CN111826467B - 用于快速检测新型冠状病毒核酸的组合物、试管装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开用了同时检测新型冠状病毒(SARS‑Cov‑2)核酸的组合物、试管反应装置和方法。本发明通过被检测核酸的两级特异识别和两级信号放大(恒温扩增和CRISPR‑荧光信号)，大大提升了新型冠状病毒检测的特异性、灵敏度和准确性，降低了假阴性的产生。另外，本发明的检出时间大大缩短(15‑30分钟)，且无需复杂的温度改变、精密的仪器设备和严格的实验室条件，可以在一个温度下完成，可以进行现场采样、现场诊断、现场读取结果，从而摆脱了对qPCR仪等精密仪器的依赖，弥补了恒温核酸扩增假阴性高的不足，具有较为广阔的临床和非临床应用前景。

Description

用于快速检测新型冠状病毒核酸的组合物、试管装置和方法
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，具体地涉及检测新型冠状病毒核酸的组合物、试管装置和方法。
背景技术
为了应对新型冠状病毒的传播，及时发现和鉴别病毒的存在和感染极其重要。目前已开发了多种核酸检测手段，例如，基于荧光PCR的方法、联合探针锚定聚合测序法、恒温扩增芯片法、恒温扩增+实时荧光法、杂交捕获免疫荧光法、双扩增法等。然而这些方法均需要特定设备和洁净的场所，并且检测时间较长(一般PCR法需要4小时)，不适于快速及时检测，特别是大量疑似患病人群的快速及时检测，以及公共场合物体表面、空气、水、食品等。目前中国国家食品药品监督管理总局尚未认证能够在1小时以内进行快速有效检测的其他产品。
目前CRISPR技术的发展和向诊断技术的研发，为即时检测(POCT)开辟了一个简单、快速、精准、无需特殊设备和成本低廉的方法。CRISPR核酸诊断技术特异性好、灵敏度高，每微升里仅10-100个病毒拷贝，就可以被检测出来，且步骤简单，只需三步，一小时内就可以完成检测(Feng Zhang et al.,2020)。基于CRISPR的核酸检查的基本步骤包括：1)核酸样本采集与核酸提取；2)足量的目的核酸扩增(信号放大)；3)信号检测与结果判定。虽然CRISPR方法简单、无需精密设备并能够大大缩短检测时间，但在新型冠状病毒检测方面尚未有较多创新性报道，或者需要的温度梯度、步骤、灵敏度、反应装置、反应时间等未得到优化，如MIT张峰团队应用的CRISPR/Cas13a系统，理论上，Cas13a的荧光报告基因片段为单链RNA,相对于DNA而言，RNA不稳定、易降解，会造成假阳性增多的现象。其次，单一片段的或者分开的多片段检测方法，检出率低，或者步骤重复、成本高，实际应用的灵敏度受限。同时，使用过程中各反应体系分别在独立反应管中进行，移液步骤越多，污染机会越多，操作越麻烦。
发明内容
针对现有核酸诊断技术(一代的PCR技术和二代的恒温扩增技术)的缺陷和不足，以及近年出现的CRISPR诊断技术中存在的技术问题，结合新冠病毒的生物学特点，本发明提供能够在短时间，例如15-60分钟内，快速、有效、操作简单的检测新型冠状病毒核酸的方案。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于快速检测新型冠状病毒核酸的组合物，其包含用于进行第一信号放大反应的第一组合物和用于进行第二信号放大反应的第二组合物，其中：
所述第一组合物包含用于扩增第一目的片段的引物、用于扩增第二目的片段的引物和用于扩增第三目的片段的引物；所述第二组合物包含靶向第一目的片段的crRNA、靶向第二目的片段的crRNA、靶向第三目的片段的crRNA和Cas剪切酶；所述第一目的片段为Corvid-19病毒ORF1ab基因的部分连续片段(O)，所述第二目的片段为Corvid-19病毒核壳蛋白基因的部分连接片段(N)，所述第三目的片段为Corvid-19病毒包膜蛋白基因的部分连接片段(E)。
根据本发明的用于快速检测新型冠状病毒核酸的组合物，优选地，所述第一组合物为用于等温扩增的组合物，其进一步包含逆转录酶、重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶。
根据本发明的用于快速检测新型冠状病毒核酸的组合物，优选地，进一步包含报告分子，所述报告分子包含单链脱氧核糖核酸ssDNA、连接至其一末端的荧光基团和连接至另一末端的淬灭基团或生物素。
本发明的第二方面，提供一种用于检测新型冠状病毒核酸的方法，其包括以下步骤：
(1)提供来源于生物样本的核酸提取液；
(2)在第一反应体系中于35-65℃下反应5-30分钟，从而进行目的核酸片段的扩增，即第一信号放大反应；
(3)使步骤(2)的反应产物在第二反应体系中于35-65℃下反应1-20分钟，从而进行新冠病毒特异核酸片段的再识别和DNA荧光报告信号的释放，即第二信号放大反应，本信号放大体系与Cas2a激活状态和荧光报告信号浓度有关，与新冠病毒的原始浓度无线性关系。
优选地，第一反应体系包含第一缓冲液，第二反应体系包含第二缓冲液，第一缓冲液与第二缓冲液具有相同的成分。还优选地，第一信号放大反应和第二信号放大反应分别进行，或第一信号放大反应和第二信号放大反应同时进行。同时进行优选是指两者在同一反应体系中进行，此时第一反应体系和第二反应体系。
根据本发明的用于检测新型冠状病毒核酸的方法，优选地，所述第一组合物包含序列如SEQ ID No.1-47所示的寡核苷酸，和/或所述第二组合物包含序列如SEQ ID No.48-62所示的crRNA。
本发明的第三方面，提供一种用于快速检测新型冠状病毒核酸的试管装置，其包括用于容纳第一组合物的第一空腔和用于容纳第二组合物的第二空腔，所述第一空腔具有与第二空腔相对隔离的第一状态或与第二空腔连通从而使第一空腔中的至少部分液体流至第二空腔的第二状态。
根据本发明的用于快速检测新型冠状病毒核酸的试管装置，其中，所述第一空腔由内管组成，所述第二空腔由外管组成，所述内管的侧方管壁具有第一密封部，所述第一密封部设置贯通厚度方向的通孔，所述外管的内壁设置向空腔突起的第二密封部，在第一状态时，所述第一密封部与所述第二密封部紧密结合，从而使通孔密封，在第二状态时，所述第一密封部与所述第二密封部分离，从而使内管与外管通过所述通孔而连通。优选地，内管进一步包含第一缓冲液，外管进一步包含第二缓冲液。
根据本发明所述的用于快速检测新型冠状病毒核酸的试管装置，优选地，所述内管侧壁外侧的上部设置突起的第一限位档和第二限位档，所述外管的内壁设置第一限位槽和第二限位槽；所述第一限位档与所述第一限位槽配合用于指示所述试管装置处于第一状态，所述第二限位档与所述第二限位槽配合用于指示所述试管装置处于第二状态。
根据本发明所述的用于快速检测新型冠状病毒核酸的试管装置，优选地，所述第一空腔内预装干粉状的第一组合物，和/或所述第二空腔内预装干粉状的第二组合物。
根据本发明所述的用于快速检测新型冠状病毒核酸的试管装置，优选地，所这第二空腔内预装第二组合物的溶液。
本发明的检测方法通过两级信号放大，不仅大大提升了新型冠状病毒检测的灵敏度和准确性，降低了假阴性的产生，而且还大大缩短了检测时间，例如能够在1小时，优选40分钟，更优选30分钟，甚至20分钟内进行有效检测。另外，本发明无需复杂的温度改变，在常温或者35-65℃范围内的某一温度下亦可完成，优选55℃，从而摆脱了对qPCR仪等精密仪器的依赖，具有较为广阔的应用前景。可提高检测的灵敏度和特异性、缩短检测时间、简化检测程序、降低检测费用。
附图说明
图1示例性示出了一种具有套管结构的试管装置。
图2示例性示出了一种套管密封结构的剖面及不同使用状态的图。
图3示例性示出了另一种套管密封结构的横截面及不同使用状态的图。
图4本发明的检测方法与单独针对一个目的片段进行检测的结果比较。
图5为不同Cas12a浓度时本发明检测方法的荧光曲线图。
附图标记说明：
1-试管装置、10-内管、20-外管、12-通孔、11-第一密封部、21-第二密封部
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本发明的术语“新型冠状病毒”是指引发新型冠状病毒肺炎Corvid-19的病原体，本文也称作“Corvid-19病毒”、“2019-nCoV”或“SARS-CoV-2”。
[用于快速检测新型冠状病毒核酸的组合物]
本发明的第一方面，提供一种用于快速检测新型冠状病毒核酸的组合物，其包含用于进行第一信号放大反应的第一组合物和用于进行第二信号放大反应的第二组合物。本发明通过两种组合物实现两级信号放大，在实现快速检测的同时大大提升检测灵敏度，降低阴性检测结果。
第一组合物
本发明的第一组合物用于核酸的等温扩增，从而以指数增长方式实现第一信号放大。第一组合物需包含扩增引物和可选的必要成分，例如蛋白酶、缓冲液等。
发明人发现目前新型冠状病毒核酸检测试剂盒出现漏检(即假阴性)原因之一，是核酸检查系统中只含有一个特定靶序列片段的探针或者扩增引物，造成检出率低。为提高检出效率，本发明设计第一组合物用于扩增病毒特定、保守的基因组序列的三个不同的目的片段。优选地，三个目的片段中至少一个目的片段位于新型冠状病毒基因组的N端，至少一个目的片段位于新型冠状病毒基因组的C端。更优选地，第一目的片段为SARS-CoV-2的ORF1ab基因的部分连续片段(简称O)。第二目的片段为Corvid-19病毒核壳蛋白基因的部分连接片段(简称E)。第三目的片段为Corvid-19病毒包膜蛋白基因的部分连接片段(简称N)。与一般扩增片段不同，本发明的目的片段为保守区中更不宜变异区，并且三种目的片段的序列中需要包含TTTG基序。优选地，TTTG基序位于目的片段的5’端侧。优选地，在O、E、N三段区域中，从不同的靶序列中分别优选出一个反应效果最好者，作为产品的最好组合成分。此外，在选择目的片段时还需考虑病毒的特异性，避免其他冠状病毒的干扰。
在某些实施方案中，本发明的第一组合物中的引物序列如SEQ ID No.1-47所示。在某些实施方案中，本发明的第一组合物中的引物序列如SEQ ID No.63-68所示。
为了实现扩增，本发明的第一组合物还可包含必要的蛋白酶或缓冲液(第一缓冲液)。必要的酶和缓冲液(第一缓冲液)可以与引物作为混合物一起提供，也可单独提供酶或缓冲液(第一缓冲液)。本发明的酶为逆转录酶、重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶中的一种或多种。DNA聚合酶的实例包括但不限于Bst 2.0DNA聚合酶等。本发明的缓冲液(第一缓冲液)一般包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween-20、Trion X-100和dNTPs中的一种或多种。在示例性实施方案中，本发明的缓冲液(第一缓冲液)组成如下Tris-HCl 20mM(pH8.8)、MgSO4 6mM、Trion X-100 0.1％和dNTPs 0.2μM。
第二组合物
本发明的第二组合物用于实现第二信号放大反应，为此本发明的第二组合物包含crRNA和Cas12a剪切酶。需要说明的是，本发明的第二组合物不包含tracrRNA。在适宜条件下，第二组合物中的crRNA和Cas12a剪切酶形成复合物，并通过crRNA引导至靶标，从而激发针对靶标的切割，同时引发非特异性的针对单链报告分子的切割。
本发明的crRNA具有特定结构。具体地，crRNA序列中需包含UUUC序列，优选UUUCUACUCUU，序列，更优选UAAUUUCUACUCUUG UAGAU。本发明的第二组合物中crRNA的种类为三种，分别对应于第一目的片段、第二目的片段和第三目的片段。作为对应于第一目的片段的crRNA的序列优选为SEQ ID No.48、51、54所示的序列。作为对应于第二目的片段的crRNA的序列优选为SEQ ID No.49、52、55所示的序列。作为对应于第三目的片段的crRNA的序列优选为SEQ ID No.50、53、56所示的序列。本发明第二组合物中可选择组合第一目的片段、第二目的片段和第三目的片段。
本发明的第二组合物中剪切酶优选为Cas12a，其含量不特别限定，只要能够使由第二组合物得到的第二反应体系中Cas12a的浓度在40-110nM，优选50-100nM即可。
为了检测放大后的信号，本申请的组合物还可进一步包含报告分子。本发明的报告分子由单链脱氧核糖核酸ssDNA、连接至其一末端的荧光基团和连接至另一末端的淬灭基团或生物素组成。其中，ssDNA的序列虽然不特别限定，但需要具有特异性，即不能与样本中的核酸序列，特别是目标序列结合。ssDNA的长度不特别限定，只要能够使荧光基团与淬灭基团之间保持足以淬灭荧光的距离即可。为实现此目的，ssDNA一般为5-15个碱基，优选5-10个碱基。ssDNA变长，容易引起较高的背景噪音。另一方面，如果ssDNA长度变短，检测灵敏度变低。为了实现信号检测，报告分子的一端连接荧光基团，而另一端连接淬灭基团。当反应未发生时，报告分子以完整形式存在，荧光基团的能够通过FRET或荧光共振能量转移至淬灭基团，从而不能发光。而当报告分子被切割而使荧光基团和淬灭基团分离时，可恢复由荧光基团产生的可检测荧光。
本发明中，荧光基团和淬灭基团在本领域内是已知的。荧光基团及与其对应的淬灭基团之间通过FRET或荧光共振能量转移而使产生荧光的波被吸收。作为荧光基团的实例包括但不限于基于荧光素的荧光团，例如FAM(6-羧基荧光素)、TET(四氯荧光素)、HEX(六氯荧光素)；基于罗丹明的荧光团，例如ROX(6-羧基-X-罗丹明)和TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)；Cy染料家族，尤其是Cy3和Cy5。作为淬灭基团的实例包括但不限于DABCYL、TAMRA和Black Hole QuenchersTM(BHQ)。优选地，本发明的荧光基团和淬灭基团为FAM和BHQ。
需要说明的是，本发明的报告分子虽然用于指示第二信号放大反应，但是该报告分子并非必然包含于第二组合物中。实际上，报告分子完全可以单独存在，甚至完全可以包含于第一组合物中，只要能够在检测时使报告分子与crRNA\Cas12a复合体接触即可。
[用于快速检测新型冠状病毒核酸的方法]
本发明的第二方面，提供用于快速检测新型冠状病毒核酸的方法。本发明的方法至少包括第一信号放大反应和第二信号放大反应。通过两级放大而大大提升检测灵敏度，降低阴性检测结果。另外，虽然为两级反应，但是并未使检测时间整体变长，反而是大大缩短了检测时间。
第一信号放大反应
本发明的第一信号放大反应为等温扩增反应，通过该反应使待检测物以指数方式增加。第一信号放大反应通常在35-65℃下反应5-30分钟，优选5-20分钟，更优选8-15分钟。反应温度和时间通常根据反应酶的性质而变化，但无论温度高低，第一信号放大反应均不需要温度变化的变性步骤。
在某些实施方案中，为了方便在例如家庭或野外实施本发明，可控制反应温度为35-42℃，优选35-37℃。为此目的，第一信号放大反应的反应体系(第一反应体系)中可包含重组酶(如T4 uvsX、E.coli recA等)、单链结合蛋白(如T4 gp32等)和链置换DNA聚合酶等。
在某些实施方案中，为了方便使用，本发明的反应体系通过将待检测物和第一组合物加入基础混合物而构建。其中，基础混合物中含有反应所需的全部酶和试剂。优选地，基础混合物为无镁离子混合物，在反应前加入例如醋酸镁(MgOAc)至混合物体系中启动反应。
在某些实施方案中，本发明的第一反应体系中包含缓冲液，其包含Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Tween-20。反应体系的体积例如为30μL，包括如下体积的试剂：反应缓冲液20μL、引物各0.05μL、BSst DNA聚合酶1μL、余量为双蒸水。此时，第一信号放大反应的条件包括55-65℃，例如60℃、62℃和64℃反应时间和10-30分钟的反应时间。优选地，55-60℃反应温度和15-25分钟的反应时间。
在某些实施方案中，本发明的第一反应体系进一步包含逆转录酶。更优选地，第一反应体系包含报告分子。
第二信号放大反应
本发明的第二信号放大反应为酶促级联反应，通过该反应使待检测物的信号进一步放大。第二信号放大反应通常在35-65℃下反应1-20分钟。反应温度和时间通常根据反应酶的性质而变化。优选地，第二信号放大反应温度为50-60℃，反应时间为1-10分钟，例如1-6分钟。在第二信号放大反应中，报告分子的浓度一般控制为45nM-100nM，优选50nM-100nM，更优选50nM-80nM。
在某些实施方案中，本发明通过优化第一信号放大反应和第二信号放大反应，从而控制整体反应温度在较低水平和缩短的反应时间下有利地进行，而不影响检测的灵敏度。虽然在此优化条件下，对于第一信号反应和/或第二信号反应单独而言并不是最优的条件，但作为检测方法整体而言能够在例如家庭环境中进行，并且同时保证了检测的灵敏度。优选地，通过优化反应条件可使第一信号反应和第二信号反应在相同的温度，例如37-40℃或50-65℃例如，60、62、64℃下进行。
在某些实施方案中，本发明通过优化第一信号放大反应和第二信号放大反应的缓冲液组成，使例如第一信号放大反应的缓冲液成分对第二信号放大反应不产生实质性影响，由此可以将第一信号放大反应后的反应产物，直接加入至第二信号放大反应体系。发明人发现当第一反应体系的缓冲液包含Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Tween-20时，可实现上述效果。
本发明的检测方法优选进一步包括信号检测步骤。信号检测步骤的实例包括但不限于通过使用酶标仪读取荧光数值，或者层流试纸条来显示，此时的荧光报告分子的一端为生物素(Biotin)，另一端为荧光分子。这些检测手段在本领域内是已知的。为了提高使用的便捷性，可使用层流试纸条作为信号显示手段。
[用于快速检测新型冠状病毒核酸的试管装置]
本发明的第三方面，提供用于快速检测新型冠状病毒核酸的试管装置。本发明的试管装置是为快速、简便检测新型冠状病毒的专用装置。
本发明的试管装置一般包括用于容纳第一组合物的第一空腔和用于容纳第二组合物的第二空腔。第一空腔具有与第二空腔相对隔离的第一状态和与第二空腔连通从而使第一空腔中的至少部分液体流至第二空腔的第二状态。
本发明中，第一空腔和第二空腔为相对独立且能够容纳本发明的组合物的空间，对此不特别限定。在示例性实施方案中，第一空腔和第二空腔分别由不同的试管构成。例如，第一空腔由内管组成，第二空腔由外管组成，或者第一空腔由外管组成，第二空腔由内管组成，由此使本发明的试管装置表现为套管结构。
图1示例性示出了一种具有套管结构的试管装置。如图1所示，试管装置1包括内管10和外管20。在内管10的侧方管壁的上部设置贯通厚度方向的通孔12，设置通孔12的管壁的外侧用作第一密封部11。在外管20的内壁设置向空腔突起的第二密封部21。通孔12的数量不限定可根据需要而设置1个、2个、3个、4个或更多个等。
图2示例性示出了一种套管密封结构的剖面及不同使用状态的图。如图2所示，通过内管10和外管20的相对上下移动来实现不同使用状态。具体地，内管10的上部管壁的外侧用作第一密封部11，第二密封部21为设置于外管20内部上方沿整个管壁的环形突起结构，从而使外管20的上部内径小于与其临接的下方的内径，但外管20的上部内径略大于内管10的外径，从而能够使内管10插入并贴合于外管20的内壁。将内管10插入外管20内向下移动至第一位置时，第一密封部11与第二密封部21紧密贴合，由此使设置于第一密封部11的通孔12由于内管10和外管20侧壁的贴合而密封。此时，试管装置处理于第一状态。当进一步下移内管10至第二位置时，第一密封部11经过第二密封部21而移动至其下方，此时由于外管20的内径变大，从而使通孔12与外管20的内腔连通，由此使内管10内的液体流至外管20。
图3示例性示出了另一种套管密封结构的横截面及不同使用状态的图。如图3所示，外管20的上部管壁内侧同一水平方向设置3个突起21，突起21独立存在，未连接成环状，并且当内管10插入外管20内时，通过突起21固定内管10，调整内管10的位置可使通孔12与突起21接触，由此密封内管10。这种情况为第一状态。当内管10和外管20相对旋转一定角度后，通孔12与突起21错开，从而使通孔12与外管20的内腔连通，此状态为第二状态。
上述试管装置仅为示例性方案，本领域技术人员在此基础上可进行改造或完善，从而更有便于使用。例如，在内管10的管壁外侧上部设置突起的第一限位档和第二限位档。外管20的内壁设置相应的第一限位槽和第二限位槽。第一限位档与第一限位槽配合时指示试管装置处于第一状态。第二限位档与第二限位槽配合时指示试管装置处于第二状态。再例如，通过改变通孔的位置(或高度)可控制由内管10流出至外管20内部的液体体积。优选地，在内管10的侧壁外侧设置指示液体流入量的刻度等。
本发明的试管装置中，一般而言，内管10用于容纳第一组合物或包含第一组合物的反应体系，外管20用于容纳第二组合物或包含第一组合物的反应体系。在不影响本发明目的实现的情况下，本领域技术人员也可将内管10用于容纳第二组合物或包含第二组合物的反应体系，将外管30用于容纳第一组合物或包含第一组合物的反应体系。
为了提高使用的便捷性，还可在内管10和/或外管20内预装规定量的第一组合物或第二组合物或包含它们的反应体系。预装的第一组合物或第二组合物可以是干燥粉末状态也可以是溶液状态。
实施例
一、核酸提取
利用试剂盒由病毒提取核酸。
二、核酸扩增
按顺序将以下组分添加至反应管中，其中1X Isothermal Amplification Buffer包含20mM Tris-HCl(pH8.8@25℃)、50mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM硫酸镁、0.1％Tween-20。
震荡混匀后，放在65℃金属浴内反应15min。
三、酶促反应
按顺序将以下组分添加至反应管中，Sample为上一步骤的产物，其中1X BindingBuffer含20mM Tris-HCl，pH7.5，100mM KCl，5mM氯化镁，1Mm DTT,5％glycerol，50μml- 1heparin。
Component Final Conc.
nuclease-free water 14μl
10×binding buffer 1× 2μl
2.5μM crRNA NT3 250nM 0.5μl
2.5μM crRNA ET1 250nM 0.5μl
2.5μM crRNA OT2 250nM 0.5μl
2μM Cas12a 200nM 0.5μl
10μM ssDNA FQ reporter substrate 500nM 1μl
Sample 1μl
Total Reaction Volume 20μl
震荡混匀后，放在50℃金属浴内反应10min，放入机器读数，荧光激发波长λex＝485nm，荧光发射波长λem＝535nm。荧光值超过6000视为阳性。
实施例2
本实施例为采用三个目的片段的组合进行检测与单独针对一个目的片段进行检测的结果比较。如图4所示，当只检测一个目的片段时，不能在5分钟内达到检测要求。即使增大报告分子FQ的浓度至500nM也不能在5分钟内使荧光值超过6000。而在组合三种目的片段时，在50nM浓度下就可以在5分钟达到6000荧光值。
另外，图5示出不同Cas12a浓度时同时检测三个靶标的荧光曲线图。如图5所示，与一般理解不同的是，当Cas12a浓度为50nM和100nM时，两者的荧光曲线几乎重叠，而随着浓度变大，荧光曲线变平缓，达到相同荧光强度所需的时间变长。该结果出乎本领域技术人员的预料。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
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Claims (3)

1.一种用于快速检测新型冠状病毒核酸的试管装置，其特征在于，包括第一空腔、第二空腔、第一组合物、第二组合物，所述第一空腔容纳有第一组合物，所述第二空腔容纳有第二组合物，所述第一空腔具有与第二空腔相对隔离的第一状态或与第二空腔连通从而使第一空腔中的至少部分液体流至第二空腔的第二状态；
所述第一组合物包含序列分别如SEQ ID No.1-15、17-21、23-33、35-39、42-46所示的引物及用于RT-LAMP的酶和第一缓冲液，所述第二组合物包含序列分别为SEQ ID NO:49、51和56的crRNA、浓度为50-100nM的剪切酶Cas12a和第二缓冲液；
其中，所述第一缓冲液由在25℃时pH为8.8的20mM Tris-HCl、50mM KCl、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4和0.1% Tween-20组成，所述用于RT-LAMP的酶为Bst 2.0或Bst 2.0热启动DNA聚合酶以及热启动RTx逆转录酶，引物中FIP/BIP引物为40μM，F3/B3引物为5μM，Loop F/B引物为10μM；
所述第二缓冲液由20mM pH为7.5的Tris-HCl、100mM KCl、5mM氯化镁、1mM DTT、5%甘油、50μml-1肝素组成，SEQ ID NO:49、51和56的crRNA各自分别为2.5μM；
所述第一空腔由内管组成，所述第二空腔由外管组成，由此使所述试管装置为套管结构，所述内管的侧方管壁具有第一密封部，所述第一密封部设置贯通厚度方向的通孔，所述外管的内壁设置向空腔突起的第二密封部，在第一状态时，所述第一密封部与所述第二密封部紧密结合，从而使通孔密封，在第二状态时，所述第一密封部与所述第二密封部分离，从而使内管与外管通过所述通孔而连通；
所述内管的上部管壁的外侧用作第一密封部，第二密封部为设置于外管内部上方沿整个管壁的环形突起结构，从而使外管的上部内径小于与其临接的下方的内径，但外管的上部内径略大于内管的外径，从而能够使内管插入并贴合于外管的内壁，当将内管插入外管内向下移动至第一位置时，第一密封部与第二密封部紧密贴合，由此使设置于第一密封部的通孔由于内管和外管侧壁的贴合而密封，此时试管装置处于第一状态；当进一步下移内管至第二位置时，第一密封部经过第二密封部而移动至其下方，此时由于外管的内径变大，从而使通孔与外管的内腔连通，由此使内管内的液体流至外管，此时试管装置处于第二状态；或者
外管的上部管壁内侧同一水平方向设置3个突起，突起独立存在，未连接成环状，并且当内管插入外管内时，通过突起固定内管，调整内管的位置使通孔与突起接触，由此密封内管，此时试管装置处于第一状态，当内管和外管相对旋转一定角度后，通孔与突起错开，从而使通孔与外管的内腔连通，此时试管装置处于第二状态。
2.根据权利要求1所述的用于快速检测新型冠状病毒核酸的试管装置，其特征在于，进一步包含报告分子，所述报告分子包含单链脱氧核糖核酸ssDNA、连接至其一末端的荧光基团和连接至另一末端的淬灭基团或生物素。
3.一种用于检测新型冠状病毒核酸的非诊断方法，其特征在于，使用权利要求1或2所述的试管装置进行检测，并包括以下步骤：
(1) 提供来源于生物样本的核酸提取液；
(2) 在第一反应体系中于35-65℃下反应5-30分钟，从而进行第一信号放大；
(3) 使步骤(2)的反应产物在第二反应体系中于35-65℃下反应1-20分钟，从而进行第二信号放大反应；
其中，所述第一反应体系包含权利要求1所述的第一组合物，所述第二反应体系包含权利要求1所述的第二组合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20240002956A1 (en) * 2020-11-18 2024-01-04 University Of Connecticut SENSITIVE QUANTITATIVE DETECTION OF SARS-CoV-2 USING DIGITAL WARM-START CRISPR ASSAY
CN112980844A (zh) * 2021-03-19 2021-06-18 华南师范大学 针对有转录活性的SARS-CoV-2的检测试剂盒和使用方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103890163A (zh) * 2011-06-19 2014-06-25 阿博根公司 用于样品采集的装置、溶液和方法
WO2020028729A1 (en) * 2018-08-01 2020-02-06 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease compositions and methods of use thereof
CN110894530A (zh) * 2019-12-25 2020-03-20 武汉博杰生物医学科技有限公司 结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法
CN110904239A (zh) * 2019-12-25 2020-03-24 武汉博杰生物医学科技有限公司 肺癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103890163A (zh) * 2011-06-19 2014-06-25 阿博根公司 用于样品采集的装置、溶液和方法
WO2020028729A1 (en) * 2018-08-01 2020-02-06 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease compositions and methods of use thereof
CN110894530A (zh) * 2019-12-25 2020-03-20 武汉博杰生物医学科技有限公司 结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法
CN110904239A (zh) * 2019-12-25 2020-03-24 武汉博杰生物医学科技有限公司 肺癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
2019新型冠状病毒核酸检测的研究状况与应用探讨;王旭东等;临床检验杂志;第38卷(第2期);第82页 *
CRISPR/Cas基因编辑系统研究进展;韦涛等;生命的化学;第39卷(第1期);第39-45页 *
CRISPR/Cas系统在抗病毒研究中的应用;于楠楠等;中国生物化学与分子生物学报;第35卷(第4期);第393-398页 *

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