CN107964565A - 一种用于检测10种临床感染常见病原菌的核酸质谱方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测10种临床感染常见病原菌的引物系统。使用该检测体系，对病原菌感染患者的血液或体液(胸水，腹水，引流液，关节液，脑脊液)感染样本进行检测，检测结果结合其他临床指标，可为临床医师早期诊断，合理使用抗生素提供参考，避免延误治疗及抗生素不规范使用。本发明能在两个反应体系内对10种不同病原菌的毒力因子基因位点同时进行检测，较测序、实时荧光定量PCR等技术成本更低，操作更简便，准确度和灵敏度提高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于确定10种感染常见病原菌菌属的特异性基因位点的检测方法及产品，具体而言是利用多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，对临床感染常见病原菌相关的10种菌属的特异性基因位点进行检测的方法及相应的试剂盒。
背景技术
由病原微生物引起的感染性疾病严重威胁着人类健康，其中以细菌性疾病最为常见，而细菌性临床感染以起病急、病情重、病死率高而受到普遍重视。提高救治率的前提是明确感染病原菌，选择敏感性药物进行针对性治疗。目前临床感染的诊断主要依赖血培养，然后将培养阳性菌液转到固体培养基上进行分离，再通过菌落特征、形态识别、生化反应等方法开展细菌种类鉴定和药物敏感性试验，完成上述流程至少需要2～3天，且标本采集、送检、培养过程中易受到众多因素的干扰，易污染且阳性率不高，这将贻误患者的最佳治疗时机。急需快速、敏感、准确的临床感染诊断方法和技术。
由于目前血培养鉴定周期过长，临床医生在实验室鉴定结果报告出来之前常根据经验，选用一种或多种抗生素进行治疗，然后根据疗效调整用药种类，但是这种盲目用药导致耐药性细菌逐年增加，严重影响了感染性疾病的控制和治疗。国内外研究表明，许多革兰氏阴性需氧杆菌对广谱的青霉素普遍有耐药性，对氨基糖甙类有很高的耐药性，第三代头孢菌素的效果亦有所降低。经研究证实，减少抗生素的使用与咽部定植的青霉素耐受肺炎链球菌的减少有密切关系，减少大环内酯类药物的使用减少了耐红霉素得化脓链球菌，耐头孢菌素类药物和喹诺酮类药物的肠杆菌科细菌的减少与这两类处方药的使用趋势相关。因此早期及时准确的鉴定出临床感染致病菌的种类能够帮助临床医生有针对性的选择敏感抗生素，减少或避免抗生素过度应用，延缓耐药菌株出现。
重症患者病情重，病程长，不可避免的会经历反复手术、长期借助于呼吸机等治疗手段，使患者本身的免疫系统受损。另外，在手术过程中使用广谱抗生素的频率增加，会导致体内菌群失调，一些耐药性比较强的菌株日益增殖。而且，由于体内长期插入各种医疗器械，侵入性治疗手段多，接触病原菌的机会大大增加，在患者免疫力比较低的情况下，很容易发生感染，严重者会诱发全身器官衰竭，会加大患者死亡的风险。因此，血液中病原微生物的快速鉴定对临床医生及时采取针对性治疗措施，降低重症患者死亡率具有重要意义。
目前国际上，实验室鉴定细菌病原微生物通行的金标准依然是血培养法，除此之外，常用的方法还有病原体蛋白多肽特征指纹图谱(蛋白质质谱)和荧光定量PCR技术。
病原体蛋白多肽特征指纹图谱：此方法通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry，MALDI-TOF MS)对病原体中的蛋白多肽进行检测。其具体方法是首先进行血培养，然后分离单菌落，裂解后进行多肽富集，再将纯化后的多肽样品置于靶板上，与基质形成结晶，经激光电离后，结晶释放出的多肽离子在高压电场的加速下飞过真空管道，检测系统对样品中不同记录大小的肽链到达检测器所用的时间，质量小的肽链飞行时间短，反之较长，通过软件将飞行时间转换为分子量后，可绘制出相应多肽图谱。因为不同菌种裂解后形成的多肽种类和数量均不相同，所以每种细菌都有其特征性的指纹图谱。被检样品的检测结果通过软件与数据库中存贮的已知菌种的指纹图谱进行比对,计算相似度，以此实现对被测样品中菌株的鉴定。
该方法也存在一些缺点。首先，指纹图谱中各特征峰所代表的多肽的种类、数量及氨基酸序列均无法获知，所以特异性较差，当被检样品图谱质量不好时(峰高不足，峰型不好，位置偏移和杂峰干扰)，对数据库比对造成很大困难，阻碍评分过程，影响结果的判定；其次，该种鉴定方法仍然需要增菌培养，分离菌落等流程，鉴定周期与血培养相差无几，只是解决了最后对所分离菌落的通量问题，一旦样本在保存和运送中存贮不当，造成细菌死亡，则无法进行多肽的检测；而且，该方法只能对高纯度的菌落进行有效鉴定，很难实现对混合菌的准确鉴定。
实时荧光定量PCR(Real-time PCR)，该方法通过检测不同病原体基因组种属保守序列的差异，实现鉴定不同病原微生物的目的。其优点是标本无需增菌培养，耗时短，准确性高。但是，由于受到荧光检测通道的限制(一次只能检测2到3个位点)，无法满足同时鉴定多种病原微生物的临床需求。
综上所述，建立高效的无需增菌培养可直接对外周血感染致病菌进行鉴定的方法，对指导感染性疾病的精准诊断、精准治疗、精准用药具有十分重要的意义。
发明内容
本发明原理在于：提供了一种联合多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，检测外周血感染致病菌的检测方案。其中：在多重PCR中同时扩增多达10个与外周血感染致病菌毒力因子相关的DNA片段；在单碱基延伸过程中，对多重PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在10个毒力因子特异位点处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与感染常见致病菌毒力因子相关；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而确定各SNP处的基因型。
本发明目的是提供一种用于检测病原菌的PCR引物系统，所述PCR引物系统包含选自如下组的引物(具体序列信息请参见表1-2)：
1)扩增肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)特异性序列的引物SEQ ID No：1和SEQ IDNo：2，延伸引物SEQ ID No：21；
2)扩增鲍曼不动杆菌(A.baumannii)特异性序列的引物SEQ ID No：3和SEQ IDNo：4，延伸引物SEQ ID No：22；
3)扩增屎肠球菌(E.faecium)特异性序列的引物SEQ ID No：5和SEQ ID No：6，延伸引物SEQ ID No：23；
4)扩增肺炎链球菌(S.pneumonia)特异性序列的引物SEQ ID No：7和SEQ ID No：8，延伸引物SEQ ID No：24；
5)扩增粪肠球菌(E.faecalis)特异性序列的引物SEQ ID No：9和SEQ ID No：10，延伸引物SEQ ID No：25；
6)扩增大肠埃希菌(E.coli)特异性序列的引物SEQ ID No：11和SEQ ID No：12，延伸引物SEQ ID No：26；
7)扩增金黄色葡萄球菌(S.aureus)特异性序列的引物SEQ ID No：13和SEQ IDNo：14，延伸引物SEQ ID No：27；
8)扩增变形杆菌(P.mirabilis)特异性序列的引物SEQ ID No：15和SEQ ID No：16，延伸引物SEQ ID No：28；
9)扩增表皮葡萄球菌(S.epidermidis)特异性序列的引物SEQ ID No：17和SEQ IDNo：18，延伸引物SEQ ID No：29；和/或
10)扩增铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)特异性序列的引物SEQ ID No：19和SEQ IDNo：20，延伸引物SEQ ID No：30。
同时，还提供了一种同时检测10种感染常见致病菌毒力因子基因位点的引物系统或引物组，所述引物系统或引物组包含如表1-2所示序列。
表1
其中，各位点对应的延伸引物及延伸产物分子量如表2所示。
表2
在一个实施方案中，上述PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'段加入10bp的tag(ACGTTGGATG)，例如，PCR引物SEQ ID NO:1的5'端加入保护碱基序列即为5'-ACGTTGGATGGACGATGCTACTTATCC-3’。在另一个具体实施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。
本发明第二个目的是使用上述引物来检测临床感染致病菌的方法，包括如下步骤：
(1)多重PCR：使用特异性的PCR引物，在两个反应体系中，对10种病原菌相关的毒力因子基因位点所在DNA区域同时进行扩增，得到含10处毒力因子基因位点所在DNA区域的PCR产物；
(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；
(3)单碱基延伸：使用10条特异性的延伸引物，在两个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的毒力因子特异位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与毒力因子特异位点处的基因型互补配对；
(4)延伸产物纯化：对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；
(5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行进行检测；
其中，所述10个与病原菌致病相关毒力因子基因特异位点分别是：Klebsiellapneumonia毒力因子khe基因位点(4212.8-T)、Acinetobacter baumannii毒力因子OXA基因位点(5121.4-T)、Enterococcus faecium毒力因子ddl基因位点(4620.9-A)、Streptococcus pneumonia毒力因子Lyt基因位点(4815.2-G)、Enterococcus faecalis毒力因子ddl基因位点(5169.4-T)、Escherichia coli毒力因子phoA基因位点(7093.6-A)、Staphylococcus aureus毒力因子nuc基因位点(7942.2-T)、Proteus mirabilis毒力因子ureR基因位点(7472.7-A)、Stagphylococcus epidermidis毒力因子nuc基因位点(6357.2-T)、Pseudomonas aeruginosa毒力因子ecfX基因位点(6735.4-T)。
同时，本发明也提供了一种检测病原菌的方法，具体步骤包括：
(1)多重PCR：使用上述引物系统中的部分或全部扩增引物，在含有病原菌DNA的反应体系中进行扩增；
(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；
(3)单碱基延伸：使用上述引物系统中的部分或全部延伸引物对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的毒力因子特异位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与毒力因子特异位点处的基因型互补配对；
(4)延伸产物纯化：对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；
(5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行进行检测。
本发明所述“病原菌”可来源于生物样本或非生物样本，生物样本例如离体病灶组织，患者血液、体液等，非生物样本例如食物，水源，空气，土壤等等。
本发明所述“检测病原菌”或“病原菌检测”即可以是疾病/健康状况诊断或治疗目的的病原菌检测，也可以是非诊断或治疗目的的病原菌检测，例如环境监测，食物安全监测等。
本发明第三个目的是提供前述检测体系检测临床10种常见感染病原菌相关的毒力因子基因位点的用途。
本发明优点和效果如下：
1.敏感：本发明综合了多重PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体，既可通过PCR技术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本，综合了两种技术的优点，远远优于单独使用PCR检测多态性基因位点，因此它的检测灵敏度很高。
2.特异：单碱基延伸又称为“微测序”，使用特异性探针对DNA分子进行识别，具有测序技术的高准确性，特异性好、假阳性低等特点；特别的，不同于测序技术延伸数百个碱基，该技术仅延伸单个碱基，出错概率更低；
3.简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染；
4.快速：速度快、高通量，可在5-6小时内完成数百个样本的检测。
5.本发明对病原菌感染患者血液样本进行检测，分别得到具有不同毒力因子基因位点的检测结果，其中患者可能是单重细菌感染，也可能是多重细菌混合感染。从而为临床治疗提供参考信息。
6.本发明克服了以往技术无法同时鉴定多种病原微生物的缺陷,成本低廉。
原理与定义：
本发明提供了一种联合多重PCR、单碱基延伸和质谱检测等技术，检测10种临床常见感染病原菌相关的毒力因子基因位点的检测方案。其原理在于：
在多重PCR步骤中，通过设计并使用合适的引物，对10种病原菌相关的毒力因子基因位点所在DNA区域同时进行扩增，得到含10处毒力因子基因位点所在DNA区域的PCR产物。
在单碱基延伸步骤中，对上一步多重PCR的产物依次进行纯化和多重单碱基延伸。其中，延伸引物共10条，分别与10个毒力因子特异位点对应，并在对应位点处延伸一个与该位点处的碱基互补配对的核苷酸(如某毒力因子特异位点处是A碱基，将在对应的延伸引物上延伸T核苷酸)。在单碱基延伸步骤中，采用ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一个碱基后，延伸引物将终止延伸。
在质谱检测过程中，单碱基延伸产物在纯化后，点至含基质的靶片，并在真空环境中被激光激发，通过飞行管至检测器。分子量越大的物质，飞行速度越慢，通过飞行管的时间越长，到达检测器的时间越晚。
术语“保护碱基”，指在PCR引物的5'端添加碱基序列，增大PCR引物的分子量，避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口，干扰检测效果。此外，保证各延伸引物的分子量及延伸产物分子量相差大于25道尔顿以上，以避免局部区域质谱峰过于集中而产生干扰和分辨不清，从而提高检测效果。
术语“碱性磷酸酶消化”指用于减少待检体系内其他物质对后续反应影响的处理步骤。碱性磷酸酶的作用是降解前面反应中剩余的dNTP，避免继续作为单碱基延伸酶的底物，从而不干扰参与单碱基延伸反应。
术语“单碱基延伸”，指在体系中加入延伸引物和ddNTP，ddNTP与延伸引物的3'端连接形成延伸产物(即引物延伸了一个碱基)，根据碱基互补配对原则，由毒力因子特异位点处碱基类型决定具体连接何种ddNTP，这个过程类似于PCR过程中dNTP根据互补链的碱基组成，逐个添加到PCR引物上。由于“ddNTP”与普通dNTP不同的是，在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基，不能同后续的ddNTP形成磷酸二酯键，因而，延伸引物仅在特异位点处连接一个ddNTP后即终止延伸，而不能像PCR那样，不断的往下延伸，因此称之为单碱基延伸。因此单碱基延伸产生的是延伸引物仅延伸一个碱基后的核苷酸片段。
术语“ddNTP”是一种特殊的核苷酸，本技术方案共采用四种，它们之间存在分子量差异，如ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP的分子量分别是271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da。延伸引物根据毒力因子特异位点的碱基不同而延伸不同的核苷酸，将形成分子量差异。通过质谱检测，可分辨出这种差异。
术语“检测窗口”，指可用于质谱检测核苷酸分子量的范围，通常涉及引物的设计参考范围。其中，在设计延伸引物时，对于不同的基因位点，根据这些位点所在DNA区域的序列特点，可以设计出分子量不同的延伸引物和延伸产物，避免不同延伸引物及产物之间由于分子量接近而存在干扰，从而可在一个相对宽阔的检测窗口，如4000-9000Da，实现对多个基因位点的检测。
附图说明
图1为实施例四中，对10个菌株阳性质控品检测质谱图，每种颜色对应从左至右两条虚线，分别是延伸引物、延伸产物的理论峰值。10个毒力因子特异位点的检测结果，其中：
峰1(3941.6)表示肺炎克雷伯杆菌毒力因子khe基因位点反应完的延伸引物SEQID No：21，
峰2(4212.8)表示肺炎克雷伯杆菌毒力因子khe基因位点(T)。
峰3(4293.8)表示屎肠球菌毒力因子ddl基因位点反应完的延伸引物SEQ ID No：23，
峰4(4620.9)表示屎肠球菌毒力因子ddl基因位点(A)。
峰5(4568.0)表示肺炎链球菌毒力因子Lyt基因位点反应完的延伸引物SEQ IDNo：24，
峰6(4815.2)表示肺炎链球菌毒力因子Lyt基因位点(G)。
峰7(4850.2)表示鲍曼不动杆菌毒力因子OXA基因位点未反应完的延伸引物SEQID No：22，
峰8(5121.4)表示鲍曼不动杆菌毒力因子OXA基因位点(T)。
峰9(4898.2)表示粪肠球菌ddl基因位点反应完的延伸引物SEQ ID No：25，
峰10(5169.4)表示粪肠球菌ddl基因位点(T)。
峰11(6086.0)表示表皮葡萄球菌毒力因子nuc基因位点反应完的延伸引物SEQ IDNo：29，
峰12(6357.2)表示表皮葡萄球菌毒力因子nuc基因位点(T)。
峰13(6464.2)表示铜绿假单胞菌毒力因子ecfX基因位点未反应完的延伸引物SEQID No：30，
峰14(6735.4)表示铜绿假单胞菌毒力因子ecfX基因位点(T)。
峰15(6806.4)表示大肠杆菌毒力因子phoA基因位点反应完的延伸引物SEQ IDNo：26，
峰16(7093.6)表示大肠杆菌毒力因子phoA基因位点(C)。
峰17(7145.6)表示变形杆菌毒力因子ureR基因位点反应完的延伸引物SEQ IDNo：28，
峰18(7472.7)表示变形杆菌毒力因子ureR基因位点(A)。
峰19(7671.0)表示金黄色葡萄球菌毒力因子nuc基因位点反应完的延伸引物SEQID No：27，
峰20(7942.2)表示金黄色葡萄球菌毒力因子nuc基因位点(T)。
图2为实施例四中，对阴性对照品检测的质谱图。
图3为实施例四中，对空白水对照检测的质谱图。
图4-9为实施例四中，对病原菌感染患者血液样本检测的质谱图。
图4为实施例四中，对C1样本的检测结果，从左至右两条虚线分别是延伸引物、延伸产物的理论峰值，检测结果显示在分子量6735.4处有A碱基延伸峰。
图5为实施例四中，对C2样本的检测结果，从左至右两条虚线分别是延伸引物、延伸产物的理论峰值，检测结果显示在分子量7942.2处有A碱基延伸峰。
图6为实施例四中，对C3样本的检测结果，从左至右两条虚线分别是延伸引物、延伸产物的理论峰值，检测结果显示在分子量7093.6处有G碱基延伸峰。
图7为实施例四中，对C4样本的检测结果，从左至右两条虚线分别是延伸引物、延伸产物的理论峰值，检测结果显示在分子量4620.9处有T碱基延伸峰。
图8为实施例四中，对C5样本的检测结果，从左至右两条虚线分别是延伸引物、延伸产物的理论峰值，检测结果显示在分子量4212.8处有A碱基延伸峰。
图9为实施例四中，对C6样本的检测结果，从左至右两条虚线分别是延伸引物、延伸产物的理论峰值，检测结果显示在分子量4212.8和5169.4两处均有A碱基延伸峰。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例一：引物设计及合成
针对10个与病原菌致病相关毒力因子基因：Klebsiella pneumonia毒力因子khe基因、Acinetobacter baumannii毒力因子OXA基因、Enterococcus faecium毒力因子ddl基因、Streptococcus pneumonia毒力因子Lyt基因、Enterococcus faecalis毒力因子ddl基因、Escherichia coli毒力因子phoA基因、Staphylococcus aureus毒力因子nuc基因、Proteus mirabilis毒力因子ureR基因、Stagphylococcus epidermidis毒力因子nuc基因、Pseudomonas aeruginosa毒力因子ecfX基因相关的特异位点，设计对应特异性PCR引物核心序列(SEQ ID No：1至SEQ ID No：20)和特异性延伸引物核心序列(SEQ ID No：21至SEQID No：30)。
其中，为了避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果，每条PCR引物的5'端可以在核心序列(SEQ ID No：1至SEQ ID No：20)的基础上增加一定数目的碱基，常见如10bp的tag(ACGTTGGATG)，以使PCR引物的分子量增大，从而超出质谱仪检测窗口。
相关引物在生工生物工程(上海)有限公司进行合成。
以下检测过程参照毅新博创(北京)科技有限公司核酸质谱检测系统进行操作。
实施例二：样本DNA提取
收集临床病原菌感染患者(热(者(热染样或低温(低温热染样本寒战,白细胞增多(计数大于10.0多样本9/L,特别有“核左移”时),皮肤黏膜出血、昏迷、多器官衰竭,血压降低,C-反应蛋白升高及呼吸加快,血液病患者出现粒细胞减少,血小板减少等,或同时具备上述几种体征)血液样本共6例。其中DNA提取等按照说明书要求，在患者寒战，发热，体温达到最高点时采集人静脉血，并以EDTA抗凝管收集。按照说明书要求，采集的血液在2-8℃保存不应超过一周，-20℃保存不应超过一个月，尽量采用新鲜血液进行细菌基因组DNA提取。由于本检测系统不提供细菌基因组DNA提取试剂，因此采用商业化的核酸提取试剂盒(QIAGEN公司DNeasy Blood and Tissue kit)，从每位患者的1.5mL血浆中提取细菌基因组DNA，以NanoDrop 2000(Thermo公司)定量，并标化至10ng/ul(分别为C1-C6)。按照说明书要求，提取后的细菌基因组DNA，在2-8℃保存不应超过一周，-20℃保存不应超过两年，-80℃可长期保存，应避免反复冻融。
实施例三：生物实验
使用毅新博创公司PCR仪，对临床感染10种常见病原菌毒力因子基因相关的基因位点进行检验。
检测系统中用于PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸的组分为：
| 序号 | 组分名称 | 主要成分 |
| 1 | PCR混合物 | dNTPs、MgCl2 |
| 2 | PCR引物混合液 | PCR引物 |
| 3 | PCR酶 | Taq酶 |
| 4 | SAP酶混合物 | SAP酶 |
| 5 | 延伸引物混合液 | 延伸引物 |
| 6 | 延伸酶混合物 | iPLEX酶、ddNTPs |
| 7 | 阳性质控品 | 10种细菌基因组DNA(10ng/ul) |
按说明书，具体操作方法如下：
1.PCR扩增
1.1在PCR配液区，按照待检样品数(含阳性质控品、阴性对照、空白对照)准备200ulPCR反应管，并在管上标记样本编号。
1.2从试剂盒中取出PCR混合物、PCR引物混合液、PCR酶，使其自然解冻，涡旋振荡充分混匀，简短离心。
1.3PCR反应体系5μL，包括10×Buffer 0.5μL，25mmol/L dNTP 0.1μL，25mmol/LMgCl2 0.4μL，0.5μmol/L混合引物1μL，5U/μL Taq酶0.2μL(agena公司)，DNA模板1μL(步骤1.4中加入)，ddH2O1.8μL。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，应适当放大混合物的配制体积。例如有10份待测样品时，可按10.5-11份样品配制混合物。
1.4在PCR扩增区内向每管混合物中加入1μL待测样品，使每份PCR反应体系总体积为5ul。其中，阴性对照为健康人基因组DNA，空白对照为纯化水。
1.5将PCR反应管置于PCR扩增仪中，反应条件：95℃预变性2min，95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。
2.SAP酶消化
PCR反应结束后，进行虾碱性磷酸酶反应，共7μL体系，其中虾碱性磷酸酶混合液2μL(10X缓冲液0.17μL，1.7U/μL虾碱性磷酸酶0.3μL，无菌超纯水1.53μL)，原PCR反应产物5μL。PCR仪上37℃反应40min，80℃孵育5min,使虾碱性磷酸酶失活。
3.单碱基延伸
3.1在虾碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，总体积共9μL，其中上一步反应产物7μL，加入延伸混合引物2μL(延伸引物1μL，iPLEX缓冲液0.2μL，iPLEX终止液0.2μL，iPLEX酶0.041μL，无菌超纯水0.559μL)。
3.2将PCR反应管置于PCR扩增仪中，反应条件为94℃预变性30s，95℃变性5s，58℃退火5s，80℃延伸5s，内部循环5次，共40个外部循环，72℃延伸3min，4℃保存。
4.树脂纯化
PCR反应完成后，反应产物中加入16μL超纯水，振荡混匀，2000r/min，离心3min，将次25μL体积混合液全部转入384孔板中。加入6mg树脂于延伸产物中，封膜，反转摇匀仪上进行树脂纯化反应30min,反应完成后，2000r/min，离心3min。
5.点样
使用毅新博创(北京)科技有限公司生产的Clin-TOF型飞行时间质谱仪自动点样至芯片。
实施例四：上机检测及结果判读。
使用毅新博创(北京)科技有限公司生产的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的芯片进行检测和结果判断。
如前述表2所示，10条延伸引物及它们在10个基因特异位点上产生的延伸产物具有不同的分子量，这些分子量对应各自的质谱峰，若在某分子量处出现质谱峰，则判断为存在与该分子量对应的物质(延伸引物或产物)：
判断标准：
(1)单碱基延伸位点处检测到相应的延伸峰则判读为该种细菌感染，单碱基延伸位点处无延伸峰出现则判读为无该种细菌感染。
(2)若延伸峰仅出现一个，则判断为所出现质谱峰对应的菌株的单重感染；
(3)阴性对照和空白对照指控后，若延伸峰出现多个，则判断为多重细菌感染。
质谱结果如图所示，其中图1为10个菌株阳性质控品质谱图，图2为阴性对照的质谱图，图3为空白水对照的质谱图，图4-9为病原菌感染患者血液样本的质谱图。
各样本的检测结果如下表所示：
在6例患者中，共检测出铜绿假单胞菌感染1例(样本C1)，金黄色葡萄球菌感染1例(样本C2)，大肠杆菌感染1例(样本C3)，屎肠球菌感染1例(样本C4)，肺炎克雷伯杆菌感染1例(样本C5)，粪肠球菌混合肺炎克雷伯杆菌感染1例(样本C6)。检测结果与中国人民解放军301医院微生物科梅利埃血培养系统培养结果一致。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军总医院
<120> 一种用于检测10种临床感染常见病原菌的核酸质谱方法
<160> 30
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 1
gacgatgcta cttatcc 17
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 2
ctgctcggtg ttatt 15
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 3
taatgctttg atcgg 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 4
tgcacttcat cttgg 15
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 5
tcggcattac aaagg 15
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 6
aagtcgtccg aacat 15
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 7
ggcattagcc gtgagca 17
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 8
atttcgcctg agttgt 16
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 9
tgtcgctttc tatgatta 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 10
cgcttgatga gctacttc 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 11
tcagttggtg agcgatgc 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 12
ttaggaacac ccgtttaac 19
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 13
gctcagcaaa tgcatcacaa a 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 14
gcacttgctt cagggccata 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 15
cgctttatcc tgtttgag 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 16
tataccgcac tacccatc 18
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 17
ttgagcttgt cattggttcg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 18
tgtagaggtt gcacgtcgag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 19
atgcctatca ggcgttccat 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> PCR引物
<400> 20
ggcgatctgg aaaagaaatg 20
<210> 21
<211> 13
<212> DNA
<213> 延伸引物
<400> 21
cggctatctc tgg 13
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> 延伸引物
<400> 22
cagatatcgg taccca 16
<210> 23
<211> 14
<212> DNA
<213> 延伸引物
<400> 23
tcgaagttgc tgta 14
<210> 24
<211> 15
<212> DNA
<213> 延伸引物
<400> 24
cactggctac tggta 15
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> 延伸引物
<400> 25
cacgattgaa atgcaa 16
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 延伸引物
<400> 26
ggccattatc acggtggtag gt 22
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 延伸引物
<400> 27
agactattat tggttgatac acctg 25
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 延伸引物
<400> 28
ggagaaggta aaatagtcac tgc 23
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 延伸引物
<400> 29
ccgcttctaa cacaggagta 20
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 延伸引物
<400> 30
tggaacgaca gcttcaacga g 21
Claims (9)
1.一种用于检测病原菌的PCR引物系统，其特征在于，所述PCR引物系统包含选自如下组的引物：
1)扩增肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)特异性序列的引物SEQ ID No：1和SEQ ID No：2，延伸引物SEQ ID No：21；
2)扩增鲍曼不动杆菌(A.baumannii)特异性序列的引物SEQ ID No：3和SEQ ID No：4，延伸引物SEQ ID No：22；
3)扩增屎肠球菌(E.faecium)特异性序列的引物SEQ ID No：5和SEQ ID No：6，延伸引物SEQ ID No：23；
4)扩增肺炎链球菌(S.pneumonia)特异性序列的引物SEQ ID No：7和SEQ ID No：8，延伸引物SEQ ID No：24；
5)扩增粪肠球菌(E.faecalis)特异性序列的引物SEQ ID No：9和SEQ ID No：10，延伸引物SEQ ID No：25；
6)扩增大肠埃希菌(E.coli)特异性序列的引物SEQ ID No：11和SEQ ID No：12，延伸引物SEQ ID No：26；
7)扩增金黄色葡萄球菌(S.aureus)特异性序列的引物SEQ ID No：13和SEQ ID No：14，延伸引物SEQ ID No：27；
8)扩增变形杆菌(P.mirabilis)特异性序列的引物SEQ ID No：15和SEQ ID No：16，延伸引物SEQ ID No：28；
9)扩增表皮葡萄球菌(S.epidermidis)特异性序列的引物SEQ ID No：17和SEQ ID No：18，延伸引物SEQ ID No：29；和/或
10)扩增铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)特异性序列的引物SEQ ID No：19和SEQ ID No：20，延伸引物SEQ ID No：30。
2.一种检测临床感染10种常见致病菌相关毒力因子的引物系统，其特征在于，所述引物系统包含SEQ ID No：1-SEQ ID No：30所示引物。
3.根据权利要求1或2所述的引物系统，其特征在于，其中PCR引物序列为核心序列，其5'端可包括5-15个保护碱基，所述保护碱基序列优选为10bp的tag：ACGTTGGATG。
4.根据权利要求1-3任一项所述的引物系统，其中延伸引物5'端可增加作为接头的碱基序列，所述接头的碱基序列优选为1-15个碱基，更优选为1-3个碱基。
5.由权利要求1-4任一项所述的引物系统制备的用于检测临床常见病原菌的检测产品。
6.根据权利要求5所述的检测产品，其特征在于，所述检测产品为检测试剂盒，包括：
(1)用于提取细菌基因组DNA的试剂；
(2)用于PCR的反应试剂。
7.根据权利要求5或6任一项所述的检测产品，其特征在于，其还可包括：阴性质控品，和/或阳性质控品。
8.一种检测病原菌的方法，其特征在于，具体步骤包括：
(1)多重PCR：使用权利要求1-4任一项所述引物系统中的扩增引物，在含有病原菌DNA的反应体系中进行扩增；优选为，在两个反应体系中，对10种病原菌致病相关的毒力因子基因特异位点所在DNA区域同时进行扩增，得到含10处毒力因子基因位点所在DNA区域的PCR产物；
(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；
(3)单碱基延伸：使用权利要求1-4任一项所述引物系统中的延伸引物对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的毒力因子特异位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与毒力因子特异位点处的基因型互补配对；优选使用SEQ ID No：21-30所示10条特异性的延伸引物，在两个反应体系中，进行上述单碱基延伸；
(4)延伸产物纯化：对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；
(5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行进行检测；
其中，所述10种病原菌致病相关毒力因子基因特异位点分别是：Klebsiellapneumonia毒力因子khe基因位点(4212.8-T)、Acinetobacter baumannii毒力因子OXA基因位点(5121.4-T)、Enterococcus faecium毒力因子ddl基因位点(4620.9-A)、Streptococcus pneumonia毒力因子Lyt基因位点(4815.2-G)、Enterococcus faecalis毒力因子ddl基因位点(5169.4-T)、Escherichia coli毒力因子phoA基因位点(7093.6-A)、Staphylococcus aureus毒力因子nuc基因位点(7942.2-T)、Proteus mirabilis毒力因子ureR基因位点(7472.7-A)、Stagphylococcus epidermidis毒力因子nuc基因位点(6357.2-T)、Pseudomonas aeruginosa毒力因子ecfX基因位点(6735.4-T)。
9.权利要求1-4任一项所述引物系统在制备病原菌检测产品中的应用，所述病原菌检测产品优选为应用于临床检测常见致病菌的产品。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180427 |
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