KR20170085931A - 실시간 유전자 증폭기술 (Real-time PCR)을 이용한 장내 세균 분석 방법 - Google Patents

실시간 유전자 증폭기술 (Real-time PCR)을 이용한 장내 세균 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피검자의 장 건강정보를 분석하기 위한 장내 세균 분석 방법으로서, 버퍼를 포함하는 채변키트에 채변 샘플을 채취하는 단계;채변 샘플을 저온처리하는 단계;채변 샘플에서 DNA를 추출하는 단계; 및 상기 추출된 DNA 정량분석을 통해 락토바실러스(Lactobacillus spp.), 비피도박테리움(Bifidobacterium spp .), 클로스트리듐(Clostridium spp.) 및 박테로이데스(Bacteroides spp.)의 장내 분포정도를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 장내 세균 분석 방법에 대한 것이다.

Description

실시간 유전자 증폭기술 (Real-time PCR)을 이용한 장내 세균 분석 방법{Method for Gut Microbiota Analysis Using Real-time PCR}
본 발명은 버퍼를 포함하는 채변키트에 채변 샘플을 채취하는 단계;채변 샘플을 저온처리하는 단계;채변 샘플에서 DNA를 추출하는 단계; 및 상기 추출된 DNA 정량분석을 통해 락토바실러스(Lactobacillus spp.),비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 클로스트리듐(Clostridium spp.) 및 박테로이데스(Bacteroides spp.)의 장내 분포정도를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 장내 세균 분석 방법에 관한 것이다.
사람의 몸에 살고 있는 세균의 수는 약 100조 마리가 넘는 것으로 알려져 있다. 이는 인체를 구성하고 있는 세포의 수보다 약 10배나 많은 셈이다. 특히, 인체의 장내에 살고 있는 세균은 태어나면서부터 구성과 기능이 함께 발달 되고 개인의 게놈(genome), 영양소 및 라이프 스타일(life style) 등과 상호작용하여 복잡한 네트워크를 형성한다. 이렇게 형성된 장내 세균은 장, 간, 근육 및 뇌 등이 관여하는 물질 대사, 신호 전달 및 면역 반응 등에 대한 수많은 대사 기능을 조절한다.
인체의 장내에는 인체에 이로운 유익균, 인체에 해로운 유해군, 및 인체에 살고는 있지만 유익균이 우세환 환경에 있으면 유익균이 되고, 유해균이 증식하면 유해균이 되는 중간균이 존재하고 있으며 이들 각 균은 장 건강, 궁극적으로는 인체의 건강에 관여한다. 유익균은 인체에 이로운 균으로 예를 들어 유해균 성장 억제 및 건강한 면역 체계 형성 등에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 반면 유해균은 인체에 해로운 균으로 예를 들어 과민성장증후군과 아토피에서는 유해균이 증가되어 있다고 알려져 있고, 그 밖에 비만, 염증성장질환, 대장 용종, 알레르기나 천식과 같은 면역 질환, 자폐증, 우울증, 고혈압 및 순환기계 질환 등 다양한 질병과도 연관되는 것으로 보고되고 있다.
한편, 인체의 장 건강 개선과 관련하여, 장 질환을 예방(또는 치료)하거나 내장 기능을 개선하기 위한 약학적 또는 식품학적 조성물이 제시되었다. 예를 들어,대한민국 공개특허 제10-2015-0106075호는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장 질환 예방 또는 개선용 건강식품 및 약학 조성물이 제시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0811683호에는 마추출물을 유효성분으로 포함하는 장 기능 개선용 조성물 및 이를 함유하는 기능성 건강식품이 제시되어 있다. 또한, 장내 유익균의 증식 촉진 및 장내 유해균의 생육 억제에 관한 기술이 시도되었다. 예를 들어, 대한민국 등록특허 제10-1395875호에는 감잎 추출물을 포함하는 장내 유익균의 증식 촉진 및 장내 유해균의 생육 억제용 프로바이오틱스가 제시되어 있다.
그런데, 장 건강과 관련하여 상기 선행특허문헌들을 포함한 대부분의 종래기술은 장 질환 예방(또는 치료), 장내 유익균 증식 및 장내 유해균 생장 억제 등을 통하여 장 건강의 개선을 도모하고 있으나 여전히 장내 건강을 효율적으로 관리하기 위해 분석해야 할 세균의 종류 및 상기 세균의 상대적인 분포정도에 대한 연구에 대해서는 부족한 실정이다.
따라서, 피검자의 장 건강정보를 분석하기 위한 방법으로 장내 세균에 대한 과학적이고 객관적인 연구가 계속 필요하다.
본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 특정 세균들에 대한 장내 세균분포를 분석하는 방법을 연구하였다. 그 결과 락토바실러스(Lactobacillus spp.), 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 클로스트리듐(Clostridium spp.) 및 박테로이데스(Bacteroides spp.)에 대한 정량분석의 특이성(specificity)과 민감성(sensitivity)을 향상시키는 방법을 발견하였다.
본 발명은 피검자의 장 건강정보를 분석하기 위한 장내 세균 분석 방법으로서, 버퍼를 포함하는 채변키트에 채변 샘플을 채취하는 단계;채변 샘플을 저온처리하는 단계;채변 샘플에서 DNA를 추출하는 단계; 및 상기 추출된 DNA 정량분석을 통해 락토바실러스(Lactobacillus spp.), 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 클로스트리듐(Clostridium spp.) 및 박테로이데스(Bacteroides spp.)의 장내 분포정도를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 장내 세균 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 저온처리는 -75℃ 내지 -85℃에서 실시될 수 있다.
상기 DNA를 추출하는 단계는 비드 0.15 ~ 0.25g을 포함하는 InhibitEX 버퍼액 2ml을 채변키트에 추가하는 단계; 상기 버퍼액을 균질화하는 단계; DNA가 존재하는 상층액을 분리하는 단계; 상기 상층액을 용출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 DNA 정량분석은 실시간 유전자 증폭기술 (Real-time PCR)을 이용하는 것 일 수 있다.
상기 실시간 유전자 증폭기술 (Real-time PCR)의 annealing temperature은 55℃ 내지 60℃이고, Template DNA는 10ng/ul 내지 15 ng/ul 일 수 있다.
상기 실시간 유전자 증폭기술 (Real-time PCR)은 서열번호 1 내지 서열번호 9의 프라이머쌍을 이용할 수 있다.
상기 장내 세균은 락토바실러스(Lactobacillus spp.), 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.),클로스트리듐(Clostridium spp.) 및 박테로이데스(Bacteroides spp.)일 수 있다.
상기 피검자의 장 건강정보는 장과 관련된 질병발병 가능성을 포함할 수 있다.
본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus spp.), 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 클로스트리듐(Clostridium spp.) 및 박테로이데스(Bacteroides spp.)의 정량분석시 특이성과 민감성을 향상시켜 피검자의 장 건강정보를 분석하기 위한 장내 세균 분석이 가능하다.
도1은 Real-time qPCR을 이용한 락토바실러스(Lactobacillus spp.), 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 클로스트리듐(Clostridium spp.) 및 박테로이데스(Bacteroides spp.)분석결과이다.
도2는 장내 세균의 분석결과값을 도식화한 균수 분석차트이다.
도3은 장내 세균의 분석결과값을 도식화한 다각형 분석차트이다.
도4는 장내 세균의 랭킹 분석차트의 예시이다.
본 발명은 피검자의 장 건강정보를 분석하기 위한 장내 세균 분석 방법으로서, 버퍼를 포함하는 채변키트에 채변 샘플을 채취하는 단계; 채변 샘플을 저온처리하는 단계; 채변 샘플에서 DNA를 추출하는 단계; 및 상기 추출된 DNA 정량분석을 통해 락토바실러스(Lactobacillus spp.), 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 클로스트리듐(Clostridium spp.) 및 박테로이데스(Bacteroides spp.)의 장내 분포정도를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 장내 세균 분석 방법에 대한 것이다.
본 발명의 채변키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성될 수 있으며 구체적으로는 InhibitEX 버퍼가 포함되어 있는 채변튜브일 수 있다.
InhibitEX 버퍼는 채변튜브내에서 분변 샘플에 존재하는 PCR 방해요소를 효율적으로 제거하여 분변 샘플내의 존재하는 미생물의 DNA에 대한 PCR을 효율적으로 진행시킨다. 또한 상기 채변키트에서의 분변을 받을 경우, DNA 손상을 줄이기 위해 inhibitEX 버퍼 4ml를 미리 첨가시킨다.
또한 상기 채변키트는 미생물이나 환경적인 요인에 의한 오염을 방지하기 위해 121℃ 에서 15분동안 고압멸균을 실시할 수 있다.
실시간 PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제, 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 본 발명은 분변 샘플에서 DNA를 추출하고 상기 본 발명의 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 장내 세균 정량 분석 방법을 제공한다.
실시간(real-time) 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻은 Ct(Cycle threshold) 값을 표준 검량선에 대입하여 분변 샘플에 존재하는 특정 미생물을 정량 분석하는 방법을 제공한다.
실시간 PCR 방법은 지수적인 증폭이 일어나는 초기 시료의 양을 형광물질의 지수적 증가가 탐지되기 시작하는 사이클의 수(Cycle threshold, 이하 'Ct'라고 칭함)로 나타내므로 보다 정확한 정량분석이 가능하며 반응을 실시간으로 분석할 수 방법이다.
이 방법은 전기영동하여 영상분석기로 강도를 측정하는 단계가 생략되고 증폭산물의 증폭정도를 자동화, 수치화시켜 빠르고 간편하게 진단할 수 있는 방법이다. 예를 들어, 형광을 이용한 실시간 PCR 방법 중 PCR에 의해서 증폭된 이중가닥 DNA에 형광염료가 삽입되어 형광을 나타내는 형광삽입 (intercalation) 방법을 사용할 수 있으며, 이때 발생하는 형광 강도를 측정함으로써 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다.
본 발명은 분변 샘플의 장내 세균 관리를 위한 핵심 기술로 그 필요성 및 중요성이 크며, 본 발명에서는 분변 샘플에 존재하는 미생물들을 정량검출 할 수 있는 quantitative real-time PCR 분석법을 확립하였다.
본 발명에서 저온처리는 -75℃ 내지 -85℃에서 실시될 수 있다.
이는 물성의 변화를 막기 위한 조치이다.
본 발명에서 DNA를 추출하는 단계는 비드 0.2g을 포함하는 InhibitEX 버퍼액 2ml을 채변키트에 추가하는 단계; 상기 버퍼액을 균질화하는 단계; DNA가 존재하는 상층액을 분리하는 단계; 상기 상층액을 용출하는 단계를 포함할 수 있다.
비드는 분변에 살고 있는 박테리아로부터 DNA를 추출하기 위해 버퍼와 함께 사용되어 균질화된다. 비드는 그람 양성균 또는 그람 음성균의 세포벽을 파쇄하는 enhencer 역할을 수행한다.
본 발명에서, 실시간 유전자 증폭기술 (Real-time PCR)의 annealing temperature가 55℃ 내지 60℃이고, Template DNA는 10ng/ul 내지 15 ng/ul 일 수 있다.
PCR 과정에서 적정 결합온도의 설정은 반응의 정확성을 결정하는 중요요소이다. 결합온도를 너무 높게 설정하면 프라이머가 주형 DNA에 너무 약하게 결합되어 증폭된 DNA 산물이 매우 적어지고, 온도를 너무 낮게 설정하면 프라이머가 비특이적으로 결합하기 때문에 주형 DNA외의 비-특이적 DNA가 증폭될 수 있다.
본 발명에서, 실시간 유전자 증폭기술 (Real-time PCR)은 서열번호 1 내지 서열번호 9의 프라이머쌍을 이용할 수 있다.
프라이머는 박테리아의 특정 유전자 부위를 화학적으로 합성하여 만든 18-24mer의 짧은 유전자 서열로 박테리아가 가지는 유전자와 서로 반대되는 염기구조를 가지며, 주형 DNA를 타겟하여 복제 및 증폭을 하는 중요한 시료이다. 프라이머의 염기서열과 농도는 전체 분석결과에 가장 큰 영향을 미치는 요인으로 볼 수 있다.
본 발명에서 분석하고자 하는 박테리아를 위한 프라이머 서열은 다음과 같다.
<표>. 박테리아별 프라이머 서열 (5' -> 3')
Figure pat00001
상기 프라이머 서열은 길이가 18~24nt로서, 두 프라이머의 Tm 값의 차이는 5℃ 이내이고 G+C 값은 40~60%로 하여 두 프라이머의 3'사이의 상보 결합이 없도록 구성하였다. 상기 프라이머 세트로 인하여 분석하고자 하는 박테리아의 정량분석값의 상호간섭이 없이 동시 또는 별도로 4종의 박테리아에 대한 정확한 정량분석이 가능하다.
본 발명에서, 장내 세균은 락토바실러스(Lactobacillus spp.), 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 클로스트리듐(Clostridium spp.) 및 박테로이데스(Bacteroides spp.) 일 수 있다.
장내 세균 분석 대상자에 대해 상기의 장내의 세균을 정략적으로 분석한다. 본 발명에서 장내 세균 분석 대상자는 임의의 특정 개인으로 장내 세균 환경 관리 대상자(이하 '피검자'라 한다.)이다. 피검자의 장내 세균 분석을 위해 장내에 살고 있는 세균을 유익균, 중간균 및 유해균으로 분리하여 상기 유익균, 중간균 및 유해균의 각 균수를 정량적으로 분석한다. 이를 위해 장내에 존재하는 세균들 중 지표가 되는 유익균과 유해균 및 중간균의 선정이 필수이다.
상기 유익균과 유해균 및 중간균의 선정은 해당 균의 증감에 따라 과민성 장증후군, 염증성 장질환, 대장 용종, 알러지, 천식 및 헬리코박터균으로 인한 위염등 각종 질병과의 상관관계가 연구를 통해 밝혀진 바를 기준으로 하여 선정하였다.
유익균으로는 락토바실러스(Lactobacillus spp.), 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.)을 선정하였다. 이 균은 장내 유해균의 침입을 막아주거나 성장을 억제하고 장 벽막을 강화시켜 영양분의 흡수를 돕는다. 또한 위에서 분해되지 못한 음식물이 인체에 쉽게 흡수되도록 효소를 분비하여 소화를 돕고, 면역세포가 과민한 면역반응을 하지 않도록 도와 건강한 면역체계를 형성하여 질병으로부터 몸을 보호하는 것으로 알려져 있다.
중간균으로는 박테로이데스(Bacteroides spp.)을 선정하였다. 이 균은 몸속에 살고 있지만 유해한 기능이나 유익한 기능을 하지 않는, 기능이 뚜렷하지 않은 중립균이다. 그러나 유익균이 우세한 환경에 있으면 유익균이 되고, 유해균이 증식하면 유해균이 되는 균으로 중간균이 유해균으로 바뀌지 않는 장내환경을 유지해야 한다.
유해균으로는 클로스트리듐(Clostridium spp.)이 선정하였다. 이 균은 인체에 해로운 균으로, 독소나 노폐물을 만들거나 설사나 감염을 유발시켜 면역력을 떨어뜨려 질병에 쉽게 걸리도록 하고 암이나 노화를 촉진시키는 것으로 알려져 있어 건강에 이롭지 않은 균이다.
이러한 각 균들의 작용과 질병과의 상관관계에 대해 다양한 연구를 통해 밝혀진 바가 아래 표와 같은 상관관계가 확인되었는바, 이러한 균을 선정하여 다양한 대장내 건강상태를 파악할 수 있도록 하는 것이며, 상기 대장내 건강상태는 과민성 대장증후군, 염증성 장질환, 대장용종, 알러지, 천식, 아토피, 헬레코박터균와 관련된 대장내 건강상태일 수 있다.
Figure pat00002
상기 세균에 최적화된 프라이머를 제공하여 상호 간섭없이 실시간 PCR로 4종의 세균에 대한 정량분석이 가능하다. 장내 세균 분석은 피검자의 대변에서 DNA를 추출하여 유전자 분석을 통해 수행한다. 상기 선정된 유익균과 유해균 및 중간균의 수를 정량적으로 분석하게 된다. 채변샘플에서 DNA를 추출하고 실시간 유전자 증폭 기술(Real time qPCR)을 이용해 추출된 DNA를 증폭시켜 장내 세균을 검출하면서 동시에 세균의 양을 측정한다.
즉, 선정된 유익균과 유해균 및 중간균의 염기서열을 토대로 해당 균에 대한 특정 부분을 증폭할 수 있는 프라이머 세트(primer set)를 만들고, 해당 프라이머 세트로 실시간 유전자 증폭을 수행하여 얻어진 Ct(threshold cycle)값으로 정확한 결과를 얻는다.
상기 분석된 결과에 기초하여 결과지를 작성한다. 결과지로서 하기 (a) 내지 (d) 중에서 선택된 하나 이상의 분석 차트로 작성한다.
(a) 균수 분석 차트
피검자의 장에 분포하고 있는 세균들 중 선정된 유익균, 유해균 및 중간균의 각 균별 분석된 값을 차트로 보여준다. 도 2에 도시된 바와 같이 막대그래프로 표시하여 한 눈에 각 균의 절대적인 수치를 확인할 수 있다.
(b) 다각형 분석 차트
이 결과는 각 균의 누적결과 값을 그림으로 보여준다. 도 3에 도시된 바와 같이 다각형 형상으로 보여줌으로써 피검자의 장내 세균을 분석한 결과에 따른 각 균의 균형을 한눈에 확인할 수 있다.
(c) 랭킹 분석 차트
한국인의 장내 세균 분석 통계 자료를 기준으로 피검자의 장내 세균을 분석한 결과를 상기 통계 자료에 대입하여 현재 피검자의 위치가 상위 몇 퍼센트 내에 속한지를 보여준다. 도 4에 도시된 바와 같은바, 선정된 유익균과 유해균 및 중간균 별로 각각 그래프로 나타내어 결과를 보여주게 된다. 이러한 랭킹 분석 차트를 통해 통계 대비 피검자의 위치를 정확히 파악할 수 있는바, 대체로 상위 30% 이하에 속하면 균형잡힌 장내 환경, 그 이상이면 불균형인 장내 환경임을 제시하게 된다.
이때, 상기 그래프에는 특정한 기준을 정하여 블루존(상위 30% 이내), 그린존(상위 31~50%), 옐로우존(상위 50~80%), 레드존(상위 81~100%)과 같이 색상으로 장내 세균 환경이 균형잡힌 상태인지(블루존), 불안정한 상태인지(그린존,옐로우존, 레드존)를 볼 수 있도록 제시할 수 있다.
(d) 모니터링 분석 차트
피검자에 대한 장내 세균 분석이 시차를 두고 다수 회, 즉 최소 2회 이상 이루어진 경우 유익균과 유해균 및 중간균의 변화를 제공하는 차트이다. 1차, 2차, 3차 등 분석한 차수별로 각 균에 대한 증감을 막대그래프로 나타내서 결과를 보여주게 된다.
3~6개월 마다 규칙적인 장내 세균 분석으로 통해 장내 세균 변화의 추이를 관찰함으로써 지속적인 모니터링을 통해 건강에 도움을 줄 수 있도록 하는 것이 바람직한 바, 모니터링 분석 차트를 통해 장내 세균 분포 변화를 확인할 수 있도록 하여 모니터링이 가능하도록 한다.
상기 분석된 결과에 기초하여 종합적인 장내 건강 상태 및 관리 방안에 대한 전문가의 조언을 제공할 수 있다. 유익균과 유해균 및 중간균의 분포에 따른 각종 질병의 발생 가능성, 예방법 등에 대한 종합적인 조언을 제시함으로써 개개인이 조언에 따라 건강을 관리할 수 있도록 하는 것이다. 예를 들면 장내 세균 분포에 따른 바람직한 식생활 방향성에 대한 조언이나 이후 재검사 스케줄에 대한 안내 등이 포함될 수 있다.
실시예1 ( 분변 DNA 추출방법)
저온 처리기(Deep freezer)에서 -80℃로 보관된 샘플을 꺼내어 4℃에서 20분 동안 보관한다. 상기 샘플을 1분동안 vortexing (Vortex Genie2 No.G560E)하면서 샘플이 녹은 것을 확인한다. 이때, 육안으로 분변의 샘플의 양을 확인한 후 InhibitEX buffer를 2ml 추가한다.
2,500 rpm으로 10분 동안 vortexing (Benchmark BenchMixer, Multi-Tube Vortexer BV1010)하여 샘플이 균질화된 것을 확인한다.
샘플을 95℃ (Biofree, Drying oven)에서 10분 동안 보관후, 10여분간 원심분리를 실시한다. 1.5 ml 마이크로튜브에 상기 원심분리를 통해 얻어진 상층액 200 ㎕을 분리하고, 15 ㎕ proteinase K를 추가한다. AL버퍼 200 ㎕를 넣고 15초 동안 vortexing (Vortex Genie2 No.G560E) 후 스핀 다운한다. 70℃ (Biofree, Drying oven)에서 10분 동안 샘플을 보관 후 100% 에탄올 200 ㎕를 샘플에 넣고, vortexing (Vortex Genie2 No.G560E) 후 스핀 다운을 실시한다.
새로운 2 ml QIAamp spin column 캡에 옮기고 12,000 rpm으로 2분 동안 원심분리 (VISION, VS-15000CFNII)한다. 새로운 2ml collection tube에 column을 끼운 후 500 ㎕ AW1 buffer를 넣고 12,000 rpm으로 2분 동안 원심분리(VISION, VS-15000CFNII)하여 여과한 액체는 폐기한다. 새로운 2ml collection tube에 column을 끼운 후 500 ㎕ AW2 buffer를 넣고 12,000 rpm으로 4분 동안 원심분리(VISION, VS-15000CFNII)하여 여과한 액체는 폐기한다. 새로운 2ml collection tube에 column을 놓고 다시 4분 동안 원심분리(VISION, VS-15000CFNII)하여 여과한 액체는 폐기한다. 새로운 1.5 ml 마이크로튜브에 column을 끼우고 멤브레인에 ATE buffer 200 ㎕를 넣는다. 실온에서 5분 동안 보관 후 12,000 rpm으로 2분 동안 원심분리(VISION, VS-15000CFNII)한다.
용출된 용액을 멤브레인에 옮겨 12,000 rpm으로 2분 동안 원심분리(VISION, VS-15000CFNII)한 후 DNA를 추출한다
실시예2 (실시간 PCR )
분석하고자 하는 Primer와 DNA를 -20℃에서 꺼내어 4℃에서 녹인다. 2차 증류수를 15 ml conical tube에 담는다. 1.7 ml tube에 DNA mixture와 Taq mixture를 라벨링한다. Taq mixture 와 DNA mixture를 알맞게 제조한다. Taq mixture는 negative control(이하 NC, 대조군)을 포함하여 2(반복수) x (DNA 개수 + NC + spare)로 계산하여 제조한다. plate setting에 맞도록 PCR plate(96-well, 0.1 ml, APPLIED BIOSYSTEMS) 또는 strip (MicroAmpⓡ FAST Reaction Tubes, 8Tubes/Strip)에 taq mixture를 14.4 ㎕ 분주한다. taq mixture가 분주된 PCR plate 또는 strip에 plate setting에 맞게 DNA mixture와 D.W를 5.6 ㎕씩 분주한다. PCR plate에 분주 한 경우 MicroAmpTM Optical Adhesive Film PCR Compatible, DNA/RNA/RNase Free를 잘 부착하고, Strip에 분주한 경우 MicroAmpⓡ Optical 8-Cap Strip을 닫고, 스핀 다운한다. Real-time qPCR(Step One PlusTM, APPLIEDBIOSYSTEMS)에 분주된 PCR plate(96-well, 0.1 ml, APPLIED BIOSYSTEMS) 또는 strip (MicroAmpⓡ FAST Reaction Tubes, 8 Tubes/Strip)을 넣고 PCR을 실시한다.
실험예1 .
적절한 농도의 DNA를 추출하는데 필요한 InhibitEX 버퍼의 양을 정하고자 분변 샘플이 들어있는 채변 튜브에 들어가는 InhibitEX 버퍼의 양을 2ml 와 4ml로 하여 DNA추출을 위한 균질화를 하고 200ul의 용출 버퍼에서 DNA의 양을 측정하였다.
그 결과 2ml 버퍼로 DNA 추출을 시도한 결과 확인된 DNA 농도는 43.9ng/ul이며, 4ml 버퍼로 DNA 추출을 시도한 결과 확인된 DNA 농도는 7.35ng/ul이었다. 결국 4ml Inhibit 버퍼를 넣었을 때보다, 2ml Inhibit 버퍼를 넣어 DNA를 추출하였을때, 약 6배 이상의 DNA가 검출된 것을 확인하였다.
<표> DNA 추출을 위한 InhibitEx buffer의 volume 측정 실험결과값
Figure pat00003
Figure pat00004
실험예2 .
DNA 추출에 사용되는 비드의 적절한 농도를 설정하기 위해 비드의 농도를 각각 0g/0.1g/0.2g 넣어 DNA가 추출되는 정도를 비교하였다.
비드의 농도를 제외한 나머지 요인에 의한 결과값의 오차를 줄이기 위해 동일한 채변샘플을 이용하여 동일한 DNA 추출 실험을 수행하였다.
<표> DNA 추출을 위한 비드의 질량측정 실험결과값
Figure pat00005
그 결과 DNA 추출한 후 용출버퍼(200ul)에서 0.2g의 비드를 넣은 채변 샘플에서 DNA 농도가 가장 높았다.
실험예3 . annealing temperature test
PCR 수행시 annealing temperature는 프라이머의 Tm 값에 따라 결정된다. 주로 사용하는 온도인 50℃, 55℃, 60℃에서 annealing temperature test를 실시하였다.
50℃, 55℃, 60℃에서 각각 amplification peak를 확인하였고, Ct(cycle threshold)값을 확인하였다.
(a) 50℃에서의 Ct(cycle threshold)값 확인
Figure pat00006
(b) 55℃에서의 Ct(cycle threshold)값 확인
Figure pat00007
(c) 60℃에서의 Ct(cycle threshold)값 확인
Figure pat00008
그 결과, 50℃에서 non-specific DNA 가 증폭될 확률이 높았으며, 55℃, 60℃에서 모두 비록 Ct(cycle threshold)값은 유사하게 확인되었으나, 60℃에서 주형 DNA에 대한 특이성이 높고, 많은 샘플을 동시에 볼 수 있기 때문에 55℃보다 60℃가 더 바람직한 것으로 나타났다.
실험예4 .
PCR은 아주 적은 양의 DNA을 이용하여 많은 양의 DNA합성이 가능하다. 주형 DNA의 양과 질은 PCR에 절대적으로 영향을 미친다. 주형이 적을수록 산물의 양 역시 비례적으로 감소하게 되며, 순도가 떨어지는 불순한 주형에는 반응 방해요소(inhibits)들을 많이 포함하고 있어 반응 효율성을 떨어뜨릴 수 있다. DNA 농도 10ng/ul와 50ng/ul로 PCR하여 농도의 sensitivity를 테스트하였다.
그림. PCR sensitivity을 위한 DNA 농도실험결과
Figure pat00009
그 결과, PCR후 각 균의 비율을 비교해 보았을 때, 50ng/ul DNA로 PCR하였을 경우 각 프라이머에 대한 균의 민감성이 떨어져 특정 균의 값이 확인이 안 되는 샘플이 존재(blue circle)하였다. 최종적으로 10ng/ul 농도의 DNA가 각 균의 대한 민감성을 모든 샘플에 대해 고르게 보여주고 그에 따라 본 분석서비스의 목적인 여러 균의 다양성 확인에도 문제가 없었다.
<110> Bioeleven <120> Method for Gut Microbiota Analysis Using Real-time PCR <130> 16p <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus spp F <400> 1 agcagtaggg aatcttcca 19 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus spp R <400> 2 caccgctaca catggag 17 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bifidobacterium spp. F <400> 3 gggtggtaat gccggatg 18 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bifidobacterium spp.R <400> 4 taagcgatgg actttcacac c 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clostridium spp. F <400> 5 cggtacctga ctaagaagc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clostridium spp. R <400> 6 agtttyattc ttgcgaacg 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacteroides spp. F <400> 7 atagcctttc gaaagraaga t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacteroides spp. R <400> 8 ccagtatcaa ctgcaatttt a 21

Claims (7)

  1. 피검자의 장 건강정보를 분석하기 위한 장내 세균 분석 방법으로서,
    버퍼를 포함하는 채변키트에 채변 샘플을 채취하는 단계;
    채변 샘플을 저온처리하는 단계;
    채변 샘플에서 DNA를 추출하는 단계; 및
    상기 추출된 DNA 정량분석을 통해 락토바실러스(Lactobacillus spp.), 비피도박테리움(Bifidobacterium spp .), 클로스트리듐(Clostridium spp.) 및 박테로이데스(Bacteroides spp .)의 장내 분포정도를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 장내 세균 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 저온처리는 -75℃ 내지 -85℃에서 실시되는 것을 특징으로 하는 장내 세균 분석 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    DNA를 추출하는 단계는 비드 0.15~0.25g을 포함하는 InhibitEX 버퍼액 1.5~2.5ml을 채변키트에 추가하는 단계; 상기 버퍼액을 균질화하는 단계; DNA가 존재하는 상층액을 분리하는 단계; 상기 상층액을 용출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 장내 세균 분석 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 DNA 정량분석은 실시간 유전자 증폭기술 (Real-time qPCR)을 이용하는 것을 특징으로 하는 장내 세균 분석 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    실시간 유전자 증폭기술 (Real-time PCR)의 어닐링 온도(annealing temperature)가 55℃ 내지 60℃이고, 주형 DNA는 10ng/ul 내지 15 ng/ul 인 것을 특징으로 하는 장내 세균 분석 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    실시간 유전자 증폭기술 (Real-time PCR)은 서열번호 1 내지 서열번호 9의 프라이머쌍을 이용하는 것을 특징으로 하는 장내 세균 정량 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 피검자의 장 건강정보는 장과 관련된 질병발병 가능성을 포함하는 장내 세균 정량 방법.
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