ITVT20110002A1 - Metodo di determinazione dell'origine di fluidi o tracce biologiche e kit di reagenti per la loro identificazione in un campione. - Google Patents

Description

"METODO E KIT DI REAGENTI PER L'IDENTIFICAZIONE DI FLUIDI BIOLOGICI IN UN CAMPIONE"

La presente invenzione riguarda il settore biotecnologico , ed in particolare riguarda un metodo e un kit di reagenti utilizzabile in modo semplice per 1 'identificazione di fluidi biologici in un campione di qualsiasi genere, per esempio costituito da reperti forensi, prelievi clinici , tamponi ambulatoriali od ospedalieri , reperti raccolti sulla scena di un delitto, e/o tracce di interesse medico-legale per investigazioni scientifiche di carabinieri, polizia, investigazioni private.

E ' noto che in ambito forense, per risalire alla origine di una macchia o traccia lasciata su un reperto vengono utilizzate indagini di laboratorio da parte dei reparti preposti alle investigazioni scientifiche. I casi dei sequestri e delle violenze a sfondo sessuale, come diverse altre situazioni di Interesse medico-legale, hanno recentemente evidenziato 1'importanza di poter disporre di strumenti scientifici avanzati per contribuire a ricostruire la scena del delitto ed acquisire informazioni su tracce compatibili con la presenza di fluidi biologici su oggetti, indumenti , reperti riscontrati sulla scena del delitto. In questo contesto, assume specifica rilevanza, per esempio, la possibilità di poter distinguere su un reperto una eventuale traccia di fluido vaginale da altri fluidi biologici quali saliva, muco rettale, sperma, o da altri materiali organici quali ad esempio sangue animale, alcune bevande o alimenti. Sono già noti alcuni metodi per la identificazione di fluidi biologici in un campione, tuttavia tali tecniche, sono spesso poco affidabili, oppure richiedono generalmente l’applicazione di strumentazioni complesse e costose, oltre a delle competenze professionali particolarmente elevate. Inoltre, nessun metodo noto à ̈ in grado di garantire una sufficiente sensibilità e specificità adeguata all'analisi di campioni complessi ed eterogenei contemporaneamente alla possibilità di distinguere simultaneamente una arpia gamma di fluidi biologici. I metodi noti si basano, per esempio su proprietà fisiche o biochimico-enzimatiche del fluido biologico , che possono essere fortemente influenzate dall'azione di degradazione, disidratazione, e/o alterazione a seguito dell 'esposizione ai diversi agenti ambientali -chimici , fisici o biologici- specie se prolungata nel tempo. Una generale strategia di indagine, che si à ̈ rivelata efficace, tecnologicamente avanzata, ed attualmente già in uso nei laboratori per le investigazioni scientifiche si basa sulla analisi del DNA. Tuttavia, la biologia molecolare e le analisi già disponibili per identificare e classificare tracce di DNA umano, non sono applicabili alla determinazione della tipologia di un fluido biologico, in quanto il DNA di un individuo à ̈ identico nei diversi tessuti di uno stesso soggetto, non consentendo perciò di differenziare nà ̈ la tipologia nà ̈ l'origine tissutale di alcun fluido biologico. Un metodo alternativo sempre basato su tecniche di biologia molecolare, ma ancora sperimentale, potrebbe fondarsi sulla analisi della espressione degli mRNA tipica delle cellule del tessuto mucoso da cui deriva il fluido biologico, ma questo approccio à ̈ ancora ipotetico ed à ̈ a sua volta fortemente influenzabile dalla azione degli agenti ambientali, in quanto le molecole di RNA sono particolarmente deperibili a causa anche della ubiquitaria e massiccia presenza nei materiali organici e nell'ambiente, indoor ed outdoor, di agenti in grado di degradarlo (rnasi), che renderebbero 1'eventuale reperto difficilmente utilizzabile. Al momento, dunque, i benefici delle acquisizioni della biologia molecolare, ossia elevata rapidità, sensibilità, specificità, riproducibilità, non sono applicati per rispondere a tali quesiti di compatibilità in indagini su possibili tracce di fluidi biologici, attraverso un sistema diagnostico a più ampio spettro .

Scopo della presente invenzione à ̈ pertanto quello di fornire un kit per 1'identificazione di una gamma di fluidi biologici che possa essere utilizzato in modo semplice e con 1 'ausilio di strumentazioni comunemente presenti nei piccoli e medi laboratori di biologia molecolare, diffusi nel territorio . Detto scopo viene conseguito con un kit le cui caratteristiche principali sono specificate nella prima rivendicazione ed altre caratteristiche sono specificate nelle rivendicazioni successive.

Il kit secondo la presente invenzione si basa su tecniche di biologia molecolare consuete nei laboratori forensi ed applicabili anche a tracce di fluidi biologici di interesse medico-legale, e si fonda sulla tecnica della reazione a catena della polimerasi e sulle tecniche di ibridazione; ma la presente invenzione differisce da quanto attualmente disponibile anzitutto perchà ̈ si basa sulla amplifreazione ed identificazione non di una sequenza genomica o mitocondriale umana, bensì di diverse sequenze batteriche appartenenti a varie specie che albergano i distretti di provenienza dei fluidi biologici in esame.

Popolazioni batteriche complesse colonizzano, infatti, vari distretti corporei, quali la cavità orale, le zone genitali ed anali. Sebbene le singole specie microbiche, in risposta a particolari condizioni patologiche o comportamentali, possano essere ritrovate in più distretti, ogni regione corporea tende a creare un equilibrio stabile tra vari batteri generando una popolazione ben definita. È allora possibile parlare di "firma" microbica tipica di ogni distretto. La mucosa vaginale, per esempio, à ̈ caratterizzata da una complessa popolazione microbica che in condizioni non patologiche , vede predominare elementi appartenenti al genere Lactobacillus , quali ad esempio L. iners, L. crispatus, e L. gasseri. Questi lattobacilli svolgono un'impor tante funzione di difesa tramite l'acidificazione del tessuto, rendendolo di fatto meno colonizzabile da specie patogene (Verstraelen H, 2008). L'utilizzo di tecniche di biologia molecolare ha contribuito negli ultimi anni a caratterizzare con elevata accuratezza le popolazioni di batteri vaginali. È stato possibile evidenziare come donne appartenenti ad etnie diverse, possano presentare un quadro microbico differente . Secondo Dumonceaux e colleghi (2009) soggetti africani mostrano buoni livelli di L. iners, ma non di L. crispatus. Ravel e colleghi (2010) hanno riportato differenze nella popolazione microbica rapportabili a valori etnico specifici del pH vaginale. La flora batterica vaginale risente poi anche del quadro clinico del soggetto . È infatti largamente documentata la riduzione di Lattobacilli a favore della proliferazione di A. vaginae e G. vaginalis nei casi di vaginosi batterica (Bradshaw et al., 2006). Secondo Zozaya-Hinchliffe e colleghi (2010) la popolazione di L. iners non sarebbe però particolarmente influenzata da situazioni di vaginosi. Poiché i diversi metodi disponibili per 1'identificazione di fluido vaginale sono limitati ed inadeguati, e poiché la identificazione di tracce di fluido vaginale rappresenta una esigenza importante per 1'ambito forense , diversi approcci sono stati percorsi ed alcuni kit commerciali sono disponibili, sebbene possiedano una sensibilità e specificità troppo bassa. In genere si basano, infatti, sulla identificazione di proprietà enzimatiche e/o antigeniche, e dipendendo dalla integrità di prodotti proteici (per esempio l'amilasi salivare), sono dunque fortemente influenzati anche dalla facile degradabilità delle proteine nell'ambiente. Il DNA à ̈ più resistente, ma le tecniche d'analisi del genoma umano attualmente in uso nei laboratori forensi e biomedici, non permettono, ad oggi, di distinguere la provenienza dei fluidi, in quanto la struttura primaria del DNA di un individuo à ̈ identica nei diversi tessuti. Sulla base di queste ed altre considerazioni diversi studi sono stati sviluppati, tra cui quelli di Frumkin (2010) basati sulle xnetilazioni del genoma umano nei diversi tessuti e quelli di Fleming and Harbison (2010) che hanno suggerito approcci alternativi, tra cui anche quelli basati sull'uso delle differenze nella espressione genica in cellule della mucosa vaginale o in cellule della microflora, avendo anche proposto una amplificazione multipla su mRNA batterico.

Tuttavia, non risulta ancora descritto un approccio per la identificazione integrata dei diversi fluidi biologici sulla base del DNA genomico della microflora utilizzabile come indicatore per l'identificazione -simultanea e comparata- di due o più fluidi biologici. Data 1'impossibilità di definire una specie batterica tipica per le secrezioni vaginali e sicuramente assente in altri fluidi corporei un test integrato di tipo multi-target assume un valore fondamentale e significativo nell'identificazione della "firma" microbica di un fluido biologico. L 'applicazione del presente metodo consente una analisi basata sulla amplificazione del DNA della microflora a partire da sequenze specifiche per uno o più specie microbiche vaginali ed allo stesso tempo anche per uno o più batteri provenienti da altre possibili microflore, permettendo di identificare o escludere l'origine vaginale di un fluido in un campione, ed indicando la eventuale contami nazione con possibili altri fluidi biologici .

Il kit identificando proprietà caratteristiche della microflora del fluido biologico a partire dal genoma consente, infatti, di fare una diagnosi di compatibilità e/o esclusione rispetto ad altri fluidi biologici. Questo accorgimento comporta la possibilità di definire lina compatibilità tra una traccia ed un fluido biologico, anche se il reperto non fosse immediatamente prelevato e/o fosse stato esposto a condizioni ambientali sfavorevoli, in quanto la resistenza del DNA batterico à ̈ sufficientemente elevata, come à ̈ noto. Inoltre, il kit può essere applicato all 'interno di procedure di biologia molecolare tradizionali, già utilizzate per analisi su tracce di DNA umano, applicando tecnologie e competenze già disponibili e provvedendo valore aggiunto all'indagine . Un notevole vantaggio per quanto riguarda la velocità di amplificazione -la quale à ̈ a sua volta direttamente proporzionale alla sensibilità del metodo- à ̈ sostenuto dalla elevata carica microbica presente nel fluido, che nelle microflore umane tende a superare le 10<6>-10<9>cellule microbiche per millilitro .

Un ulteriore vantaggio del kit secondo la presente invenzione, rispetto ad altri metodi basati sulla reazione a catena della polimerasi, consiste nel fatto che esso non richiede l'uso di enzimi di restrizione, di apparecchi per elettroforesi o di coloranti del DNA, ma si basa sulla ibridazione con sonda, rivelabile con un classico strumento per amplificazione reai time, consentendo di ricercare diversi indicatori microbici contemporaneamente in un'unica prova -qualitativa e quantitativa- prestandosi anche per l'automatizzazione delle analisi. Tuttavia non à ̈ preclusa la possibilità di effettuare una valutazione preliminare mediante elettroforesi e/o digestione con enzimi di restrizione secondo le procedure tradizionali.

Un altro vantaggio del kit secondo la presente invenzione consiste nel fatto che l'amplificazione per uno o più fluidi biologici può essere realizzata in una unica operazione anche con più indicatori microbici parallelamente, aggiungendo ad una miscela di reazione standard solo i componete A e B ed il DMA del campione diluito in acqua.

Ulteriori vantaggi e caratteristiche del kit secondo la presente invenzione risulteranno evidenti agli esperti del ramo dalla seguente dettagliata descrizione di una sua forma realizzati va con riferimento agli annessi esempi operativi.

Il kit secondo la presente invenzione comprende due componenti per ciascun fluido biologico. Il primo di tali componenti (componente A) comprende i reagenti per 1 'amplifreazione multipla, ed il secondo (componente B) i reagenti per 1'ibridazione.

Il Componente A consta di una miscela di amplificazione che comprende tutti i reagenti necessari secondo il procedimento noto per la reazione a catena della polimerasi , comunemente detta PCR e descritta tra 1'altro nei brevetti USA 4.683.195 e 4.683.202. Tali reagenti sono: il tampone di reazione che permette di creare le condizioni per la funzionalità dell'enzima (pH, concentrazione salina); il dNTP ossia i deossinucleotidi trifosfati costituiti da basi azotate (adenina, guanina, citosina, timidina) monomeri necessari alla reazione polimerasica; il cloruro di magnesio (MgCL2) necessario per garantire specificità ed efficienza della reazione (appaiamento dei primers e funzionalità della polimerasi) ; e la miscela dei primers ossia oligonucleotidi di sequenza specifica, necessari per avviare 1 'amplificazione del DNA loro complementari secondo il noto principio della reazione a catena della polimerasi.

Per individuare i primers adatti ad essere utilizzati nelle miscele di reazione, e che consentono la amplificazione degli indicatori utilizzati per la identificazione dei diversi fluidi biologici, à ̈ stato necessario dapprima condurre delle ricerche in letteratura ed in banche dati sulle microflore e sulle regioni del DNA che fossero compatibili con gli scopi prefissati, anche attraverso l'adozione di strumenti di bioinformatica. Poi, sono state scelte le singole sequenze dei primers, che sono stati fatti sintetizzare. Successivamente sono stati svolti ulteriori studi di bioinformatica e di laboratorio per individuare e/o ottimizzare i rapporti reciproci tra i diversi oligonucleotidi nelle miscele di reazione, nonché le condizioni adatte di magnesio e le temperature di appaiamento dei primers al DNA. In questo modo, nei componenti A del kit, secondo la presente invenzione, per ciascun fluido biologico i reagenti sono presenti e dosati in modo tale da consentire la amplificazione simultanea di segmenti dei geni di diverse specie batteriche . Dalle ricerche effettuate à ̈ risultato che dette miscele sono sufficientemente stabili per cui possono essere incluse nel kit come tali . Esse consentiranno perciò al laboratorio diagnostico di non dover dosare separatamente i diversi reagenti , come generalmente eseguito.

Secondo una forma realizzativa preferita dell'invenzione, la miscela A comprende i primers corrispondenti a diverse specie biologiche, per esempio per il fluido vaginale sequenze appartenenti a Lattobacillus Gasseri e Lattobacillus crispatus o Lattobacillus iners; per la saliva a Streptococcus salivarius e Streptococcus mutans; per il muco rettale a Escherichia coli ed Enterococcus faecalis. In questo caso, ogni miscela contiene circa 20 parti di una soluzione 100 micromolare dei primers corrispondenti a ciascuna specie. Queste aliquote possono ovviamente variare entro certi limiti , che possono essere anche di circa il 10%, senza pregiudicare l'efficacia della miscela e la sua stabilità. I primers possono essere ordinati da diverse ditte tra cui, per esempio: Sigma-Aldrich, MWG, PRIMM. Alcune sequenze 5 '-3' di primers utilizzabili, rispettivamente forward e reverse, sono specificate qui di seguito, e saranno poi riprese negli esempi successivi:

L. crispatus:

GCACTAACAGC CGAAGAAGG TTCGGATATCTCCGGATCAC

Ir. gasseri.·

AGATTGAAGAGCGACCGAGA CCTTCATCGGCTTCTAGTGC

li. iners:

CGGTGAATTGATTGCTGATG ATCGGCTTCCATCTTGTCAT

S. mutans:

CGGTTCTCAGCAAGACATGA ATGGTACCCAATCCGCAATA

S . salivarius:

GATGCCAAGGGTGAAGTTGT GAGCCATCAGGATTCGTAGC

E. coli:

CCCTTACGCTGAAGAGATGC GAGGTTAAAGCCGACAGCAG

E. faecalis:

AGAAATTCCAAACGAACTTG CAGTGCTCTACCTCCATCATT

Per aumentare le tipologie di fluidi biologici identificabili con il kit secondo la presente invenzione, Ã ̈ possibile aggiungere alla miscela A i primers corrispondenti ad altre specie caratteristiche delle diverse microflore umane e/o animali e/o appartenenti a specifiche matrici ambientali e/o alimentari di interesse in una diagnosi differenziale ed anche in un procedimento di diagnosi per esclusione .

Per esempio, per evidenziare la presenza di tracce di sangue bovino à ̈ possibile aggiungere circa 10 parti di una soluzione 100 micromolare dei seguenti primers 5'-3' corrispondenti alla specie Bos tauras:

CAGCCCCATCAAACATTTCATC e CCCGTAATAATATAAGCCTCGTCC , e prevedendo per il componente B, una sonda di sequenza ATATCTGCCGAGACGTGAACTACG .

Considerando adesso il componente B del kit secondo la presente invenzione, esso à ̈ costituito da una soluzione contenente le sonde. Per sonda si intende un oligonucleotide di sequenza nota specifica per la specie biologica ricercata, che può essere fatto sintetizzare da apposite ditte oppure sintetizzato direttamente in laboratorio con l'uso di uno strumento detto sintetizzatore di oligonucleotidi . La caratteristica importante della sonda à ̈ che la sequenza di basi A, C, G, T (adenina, citosina, guanina, timina) sia definita.

Secondo una forma realizzativa preferita dell'invenzione, il kit comprende sonde corrispondenti a diversi fluidi biologici umani, per esempio fluido vaginale, saliva, muco rettale, ed à ̈ cosi consentita la identificazione contenporanea di almeno due diversi fluidi biologici umani. Le sonde hanno la funzione di legare i segmenti di DNA che sono amplificati utilizzando le miscele componente A. Tali segmenti subiranno una reazione di ibridazione permettendo di identificare i fluidi biologici ricercati . Per l'ibridazione possono essere utilizzati procedimenti noti e soluzioni standard e per la rivelazione può essere utilizzato qualsiasi sistema. In questo caso, sono state utilizzate simultaneamente almeno due triadi primer- sonda per ciascun fluido biologico, corrispondenti rispettivamente ad almeno due indicatori batterici . In particolare , in questo caso, à ̈ stato utilizzato un approccio basato sulla amplificazione real-time (Strumento ABI 7000, Applied Biosystems, ma sono disponibili strumenti analoghi anche da altri fornitori, ad esempio Biorad) e le sequenze oligonucleotidiche sono state marcate (Sigma) con un sistema per la rivelazione attraverso fluorescenza, secondo i protocolli classici per la reai time per, noti agli operatori del settore.

Le sequenze delle sonde oligonucleotidiche specifiche per i fluidi sopramenzionati sono riportate qui di seguito, con indicato anche un tipo di marcatura utilizzata:

Fluido vaginale:

L . crispatus: [FAM]CGAAAAGCTTCGGGGAGCGGT [BLACK_QUENCER] L . gasseri: [JOE]AAGGGCGCATGGTGAATGCCT [BLACK_QUENCER ]

L . iners: [FAM]TGGAACGAGTAGGACACGATGGTG [BLACK_QUENCER] Saliva:

S . matans: [FAM]TGCAGTTAAAGCTCTGCATAAAAGCGG [BLACK_QUENCER] S. salivarius [JOE]TGGCGAACAGACGATCAACGG [BLACK_QDENCER] Muco rettale:

E. coli: [FAM]TGGGCAGATGAACATGGCATCG [BLACK_QUENCER]

E .faecalis [JOE]TGGTTCTCTCCGAAATAGCTTTAGGGCTA [BLACK_QUENCER] Altre sonde corrispondenti ad altri componenti di microflore utili nel caratterizzare ulteriormente un medesimo fluido o nell 'identificare altra matrice, possono essere addizionate in modo da ottenere una reazione aggiuntiva che possa consentire al kit secondo la presente invenzione di identificare con lo stesso procedimento uno stesso fluido con ulteriori sonde e/o altri possibili contaminanti biologici di interesse in una diagnosi differenziale di esclusione .

Al momento dell'uso, i componenti A e B andranno aggiunti ad i reagenti necessari per la reazione di amplificazione , secondo protocolli noti. In particolare, i singoli reagenti sono acquisibili da diverse ditte (SIGMA, Fermentas , Promega) , e vanno tipicamente utilizzati alle seguenti concentrazioni finali: lOmM tris-HCl pH 8,3 (20°C), 50 mM RC1, MgCl 1,5 mM, dNTP 0,2 mM (inoltre, à ̈ anche possibile perfezionare la resa e la stabilità, aggiungendo stabilizzanti e/o un reference dye, acquisibili preconfezionati da diverse ditte, e da dosare secondo protocolli già noti). Per l'amplificazione reai time possono essere comunque utilizzate anche le soluzioni preconfezionate già pronte per l'uso, ottenibili da diverse ditte (Sigma, Applied Biosystems).

ESEMPIO 1

Preparazione dei componenti A e B.

- Per la preparazione del componente A, sono stati diluiti in acqua ultrapura 20 parti di una soluzione ΙΟΟÎ1⁄4Îœ di ciascun primer. In particolare, gli oligonucleotidi furono fatti sintetizzare (SIGMA-Aldrich) , ricevuti liofilizzati e risospesi in acqua sterile ultrapura alla concentrazione finale di 100 Î1⁄4Îœ.

Per la preparazione del componente A per la identificazione di fluido vaginale si à ̈ proceduto nel seguente modo: in una provetta da 2 mi furono aggiunti 100 Î1⁄4Î di acqua sterile ultrapura, e rispettivamente 100 Î1⁄4Î del primer di sequenza GCACTAACAGCCGAAGAAGG , 100 Î1⁄4Î del primer di sequenza TTCGGATATCTCCGGATCAC , 100 Î1⁄4Î del primer di sequenza AGATTGAAGAGC GACCGAGA , 100 Î1⁄4Î del primer di sequenza CCTTCATCGGCTTCTAGTGC .

Per la preparazione del componente A per la identificazione di saliva si à ̈ proceduto nel seguente modo: in una provetta da 2 mi furono aggiunti 100 Î1⁄4Î di acqua sterile ultrapura, e rispettivamente 100 Î1⁄4Î del primer di sequenza CGGTTCTCAGCAAGACATGA , 100 Î1⁄4Î del primer di sequenza ATGGTACCCAATCCGCAATA , 100 Î1⁄4Î del primer di sequenza GATGCCAAGGGTGAAGTTGT , 100 Î1⁄4Î del primer di sequenza GAGCCATCAGGATTCGTAGC .

Per la preparazione del componente A per la identificazione di muco rettale si à ̈ proceduto nel seguente modo: in una provetta da 2 mi furono aggiunti 100 Î1⁄4Î di acqua sterile ultrapura, e rispettivamente 100 Î1⁄4Î del primer di sequenza CCCTTACGCTGAAGAGATGC 100 Î1⁄4Î del prixner di sequenza GAGGTTAAAGCCGACAGCAG , 100 Î1⁄4Î del primer di sequenza AGAAATTCCAAACGAACTTG , 100 Î1⁄4Î del primer di sequenza CAGTGCTCTACCTCCATCATT .

- Per la preparazione del componente B, sono state diluite in acqua ultrapura 5 parti di una soluzione 100Î1⁄4Îœ di ciascuna sonda. In particolare, gli oligonucleotidi marcati al 5' con un fluoroforo ed al 3' con un quencher furono fatti sintetizzare (SIGMA-Aldrich) , ricevuti liofilizzati e risospesi in acqua sterile ultrapura alla concentrazione finale di 100 Î1⁄4Îœ.

Per la preparazione del componente B per la identificazione di fluido vaginale si à ̈ proceduto nel seguente modo: in una provetta da 2 mi furono aggiunti 450 Î1⁄4Î di acqua sterile ultrapura, e rispettivamente 25 Î1⁄4Î di ciascuna delle seguenti sonde marcate di sequenza:

[FAM]CGAAAAGCTTCGGGGAGCGGT [BLACK_QUENCER]

[JOE]AAGGGCGCATGGTGAATGCCT [BLACK_QUENCER]

Per la preparazione del componente B per la identificazione di saliva si à ̈ proceduto nel seguente modo: in una provetta da 2 mi furono aggiunti 450 Î1⁄4Î di acqua sterile ultrapura, e rispettivamente 25 Î1⁄4Î di ciascuna delle seguenti sonde marcate di sequenza:

[FAM]T GCAGTTAAAGCTCTGCAT AAAAGCGG [BLACK_QUENCER]

[JOE]TGGCGAACAGACGATCAACGG [BLACK_QUENCER]

Per la preparazione del componente B per la identificazione di muco rettale si à ̈ proceduto nel seguente modo: in una provetta da 2 mi furono aggiunti 450 Î1⁄4Î di acqua sterile ultrapura, e rispettivamente 25 Î1⁄4Î di ciascuna delle seguenti sonde marcate di sequenza:

[FAM]TGGGCAGATGAACATGGCATCG [BLACK_QUENCER ]

[JOE]TGGTTCTCTCCGAAATAGCTTTAGGGCTA [BLACK_QUENCER]

Tutte le soluzioni, una volta preparate sono state aliquota te e conservate a -20°C, pronte per l'uso.

ESEMPIO 2

Analisi di campioni salivari, vaginali e fecali.

DNA à ̈ stato isolato da tamponi orali (n=5), vaginali (n=5) e rettali (n=2) (conservati a temperatura ambiente per almeno 72 ore dal prelievo, per consentire disidratazione e simulare l'esposizione ambientale , in analogia a «pianto può avvenire in casi di interesse forense), e processati secondo protocolli tradizionali di estrazione che tenessero conto della buona prassi di laboratorio, dei principi generali per l'estrazione di dna batterico e dei principi generali per la estrazione di dna da canqpioni forensi e/o antichi. In particolare, à ̈ stato utilizzato il GenElute Bacterial Genoxnic DNA kit (Sigma-Aldrich NA2100) con alcune modifiche al protocollo. Brevemente, il tampone venne lavato in 500 Î1⁄4Î di PBS sterile per 45 minuti in agitazione a temperatura ambiente. L'eluato fu centrifugato e il pellet congelato a -20°C per 20 minuti. Quindi, si aggiunsero Glass Beads (Sigma-Aldrich G1145) assieme a 200 Î1⁄4Î di Lysozime solution. Con un pestello sterile si disgregò accuratamente il pellet e si incubò poi a 37°C per 30 minuti. Quindi si procedette aggiungendo RNase e Proteinasi K, giungendo fino alla eluizione che viene compiuta in un volume finale di 50 Î1⁄4Î . - Ai campioni suddetti furono aggiunti per 1<1>analisi anche 3 controlli negativi, costituiti da acqua sterile ultrapura; e 3 controlli positivi, costituiti da DNA batterico delle specie ricercate, diluito in acqua sterile ultrapura alla concentrazione finale dell'ordine di 0,2 ng/Î1⁄4Î ;

Le reazioni di amplificazione furono condotte su un apparecchio ABI 7000 della Applied Biosystems, in un volume di 25 Î1⁄4Î totali, programmato come segue: denaturazione 95 °C per 10 minuti, seguita da 40 cicli a 95°C per 15 secondi e 60 °C per un minuto. Ciascuno dei campioni di DNA sopra indicati e dei controlli positivi e negativi, fu analizzato in parallelo per la ricerca di tre fluidi biologici : vaginale, salivare, rettale, utilizzando le rispettive componenti A e B preparate come descritto in esenq>io 1. Per ciascun campione, furono aggiunti 10 Î1⁄4Î di DNA in una provetta thin wall da 0,2 mi nella quale erano stati aliquotati 1,25 Î1⁄4Î di componente A, 1,25 Î1⁄4Î di componente B e 12,5 Î1⁄4Î di reazione di anqplifreazione 2X della ditta Applied Biosystems . Ciascun campione di DNA fu amplificato parallelamente in tre provette utilizzando rispettivamente i componenti A e B per il fluido vaginale, per la saliva e per il muco rettale. I risultati osservati hanno consentito di attribuire correttamente ciascun campione al fluido di provenienza .

Nella FIGURA I à ̈ riportato un esempio di identificazione di fluido vaginale. Il cauzione di DNA estratto da tampone vaginale risultò positivo per la presenza di L. gasseri e L. crispatus, mentre non appare segnale significativo per gli indicatori di altri fluidi biologici quali saliva e/o muco rettale .

ESEMPIO 3

Analisi di campioni particolari di fluido vaginale, curve di taratura, miscela dei componenti A e B nella soluzione AB.

Utilizzando le condizioni generali di estrazione del DNA e di amplificazione precedentemente descritte in esempio 2, si à ̈ provveduto ad analizzare ulteriori cauzioni di fluido vaginale, provenienti da situazioni conqplesse anche per le modalità di conservazione (per esempio: umidità, temperatura , contaminazione con altri fluidi biologici, condizioni di infezione sovrapposta, presenza di sangue, conservazione oltre i 10 giorni a temperatura ambiente).

Inoltre, vennero preparati alcuni campioni di DNA batterico diluiti serialmente al fine di poterli utilizzare per poter stimare una soglia di sensibilità e specificità del metodo, misurabile in CT (ciclo soglia). In particolare, per questo aspetto sono state utilizzate sonde e primers per Lactobacillus gasseri, e per Enterococcus faecalis. I campioni di DNA sono stati estratti e processati come già descritto in esempio 2, soltanto che à ̈ stata utilizzata una miscela 1:1 di componente A e componente B, dalla quale sono stati aliquotati 2,5 Î1⁄4Î in ogni provetta.

Su 15 campioni di fluido vaginale analizzati 14 hanno fornito un risultato corretto. Un campione non ha mostrato alcun segnale, ma si à ̈ dimostrato poi non contenere DNA batterico amplificabile ; Le diluizioni seriali hanno consentito di stabilire una accettabile soglia per la aspecificità, collocabile entro il 35 ciclo, inoltre hanno consentito di rilevare fino ad una concentrazione di 6 fg per tubo di reazione, che corrispondono a poco più di un genoma batterico (Dodd and Peznberton, 1998). In conclusione, l'applicazione ha mostrato sufficiente sensibilità e specificità, nonché tempi rapidi di esecuzione delle analisi del campione di DNA con una visualizzazione del risultato nel giro di poche ore (<3h), con elevata riproducibilità in diverse tipologie di campioni.

Nella FIGURA II Ã ̈ riportato un esempio di curva di taratura (F. faecalis, diluizioni seriali)

In conclusione, come apparirà evidente da quanto anzi riportato, nella applicazione del kit utilizzabile in uno strumento per l'amplificazione realtime, i componenti A e B per ciascun fluido biologico, possono essere congiunti in un unica soluzione (componente AB). Inoltre, primers e sonde possono essere aumentate di numero entro i limiti di lettura dell'apparecchio utilizzato e dei fluorocromi disponibili per la marcatura delle sonde all 'interno di una singola provetta. Anche la miscela di amplificazione può essere preparata dall 'utilizzatore secondo protocolli noti; oppure acquistata già pronta da ditte quali Sigma o Applied Biosystems , dovendo 1'utilizzatore semplicemente aggiungere il DNA del campione da esaminare, e la miscela di primers e sonde (componente A e componente B oppure componente AB). In ogni caso, per completare l'utilizzazione del kit nella sua applicazione in strumenti per reai time per forniti da diverse ditte (Biorad, Applied Biosystems, WVR) , oltre 1 'apparecchiatura calibrata ed adeguatamente programmata per le condizioni di amplificazione, occorreranno i controlli positivi e negativi, provette adeguate ed i criteri per 1 'interpretazione dei risultati, ma tutto questo materiale e procedure generali sono già note nella metodologia generale e quindi non necessitano di particolare descrizione. Se del caso, il completamento del kit può essere effettuato dal laboratorio diagnostico stesso, il quale può semplicemente adattare il protocollo al proprio strumento adeguando alle proprie esigenze l'utilizzazione dei componenti A e B secondo la presente invenzione.

Eventuali varianti e/o aggiunte possono essere apportate dagli esperti del ramo alla forma realizzativa qui descritta ed illustrata restando nell'ambito dell'invenzione stessa.

Claims (7)

1. RIVENDICAZIONI 1) Metodo per l'identificazione e la rilevazione della natura di fluidi biologici, in cui si impiegano sequenze di DNA di microrganismi presenti nella microflora che alberga mucose ed epiteli umani od animali.
2. 2) Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui si estrae il DMA genomico della microflora presente su un campione da analizzare e si esegue la rilevazione di sequenze di DNA di microrganismi al fine di identificare la natura del campione stesso.
3. 3) Kit di reagenti per condurre il metodo secondo le rivendicazioni 1 e 2, per l'identificazione di almeno due fluidi biologici in un campione, caratterizzato dal fatto di comprendere un primo componente (componente A) per 1'amplificazione multipla contenente i primers di uno o più geni di microrganismi appartenenti alla microflora presente in un fluido biologico ed un secondo componente (componente B) per l’ibridazione con sonda.
4. 4) Kit di reagenti secondo la rivendicazione 3 caratterizzato dalla miscelazione dei primers del componente A e delle sonde del componente B in un unica soluzione ovverosia in un unico componente AB.
5. 5) Kit di reagenti secondo la rivendicazione 4 caratterizzato dal fatto che la miscela di amplificazione componente A comprende una coppia di primers corrispondenti alla specie Lattobacillo crispatus di sequenze GCACTAACAGCCGAAGAAGG (SEQ ID 1) e TTCGGATATCTCCGGATCAC (SEQ ID 2) ; ed una coppia di primers corrispondenti alla specie Lactobacillus gasseri AGATTGAAGAGCGACCGAGA (SEQ ID 3) e CCTTCATCGGCTTCTAGTGC (SEQ ID 4).
6. 6) Kit di reagenti secondo la rivendicazione 4 caratterizzato dal fatto che la miscela di amplificazione componente A comprende una coppia di primers corrispondenti alla specie Streptococcus salivarius GATGCCAAGGGTGAAGTTGT (SEQ ID 9) e GAGCCATCAGGATTCGTAGC (SEQ ID 10); ed una coppia di primers corrispondenti alla specie Streptococcus mutane CGGTTCTCAGCAAGACATGA (SEQ ID 7) e ATGGTACCCAATCCGCAATA (SEQ ID 8).
7. 7) Kit di reagenti secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che la miscela di ibridazione componente B comprende una sonda corrispondente alla specie Lactobacillus crispatus di sequenza CGAAAAGCTTCGGGGAGCGGT (SEQ ID 18); ed una sonda corrispondente alla specie Lactobacillus gasseri di sequenza AAGGGCGCATGGTGAATGCCT (SEQ ID 19) 8) Kit di reagenti secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che la miscela di ibridazione componente B comprende una sonda corrispondente alla specie Streptococcus salivarius di sequenza TGGCGAACAGACGATCAACGG (SEQ ID 22); ed una sonda corrispondente alla specie Streptococcus mutane di sequenza TGCAGTTAAAGCTCTGCATAAAAGCGG (SEQ ID 21). 9) Kit di reagenti secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni 3-8 in cui la componente A contiene almeno una coppia di primers per Enterococcus faecalis e la componente B contiene almeno una sonda per Enterococcus faecalis. 10) Kit di reagenti secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni 3-9, caratterizzato dal fatto che il supporto per le sonde à ̈ costituito da un microchip/microarray atto ad essere introdotto in un dispositivo automatizzato per il riconoscimento di fluidi biologici. 11) Kit di reagenti secondo UNA qualsiasi delle precedenti rivendicazioni che impieghi gli oligonucleotidi descritti attraverso altri metodi di amplificazione del DNA e/o ibridazione e/o sequenziamento, al fine della identificazione di un fluido biologico attraverso 1'analisi di sequenze di componenti della microflora utilizzate come marcatori della presenza di un fluido biologico in un campione, che include ma non à ̈ limitato alla identificazione di fluido vaginale umano od animale. 12) Impiego di DNA genomico o porzioni di esso appartenente alla microflora dei fluidi biologici umani e animali al fine della identificazione di detto fluido biologico attraverso 1'analisi di sequenze di detto DNA o sue porzioni.