CN111778359B - 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的系统及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及了一种用于检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的系统及其使用方法。一种用于检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的系统包括mRT‑LAMP单元和检测单元，所述mRT‑LAMP单元包括第一引物组合和第二引物组合。本系统可实现对SARS‑CoV‑2的RdRp和N两个基因的同时检测；所述检测单元用于检测多重逆转录环介导等温扩增后的RdRp基因和N基因产物。本系统具有耗时短、操作简单和检测灵敏度高等优点。本方案可应用于新冠病毒的检测的实践操作中，用以缩短检测时间，增加检测的准确度，具有较高的应用价值。

Description

一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的系统及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及了一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的系统及其使用方法。

背景技术

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是一种RNA病毒，也是造成呼吸系统疾病COVID-2019全球大流行的病原体，COVID-2019也被世界卫生组织划分为国际公共卫生紧急事件。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。SARS-CoV-2传染性强，潜伏期较长，已经成为世界公共卫生的一大威胁，需要采取各种手段控制COVID-2019的流行。在疫苗、特异性药物还未开发形成的情况下，开发一种可靠、简单和快速的新冠病毒检测系统，对及时发现病毒流行情况和控制疾病流行具有非常大的意义。

目前，对于SARS-CoV-2的检测主要依赖于实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）。然而这些方法均依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，所需探针的合成的成本高，耗时较长，还需要熟练的操作人员。对于一些落后的实验室或在一些偏远地区无法进行以RT-PCR为基础的诊断， RT-PCR不适合于快速检测和应急检测。

发明内容

本发明的目的在于一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的系统及其使用方法，本系统可实现对SARS-CoV-2的RdRp和N两个基因的同时检测，以防止出现假阳性或假阴性检测结果），本系统用以解决现有的检测方法耗时长、操作复杂和检测灵敏度低等技术问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于检测新型冠状病毒的SARS-CoV-2的系统 ，其特征在于：包括mRT-LAMP单元，所述mRT-LAMP单元包括第一引物组合和第二引物组合；

第一引物组合包括第一外引物对、第一内引物对和第一介环引物对；

第一外引物对中的正向引物的序列为：5ʹ-CACCTTATGGGTTGGGAT-3ʹ；

第一外引物对中的反向引物的序列为：5ʹ-AACATATAGTGAACCGCCA-3ʹ；

第一内引物对中的正向引物的序列为：

5ʹ-GCAAGAACAAGTGAGGCCATAATCCTAAATGTGATAGAGCCA-3ʹ；

第一内引物对中的反向引物的序列为：

5ʹ-ACATACAACGTGTTGTAGCTTGTCCACATGACCATTTCACTCAA-3ʹ；

第一介环引物对中的正向引物的序列为：5ʹ-ATTCTAAGCATGTTAGGCA-3ʹ；

第一介环引物对中的反向引物的序列为：5ʹ-ATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGT-3ʹ；

第二引物组合包括第二外引物对、第二内引物对和第二介环引物对；

第二外引物对中的正向引物的序列为：5ʹ-TGGCTACTACCGAAGAGCT-3ʹ；

第二外引物对中的反向引物的序列为：5ʹ-TGCAGCATTGTTAGCAGGAT-3ʹ；

第二内引物对中的正向引物的序列为：

5ʹ-TCTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTCCAGACGAATTCGTGGTGG-3ʹ；

第二内引物对中的反向引物的序列为：

5ʹ-AGACGGCATCATATGGGTTGCACGGGTGCCAATGTGATCT-3ʹ；

第二介环引物对中的正向引物的序列为：

5ʹ-Biotin-AAATACCATCTTGGACTGAGATC-3ʹ；

第二介环引物对中的反向引物的序列为：5ʹ-AGGGAGCCTTGAATACACCAA-3ʹ；

其中，第一介环引物对中的正向引物以及第二介环引物对中的正向引物的5’端均修饰有第一标记分子；第一内引物对中的正向引物的5’端修饰有第二标记分子；第二内引物对中的正向引物的5’端修饰有第三标记分子。

采用上述技术方案，技术原理为：mRT-LAMP单元先对样本中的病毒进行逆转录形成cDNA，然后第一引物组合和第二引物组合对RdRp基因和N基因进行LAMP扩增，扩大目的片段的拷贝数，然后再通过三种标记分子实现对目的基因的检测，从而推断样本中是否具有目的病原体。同时检测两个基因的目的在于防止检测结果出现假阳性或者假阴性，如检测结果为只有一个基因呈阳性，则需要对样本进行重新检测，如果重复检测都只有一个基因呈阳性，则判定该样本为SARS-CoV-2阴性。本方案的设计要点在于引物所扩增的片段的选择，RdRp基因和N基因上用于检测的片段的序列需要区别于其他病原菌的基因序列（不能够形成互补结合），这两个基因上用于检测的片段需要适合于LAMP扩增。也并不是在RdRp基因和N基因上的特有的片段上都能找到可以用于LAMP扩增的片段。其中，RdRp基因和N基因上的特有的片段是指不与或不易与其他病原菌的基因互补结合的片段，又称特异性片段。而在本发明人的研究过程中，发现了RdRp基因上有一些的特异性片段，N基因上也有一些特异性片段。发明人针对上述特异性片段进行LAMP引物设计，并通过大量实验验证扩增效果，结果发现：只有针对RdRp基因上的一段特异性片段才能成功地进行LAMP扩增（我们将这一段称为RdRp基因检测靶片段），并设计本方案的第一引物组合，才能实现对RdRp基因的检测；只有针对N基因上的一段特异性片段才能成功地进行LAMP扩增（我们将这一段称为N基因检测靶片段），并设计本方案的第二引物组合，才能实现对N基因的检测。在LAMP扩增中，引物设计要点在于在同一反应体系中两套引物在扩增不同目的基因时既要保证引物特异性又要保证两套引物的兼容性。具体指每套引物既能特异的扩增不同的目的基因，同时两套引物之间不能相互结合，且两套引物的扩增条件必须要一致。发明人进而将第一引物组合和第二引物组合放入同一LAMP扩增体系中，同时进行两个基因的LAMP扩增，这两组引物适配性良好，可以同时完成两种基因的检测。

本发明的有益效果在于：

（1）环介导恒温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）较传统PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。LAMP技术能够在恒温条件下实现靶序列扩增，具有扩增速度快、反应灵敏、特异性高等优点。

（2）可对RdRp基因和N基因进行同时检测，克服了两种基因分别检测耗时长的缺点。

（3）发明人发现了在RdRp基因上的适合于LAMP扩增的特异性片段，以及发现了在N基因上适合于LAMP扩增的特异性片段，并且针对这两段特异性片段的两组引物组合具有较高的兼容性，可以放置于同一LAMP扩增系统中进行检测。发明人经过了大量实验尝试，发现只有针对这两个基因的这两个特异性片段进行LAMP扩增检测，才能获取高灵敏度、高准确性和高特异性的检测结果。

进一步，第一标记分子为生物素；第二标记分子为羧基荧光素；第三标记分子为地高辛。

采用上述技术方案，地高辛、羧基荧光素和生物素为常见标记分子，他们的抗体（或结合分子）也已经实现商业化，易于获取。

进一步，所述mRT-LAMP单元用于获取mRT-LAMP扩增产物；所述系统还包括检测单元，所述检测单元用于定性检测mRT-LAMP扩增产物中的RdRp基因和N基因。

采用上述技术方案，检测单元可通过检测三种标记分子，来判断两种目的基因是否存在。

进一步，所述检测单元包括高分子纳米侧向流生物传感器，高分子纳米侧向流生物传感器包括依次固定在背板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜上设置有用于检测RdRp基因的第一检测线、用于检测N基因的第二检测线和质控线。

采用上述技术方案，采用mRT-LAMP结合侧向流生物传感器（LFB），可实现检测结果的可视化，可以很直观的观察实验结果，且无需昂贵的PCR产物检测仪器。

进一步，所述第一检测线上固定有羧基荧光素抗体，所述第二检测线上固定有地高辛抗体，所述质控线上固定有生物素偶联的牛血清蛋白；所述结合垫上包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素。

采用上述技术方案，第一检测线可实现对RdRp基因基因的检测，第二检测线可实现对N基因的检测，结合垫上金纳米粒子偶联的链霉素亲和素可与扩增后的N基因和RdRp基因结合，实现两种基因检测结果的可视化。

进一步，mRT-LAMP单元还包括链移位型聚合酶和逆转录酶。

采用上述技术方案，链移位型聚合酶可催化环介导恒温扩增反应顺利进行，逆转录酶用于催化RNA病毒的的逆转录，形成cDNA以供后续的扩增过程。

进一步，所述mRT-LAMP单元的工作温度为63ºC。

采用上述技术方案，采用上述m-LAMP扩增温度，可以实现对两个目的基因片段的稳定快速扩增。

进一步，所述mRT-LAMP单元的工作时长为30 min。

采用上述技术方案，可充分扩增目的片段，可检测RNA含量为10 copies/μL样品。实验证明，延长工作时间，并不能将检测下限增加。

进一步，系统的检测下限为10 copies/μL。

采用上述技术方案，本方案的mRT-LAMP加上LFB的检测系统具有较高的灵敏度，RNA模板中RNA的浓度在10 copies/μL或以上，即可实现对样本中是否有SARS-CoV-2进行准确检测和判断。

进一步，一种用于检测新型冠状病毒的SARS-CoV-2的系统的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）从待检测样品中获取总RNA，获得RNA模板；

（2）将RNA模板加入mRT-LAMP单元中，然后在63ºC的条件下孵育30-60min，获得mRT-LAMP扩增产物；

（3）使用高分子纳米侧向流生物传感器检测mRT-LAMP扩增产物；当第一检测线、第二检测线和质控线同时显色时，判定为SARS-CoV-2阳性。

采用上述技术方案，mRT-LAMP加LFB技术能准确的鉴别样本中是否存在SARS-CoV-2。本方案检测时间短，全过程不会超过70 min。同时检测两个基因的目的在于防止检测结果出现假阳性或者假阴性，如过只出现一条检测线显色，则需要对样本进行重新检测，如果重复检测都只出现一条检测线则表明结果为阴性。

附图说明

图1为本发明实施例1中RdRp基因引物位点示意图；

图2为本发明实施例1中N基因引物位点示意图；

图3为本发明实施例1中的RdRp-RT-LAMP扩增产物电泳图；

图4为本发明实施例1中的对RdRp-RT-LAMP扩增产物的比色指示仪检测结果以及LFB检测结果；

图5为本发明实施例1中的N-RT-LAMP扩增产物电泳图；

图6为本发明实施例1中的对N-RT-LAMP扩增产物的比色指示仪检测结果以及LFB检测结果；

图7为本发明实施例1中的mRT-LAMP扩增产物电泳图；

图8为本发明实施例1中的对mRT-LAMP扩增产物的比色指示仪检测结果以及LFB检测结果；

图9为本发明实施例2的对RdRp-RT-LAMP扩增产物的比色指示仪检测结果以及LFB检测结果；

图10为本发明实施例2的N-RT-LAMP扩增产物的比色指示仪检测结果以及LFB检测结果；

图11为本发明实施例2的对RdRp基因的RT-PCR检测结果；

图12为本发明实施例2的对N基因的RT-PCR检测结果；

图13为本发明实施例3的mRT-LAMP的灵敏度测试结果；

图14为本发明实验例1的扩增时间验证实验结果（20min）；

图15为本发明实验例1的扩增时间验证实验结果（30min）；

图16为本发明实验例1的扩增时间验证实验结果（40min）；

图17为本发明实验例1的扩增时间验证实验结果（50min）；

图18为本发明实验例2的特异性测试结果（1-30）；

图19为本发明实验例2的特异性测试结果（31-50）。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例1：

1. 材料和设备

病毒RNA提取试剂盒(QIAamp Viral RNA minikits)购自德国Qiagen公司；通用型恒温扩增试剂盒（Universal isothermal amplification kits）、AMV逆转录酶和比色指示仪（Colorimetric indicator）均购自Malachite Green公司；生物素标记的-脱氧胞嘧啶核苷三磷酸（biotin-14-dCTP）购自Bei-Jing HaiTaiZhengYuan公司。

LFB材料包括背板、样品垫、吸收垫、结合垫和NC膜，上述材料均购自Jie-YiBiotechnology. Co. Ltd.。anti-Dig（地高辛抗体），anti-FAM（羧基荧光素抗体）和biotin-BSA (生物素化的牛血清白蛋白)均购自Abcam. Co. Ltd.。金纳米粒子偶联的链霉素亲和素(深红色，(Dye streptavidin-coated polymer nanoparticles，129 nm，10 mgml^-1，100 mM 硼酸, pH 8.5，含有 0.1% BSA，0.05% 吐温20和10 mM EDTA)购自BangsLaboratories公司。

2. LAMP引物设计

根据RdRp基因(RdRp基因的序列见SEQ ID NO: 13，本实施例引物检测的RdRp基因检测靶片段见SEQ ID NO:15；RdRp基因的NCBI gene ID：MT159778.1，483 bp)和N基因(N基因的序列见SEQ ID NO:14，本实施例引物检测的N基因检测靶片段见SEQ ID NO:16；N 基因的NCBI gene ID：43740575，1260bp），新型冠状病毒的基因组序列的NCBI接收号为NC_045512.2。两个基因位于新冠病毒的基因组上（Genbank Accession No. ID: 43740575）分别针对两个基因设计了两套引物。引物设计采用Primers Explorer V5在线引物设计软件(http://primerexplorer.jp/e/; Eiken Chemical公司, 东京, 日本)，引物设计完成后使用BLAST进行复查核对（the basic local alignment search tool）。引物序列如表1所示，引物在基因中的位置见图1（RdRp基因，图中引物的标号省略了前缀RdRp-，其中，RdRp-FIP*覆盖图1中的F2和F1位置，RdRp-BIP覆盖图1中的B2和B1位置）和图2（N基因，图中引物的标号省略了前缀N-，其中，N-FIP*覆盖图1中的F2和F1位置，N-BIP覆盖图1中的B2和B1位置）。本实施例中的引物由TsingKe生物科技公司合成，均为HPLC纯化级别。引物中，Dig表示地高辛修饰，Biotin表示生物素修饰，FAM表示羧基荧光素修饰。第一引物组合（对RdRp基因进行环介导等温扩增）包括第一外引物对（RdRp-F3和RdRp-B3）、第一内引物（RdRp-FIP*和RdRp-BIP）对和第一介环引物对（RdRp-LF*和RdRp-LB）；所述第二引物组合（对N基因进行环介导等温扩增）包括第二外引物对（N-F3和N-B3）、第二内引物对（N --FIP*和N-BIP）和第二介环引物对（N-LF*和N-LB）。

表1：引物列表

3. 基于金纳米粒子的侧向流生物传感器的制备

本方案的高分子纳米侧向流生物传感器（Lateral Flow Biosensor，LFB）的制备采用现有技术中的方法，委托天津汇德鑫生物科技发展有限公司制备该高分子纳米侧向流生物传感器。LFB(4×60 mm)包括四个部分，即在背板上依次设置的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜（NC膜）及吸水垫。在结合垫上包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素（SA-PNPs，Dye streptavidin-coated polymer nanoparticles）。在硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线。检测线共有两条（第一检测线TL1和第二检测线TL2），TL1上固定有羧基荧光素抗体anti-FAM，用于检测RdRp基因，TL2上固定有地高辛抗体anti-Dig，用于检测N基因。质控线（CL）上固定有生物素偶联的牛血清蛋白（biotin-BSA）。TL2、TL1和CL依次设置，每条线间隔5mm，其中，TL2最靠近CL。

4. 人工SARS-CoV-2病毒合成

委托TsingKe生物科技公司合成含有RdRp基因和N基因的假病毒SARS-CoV-2-RdRp-N（参照新冠病毒基因组序列NC_045512.2）。合成假病毒是现有技术的常规手段，现已有商业化的用于研究的新冠假病毒售卖。

5. RNA模板制备

使用病毒RNA提取试剂盒按照操作说明从SARS-CoV-2-RdRp-N中提取全病毒RNA模板。再使用Nano drop ND-2000检测A260/280，以确定RNA含量(ng/μl)。假病毒 SARS-CoV-2-RdRp-N的拷贝数使用如下公式计算：拷贝数（copies/μL）=6.02×10²³×10^-9×RNA含量/(片段长度×340)。在上述单位中，片段长度的单位是bp，在此处具体为合成的假病毒SARS-CoV-2-RdRp-N的基因片段长度（包括了RdRp基因和N基因）。稀释SARS-CoV-2-RdRp-N至拷贝数为1×10⁴copies/μL，获得本实施例中的SARS-CoV-2 RNA模板。以同样的方法制备SARS-CoV RNA模板（SARS-CoV病毒）以及MERS RNA模板（MERS 病毒），SARS-CoV病毒和MERS病毒已有商业化病毒（购于擎科新业生物）。

6. RT-LAMP反应

RT-LAMP反应包括RdRp-RT-LAMP，N-RT-LAMP和mRT-LAMP。对于RdRp-RT-LAMP采用25μl反应体系：12.5μl 2×反应缓冲液；0.4μM RdRp-F3， 0.4μMRdRp-B3（以上均为外引物outer primer，上述浓度是指终浓度）；0.8 μM RdRp-LF*，0.8 μM RdRp-LB（以上均为介环引物loop primer，上述浓度是指终浓度）；1.6 μM RdRp-FIP*，1.6 μM RdRp-BIP（以上均为内引物inner primer，上述浓度是指终浓度）； 0.4 mM biotin-14-dCTP, 1μl (8U) BstDNA聚合酶（链移位型DNA聚合酶），1μl (8U)AMV逆转录酶和 1μl RNA模板（SARS-CoV-2 RNA模板或SARS-CoV RNA模板或MERS RNA模板）。将上述反应体系于63ºC恒温孵育1h，获得RdRp-RT-LAMP扩增产物。对于N-RT-LAMP，使用表1中的N基因的引物代替RdRp基因的引物，获得N-RT-LAMP扩增产物。对于mRT-LAMP采用25μl反应体系：12.5μl 2×反应缓冲液；0.2μMRdRp-F3， 0.2μMRdRp-B3，0.2μM N-F3， 0.2μM N-B3（以上均为外引物outer primer，上述浓度是指终浓度）；0.4 μM RdRp-LF*，0.4 μM RdRp-LB，0.4 μM N-LF*，0.4 μM N-LB（以上均为介环引物loop primer，上述浓度是指终浓度）； 0.8 μM RdRp-FIP*， 0.8μM RdRp-BIP，0.8 μM N-FIP*， 0.8 μM N-BIP（以上均为内引物inner primer，上述浓度是指终浓度）； 0.4 mM biotin-14-dCTP, 1μl (8U) Bst DNA聚合酶（链移位型DNA聚合酶），1μl(8U)AMV逆转录酶和 1μl RNA模板（SARS-CoV-2 RNA模板或SARS-CoV RNA模板或MERS RNA模板）。将上述反应体系于63ºC恒温孵育1h，获得mRT-LAMP扩增产物。

7. RT-LAMP产物检测

使用第3步制备的LFB对三种RT-LAMP产物进行检测，在LFB的样品垫上滴加RdRp-RT-LAMP扩增产物、N-RT-LAMP扩增产物或者mRT-LAMP扩增产物，观察TL1、TL2和CL的显色情况。并使用2%琼脂糖电泳检测基因含量。并同时使用比色指示仪（MG 试剂）检测RT-LAM产物的显色情况（阳性的RT-LAM产物呈不同深浅的亮绿色，阴性的RT-LAM产物呈无色，空白对照也呈无色）。本实验采用的空白对照是蒸馏水，实验结果如图3-图8所示。图3和图4展示了对RdRp-RT-LAMP扩增产物的检测结果，可见本法只对SARS-CoV-2有检测效力，并不能检测出SARS-CoV和MERS，说明检测位点的选择（RdRp基因上用于体外扩增的片段）和引物设计具有特异性。图5和图6展示了对N-RT-LAMP扩增产物的检测结果，说明了说明检测位点的选择（N基因上用于体外扩增的片段）和引物设计具有特异性。图7和图8展示了对mRT-LAMP扩增产物的检测结果，说明两套引物在同一体系中没有相互干扰，可以同时实现对两种基因的同时检测。图3中，M泳道为DNA marker，1泳道为 SARS-CoV-2 的RdRp-RT-LAMP扩增产物，2泳道为SARS-CoV的RdRp-RT-LAMP扩增产物；3泳道为MERS的RdRp-RT-LAMP扩增产物；4泳道为空白对照；图5中，M泳道为DNA marker，1泳道为 SARS-CoV-2 的N-RT-LAMP扩增产物，2泳道为SARS-CoV的N-RT-LAMP扩增产物；3泳道为MERS的N-RT-LAMP扩增产物；4泳道为空白对照；图7中，M泳道为DNA marker，1泳道为 SARS-CoV-2 的mRT-LAMP扩增产物，2泳道为SARS-CoV的mRT-LAMP扩增产物；3泳道为MERS的mRT-LAMP扩增产物；4泳道为空白对照。在图4、图6和图8中上排为比色指示仪检测结果，下排是使用LFB的检测结果，均显示只有SARS-CoV-2 的检测结果为阳性，其他的检测结果为阴性。

实施例2：RdRp-RT-LAMP，N-RT-LAMP的灵敏度测试

将SARS-CoV-2 RNA模板稀释至1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL、1×10²copies/μL、10copies/μL、1copies/μL，获得5种SARS-CoV-2 RNA稀释模板，然后以上述模板来分别进行RdRp-RT-LAMP和N-RT-LAMP，并对RdRp-RT-LAMP扩增产物和N-RT-LAMP扩增产物进行比色指示仪检测以及LFB检测。实验结果如图9和图10所示，本方案的检测灵敏度为10 copies/μL。为了对比本方案的检测效果，在本实施例中还是用了实时荧光定量RT-PCR的方法来进行基因检测，实验结果如图11和12所示，实时荧光定量RT-PCR的灵敏度为100 copies/μL。可见本方案的灵敏度是传统方法的十倍。

实施例3：mRT-LAMP的灵敏度测试

将SARS-CoV-2 RNA模板稀释至1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、10 copies/μL、1 copies/μL，获得5种SARS-CoV-2 RNA稀释模板，然后用上述模板进行mRT-LAMP，并对mRT-LAMP扩增产物进行比色指示仪检测以及LFB检测。实验结果如图13所示，同时检测两种基因的检测灵敏度为10 copies/μL。

实验例1：最佳反应时间的确定

在本实验例中对mRT-LAMP的最适反应时间进行了研究，本实验例的mRT-LAMP扩增以及LFB检测同实施例1，不同点在于，将m-LAMP的反应时间调整成了20, 30, 40 或 50min，并且RNA模板的浓度为10 copies/μL。实验结果如图14-图17所示，30min为最佳的m-LAMP反应时间。所以，采用mRT-LAMP加上LFB的检测方法所需时间为30min的基因组RNA提取，加上30min的mRT-LAMP扩增，再加上10min的LFB检测分析，共70min。

实验例2：mRT-LAMP以及LFB检测的特异性测试

本实验例对多个病毒株进行了mRT-LAMP以及LFB检测，包括了实施例1的假病毒SARS-CoV-2-RdRp-N、12个SARS-CoV-2 阳性临床样本，36个其他呼吸道病原体样本（见表2），检测过程参见实施例1中的描述。检测结果如图18和图19所示（1为SARS-CoV-2 (假病毒)；2-13为SARS-CoV-2阳性株系；14-50其他呼吸道病原体样本），结果证明了本法可以准确检测SARS-CoV-2，将其从其他病原菌区别开来。

表2：实验用病原体信息（表中缩写含义为：ATCC：美国典型培养物保藏中心；ZJCDC：浙江省疾控中心；American type culture collection; 2^ndGZUTCM： 贵州中医大学第二附属医院； GZCDC：贵州省疾控中心；P：positive；N：negative）

实验例3：使用mRT-LAMP以及LFB检测临床样本

为了进一步测试本法的实用性，本实验例对110份鼻咽拭子样本和60份人工痰标本（里面加入了浓度为10 copies/μL的假病毒SARS-CoV-2）进行了检测。检测方法包括mRT-LAMP-LFB和RT-PCR。其中，26个临床样本和35个人工痰标本被证实为SARS-CoV-2阳性。实验结果如表3所示。实验证明本方案的mRT-LAMP-LFB可以应用与临床样本的检测。

表3：临床样本检测结果

对比例1

为找到能够获得较好测试灵敏度和准确度的检测系统，发明人针对RdRp基因和N基因的不同检测靶片段（用于RT-LAMP扩增的片段）设计了大量引物组合进行测试，现将部分实验过程中用到的引物组合的情况列举在表4和表5中。使用表1中RdRp基因的第一引物组合和N基因的第二引物组合（命名为优化组），按照实施例1“6. RT-LAMP反应”的方法对SARS-CoV-2 (假病毒)（TsingKe公司合成）进行扩增，然后使用电泳检测法，对mRT-LAMP扩增产物进行了琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统输出照片，利用灰度分析软件（ImageJ）来进行电泳条带的灰度分析（记录条带的总灰度值）。同时，使用表4和表5中N基因对比引物组1和RdRp基因对比引物组1（命名为对比实验A）重复上述实验；使用表4和表5中N基因对比引物组1和RdRp基因对比引物组2（命名为对比实验B）重复上述实验；使用表4和表5中N基因对比引物组2和RdRp基因对比引物组1（命名为对比实验C）重复上述实验；使用表4和表5中N基因对比引物组2和RdRp基因对比引物组2（命名为对比实验D）重复上述实验；使用表4和表5中N基因对比引物组1和RdRp基因对比引物组3（命名为对比实验E）重复上述实验；使用表4和表5中N基因对比引物组2和RdRp基因对比引物组4（命名为对比实验F）重复上述实验。实验结果以灰度比值的方式呈现，使用对比实验的灰度值除以优化组的灰度值获得灰度比值，实验结果见表6所示。发明人通过大量实验证明，只有采用本方案的引物（第一引物组合和第二引物组合），才能获得大量的mRT-LAMP扩增产物（较高灰度值）以供后续的检测，才能获得较高的扩增效率，以提高检测的准确程度和灵敏度。本方案实施例1中采用的针对RdRp基因的引物组合扩增的检测靶片段并不是完全位于RdRp基因的开放阅读框中，检测靶片段覆盖了RdRp基因起始密码子ATG上游的一段序列。虽然RdRp基因相对比较保守，但是很难在其上面找到适合于RT-LAMP扩增的检测靶片段。发明人经过大量实验筛选发现RdRp基因启动子ATG上游的一段序列也具有较好的保守性，选择实施例1中的检测靶片段，可进行非常高效的RT-LAMP扩增，提升了本方案的检测灵敏度。

表4：本对比例涉及的引物组合列表（N基因）

表5：本对比例涉及的引物组合列表（RdRp基因）

表6：灰度测试结果

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州中医药大学第二附属医院

<120> 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的系统及其使用方法

<130> 2020.7.1

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caccttatgg gttgggat 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacatatagt gaaccgcca 19

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcaagaacaa gtgaggccat aatcctaaat gtgatagagc ca 42

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acatacaacg tgttgtagct tgtccacatg accatttcac tcaa 44

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

attctaagca tgttaggca 19

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

attagctaat gagtgtgctc aagt 24

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tggctactac cgaagagct 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgcagcattg ttagcaggat 20

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tctggcccag ttcctaggta gtccagacga attcgtggtg g 41

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agacggcatc atatgggttg cacgggtgcc aatgtgatct 40

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aaataccatc ttggactgag atc 23

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agggagcctt gaatacacca a 21

<210> 13

<211> 483

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 13

atgcctaaca tgcttagaat tatggcctca cttgttcttg ctcgcaaaca tacaacgtgt 60

tgtagcttgt cacaccgttt ctatagatta gctaatgagt gtgctcaagt attgagtgaa 120

atggtcatgt gtggcggttc actatatgtt aaaccaggtg gaacctcatc aggagatgcc 180

acaactgctt atgctaatag tgtttttaac atttgtcaag ctgtcacggc caatgttaat 240

gcacttttat ctactgatgg taacaaaatt gccgataagt atgtccgcaa tttacaacac 300

agactttatg agtgtctcta tagaaataga gatgttgaca cagactttgt gaatgagttt 360

tacgcatatt tgcgtaaaca tttctcaatg atgatactct ctgacgatgc tgttgtgtgt 420

ttcaatagca cttatgcatc tcaaggtcta gtggctagca taaagaactt taagtcagtt 480

ctt 483

<210> 14

<211> 1260

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 14

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

<210> 15

<211> 302

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 15

gcggccgctt ggcacaacat gttaaaaact gtttatagtg atgtagaaaa ccctcacctt 60

atgggttggg attatcctaa atgtgataga gccatgccta acatgcttag aattatggcc 120

tcacttgttc ttgctcgcaa acatacaacg tgttgtagct tgtcacaccg tttctataga 180

ttagctaatg agtgtgctca agtattgagt gaaatggtca tgtgtggcgg ttcactatat 240

gttaaaccag gtggaacctc atcaggagat gccacaactg cttatgctaa tagtgttttt 300

aa 302

<210> 16

<211> 295

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 16

aattggctac taccgaagag ctaccagacg aattcgtggt ggtgacggta aaatgaaaga 60

tctcagtcca agatggtatt tctactacct aggaactggg ccagaagctg gacttcccta 120

tggtgctaac aaagacggca tcatatgggt tgcaactgag ggagccttga atacaccaaa 180

agatcacatt ggcacccgca atcctgctaa caatgctgca atcgtgctac aacttcctca 240

aggaacaaca ttgccaaaag gcttctacgc agaagggagc agaggcggca gtcaa 295

Claims (2)

1.一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的系统，其特征在于：包括mRT-LAMP单元，所述mRT-LAMP单元包括第一引物组合和第二引物组合，用于同时对RdRp基因和N基因进行扩增；

第一引物组合包括第一外引物对、第一内引物对和第一介环引物对；

第一外引物对中的正向引物的序列为：5ʹ-CACCTTATGGGTTGGGAT-3ʹ；

第一外引物对中的反向引物的序列为：5ʹ-AACATATAGTGAACCGCCA-3ʹ；

第一内引物对中的正向引物的序列为：

5ʹ-GCAAGAACAAGTGAGGCCATAATCCTAAATGTGATAGAGCCA-3ʹ；

第一内引物对中的反向引物的序列为：

5ʹ-ACATACAACGTGTTGTAGCTTGTCCACATGACCATTTCACTCAA-3ʹ；

第一介环引物对中的正向引物的序列为：5ʹ-ATTCTAAGCATGTTAGGCA-3ʹ；

第一介环引物对中的反向引物的序列为：5ʹ-ATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGT-3ʹ；

第二引物组合包括第二外引物对、第二内引物对和第二介环引物对；

第二外引物对中的正向引物的序列为：5ʹ-TGGCTACTACCGAAGAGCT-3ʹ；

第二外引物对中的反向引物的序列为：5ʹ-TGCAGCATTGTTAGCAGGAT-3ʹ；

第二内引物对中的正向引物的序列为：

5ʹ-TCTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTCCAGACGAATTCGTGGTGG-3ʹ；

第二内引物对中的反向引物的序列为：

5ʹ-AGACGGCATCATATGGGTTGCACGGGTGCCAATGTGATCT-3ʹ；

第二介环引物对中的正向引物的序列为：

5ʹ-AAATACCATCTTGGACTGAGATC-3ʹ；

第二介环引物对中的反向引物的序列为：5ʹ-AGGGAGCCTTGAATACACCAA-3ʹ；

其中，第一介环引物对中的正向引物以及第二介环引物对中的正向引物的5’端均修饰有第一标记分子；第一内引物对中的正向引物的5’端修饰有第二标记分子；第二内引物对中的正向引物的5’端修饰有第三标记分子；第一标记分子为生物素；第二标记分子为羧基荧光素；第三标记分子为地高辛；

所述mRT-LAMP单元用于获取mRT-LAMP扩增产物；所述系统还包括检测单元，所述检测单元用于定性检测mRT-LAMP扩增产物中的RdRp基因和N基因；

所述检测单元包括高分子纳米侧向流生物传感器，高分子纳米侧向流生物传感器包括依次固定在背板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜上设置有用于检测RdRp基因的第一检测线、用于检测N基因的第二检测线和质控线；所述第一检测线上固定有羧基荧光素抗体，所述第二检测线上固定有地高辛抗体，所述质控线上固定有生物素偶联的牛血清蛋白；所述结合垫上包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素；当第一检测线、第二检测线和质控线同时显色时，判定为SARS-CoV-2阳性；

mRT-LAMP单元还包括链移位型聚合酶和逆转录酶；所述mRT-LAMP单元的工作温度为63ºC；所述mRT-LAMP单元的工作时长为30min；系统的检测下限为10 copies/μL。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的系统的非诊断目的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）从待检测样品中获取总RNA，获得RNA模板；

（2）将RNA模板加入mRT-LAMP单元中，然后在63ºC的条件下孵育30-60min，获得mRT-LAMP扩增产物；

（3）使用高分子纳米侧向流生物传感器检测mRT-LAMP扩增产物；当第一检测线、第二检测线和质控线同时显色时，判定为SARS-CoV-2阳性。

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