％-108.1％之间。
图2为本发明对临床样本的检测结果，埃可病毒11型RNA从临床样本中提取，使用本发明可以识别临床样本中的埃可病毒11型RNA阳性样本。
表1
实施例2
选取埃可病毒11型RNA基因组中RdRP区的部分序列作为靶标，其序列为5’-GCUGGAAGCUGUUGAUCACUAUG-3’，根据该序列设计crRNA，具体序列为5’-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACCAUAGUGAUCAACAGCUUCCAGC-3’。设计发卡探针H1、发卡探针H2、引物发卡-12，各寡核苷酸序列如下：
发卡探针H1：5’-ATTGGCACCCGCAATAGGATTAATAGCAGGATTGCGGGTGCCAAT-3’，其中5’端修饰有荧光染料FAM，3’端修饰有猝灭基团BHQ1；
发卡探针H2：5’-AGGATTAATAGCAGGATTGGCACCCGCAATCCTGCTATTAATCCTATTGCGGG-3’；
引物发卡-12：5’-TAGCAGGATTGCGGrUrUrUrUrUATTGGCACCCGCAATCCTGCTA-3’，其包含的5个尿嘧啶核苷酸(rU)，可以作为CRISPR/Cas13a的反式切割底物；引发链5’-ATTGGCACCCGCAATCCTGCTA-3’可以触发催化发卡自组装放大。
将合成的发卡探针H1和H2用离心机在4000rpm条件下离心30～60秒，再分别加入缓冲溶液使H1的终浓度为5μM，H2的终浓度为10μM。H1和H2溶液分别置于95℃水浴加热5分钟，然后置于室温下冷却1小时。使用离心机在4000rpm条件下，将合成的引物发卡-12和crRNA离心30～60秒，然后分别加入缓冲溶液使引物发卡-12的终浓度为2.5μM，crRNA的终浓度为200nM。引物发卡-12溶液置于76℃水浴加热5分钟，随后置于室温下冷却1小时。所述的缓冲溶液为50mM Tris-HCl(50mM NaCl，10mM MgCl2，pH＝8.0)。
一步法反应体系总体积为50μL，其中包含1μL 500nM Cas13a、2.5μL 200nMcrRNA、1μL 2.5μM引物发卡-12、5μL不同浓度的RdRP RNA、2μL 5μM H1、4μL 10μM H2和34.5μL缓冲溶液，该反应体系置于37℃鼓风干燥箱中反应30分钟。反应完毕后向该体系中加入50μL纯水，然后转移到微量荧光比色皿中，设置激发波长为485nm，测量该反应体系在520nm处的荧光强度值。根据荧光强度的增加值与RdRP RNA浓度的对数关系作出线性曲线。
图3为定量检测RdRP RNA的工作曲线。本方法用于埃可病毒11型RNA RdRP区的定量检测，检测范围是100aM-5nM，检测限为24aM。整个反应可在30分钟内完成。
在进行实际样品检测时，先将唾液样本进行处理以使核糖核酸酶失活，具体过程为：向唾液样本中加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液，EDTA和TCEP的终浓度分别为1mM和100mM，然后将上述混合液转入水浴锅中50℃加热5分钟，随后转移到95℃加热5分钟。处理好的唾液样本溶液加入无酶的纯水稀释100倍，分别选取了三种不同浓度的RdRP RNA加入到处理好的唾液样品中，按照上述一步法反应进行操作，测量其荧光强度，然后将得到的荧光强度增加值代入工作曲线即可进行定量分析。结果如表2所示，回收率在87.7％-116.1％之间。
图4为本发明对临床样本的检测结果，埃可病毒11型RNA从临床样本中提取，使用本发明可以识别临床样本中的埃可病毒11型RNA阳性样本。
表2
Claims (6)
1.一种基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)根据待检RNA的序列设计crRNA；
设计发卡探针H1、发卡探针H2和引物发卡-12；
所述的发卡探针H1的寡核苷酸序列为：5’-ATTGGCACCCGCAATAGGATTAATAGCAGGATTGCGGGTGCCAAT-3’，其中5’端修饰有荧光染料，3’端修饰有猝灭基团；
所述的发卡探针H2的寡核苷酸序列为：5’-AGGATTAATAGCAGGATTGGCACCCGCAATCCTGCTATTAATCCTATTGCGGG-3’；
所述的引物发卡-12的寡核苷酸序列为：5’-TAGCAGGATTGCGGrUrUrUrUrUATTGGCACCCGCAATCCTGCTA-3’；
(2)配制包含Cas13a、crRNA、引物发卡-12、待检样品、发卡探针H1、发卡探针H2和缓冲溶液的反应体系进行扩增反应；
(3)在步骤(2)的反应液中加入水转入荧光比色皿中，或直接将反应液转入荧光比色皿中，设置激发波长为485nm，测量其在发射波长505～550nm范围的荧光光谱图；
(4)定性检测：如果荧光强度有增加则待检样品中含待检RNA；
定量检测：将荧光强度的增加值代入到定量检测待检RNA的工作曲线中，得到待检RNA的含量；所述的定量检测待检RNA的工作曲线为根据荧光强度的增加值与待检RNA浓度的对数的关系作出的线性曲线；
所述荧光强度的增加值为存在待检RNA时的荧光强度值减去无待检RNA时的荧光强度值。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述的缓冲溶液为50mM Tris-HCl。
3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步检测方法，其特征在于：步骤(2)中的反应体系如下：1μL 500nM Cas13a、2.5μL 200nM crRNA、1μL2.5μM引物发卡-12，5μL待检RNA、2μL 5μM发卡探针H1、4μL 10μM发卡探针H2和34.5μL缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步检测方法，其特征在于：步骤(2)中反应的条件为25～45℃反应10～60分钟。
5.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步检测方法，其特征在于：所述的病毒为埃可病毒11型时，crRNA的寡核苷酸序列为：5’-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACUGCAUUUAUAUAUUGACACAACC-3’或5’-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACCAUAGUGAUCAACAGCUUCCAGC-3’。
6.一种检测病毒RNA的试剂盒，其特征在于：包含Cas13a、crRNA、引物发卡-12、发卡探针H1、发卡探针H2；
所述的发卡探针H1的寡核苷酸序列为：5’-ATTGGCACCCGCAATAGGATTAATAGCAGGATTGCGGGTGCCAAT-3’，其中5’端修饰有荧光染料，3’端修饰有猝灭基团；
所述的发卡探针H2的寡核苷酸序列为：5’-AGGATTAATAGCAGGATTGGCACCCGCAATCCTGCTATTAATCCTATTGCGGG-3’；
所述的引物发卡-12的寡核苷酸序列为5’-TAGCAGGATTGCGGrUrUrUrUrUATTGGCACCCGCAATCCTGCTA-3’。
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