CN111334593A - 一种同时检测甲氧西林敏感型和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌的系统及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及了一种同时检测甲氧西林敏感型和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌的系统和使用方法。该系统包括m‑LAMP单元和检测单元；m‑LAMP单元用于在同一反应体系中同时对femA基因和mecA基因进行环介导等温扩增，m‑LAMP单元包括对femA基因进行环介导等温扩增的第一引物组合和对mecA基因进行环介导等温扩增的第二引物组合；所述检测单元用于检测环介导等温扩增后的femA基因和mecA基因产物。本系统可实现对MSSA和MRSA的同时检测，可以应用于医院等机构对MSSA和MRSA的检测的实践操作中，为制定及时准确的治疗方案提供有效参考。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及了一种同时检测甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA)和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的系统和使用方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是医院和社区环境中最常见的致病菌之一，几乎可以感染全身各个组织和器官，引发广泛的感染性疾病，例如软组织感染、皮肤感染肺炎、乳腺炎、骨髓炎和心内膜炎等。由于近几年抗生素的不规范应用，相关机构监管不力，耐药菌株和“超级细菌”等的爆发流行趋势严重。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)自1961年首次被检出后，其检出率持续增高，它不仅对β-内酰胺类药物，还对氟喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖苷类等抗生素均具有一定耐药性。因此，为了给予临床病人准确快速的诊断，进而给出合理的抗生素治疗方案，研发一个省时、省力和特异性较高的用于区分普通金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法成为必要。
目前，对于普通金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible S.aureus，MSSA)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检测主要依赖于传统的增菌培养和细菌药敏试验。该方法耗时大约2-4天，包括增菌、选择培养及后续的系统生化试验和药敏试验等，上述方法的劣势是：耗时耗力、结果的判读主观性强、结果重复性差、易出现错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于金黄色葡萄球菌的检测，然而这些方法均依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，所需探针的合成的成本高，还需要熟练的操作人员。对于一些落后的实验室无法进行以PCR为基础的诊断，并且以PCR为基础的诊断还存在检测灵敏度较差和检测过程耗时较长等问题，不利于快速检测和应急检测。
发明内容
本发明的目的在于一种同时检测两种金黄色葡萄球菌的系统，本系统可实现对MSSA和MRSA的同时检测，本系统具有耗时短、操作简单和检测灵敏度高等优点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种同时检测甲氧西林敏感型和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌的系统，包括m-LAMP单元和检测单元；所述m-LAMP单元用于在同一反应体系中同时对femA基因和mecA基因进行环介导等温扩增，m-LAMP单元包括对femA基因进行环介导等温扩增的第一引物组合和对mecA基因进行环介导等温扩增的第二引物组合；所述检测单元为用于检测环介导等温扩增后的femA和mecA基因的扩增产物的高分子纳米生物传感器。
采用上述技术方案，技术原理为：本方案根据金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性基因femA和mecA分别设计LAMP引物(第一引物组合和第二引物组合)。利用环介导恒温扩增技术同时且在同一扩增体系中对待测样本中的femA基因和mecA基因进行扩增，如果待测样本中存在上述两种基因，经过扩增，可以增大两种基因的拷贝数，在后续的检测单元检测中，可对待测样本中是否含有普通金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行快速且准确的判定。其中，femA基因(S.aureus-specific gene)为所有金黄色葡萄球菌中均含有的基因，mecA基因(encoding penicillin-binding protein 2a)为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性基因。
本发明的有益效果在于：
(1)环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)较传统PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。LAMP技术能够在恒温条件下实现靶序列扩增，具有扩增速度快、反应灵敏、特异性高等优点。
(2)在同一反应体系中同时对femA基因和mecA基因进行扩增，相对于单独对这两个基因分别进行扩增的方案，节约了操作时间，进一步提高了检测效率。
进一步，所述第一引物组合包括第一外引物对、第一内引物对和第一介环引物对；所述第二引物组合包括第二外引物对、第二内引物对和第二介环引物对；第一内引物对中的上游引物的5′端连接有第一标记分子，第二内引物对中的上游引物的5′端连接有第二标记分子，第一介环引物对中的上游引物的5′端和第二介环引物对中的上游引物的5′端均连接有第三标记分子。
采用上述技术方案，三种标记分子的引入，可以通过检测标记分子来判断两种目的基因是否存在。相对于LAMP扩增之后再采用电泳等检测方法，对标记分子进行检测更为简单可行。
进一步，所述第一标记分子为地高辛，所述第二标记分子为羧基荧光素，所述第三标记分子为生物素。
采用上述技术方案，地高辛、羧基荧光素和生物素为常见标记分子，他们的抗体(或结合分子)也已经实现商业化，易于获取。
进一步，所述高分子纳米生物传感器为高分子纳米侧向流生物传感器，高分子纳米侧向流生物传感器包括依次固定在背板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜上设置有用于检测femA基因的第一检测线、用于检测mecA基因的第一检测线和质控线。
采用上述技术方案，采用m-LAMP结合侧向流生物传感器(LFB)(即m-LAMP-LFB检测系统)检测金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的可视化，可以很直观的观察实验结果，且无需昂贵的PCR产物检测仪器。
进一步，所述第一检测线上固定有地高辛抗体，所述第二检测线上固定有羧基荧光素抗体，所述质控线上固定有生物素偶联的牛血清蛋白；所述结合垫上包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素。
采用上述技术方案，第一检测线可实现对femA基因的检测，第二检测线可实现对mecA基因的检测，结合垫上金纳米粒子偶联的链霉素亲和素可与扩增后的femA基因和mecA基因结合，实现两种基因的可视化。
进一步，所述第一引物组合的序列信息如下：
第一外引物对中的上游引物：5′-GTCCTGAAAATAAAAAAGCACAT-3′
第一外引物对中的下游引物：5′-ACTTCCGGCAAAATGACG-3′
第一内引物对中的上游引物：
5′-Dig-TGTTCTTCTTGTAGACGTTTACCTTCGAGATAACTTACAACAACAACTTG-3′
第一内引物对中的下游引物：
5′-ACCTATCTCTGCTGGTTTCTTCTAATGCATTTGATGTACCACC-3′
第一介环引物对中的上游引物：5′-Biotin-TCAATCTTTTGCTCATTTGC-3′
第一介环引物对中的下游引物：5′-CCATTTGAAGTTGTTTATTATGC-3′
所述第二引物组合的序列信息如下：
第二外引物对中的上游引物：5′-GGCTCAGGTACTGCTATC-3′
第二外引物对中的下游引物：5′-TTGTTATTTAACCCAATCATTGC-3′
第二内引物对中的上游引物：
5′-FAM-ATGCCATACATAAATGGATAGACGTCAAACAGGTGAATTATTAGCACTT-3′
第二内引物对中的下游引物：
5′-CCGAAGATAAAAAAGAACCTCTGCTTTTTTGAGTTGAACCTGGTG-3′
第二介环引物对中的上游引物：5′-Biotin-CATATGAAGGTGTGCTTAC-3′
第二介环引物对中的下游引物：5′-CAAGTTCCAGATTACAACTT-3′；
其中，Dig为地高辛，FAM为羧基荧光素，Biotin为生物素。
采用上述技术方案，上述引物组合可实现两个目的基因的特异性扩增。m-LAMP的引物设计要点在于在同一反应体系中两套引物在扩增不同目的基因时既要保证引物特异性又要保证两套引物的兼容性。具体指每套引物既能特异的扩增不同的目的基因，同时两套引物之间不能相互结合，且两套引物的扩增条件必须要一致。本方案中同一体系的两套引物是经过多次筛选才得到的最好组合。
进一步，所述m-LAMP单元还包括链移位型聚合酶和DNA模板，所述DNA模板来自于待检测样品的基因组DNA。
采用上述技术方案，链移位型聚合酶可催化环介导恒温扩增反应顺利进行。
进一步，所述m-LAMP单元的工作温度为63℃，所述m-LAMP单元的工作时长为40min。
采用上述技术方案，采用上述m-LAMP扩增温度和时间，可以实现对两种金葡的快速检出。
进一步，系统的检测下限为100fg/μL。
采用上述技术方案，本方案的m-LAMP-LFB检测系统具有较高的灵敏度，DNA模板中DNA的浓度在100fg/μL或以上，即可实现对样本中是否有MSSA或MRSA进行准确检测和判断。现有技术对DNA样本的检测通常只能达到ng级别，本技术方案将检测灵敏度大大提升。
进一步，一种同时检测甲氧西林敏感型和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌的系统的使用方法，包括以下步骤：
(1)从待检测样品中获取DNA模板；
(2)使用m-LAMP单元对DNA模板中的femA基因和mecA基因在同一反应体系中同时进行环介导等温扩增，获得m-LAMP产物；
(3)使用检测单元检测m-LAMP产物中的femA基因和mecA基因；第一检测线、第二检测线和质控线同时显色，判定为MRSA阳性；第一检测线和质控线同时显色，且第二检测线未显色，判定为MSSA阳性；仅有质控线显色，判定为待检测样品中无金黄色葡萄球菌。
采用上述技术方案，m-LAMP-LFB技术能准确的鉴别金黄色葡萄球菌(MSSA)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，m-LAMP-LFB方法的特异性良好。本方案检测时间更短，传统培养和药敏试验检测金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌需要2-3天，而本方法检测全过程不会超过80min。
附图说明
图1为本发明实施例1中femA基因引物位点示意图；
图2为本发明实施例1中mecA基因引物位点示意图；
图3为本发明实施例1中的m-LAMP-LFB检测结果；
图4为本发明对比例1中，对MSSA进行单独LAMP-LFB检测的结果；
图5为本发明对比例1中，对MRSA进行单独LAMP-LFB检测的结果；
图6为本发明对比例1中，对MSSA进行单独LAMP-LFB检测的结果(检测限值测定)；
图7为本发明对比例1中，对MRSA进行单独LAMP-LFB检测的结果(检测限值测定)；
图8为本发明实验例1中，对MSSA进行不同扩增温度的单独LAMP-LFB检测的结果；
图9为本发明实验例1中，对MRSA进行不同扩增温度的单独LAMP-LFB检测的结果；
图10为本发明实验例2中，m-LAMP扩增最佳时间测试结果(20min)；
图11为本发明实验例2中，m-LAMP扩增最佳时间测试结果(30min)；
图12为本发明实验例2中，m-LAMP扩增最佳时间测试结果(40min)；
图13为本发明实验例2中，m-LAMP扩增最佳时间测试结果(50min)；
图14为本发明实验例3中，m-LAMP-LFB特异性测试结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1：m-LAMP-LFB同时检测MSSA和MRSA(针对不同DNA浓度的样品)
1.材料和设备
细菌基因组DNA提取试剂盒(Bacterial genomic DNA extraction kits；QIAampDNA minikits)购自德国Qiagen公司；通用型恒温扩增试剂盒(Universal isothermalamplification kits)和比色指示仪(Colorimetric indicator)均购自Malachite Green公司；生物素标记的-脱氧胞嘧啶核苷三磷酸(biotin-14-dCTP)购自Bei-JingHaiTaiZhengYuan公司。
LFB材料包括背板、样品垫、吸收垫、结合垫和NC膜，上述材料均购自Jie-YiBiotechnology.Co.Ltd.。anti-Dig(地高辛抗体)，anti-FAM(羧基荧光素抗体)和biotin-BSA(生物素化的牛血清白蛋白)均购自Abcam.Co.Ltd.。金纳米粒子偶联的链霉素亲和素(深红色，(Dye streptavidin-coated polymer nanoparticles，129nm，10mg ml-1，100mM硼酸,pH 8.5，含有0.1％BSA，0.05％吐温20和10mM EDTA)购自Bangs Laboratories公司。
2.LAMP引物设计
根据目的基因femA(Genbank Accession No.NC 007795，用于检测S.aureus)和mecA(Genbank Accession No.X52593，用于检测MRSA)分别设计了两套引物。引物设计采用Primers Explorer V4在线引物设计软件(http://primerexplorer.jp/e/；EikenChemical公司,东京,日本)，引物设计完成后使用BLAST进行复查核对(the basic localalignment search tool)。引物序列如表1所示，引物在基因中的位置如图1(femA)和图2(mecA)(其中，F2和B2分别是指表1中的FIP*和BIP)所示。本实施例中的引物由TsingKe生物科技公司合成，均为HPLC纯化级别。引物中，Dig表示地高辛修饰，Biotin表示生物素修饰，FAM表示羧基荧光素修饰。第一引物组合(对femA基因进行环介导等温扩增)包括第一外引物对(femA-F3和femA-B3)、第一内引物(femA-FIP*和femA-BIP)对和第一介环引物对(femA-LF*和femA-LB)；所述第二引物组合(对mecA基因进行环介导等温扩增)包括第二外引物对(mecA-F3和mecA-B3)、第二内引物对(mecA--FIP*和mecA-BIP)和第二介环引物对(mecA-LF*和mecA-LB)。
表1：引物列表
3.细菌基因组提取(获得DNA模板)
使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取S.aureus(ATCC 25923)和MRSA(ATCC 43300)的基因组DNA，然后将两种基因组DNA混合，使用Nano drop ND-2000检测提取的基因组DNA(混合)中DNA的含量，并进行梯度稀释，获得若干待测样品(即DNA模板)。DNA模板中DNA的浓度分别为10ng/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL和100ag/μL。
4.基于金纳米粒子的侧向流生物传感器的制备
本方案的高分子纳米侧向流生物传感器(Lateral Flow Biosensor，LFB)的制备采用现有技术中的方法，委托天津汇德鑫生物科技发展有限公司制备该高分子纳米侧向流生物传感器。LFB(4×60mm)包括四个部分，即在背板上依次设置的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)及吸水垫。在结合垫上包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素(SA-PNPs，Dyestreptavidin-coated polymer nanoparticles)。在硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线。检测线共有两条(第一检测线和第二检测线)，分别为TL1(用于检测MSSA，地高辛抗体anti-Dig被固定在该检测线上)和TL2(用于检测MRSA，羧基荧光素抗体anti-FAM被固定在该检测线上)。质控线(CL)上固定有生物素偶联的牛血清蛋白(biotin-BSA)。TL2、TL1和CL依次设置，其中，TL2最靠近结合垫。
5.双重环介导等温扩增(multiplex-LAMP，m-LAMP)
采用25μl反应体系对样品进行m-LAMP扩增，该体系中含有如下成分：12.5μl 2×反应缓冲液；0.2μM femA-F3，0.2μM femA-B3，0.2μM mecA-F3，0.2μM mecA-B3(以上均为外引物outer primer，上述浓度是指终浓度)；0.4μM femA-LF*，0.4μM femA-LB，0.4μM mecA-LF*，0.4μM mecA-LB(以上均为介环引物loop primer，上述浓度是指终浓度)；0.8μM femA-FIP*，0.8μM femA-BIP，0.8μM mecA-FIP*，0.8μM mecA–BIP(以上均为内引物innerprimer，上述浓度是指终浓度)；0.4mM biotin-14-dCTP,1μl(8U)of Bst DNA聚合酶(链移位型DNA聚合酶)和1μl DNA模板。将上述反应体系于63℃恒温孵育1h，获得m-LAMP扩增产物。
6.m-LAMP扩增产物的检测
使用第4步制备的LFB对m-LAMP产物进行检测，在LFB的样品垫上滴加m-LAMP产物，观察TL1、TL2和CL的显色情况。实验结果如图3所示，本检测方法可对100fg/μL实现检测，具有较高的灵敏度。
实施例2：m-LAMP-LFB检测临床样本
为了进一步测试本法的实用性，本实施例对63份全血样本进行了检测，全血样本均来自疑似金葡感染的患者(某中医药大学某附属医院采集)。在本实施例中同时采用了传统的增菌培养和细菌药敏试验(包括血液培养，菌落形态观察，革兰氏染色，生化分析和甲氧西林敏感试验)，PCR检测(使用famA和mecA两种基因的特异性引物分别进行普通PCR扩增，即，使用引物为表1中的femA-F3，femA-B3，mecA-F3，mecA-B3)和本发明的m-LAMP-LFB法。使用m-LAMP-LFB的m-LAMP扩增过程和LFB检测过程同实施例1。传统增菌培养和细菌药敏试验同本法(m-LAMP-LFB)的检测结果一致，结果显示(见表2)，63份全血样本中16份为MSSA阳性，12份为MRSA阳性。而PCR检测的方法仅仅只检测到14份MSSA阳性，9份MRSA阳性。在临床实践中，增菌培养和细菌药敏试验为检测金黄色葡萄球菌的标准方法，有实验数据可知m-LAMP-LFB的检测效力与标准方法一致度较高，而普通PCR检测方法的检测误差较大，说明m-LAMP-LFB是一种检测金黄色葡萄球菌并区分MRSA和MSSA的有效方法。
表2：三种检测方法的检测效力比较
对比例1：使用LAMP-LFB分别检测MSSA和MRSA
在本实施例中，对MSSA和MRSA分别采用单独的LAMP(即single LAMP)进行目的基因扩增，然后再进行LFB的检测。首先，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取S.aureus(MSSA，ATCC 25923)和MRSA(ATCC 43300)的基因组DNA，使用Nano drop ND-2000检测提取的基因组DNA中DNA的含量，使用双蒸水将基因组DNA的浓度稀释为10pg/μl作为DNA模板。然后再使用25μl反应体系进行LAMP反应，对MSSA针对femA基因进行LAMP扩增，对MRSA针对mecA基因进行LAMP扩增。25μl反应体系(femA基因)包括以下成分：0.4μM femA-F3，0.4μM femA-B3(以上均为外引物outer primer，上述浓度是指终浓度)；0.8μM femA-LF*，0.8μM femA-LB(以上均为介环引物loop primer，上述浓度是指终浓度)；1.6μM femA-FIP*，1.6μM femA-BIP(以上均为内引物inner primer，上述浓度是指终浓度),0.4mM biotin-14-dCTP,1μl(8U)of Bst DNA聚合酶,12.5μl 2×反应缓冲液和1μl DNA模板。25μl反应体系(mecA基因)包括以下成分：0.4μM mecA-F3，0.4μM mecA-B3(以上均为外引物outer primer，上述浓度是指终浓度)；0.8μM mecA-LF*，0.8μM mecA-LB(以上均为介环引物loop primer，上述浓度是指终浓度)；1.6μM mecA-FIP*，1.6μM mecA-BIP(以上均为内引物inner primer，上述浓度是指终浓度),0.4mM biotin-14-dCTP,1μl(8U)of Bst DNA聚合酶,12.5μl 2×反应缓冲液和1μl DNA模板。对femA基因的LAMP扩增，DNA模板来自于S.aureus(MSSA，ATCC 25923)、Pseudomonas aeruginosa(绿脓假单胞菌，阴性对照)、Enterococcus faecalis(粪肠球菌，阴性对照)和双蒸水(空白对照)。对mecA基因的LAMP扩增，DNA模板来自于MRSA(ATCC43300)、Pseudomonas aeruginosa(绿脓假单胞菌，阴性对照)、Enterococcus faecalis(粪肠球菌，阴性对照)和双蒸水(空白对照)。完成LAMP扩增(条件为63℃孵育1h)之后，使用LFB对扩增产物分别进行检测，LFB的制作方法同实施例1，并同时使用比色指示仪检测m-LAMP产物的显色情况(阳性的m-LAMP产物呈不同深浅的亮绿色，阴性的m-LAMP产物呈无色，空白对照也呈无色)。检测结果如图4和图5所示。在图4中，1组使用的是来自于MSSA的DNA模板，2组使用的是来自于绿脓假单胞菌的DNA模板，3组使用的是来自于粪肠球菌的DNA模板，4组使用的是双蒸水作为DNA模板；在图5中，1组使用的是来自于MRSA的DNA模板，2组使用的是来自于绿脓假单胞菌的DNA模板，3组使用的是来自于粪肠球菌的DNA模板，4组使用的是双蒸水作为DNA模板。图4中，1组的TL1处有深红色条带，说明样本中存在femA基因，即为MSSA阳性；图5中，1组的TL2处有深红色条带，说明样本中存在mecA基因，即为MRSA阳性。
本实施例进而对单独LAMP-LFB的灵敏度进行检测，将从S.aureus(MSSA，ATCC25923)和MRSA(ATCC 43300)提取的基因组DNA分别进行梯度稀释，获得若干待测样品(即DNA模板)，DNA模板(来自于MSSA或MRSA)中DNA的浓度分别为10ng/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL和100ag/μL。完成DNA模板的准备后进行LAMP扩增、LFB检测和比色指示仪检测(方法同本实施例前一段的描述)，实验结果如图6和图7所示，证明单独的LAMP-LFB的检测限值为100fg/μL。
实验例1：最佳反应温度的确定
LAMP的反应温度对反应效率较为重要，在本实验例中，对LAMP的反应温度进行了优化。本实验例分别对famA基因和mecA基因的LAMP温度进行了实验(单独LAMP)，实验方法同对比例1中第一段的描述，不同点为，LAMP反应的温度进行了梯度设计，从60℃到67℃，每1℃设置一个实验点。对femA基因的LAMP扩增，DNA模板(浓度10ng/μl)来自于S.aureus(MSSA，ATCC 25923)、Pseudomonas aeruginosa(绿脓假单胞菌，阴性对照)、Enterococcusfaecalis(粪肠球菌，阴性对照)和双蒸水(空白对照)。对mecA基因的LAMP扩增，DNA模板(浓度10ng/μl)来自于MRSA(ATCC 43300)、Pseudomonas aeruginosa(绿脓假单胞菌，阴性对照)、Enterococcus faecalis(粪肠球菌，阴性对照)和双蒸水(空白对照)。LAMP扩增的效率用LAMP产物的浑浊度来评价(进行实时浑浊度的测量)，实验结果如图8和图9所示，对famA基因的LAMP扩增效率在63to 66℃较高，对mecA基因的LAMP扩增效率在61-67℃较高，综合两者，选取63℃-66℃为最适温度。两套引物都能在63℃-66℃扩增，但考虑到能耗最低原则，所以选择63℃。
实验例2：最佳反应时间的确定
在本实验例中对m-LAMP的最适反应时间进行了研究，本实验例的DNA模板的制备方法、m-LAMP扩增方法和LFB检测同实施例1，不同点在于，将m-LAMP的反应时间调整成了20,30,40或50min。实验结果如图10-图13所示，40min为最佳的m-LAMP反应时间，此时，可实现对100fg/μL的DNA模板中的目的基因检出。所以，采用m-LAMP-LFB的检测方法所需时间为30min的基因组DNA提取，加上40min的m-LAMP扩增，再加上2min的LFB检测，共80min。
实验例3：m-LAMP-LFB的特异性测试
本实验例对49个菌株进行了m-LAMP-LFB检测，49个菌株包括了S.aureus标准菌株(ATCC 25923),11株MSSA临床分离菌株,MRSA标准菌株(ATCC43300),16株MRSA临床分离菌株，以及20个非金黄色葡萄球菌菌株(详见表3)。分别从上述49个菌株中提取基因组DNA，m-LAMP-LFB检测方法同实施例1，不同点为DNA模板采用统一浓度为10pg/μl，检测结果如图14所示(图14中测试的样本从1至50依次为：S.aureus标准菌株,11株MSSA临床分离菌株,MRSA标准菌株,16株MRSA临床分离菌株，以及20个非金黄色葡萄球菌菌株，双蒸水阴性对照)。LFB试纸条上TL1,TL2和CL均有深红色的线条表示MRSA阳性，LFB试纸条上TL1和CL均有深红色的线条(其余部分没有)表示MSSA阳性，LFB试纸条上CL有深红色的线条(其余部分没有)表示阴性。实验结果证实了m-LAMP-LFB检测方法可以准确对MSSA和MRSA的检出，特异性强。
表3：实验用菌株信息(表中缩写含义为：ATCC：American type culturecollection；2nd GZUTCM：the Second Affiliated Hospital,Guizhou University ofTraditional Chinese Medicine；GZCDC：Guizhou Provincial Center for DiseaseControl and Prevention；P：positive；N：negative)
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 贵州中医药大学第二附属医院
<120> 一种同时检测甲氧西林敏感型和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌的系统及其
使用方法
<130> 2020.3.15
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtcctgaaaa taaaaaagca cat 23
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acttccggca aaatgacg 18
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgttcttctt gtagacgttt accttcgaga taacttacaa caacaacttg 50
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acctatctct gctggtttct tctaatgcat ttgatgtacc acc 43
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcaatctttt gctcatttgc 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccatttgaag ttgtttatta tgc 23
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggctcaggta ctgctatc 18
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttgttattta acccaatcat tgc 23
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atgccataca taaatggata gacgtcaaac aggtgaatta ttagcactt 49
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccgaagataa aaaagaacct ctgctttttt gagttgaacc tggtg 45
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
catatgaagg tgtgcttac 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
caagttccag attacaactt 20
Claims (10)
1.一种同时检测甲氧西林敏感型和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌的系统，其特征在于：包括m-LAMP单元和检测单元；所述m-LAMP单元用于在同一反应体系中同时对femA基因和mecA基因进行环介导等温扩增，m-LAMP单元包括对femA基因进行环介导等温扩增的第一引物组合和对mecA基因进行环介导等温扩增的第二引物组合；所述检测单元为用于检测环介导等温扩增后的femA和mecA基因的扩增产物的高分子纳米生物传感器。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测甲氧西林敏感型和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌的系统，其特征在于：所述第一引物组合包括第一外引物对、第一内引物对和第一介环引物对；所述第二引物组合包括第二外引物对、第二内引物对和第二介环引物对；第一内引物对中的上游引物的5′端连接有第一标记分子，第二内引物对中的上游引物的5′端连接有第二标记分子，第一介环引物对中的上游引物的5′端和第二介环引物对中的上游引物的5′端均连接有第三标记分子。
3.根据权利要求2所述的一种同时检测甲氧西林敏感型和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌的系统，其特征在于：所述第一标记分子为地高辛，所述第二标记分子为羧基荧光素，所述第三标记分子为生物素。
4.根据权利要求3所述的一种同时检测甲氧西林敏感型和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌的系统，其特征在于：所述高分子纳米生物传感器为高分子纳米侧向流生物传感器，高分子纳米侧向流生物传感器包括依次固定在背板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜上设置有用于检测femA基因的第一检测线、用于检测mecA基因的第一检测线和质控线。
5.根据权利要求4所述的一种同时检测甲氧西林敏感型和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌的系统，其特征在于：所述第一检测线上固定有地高辛抗体，所述第二检测线上固定有羧基荧光素抗体，所述质控线上固定有生物素偶联的牛血清蛋白；所述结合垫上包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的一种同时检测甲氧西林敏感型和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌的系统，其特征在于，所述第一引物组合的序列信息如下：
第一外引物对中的上游引物：5′-GTCCTGAAAATAAAAAAGCACAT-3′；
第一外引物对中的下游引物：5′-ACTTCCGGCAAAATGACG-3′；
第一内引物对中的上游引物：5′-Dig-TGTTCTTCTTGTAGACGTTTACCTTCGAGATAACTTACAACAACAACTTG-3′；
第一内引物对中的下游引物：5′-ACCTATCTCTGCTGGTTTCTTCTAATGCATTTGATGTACCACC-3′；
第一介环引物对中的上游引物：5′-Biotin-TCAATCTTTTGCTCATTTGC-3′；
第一介环引物对中的下游引物：5′-CCATTTGAAGTTGTTTATTATGC-3′；
所述第二引物组合的序列信息如下：
第二外引物对中的上游引物：5′-GGCTCAGGTACTGCTATC-3′；
第二外引物对中的下游引物：5′-TTGTTATTTAACCCAATCATTGC-3′；
第二内引物对中的上游引物：5′-FAM-ATGCCATACATAAATGGATAGACGTCAAACAGGTGAATTATTAGCACTT-3′；
第二内引物对中的下游引物：5′-CCGAAGATAAAAAAGAACCTCTGCTTTTTTGAGTTGAACCTGGTG-3′；
第二介环引物对中的上游引物：5′-Biotin-CATATGAAGGTGTGCTTAC-3′；
第二介环引物对中的下游引物：5′-CAAGTTCCAGATTACAACTT-3′；
其中，Dig为地高辛，FAM为羧基荧光素，Biotin为生物素。
7.根据权利要求6所述的一种同时检测甲氧西林敏感型和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌的系统，其特征在于，所述m-LAMP单元还包括链移位型聚合酶和DNA模板，所述DNA模板来自于待检测样品的基因组DNA。
8.根据权利要求7所述的一种同时检测甲氧西林敏感型和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌的系统，其特征在于，所述m-LAMP单元的工作温度为63℃，所述m-LAMP单元的工作时长为40min。
9.根据权利要求8所述的一种同时检测甲氧西林敏感型和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌的系统，其特征在于，系统的检测下限为100fg/μL。
10.根据权利要求9所述的一种同时检测甲氧西林敏感型和甲氧西林耐药型金黄色葡萄球菌的系统的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从待检测样品中获取DNA模板；
(2)使用m-LAMP单元对DNA模板中的femA基因和mecA基因在同一反应体系中同时进行环介导等温扩增，获得m-LAMP产物；
(3)使用检测单元检测m-LAMP产物中的femA基因和mecA基因；第一检测线、第二检测线和质控线同时显色，判定为MRSA阳性；第一检测线和质控线同时显色，且第二检测线未显色，判定为MSSA阳性；仅有质控线显色，判定为待检测样品中无金黄色葡萄球菌。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111778359A (zh) * | 2020-07-23 | 2020-10-16 | 贵州中医药大学第二附属医院 | 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的系统及其使用方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006271370A (ja) * | 2005-03-02 | 2006-10-12 | Kitasato Inst:The | 黄色ブドウ球菌とメチシリン耐性菌の検出方法及びキット |
| CN102424836A (zh) * | 2011-11-17 | 2012-04-25 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 金黄色葡萄球菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒 |
| CN103421898A (zh) * | 2013-08-08 | 2013-12-04 | 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 |
| US20140356859A1 (en) * | 2011-04-08 | 2014-12-04 | American University Of Cairo (Auc) | Detection of nucleic acids using unmodified gold nanoparticles |
| CN106222248A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-12-14 | 宁波基内生物技术有限公司 | 一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物、探针、方法及试剂盒 |
| CN106754905A (zh) * | 2017-01-11 | 2017-05-31 | 博奥生物集团有限公司 | 用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的lamp引物组合及其应用 |
| CN108179210A (zh) * | 2018-03-13 | 2018-06-19 | 苏州百源基因技术有限公司 | 用于检测金黄色葡萄球菌的特异性引物和探针以及实时荧光定量pcr试剂盒 |
-
2020
- 2020-03-27 CN CN202010230525.XA patent/CN111334593A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006271370A (ja) * | 2005-03-02 | 2006-10-12 | Kitasato Inst:The | 黄色ブドウ球菌とメチシリン耐性菌の検出方法及びキット |
| US20140356859A1 (en) * | 2011-04-08 | 2014-12-04 | American University Of Cairo (Auc) | Detection of nucleic acids using unmodified gold nanoparticles |
| CN102424836A (zh) * | 2011-11-17 | 2012-04-25 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 金黄色葡萄球菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒 |
| CN103421898A (zh) * | 2013-08-08 | 2013-12-04 | 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 |
| CN106222248A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-12-14 | 宁波基内生物技术有限公司 | 一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物、探针、方法及试剂盒 |
| CN106754905A (zh) * | 2017-01-11 | 2017-05-31 | 博奥生物集团有限公司 | 用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的lamp引物组合及其应用 |
| CN108179210A (zh) * | 2018-03-13 | 2018-06-19 | 苏州百源基因技术有限公司 | 用于检测金黄色葡萄球菌的特异性引物和探针以及实时荧光定量pcr试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 申建维等: "多重分子信标环介导等温扩增快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌" * |
| 马晓波等: "mecA、femA基因与MRSA及MRCNS的相关性研究" * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111778359A (zh) * | 2020-07-23 | 2020-10-16 | 贵州中医药大学第二附属医院 | 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的系统及其使用方法 |
| CN111778359B (zh) * | 2020-07-23 | 2023-06-20 | 贵州中医药大学第二附属医院 | 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的系统及其使用方法 |
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