CN103725761B - 一种b族链球菌(gbs)核酸检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
一种b族链球菌(gbs)核酸检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种B族链球菌(GBS)核酸检测试剂盒及检测方法，该试剂盒含有：单引物等温扩增反应酶（SPIA）：Bst？DNA聚合酶，RNase？H；SPIA反应液：dNTPs，引物，Bst酶Buffer，RNase？H？Buffer；RIDA反应体系：切刻内切酶选择Nb.BtsI及探针；SSPIA反应引物：P1．5ˊ-3ˊUCGAUCAUGTTAGCCGC、5ˊ端后八个碱基是RNA？其余碱基是DNA，RIDA探针:5ˊ-3’GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT，内质控SPIA引物：P2.？5ˊ-3ˊCUGUCGAUCGCAATCGG、5ˊ端后八个碱基是RNA？其余碱基是DNA，内质控RIDA探针：5ˊ-3ˊGACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC，内质控为插入了人GAPDH基因的质粒DNA。本发明采用SPIA与RIDA技术相结合的方法检测B族链球菌(GBS)核酸序列的方法，具有灵敏，特异，快速的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，公开了一种B族链球菌(GBS)的核酸检测试剂盒及检测方法。
背景技术
B族链球菌为兼性厌氧的革兰氏阳性链球菌，正常妇女带菌率达30%左右，属于条件致病菌，孕妇感染可通过产道传播给新生儿，引起新生儿的败血症、脑膜炎、肺炎等，死亡率极高，是目前引发新生儿感染最主要的致病菌之一。本研究计划用于检测生殖道和直肠分泌物样品中的B族链球菌DNA，可用于B族链球菌感染的辅助诊断及疗效监控。该项检测的适用人群为妊娠34-37周的孕妇。B族链球菌感染的特异性常用诊断方法有两种，即细菌分离鉴定以及分子生物学技术。细菌的分离培养繁杂费时，无法满足大量样本的快速诊断。近年来分子生物学技术尤其以核酸等温扩增技术为基础的检测技术发展迅猛。传统PCR及实时荧光定量PCR技术在检测B族链球菌核酸时一方面操作耗时，另一方面大量扩增产物DNA容易造成交叉污染，引起后续试验的假阳性，此外传统PCR技术对仪器要求比较高，不易在基层医院进行推广。本试剂盒首次将单引物等温扩增（SPIA）与等温信号方法技术（RIDA）两种核酸检测技术进行了结合，两种技术结合的优势如下：
第一，单纯的扩增反应通过产生大量的核酸产物来实现对目标基因的检测，该模式容易产生污染，而新方法通过扩增结合信号放大的模式来实现对目标基因的检测，第一步扩增的过程可以控制在很短的时间内，使产物的量控制在一定范围之内，然后通过后续的信号放大系统来判定结果。同时由于SPIA扩增产物3’端被RNase H切割后缺失部分序列因而不会作为扩增模板污染后续反应，所以假阳性大大降低。
第二，通过在RIDA技术之前引入SPIA增强了RIDA的灵敏度，同时两种方法的结合相对于单纯的扩增反应特异性有了很大提高，即使第一步出现非特异扩增也可以通过第二步信号放大加以纠正。再通过对反应时间的控制（减少第二步反应时间）可以使得第二步反应即使单独出现非特异也不会有信号显示从而也最大程度的降低了第二步反应出现非特异的可能性。由于两步同时出现非特异的可能性非常小，特别是由于第一步扩增产物片段较小，针对扩增产物的信号放大几乎不可能出现非特异结果。所以这两种方法的结合是一种互补，既提高了灵敏度也增强了特异性。
第三，整个反应可以只需一个水浴锅和一个简易荧光检测器即可实现对结果的判定，有利于在基层医疗检疫机构推广。相比现有的PCR方法，其具有灵敏度高，反应时间短，不依赖特殊仪器等优势，可以实现病原微生物的筛选及快速诊断，便于在基层医院的推广。我们建立了这一技术可实现对病原微生物简便，灵敏，特异，高通量的筛选鉴定。
第四，新方法在反应体系中加入了内质控基因，内质控基因参与样本的DNA提取过程，从而使得结果的判定更加准确。
综上所述，本试剂盒具有灵敏，特异，简便，快捷，高效，不依赖特殊仪器等优势，可以实现对B族链球菌DNA的筛选及快速诊断，便于在基层医院的推广。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种利用SPIA与RIDA相结合的技术并具有特异，灵敏，快速，简便，高效的B族链球菌DNA核酸检测试剂盒及检测方法。
为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：提供一种B族链球菌DNA核酸检测试剂盒，该试剂盒含有：
（1） SPIA反应酶：Bst DNA聚合酶； RNase H；
（2） SPIA反应液：dNTPs , 引物, Bst酶Buffer, RNase H Buffer；
（3） RIDA反应体系：切刻内切酶选择Nb.BtsI
SPIA反应引物：P1．5'-3'UCGAUCAUGTTAGCCGC 5'端后八个碱基是RNA 其余碱基是DNA
RIDA探针:5'-3’ GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT
内质控SPIA引物 P2. 5'-3'CUGUCGAUCGCAATCGG 5'端后八个碱基是RNA 其余碱基是DNA
内质控RIDA探针：5'-3'GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC
内质控为插入了人GAPDH基因的质粒DNA，内质控同被检测样本同时参与DNA提取过程。
（4） 空白对照为DEPC水
（5） 阴性对照为甲型溶血性（草绿色）链球菌DNA，大肠杆菌DNA
（6） 阳性对照为B族链球菌(GBS)DNA。
该试剂盒，其检测探针5′端标记荧光基团为FAM，3′端标记荧光猝灭基团为TAMARA。内质控探针5′端标记荧光基团为TET，3′端标记荧光猝灭基团为TAMARA。
采用上述试剂盒检测B族链球菌(GBS)核酸的检测方法，包括以下步骤：
（1）DNA 提取：DNA提取采用TAKARA 细菌核酸提取专用试剂盒，提取方法参照说明书进行。提取到的核酸样本利用紫外分光光度计测量浓度，经过换算得到每微升拷贝数。内质控同被检测样本同时参与DNA提取过程。
（2）引物设计：从Genebank下载核酸序列，选择B族链球菌(GBS)保守基因（CAMP），设计合成SPIA引物，引物的5'端后八个碱基是RNA 其余碱基是DNA。
P1:5'-3'UCGAUCAUGTTAGCCGC
RIDA探针:根据前一步SPIA扩增后的单链靶序列设计，探针序列：5'-3’GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT，5′端标记荧光基团为FAM，3′端标记荧光猝灭基团为TAMARA。探针序列下划线部分为切刻内切酶N.BstNBI对应的识别位点。内质控为插入了人GAPDH基因的质粒DNA。内质控SPIA引物 P2.5'-3'CUGUCGAUCGCAATCGG，5'端后八个碱基是RNA 其余碱基是DNA。
内质控RIDA探针：5'-3'GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC 5′端标记荧光基团为TET,3′端标记荧光猝灭基团为TAMARA。
引物和探针由TAKARA公司合成。
（3）反应体系： 在15μLSPIA混和物(包含1mmol/L dNTPs，0.5μmol/L 反应引物,0.5μmol/L 内质控引物，1μlRNase H Buffer，0.08U RNase H，2U Bst DNA聚合酶, 1μl Bst DNA聚合酶Buffer) 中加入1μL 包含检测标本和内质控的DNA,混匀后在水浴锅上60℃加热30min,反应结束后再加入1μL 50pmol/L 反应探针及内质控探针，2μL NEB buffer3 ，5UN.BstNBI酶(NEB公司)。总反应体积达到20μL。在水浴锅上55℃继续反应15min后取出反应管放置在紫外下观察颜色变化。
（4）结果判定：含有样本核酸模板的反应管在紫外下发出黑色荧光（FAM绿色荧光加紫色荧光的混合色），此时样本可判定为阳性。如含有样本的反应管为紫色，此时样本可判定为阴性。如样本反应管发出淡红色荧光则提示样本提取过程中存在抑制反应的成分，结果无效。
具体实施方式
（1）DNA提取：DNA提取采用TAKARA 细菌核酸提取专用试剂盒，提取方法参照说明书进行。提取到的核酸样本利用紫外分光光度计测量浓度，经过换算得到每微升拷贝数。内质控同被检测样本同时参与DNA提取过程。
（2）引物设计：从Genebank下载核酸序列，选择B族链球菌(GBS)保守基因（CAMP），设计合成SPIA引物，引物的5'端后八个碱基是RNA 其余碱基是DNA。
P1:5'-3'UCGAUCAUGTTAGCCGC
RIDA探针: 根据前一步SPIA扩增后的单链靶序列设计，探针序列：5'-3’ GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT 5′端标记荧光基团为FAM, 3′端标记荧光猝灭基团为TAMARA。探针序列下划线部分为切刻内切酶N.BstNBI对应的识别位点。内质控为插入了人GAPDH基因的质粒DNA。内质控SPIA引物 P2. 5'-3'CUGUCGAUCGCAATCGG 5'端后八个碱基是RNA 其余碱基是DNA。
内质控RIDA探针：5'-3'GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC 5′端标记荧光基团为TET, 3′端标记荧光猝灭基团为TAMARA。
引物和探针由TAKARA公司合成。
（3）反应体系： 在15μL SPIA 混和物( 包含1 mmol/L dNTPs,0.5μmol/L 反应引物,0.5μmol/L 内质控引物，1μl RNase H Buffer，0.08U RNase H，2U Bst DNA聚合酶, 1μl Bst DNA聚合酶Buffer) 中加入1μL 包含检测标本和内质控的DNA，混匀后在水浴锅上60 ℃加热30 min,反应结束后再加入1μL 50 pmol/L 反应探针及内质控探针，2μL NEB buffer3，5U N.BstNBI酶(NEB公司)。总反应体积达到20μL。在水浴锅上55℃继续反应15min后取出反应管放置在紫外下观察颜色变化。
（4）结果判定：含有样本核酸模板的反应管在紫外下发出黑色荧光（FAM绿色荧光加紫色荧光的混合色），此时样本可判定为阳性。如含有样本的反应管为紫色，此时样本可判定为阴性。如样本反应管发出淡红色荧光则提示样本提取过程中存在抑制反应的成分，结果无效。
SPIA反应引物
ycgaycaygt tagccgc 17
RIDA探针
gctgagtccc ctttcttgac aat 23
内质控SPIA引物
cygycgaycg caatcgg 17
内质控RIDA探针
gaccgagtct atcggccagc tac 23
Claims (3)
1.一种B族链球菌(GBS)核酸检测试剂盒，本试剂盒方法不以疾病诊断为目的，其特征在于:
该试剂盒含有：
SPIA反应酶：Bst DNA聚合酶； RNase H；
SPIA反应液：dNTPs , 引物, Bst酶Buffer, RNase H Buffer；
RIDA反应体系：切刻内切酶选择Nb.BtsI；
SPIA反应引物：P1．5'-3'UCGAUCAUGTTAGCCGC 5'端后八个碱基是RNA 其余碱基是DNA
RIDA探针:5'-3’ GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT
内质控SPIA引物：P2. 5'-3'CUGUCGAUCGCAATCGG 5'端后八个碱基是RNA 其余碱基是DNA
内质控RIDA探针：5'-3'GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC
内质控为插入了人GAPDH基因的质粒DNA，内质控同被检测样本同时参与DNA提取过程；
空白对照为DEPC水；
阴性对照为甲型溶血性（草绿色）链球菌DNA，大肠杆菌DNA；
阳性对照为B族链球菌(GBS)DNA。
2.根据权利要求1所述的B族链球菌(GBS)核酸检测试剂盒，其特征在于检测探针5′端标记荧光基团为FAM，3′端标记荧光猝灭基团为TAMARA；内质控探针5′端标记荧光基团为TET，3′端标记荧光猝灭基团为TAMARA。
3.一种检测B族链球菌(GBS)核酸的检测方法，本检测方法不以疾病诊断为目的，其特征在于，包括以下步骤：
（1）DNA 提取：DNA提取采用TAKARA 细菌核酸提取专用试剂盒，提取方法参照说明书进行，提取到的核酸样本利用紫外分光光度计测量浓度，经过换算得到每微升拷贝数；内质控同被检测样本同时参与DNA提取过程；
（2）引物设计：从Genebank下载核酸序列，选择B族链球菌(GBS)保守基因CAMP，设计合成SPIA引物，引物的5'端后八个碱基是RNA 其余碱基是DNA；
P1:5'-3'UCGAUCAUGTTAGCCGC
RIDA探针:根据前一步SPIA扩增后的单链靶序列设计，探针序列：5'-3’ GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT 5′端标记荧光基团为FAM, 3′端标记荧光猝灭基团为TAMARA；探针序列下划线部分为切刻内切酶N.BstNBI对应的识别位点；内质控为插入了人GAPDH基因的质粒DNA；内质控SPIA引物 P2. 5'-3'CUGUCGAUCGCAATCGG 5'端后八个碱基是RNA 其余碱基是DNA；
内质控RIDA探针：5'-3'GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC 5′端标记荧光基团为TET, 3′端标记荧光猝灭基团为TAMARA；
引物和探针由TAKARA公司合成；
（3）15 μL SPIA 混和物包含1 mmol/L dNTPs、0.5 μmol/L 反应引物、0.5 μmol/L 内质控引物、1 μL RNase H Buffer、0.08 U RNase H、2 U Bst DNA聚合酶、1 μL Bst DNA聚合酶Buffer；
（4）反应体系：在15 μL SPIA 混和物中加入1 μL 包含检测标本和内质控的DNA, 混匀后在水浴锅上60 ℃加热30 min，反应结束后再加入1 μL 50 pmol/L 反应探针及内质控探针，2 μL NEB buffer3、5U N.BstNBI酶(NEB公司)，总反应体积达到20 μL，在水浴锅上55 ℃继续反应15 min后取出反应管放置在紫外下观察颜色变化；
（5）结果判定：含有样本核酸模板的反应管在紫外下发出FAM绿色荧光加紫色荧光的混合色，即黑色荧光，此时样本可判定为阳性；如含有样本的反应管为紫色，此时样本可判定为阴性；如样本反应管发出淡红色荧光则提示样本提取过程中存在抑制反应的成分，结果无效。
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