CN107164493A - 一种gbs核酸检测试剂盒 - Google Patents

一种gbs核酸检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种GBS核酸检测试剂盒，包括顶部带翻盖(1)的盒体(2)，盒体(2)内从上至下分别设有通过柱塞(3)隔开的裂解区(4)、第一清洗区(5.1)、第二清洗区(5.2)和反应区(6)；所述柱塞(3)水平设置，柱塞(3)上设有竖直方向的柱塞孔(301)；所述裂解区(4)设有裂解液，裂解液内设有封存亚微米级超顺磁磁珠和质控品的金属搅拌子；所述反应区(6)设有含GBS特定基因片段和质控品特定基因片段的核酸扩增反应液。本发明可以用于完成整个GBS核酸检测的工序，不仅可以脱离GBS核酸检测对于大量设备的依赖，提升检测效率，而且可以避免在检测过程中引入污染，提升检测精度。

Description

一种GBS核酸检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种基因检测方法及基因检测试剂盒和基因检测设备，属于医学检测技术领域。
背景技术
B族链球菌(group B streptococcus，简称GBS)，正常寄居于阴道和直肠，它是一种条件致病菌，一般正常健康人群感染GBS并不致病。
据统计约10％～30％的孕妇有感染GBS，其中40％～70％在分娩过程中会传递给新生儿。如果新生儿带了这种菌，大约有1％～3％会出现早期侵入性感染，其中有5％会导致死亡。因此，GBS的检测尤为重要。
基因检测是通过血液、其他体液或细胞对DNA进行检测的技术，是取被检测者脱落的口腔黏膜细胞或其他组织细胞，扩增其基因信息后，通过特定设备对被检测者细胞中的DNA分子信息作检测，预知身体患疾病的风险，分析它所含有的各种基因情况，从而使人们能了解自己的基因信息，从而通过改善自己的生活环境和生活习惯，避免或延缓疾病的发生。
基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检测引起遗传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。目前有1000多种遗传性疾病可以通过基因检测技术做出诊断。
由于基因检测时通常使用的样本为生物组织细胞，因此检测基因时需要对细胞进行裂解、清洗、扩增等步骤后，再利用光学检测的方式去检测基因。由于各个步骤中涉及不同的处理，通常样品需要经过多个设备分别进行不同步骤的处理，检测较为麻烦，而且在进行不同步骤时，有时还需要转移样品至不同的载体，这一过程容易引入污染，影响检测精度。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种GBS核酸检测试剂盒。它可以用于完成整个GBS核酸检测的工序，不仅可以脱离GBS核酸检测对于大量设备的依赖，提升检测效率，而且可以避免在检测过程中引入污染，提升检测精度。
本发明的技术方案：一种GBS核酸检测试剂盒，其特点是：包括顶部带翻盖的盒体，盒体内从上至下分别设有通过柱塞隔开的裂解区、第一清洗区、第二清洗区和反应区；所述柱塞水平设置，柱塞上设有竖直方向的柱塞孔；所述裂解区设有裂解液，裂解液内设有封存亚微米级超顺磁磁珠和质控品的金属搅拌子(磁性中空金属球)；所述反应区设有含GBS特定基因片段和质控品特定基因片段的核酸扩增反应液。亚微米级超顺磁磁珠直径0.5-10μm，浓度为50-200mg/ml，有表面硅基包被。
上述的GBS核酸检测试剂盒中，所述第二清洗区和反应区之间的柱塞的柱塞孔内设有用石蜡封闭的微型金属容器(不锈钢管)，微型金属容器内设有包含核酸扩增酶及防污染酶的酶液。
前述的GBS核酸检测试剂盒中，所述质控品为菌体内包有特定质粒的大肠杆菌，所述特定质粒的序列内含通过克隆技术转入的质控品特定基因片断。
前述的GBS核酸检测试剂盒中，所述样本裂解液成份为：
前述的GBS核酸检测试剂盒中，所述第一清洗区内设有第一核酸洗液，第一核酸洗液的成份为：
盐酸胍 2.0-4.0M
NaCl 2.0-4.0M
ddH2O 溶剂
前述的GBS核酸检测试剂盒中，所述第二清洗区内设有第二核酸洗液，第二核酸洗液的成份为：
乙醇 50-70％质量百分比
ddH2O 溶剂
前述的GBS核酸检测试剂盒中，所述微型金属容器内的酶液组分为：
甘油 50％质量百分比
Tris-HCl 20mM(pH8.0)
EDTA 0.1mM
TritomX-100 0.1％质量百分比
核酸扩增酶 重组耐热Taq酶，1.0-5.0U
防污染酶 重组耐热UNG酶，0.2-5.0U
ddH2O 溶剂
前述的GBS核酸检测试剂盒中，所述核酸扩增反应液体中的GBS特定基因片段为SAG0265、SAG0771、SAG2043，质控品特定基因片段为RNaseP，核酸扩增反应液体的组分为：
前述的GBS核酸检测试剂盒中，所述反应区底部设有向盒体外部方向凹进的隐藏区。
前述的GBS核酸检测试剂盒中，所所述柱塞孔带3～5°的锥度，中心直径为3～5mm，这样的设置既有利于磁珠通过，又可利用毛细作用阻断各个区间的液体自由穿过；B族链球菌(S.agalactiae)
人(Homo sapiens)
所述裂解区底端为上宽下窄的收口，每个收口边与竖直方向夹25°～35°角，以便于充分裂解及磁珠顺利汇合到柱塞孔内。
各基因序列具体参见下表。
上述基因及引物探针序列的方向均为5’-3’。探针为两端标记，5’端标记为报告荧光，3’端标记为淬灭。
与现有技术相比，本发明利用柱塞在同一个试剂盒内分隔出多个区间(腔体)，各个区间可分别放置裂解液、两道清洗液和核酸扩增反应液，使得基因检测的多个步骤可在同一个试剂盒内(配合使用一台设备)进行，不容易产生二次污染，而且工作效率大大提高，检测精度也大大提高，而且更可以解决基因检测需要很多配套设备的问题。
本发明的试剂盒采用了荧光核酸扩增检测方法，针对B族链球菌特异基因序列设计引物探针，并以生物工程方法引入含人RNaseP基因序列质粒的大肠杆菌作为过程质控，用于防止假阴性，确保检测有效性。在核酸扩增过程中可以配合仪器同步进行荧光检测。以上过程都只需要在仪器和特定试剂盒内完成，类似POCT，全自动一体化，不依赖检测操作人员的技能水平及其他配套设备。
本发明由于使用了柱塞进行分隔，它可以通过简单的机械动作即可导通各个区间，无需其它处理(若采用石蜡等物质进行隔离，导通及装配时需加热，加热会影响到试剂盒内的试剂及样品，进行影响检测精度)，操作上来说更为方便，而且柱塞的装配更为简单、便于各个区间内试剂的装配。
附图说明
图1是本发明试剂盒的结构示意图；
图2是图1的侧向示意图；
图3是图2的A部放大图。
附图中的标记为：1-翻盖，2-盒体，3-柱塞，301-柱塞孔，4-裂解区，5.1-第一清洗区，5.2-第二清洗区，6-反应区，7-弹簧，8-顶杆，601-隐藏区。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例。一种GBS核酸检测试剂盒，如图1至图3所示：包括顶部带翻盖1的盒体2，盒体2内从上至下分别设有通过柱塞3隔开的裂解区4、第一清洗区5.1、第二清洗区5.2和反应区6；所述柱塞3水平设置，柱塞3上设有竖直方向的柱塞孔301；所述裂解区4设有裂解液，裂解液内设有封存亚微米级超顺磁磁珠和质控品的金属搅拌子；所述反应区6设有含GBS特定基因片段和质控品特定基因片段的核酸扩增反应液。
所述第二清洗区5.2和反应区6之间的柱塞3的柱塞孔301内设有用石蜡封闭的微型金属容器，微型金属容器内设有包含核酸扩增酶及防污染酶的酶液。
所述质控品为菌体内包有特定质粒的大肠杆菌，所述特定质粒的序列内含通过克隆技术转入的质控品特定基因片断。即质控品为以生物工程方法引入含人RNaseP基因序列质粒的大肠杆菌。
所述样本裂解液成份为：
Tris-HCl 10-100mM(pH5.0-7.0)
EDTA 10-50mM
NaCl 0.1-1.0M
TritonX-100 2.0-6.0％质量百分比
十二烷基肌氨酸钠 5-10％质量百分比
异硫氰酸胍 1.0-3.0M
盐酸胍 1.0-3.0M
ddH2O 溶剂
所述第一清洗区5.1内设有第一核酸洗液，第一核酸洗液的成份为：
盐酸胍 2.0-4.0M
NaCl 2.0-4.0M
ddH2O 溶剂
所述第二清洗区5.2内设有第二核酸洗液，第二核酸洗液的成份为：
乙醇 50-70％质量百分比
ddH2O 溶剂
所述微型金属容器内的酶液组分为：
甘油 50％质量百分比
Tris-HCl 20mM(pH8.0)
EDTA 0.1mM
TritomX-100 0.1％质量百分比
核酸扩增酶 重组耐热Taq酶，1.0-5.0U
防污染酶 重组耐热UNG酶，0.2-5.0U
ddH2O 溶剂
所述核酸扩增反应液体中的GBS特定基因片段为SAG0265、SAG0771、SAG2043，质控品特定基因片段为RNaseP，核酸扩增反应液体的组分为：
Tris-HCl 10-50mM,pH8.0
KCl 20-200mM
MgCl2 3.0-8.0mM
dNTPs 0.1-0.4mM
dUTP 0.1-0.4mM
SAG2043P1 0.2-0.6uM
SAG2043P2 0.2-0.6uM
SAG2043P3 0.05-0.3uM
SAG0265P1 0.2-0.6uM
SAG0265P2 0.2-0.6uM
SAG0265P3 0.05-0.3uM
SAG0771P1 0.2-0.6uM
SAG0771P2 0.2-0.6uM
SAG0771P3 0.05-0.3uM
RNasePP1 0.2-0.6uM
RNasePP2 0.2-0.6uM
RNasePP3 0.05-0.3uM
所述反应区6底部设有向盒体2外部方向凹进的隐藏区601。
所述柱塞孔301带3～5°的锥度，中心直径为3～5mm，所述裂解区4底端为上宽下窄的收口，每个收口边与竖直方向夹25°～35°角。
本发明中增加SAG0771和SAG0265引物探针对是扩增GBS基因组不同基因位置，可以提高GBS检测出的阳性符合率。RNaseP引物探针对是作为质控品，可以保障检测核酸提取和扩增的有效性。
本发明的试剂盒和检测设备的具体使用方法：
①将样品放入盒体2，盖上盒盖1，然后将盒体2插入基因检测设备的试剂盒容纳槽9，在插入过程中，各个柱塞3的顶杆8依次被挡条13推动，使得各个柱塞3克服弹簧7的弹力发生移动，致使柱塞孔301对准分离腔体，导通裂解区4、清洗区5和反应区6，；
②启动电磁线圈阵列的混匀阵列，使混匀阵列的电磁线圈按环状依次启停，铁磁性混匀球在磁力驱动下剧烈搅动裂解液和样品，同时启动靠近裂解区的制冷片，控制裂解温度；
③启动电磁线圈阵列的拖动阵列，使拖动阵列的电磁线圈从上至下依次启停，磁珠携带被裂解的样品经过清洗液的清洗后，最终进入反应液，同时柱塞内携带酶组份的钢管也带入反应液，启动靠近反应区的制冷片，控制反应温度；
④关闭电磁线圈阵列，磁珠因自重落入隐藏区601；
⑤检测光纤从盒体底部检测光信号；
⑥光学检测模块根据光信号分析出样品基因。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州遂真生物技术有限公司
<120> 一种GBS核酸检测试剂盒
<130> 20170508
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 228
<212> DNA
<213> B族链球菌(S.agalactiae)
<400> 1
ttgattggga atcaaactcc ctctagttca gtagctgaaa ctacagaaca agggacagct 60
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caaccgcaag cgaataatac accagttact ccaggggtta acaatactgt tccgactcca 180
ggaactggta ctgtacctgc tactaatggg acaggtgttg ctcagtaa 228
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cgctttactg atcgtttact agatggaaca ttctaccaat attttgttga tgggaaaaaa 180
<210> 3
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<212> DNA
<213> B族链球菌 (S.agalactiae)
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ctcagggttg gcacgcaatg aagtctttaa tttttcaaca ctagtaatag cctcattaac 180
cgttttttca taatctgttc cctgaacatt atctttgata tttctcaact gaatgctatc 240
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<213> 人（Homo sapiens）
<400> 4
tcagcggctg cgcagactgg cgcgcgcgga cggtcatggg acttcagcat ggcggtgttt 60
gcagatttgg acctgcgagc gggttctgac ctgaaggctc tgcgcggaac ttgtggagac 120
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<213> B族链球菌 (S.agalactiae)
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<212> DNA
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<400> 9
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<213> B族链球菌 (S.agalactiae)
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<211> 23
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<213> 人（Homo sapiens）
<400> 16
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Claims (10)

1.一种GBS核酸检测试剂盒，其特征在于：包括顶部带翻盖(1)的盒体(2)，盒体(2)内从上至下分别设有通过柱塞(3)隔开的裂解区(4)、第一清洗区(5.1)、第二清洗区(5.2)和反应区(6)；所述柱塞(3)水平设置，柱塞(3)上设有竖直方向的柱塞孔(301)；所述裂解区(4)设有裂解液，裂解液内设有封存亚微米级超顺磁磁珠和质控品的金属搅拌子；所述反应区(6)设有含GBS特定基因片段和质控品特定基因片段的核酸扩增反应液。
2.根据权利要求1所述的GBS核酸检测试剂盒，其特征在于：所述第二清洗区(5.2)和反应区(6)之间的柱塞(3)的柱塞孔(301)内设有用石蜡封闭的微型金属容器，微型金属容器内设有包含核酸扩增酶及防污染酶的酶液。
3.根据权利要求1所述的GBS核酸检测试剂盒，其特征在于：所述质控品为菌体内包有特定质粒的大肠杆菌，所述特定质粒的序列内含通过克隆技术转入的质控品特定基因片断。
4.根据权利要求1所述的GBS核酸检测试剂盒，其特征在于，所述样本裂解液成份为：
Tris-HCl 10-100mM(pH5.0-7.0) EDTA 10-50mM NaCl 0.1-1.0M TritonX-100 2.0-6.0％质量百分比 十二烷基肌氨酸钠 5-10％质量百分比 异硫氰酸胍 1.0-3.0M 盐酸胍 1.0-3.0M ddH2O 溶剂
5.根据权利要求1所述的GBS核酸检测试剂盒，其特征在于，所述第一清洗区(5.1)内设有第一核酸洗液，第一核酸洗液的成份为：
盐酸胍 2.0-4.0M NaCl 2.0-4.0M ddH2O 溶剂
6.根据权利要求1所述的GBS核酸检测试剂盒，其特征在于，所述第二清洗区(5.2)内设有第二核酸洗液，第二核酸洗液的成份为：
乙醇 50-70％质量百分比 ddH2O 溶剂
7.根据权利要求1所述的GBS核酸检测试剂盒，其特征在于，所述微型金属容器内的酶液组分为：
甘油 50％质量百分比 Tris-HCl 20mM(pH8.0) EDTA 0.1mM TritomX-100 0.1％质量百分比 核酸扩增酶 重组耐热Taq酶，1.0-5.0U 防污染酶 重组耐热UNG酶，0.2-5.0U ddH2O 溶剂
8.根据权利要求1所述的GBS核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增反应液体中的GBS特定基因片段为SAG0265、SAG0771、SAG2043，质控品特定基因片段为RNaseP，核酸扩增反应液体的组分为：
9.根据权利要求1所述的GBS核酸检测试剂盒，其特征在于：所述反应区(6)底部设有向盒体(2)外部方向凹进的隐藏区(601)。
10.根据权利要求1所述的GBS核酸检测试剂盒，其特征在于：所述柱塞孔(301)带3～5°的锥度，中心直径为3～5mm，所述裂解区(4)底端为上宽下窄的收口，每个收口边与竖直方向夹25°～35°角。
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