CN110257484A - 一种核酸恒温荧光扩增检测方法及试剂盒 - Google Patents
一种核酸恒温荧光扩增检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110257484A CN110257484A CN201910568819.0A CN201910568819A CN110257484A CN 110257484 A CN110257484 A CN 110257484A CN 201910568819 A CN201910568819 A CN 201910568819A CN 110257484 A CN110257484 A CN 110257484A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- sample
- temperature
- constant
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 50
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 26
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108010014594 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 claims description 27
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 8
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 3
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 claims description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 abstract description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 4
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 4
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 4
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710116602 DNA-Binding protein G5P Proteins 0.000 description 2
- 101710162453 Replication factor A Proteins 0.000 description 2
- 101710176758 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit Proteins 0.000 description 2
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 description 2
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种核酸恒温荧光扩增检测方法及试剂盒，所述方法是在待测样本恒温扩增反应液中加入逆转录酶AMV、单链结合蛋白、解链酶、核酸外切酶和荧光探针，50‑60℃恒温下进行核酸扩增反应，以标准样本为阳性对照，检测扩增曲线的形状，若待测样本扩增曲线与标准样本一致，则待测样本含有所述标准样本；本发明的检测方法特异性好、灵敏度高；在恒温条件下，对目的核酸进行快速、实时及准确的检测，可应用于生物检测相关的诸多领域，例如传染病病原学检测、食品安全相关检测等。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用荧光探针结合核酸等温扩增技术。在恒温条件下，对目的核酸进行快速、实时及准确的检测，可应用于生物检测相关的诸多领域，例如传染病病原学检测、食品安全相关检测等。
背景技术
自1983年以来，KaryMullis的聚合酶链式反应(PolyChainReaction，PCR)技术，使分子生物学领域进行了一项突破性的革命。以PCR为代表的核酸扩增检测技术迅猛发展。经过几十年的发展，PCR技术凭借其敏感、特异、快速、简便以及易自动化等突出的优点，已被广泛应用于诸如分子生物学、医学、法学等生命科学的各个领域。由于PCR需要不断变化温度来实现核酸的扩增，始终无法摆脱依赖精良仪器设备的局限。
近年来多种机制的核酸等温扩增技术应运而生，也得到了迅猛的发展，而且有些技术已经完成了从实验室到实际应用，正在分子生物学、医学、法学等生命科学领域得到广泛应用，特别是在临床和现场快速诊断技术方面，等温核酸扩增技术显示了其突出的优越性。在PCR中，通过使用Taqman技术或Beacon技术，可以对PCR的整个扩增结果进行实时监测。基于等温核酸扩增技术的优势，若能在等温核酸扩增中引入荧光基团，对反应过程进行实时监测，将会使扩增的灵敏度和特异性大大增加，并且结果也会更加直观和快速，有利于此类等温核酸扩增技术更为广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种核酸恒温荧光扩增检测方法及试剂盒，克服目前荧光PCR对精密仪器的依赖较大，且反应时间长等问题。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种核酸恒温荧光扩增检测方法，所述方法是在待测样本恒温扩增反应液中加入逆转录酶AMV、单链结合蛋白、解链酶、核酸外切酶和荧光探针，50-60℃恒温下进行核酸扩增反应，以标准样本为阳性对照，检测扩增曲线的形状，若待测样本扩增曲线与标准样本一致，则待测样本含有所述标准样本；所述荧光探针长度为28-38nt。
进一步，荧光探针的荧光基团为FAM、HEX、VIC、JOE、Texas Red、Cy3、Cy5或TAMRA中的任意一种。
进一步，所述荧光探针的淬灭基团为BHQ1或BHQ2。
进一步，所述荧光探针为：5′-FAM-GCWGGCGARVACTGCCA-BHQ1-3′。
本发明还提供一种用于所述核酸恒温荧光扩增检测方法的试剂盒，所述试剂盒包括核酸恒温扩增体系、阳性对照和阴性对照；所述核酸恒温扩增体系组成：恒温扩增反应液、逆转录酶AMV、单链结合蛋白、解链酶、核酸外切酶、荧光探针、引物、待测模板、MgSO4，dNTPs溶液，Taq DNA聚合酶；所述阳性对照为待测模板的标准品；所述阴性对照为双蒸水。
进一步，所述恒温扩增体系组成为：待测模板3μl，两条引物各20pmol和1条荧光探针20pmol，1×恒温扩增反应液，MgSO4 7mmol，dNTPs溶液、各0.1mmol，Taq DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U、单链结合蛋白、解链酶8U、核酸外切酶8U和无菌双蒸水组成，总反应液体积为25μl；所述恒温扩增反应液组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。
进一步，所述待测模板为麻疹病毒RNA，引物为正向麻疹病毒引物和反向麻疹病毒引物；阳性对照为麻疹病毒核酸；
正向麻疹病毒引物为：5′-GGTTGGGACTAACCTTGARTCT-3′；
反向麻疹病毒引物为：5′-CGGAGGTGGATGGTGATGT-3′；
荧光探针的序列为：5′-FAM-GCWGGCGARVACTGCCA–BHQ1-3′。所述试剂盒检测方法为：将恒温扩增体系、阳性对照和阴性对照分别加入PCR管中，于便携式恒温荧光检测仪中(能识别FAM荧光)或常规的荧光PCR仪中，60℃恒温实时检测30分钟，当样本中含有麻疹病毒核酸时，检测曲线呈S型增长。
进一步，所述待测模板浓度为0.01-10TCID50/ml，更优选所述待测模板浓度为0.01TCID50/ml。
本发明核酸恒温荧光扩增检测方法，在恒温条件下，利用解旋酶解开DNA双链；同时单链DNA结合蛋白(SSB)稳定解开的单链为引物与荧光标记探针提供结合模板；引物探针结合目的核酸后，DNA聚合酶结合到引物的3’末端，进行子链的延生；核酸外切酶识别的荧光探针上的报告基团，酶切后使荧光基团和淬灭基团得以分离，释放荧光；通过检测扩增曲线的形状，和荧光信号的强弱，可对待测样本进行定性或定量检测。
本发明中所用一对引物，是两条寡核苷酸单链，特异性结合于目标区域的上下游，20-35核苷酸(nt)；扩增产物为单一条带，无非特异扩增；探针区域为两个引物区域之间，并靠近上游引物；上下游引物之间的距离100-150(nt)为最佳产物长度。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
(1)本发明所述核酸恒温荧光扩增方法的特异性好，灵敏度高，步骤简单，可重复性高；
(2)反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需0.5小时左右；
(3)整个扩增和检测过程中不需要打开反应管盖，减少了扩增产物污染的机会；整个反应过程不需要复杂的仪器，仅需一台小型恒温荧光检测仪，该仪器不需具备升降温功能。
附图说明
图1为本发明方法用于检测麻疹病毒核酸的特异性曲线。
图2为本发明试剂盒用于检测麻疹病毒灵敏度曲线，1-4依次为10TCID50/ml、1TCID50/ml、0.1TCID50/ml和0.01TCID50/ml。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1试剂组成与配制(以检测麻疹病毒为例)
a)RNA提取试剂：德国QIAGEN RNA提取试剂盒(Qia-74104)；
b)麻疹病毒核酸恒温荧光扩增反应液：模板3μl，两条引物(20pmol)和1条荧光探针(20pmol)，1×等温扩增反应Buffer，MgSO4(7mmol)，dNTPs溶液(各0.1mmol)，Taq DNA聚合酶(8U)，逆转录酶AMV(5U)、单链结合蛋白、解链酶(8U)、核酸外切酶(8U)和无菌双蒸水组成，总反应液体积为25μl；等温扩增反应Buffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。
正向麻疹病毒引物为：5′-GGTTGGGACTAACCTTGARTCT-3′；
反向麻疹病毒引物为：5′-CGGAGGTGGATGGTGATGT-3′；
荧光探针的序列为：5′-FAM-GCWGGCGARVACTGCCA–BHQ1-3′(SEQ ID NO.1)；
所有的引物和荧光探针均由上海生工生物有限公司合成。
c)阳性对照：麻疹病毒核酸；
d)阴性对照：无菌双蒸水。
实施例2麻疹病毒核酸的检测
a)取麻疹标本RNA作为模板，加入到装有麻疹病毒恒温荧光扩增反应液的PCR管中，其中标本RNA 3μl，反应液22μl，总体积25μl；阳性对照和阴性对照PCR管中分别加入阳性模板和阴性模板。
b)将PCR管放置到便携式恒温荧光检测仪中(能识别FAM荧光)或常规的荧光PCR仪中，60℃恒温实时检测30分钟。当样本中含有麻疹病毒核酸时，检测曲线呈S型增长。且对样本的检测仅仅需要0.5小时左右就能完成，大大缩短检测时间，结果见图1。
实施例3用本发明方法检测麻疹病毒的特异性
按照实施例2的方法检测登革热Ⅰ型核酸RNA、登革热Ⅱ型核酸RNA、登革热Ⅲ型核酸RNA、登革热Ⅳ型核酸RNA、黄热病病毒核酸RNA、乙型脑炎病毒核酸RNA。结果表明，用本发明试剂盒检测麻疹病毒核酸具有很强的特异性。
实施例4用本发明方法检测麻疹病毒核酸的灵敏度
对麻疹病毒感染力进行测定，分别稀释至浓度为10TCID50/ml、1TCID50/ml、0.1TCID50/ml和0.01TCID50/ml，采用实施例2中所述方法来确定本发明方法用于检测麻疹病毒核酸的灵敏度。结果如图2所示，图2中1-4分别表示10TCID50/ml、1TCID50/ml、0.1TCID50/ml和0.01TCID50/ml，可以发现该试剂盒可在每个反应体系中检出0.01TCID50/ml，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测麻疹病毒核酸的要求。
序列表
<110> 浙江省疾病预防控制中心
<120> 一种核酸恒温荧光扩增检测方法及试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 16
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
gcwggcgarv acgcca 16
<210> 2
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
ggttgggact aaccttgart ct 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
cggaggtgga tggtgatgt 19
Claims (10)
1.一种核酸恒温荧光扩增检测方法，其特征在于所述方法是在待测样本恒温扩增反应液中加入逆转录酶AMV、单链结合蛋白、解链酶、核酸外切酶和荧光探针，50-60℃恒温下进行核酸扩增反应，以标准样本为阳性对照，检测扩增曲线的形状，若待测样本扩增曲线与标准样本一致，则待测样本含有所述标准样本；所述荧光探针长度为28-38nt。
2.如权利要求1所述核酸恒温荧光扩增检测方法，其特征在于荧光探针的荧光基团为FAM、HEX、VIC、JOE、Texas Red、Cy3、Cy5或TAMRA中的任意一种。
3.如权利要求1所述核酸恒温荧光扩增检测方法，其特征在于所述荧光探针的淬灭基团为BHQ1或BHQ2。
4.如权利要求1所述核酸恒温荧光扩增检测方法，其特征在于所述荧光探针为：5′-FAM-GCWGGCGARVACTGCCA-BHQ1-3′。
5.一种用于权利要求1所述核酸恒温荧光扩增检测方法的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括核酸恒温扩增体系、阳性对照和阴性对照；所述恒温扩增体系组成：恒温扩增反应液、逆转录酶AMV、单链结合蛋白、解链酶、核酸外切酶、荧光探针、引物、待测模板、MgSO4，dNTPs溶液，Taq DNA聚合酶；所述阳性对照为待测模板的标准品；所述阴性对照为双蒸水。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述恒温扩增体系组成为：待测模板3μl，两条引物各20pmol和1条荧光探针20pmol，1×恒温扩增反应液，MgSO4 7mmol，dNTPs溶液、各0.1mmol，Taq DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U、单链结合蛋白、解链酶8U、核酸外切酶8U和无菌双蒸水组成，总反应液体积为25μl；所述恒温扩增反应液组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述待测模板为麻疹病毒RNA，引物为正向麻疹病毒引物和反向麻疹病毒引物；阳性对照为麻疹病毒核酸；
正向麻疹病毒引物为：5′-GGTTGGGACTAACCTTGARTCT-3′；
反向麻疹病毒引物为：5′-CGGAGGTGGATGGTGATGT-3′；
荧光探针的序列为：5′-FAM-GCWGGCGARVACTGCCA–BHQ1-3′。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒检测方法为：将恒温扩增体系、阳性对照和阴性对照分别加入PCR管中，于便携式恒温荧光检测仪中或常规的荧光PCR仪中，60℃恒温实时检测30分钟，当样本中含有麻疹病毒核酸时，检测曲线呈S型增长。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述待测模板浓度为0.01-10TCID50/ml。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于所述待测模板浓度为0.01TCID50/ml。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910568819.0A CN110257484A (zh) | 2019-06-27 | 2019-06-27 | 一种核酸恒温荧光扩增检测方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910568819.0A CN110257484A (zh) | 2019-06-27 | 2019-06-27 | 一种核酸恒温荧光扩增检测方法及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110257484A true CN110257484A (zh) | 2019-09-20 |
Family
ID=67922480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910568819.0A Pending CN110257484A (zh) | 2019-06-27 | 2019-06-27 | 一种核酸恒温荧光扩增检测方法及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110257484A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114540467A (zh) * | 2022-04-09 | 2022-05-27 | 南宁壮博生物科技有限公司 | 一种基于荧光检测的多酶恒温核酸快速扩增试剂及应用 |
| CN114686572A (zh) * | 2022-04-24 | 2022-07-01 | 南宁壮博生物科技有限公司 | 一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1688709A (zh) * | 2002-09-20 | 2005-10-26 | 新英格兰生物实验室公司 | 核酸的解旋酶依赖性扩增 |
| CN1904069A (zh) * | 2006-05-10 | 2007-01-31 | 浙江省疾病预防控制中心 | 一种麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法 |
| CN102912038A (zh) * | 2012-10-25 | 2013-02-06 | 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 | 一种检测禽流感病毒的rt-hda试剂盒及引物 |
| CN107130024A (zh) * | 2017-05-10 | 2017-09-05 | 山东师范大学 | 一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法 |
-
2019
- 2019-06-27 CN CN201910568819.0A patent/CN110257484A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1688709A (zh) * | 2002-09-20 | 2005-10-26 | 新英格兰生物实验室公司 | 核酸的解旋酶依赖性扩增 |
| CN1904069A (zh) * | 2006-05-10 | 2007-01-31 | 浙江省疾病预防控制中心 | 一种麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法 |
| CN102912038A (zh) * | 2012-10-25 | 2013-02-06 | 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 | 一种检测禽流感病毒的rt-hda试剂盒及引物 |
| CN107130024A (zh) * | 2017-05-10 | 2017-09-05 | 山东师范大学 | 一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JAMES GOLDMEYER等: "Development of a Novel One-Tube Isothermal Reverse Transcription Thermophilic Helicase-Dependent Amplification Platform for Rapid RNA Detection", 《JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》 * |
| YANHONG TONG等: "Development of isothermal TaqMan assays for detection of biothreat organisms", 《BIOTECHNIQUES》 * |
| 马丽敏等: "依赖解旋酶恒温扩增技术快速检测麻疹病毒核酸", 《中国疫苗和免疫》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114540467A (zh) * | 2022-04-09 | 2022-05-27 | 南宁壮博生物科技有限公司 | 一种基于荧光检测的多酶恒温核酸快速扩增试剂及应用 |
| CN114686572A (zh) * | 2022-04-24 | 2022-07-01 | 南宁壮博生物科技有限公司 | 一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shen et al. | Recent advances and perspectives of nucleic acid detection for coronavirus | |
| Parida | Rapid and real-time detection technologies for emerging viruses of biomedical importance | |
| US10036062B2 (en) | Primer middle sequence interference PCR technology | |
| CN105821138B (zh) | 一种基于连接反应构建双茎环结构dna模板检测核酸的方法 | |
| CN105087825B (zh) | 常温等温快速检测埃博拉病毒的方法、试剂及引物和探针 | |
| CN101638685A (zh) | 交叉引物扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用 | |
| EP2014774A1 (en) | Assay for the simulataneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample | |
| JP7477183B2 (ja) | 新規な等温単一反応用プローブセット及びその用途 | |
| US9845495B2 (en) | Method and kit for detecting target nucleic acid | |
| CN111334614A (zh) | 一种采用RT-qPCR技术检测新型冠状病毒的方法 | |
| Zhang et al. | Colorimetric detection of microRNA and RNase H activity in homogeneous solution with cationic polythiophene derivative | |
| CN113186341B (zh) | CRISPR介导的一步式恒温扩增检测SARS-CoV-2的方法 | |
| CN102643910B (zh) | 非对称多色荧光发夹探针链反应在病原菌检测中的应用 | |
| CN111778359B (zh) | 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的系统及其使用方法 | |
| CN111334611B (zh) | 一种基于双扩增技术检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的试剂盒及其应用 | |
| CN110257484A (zh) | 一种核酸恒温荧光扩增检测方法及试剂盒 | |
| Lu et al. | Rapid and highly specific detection of communicable pathogens using one-pot loop probe-mediated isothermal amplification (oLAMP) | |
| CN109097448A (zh) | 一种基于解旋酶和切刻酶的等温扩增核酸检测方法及试剂盒 | |
| Li et al. | Dual enzyme-assisted one-step isothermal real-time amplification assay for ultrasensitive detection of polynucleotide kinase activity | |
| CN111826467B (zh) | 用于快速检测新型冠状病毒核酸的组合物、试管装置和方法 | |
| CN112359143A (zh) | 一种基于y型探针组的等温指数扩增方法及其应用 | |
| CN109863252A (zh) | 用于检测或定量丙型肝炎病毒的组合物和方法 | |
| US20230090672A1 (en) | Rapid and sample-specific detection of viral pathogen for pooled testing in large-population screening | |
| CN107904284A (zh) | 编程式的核酸恒温扩增方法及其试剂盒应用 | |
| CN115029345A (zh) | 基于crispr的核酸检测试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190920 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |